JPH0435480B2 - - Google Patents
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Landscapes
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の発景
技術分野
本発明は、一般に、２，４−ジニトロフエニル
ヌクレオチド誘導体に関する。さらに具体的に
は、本発明は、ヌクレオチドの塩基以外の部分に
２，４−ジニトロベンゼンを結合させてなる２，
４−ジニトロフエニルヌクレオチド誘導体に関す
る。 先行技術 放射性同位元素を使わず、特殊な抗体や酵素に
よつて検出することができる、ポリあるいはオリ
ゴヌクレオチド誘導体は、核酸用アフイニテイー
プローブとして興味が持たれている。 近年、Vincentらによつて、２，４−ジニトロ
フエニル（以下DNPと略す）基を核酸に結合さ
せた、DNAプローブが開発されている（Nucl.
Acids Res.，106787−6796（1982））。彼らは、ア
デノシントリリン酸（ATP）のDNP誘導体を
DNA鎖に取り込ませ、相補的塩基配列を持つ
DNAにハイブリダイズさせたのち、DNPに対す
るウサギ抗血清およびパーオキシダーゼで標識し
たウサギ免疫グロブリンＧ型（IgG）に対するヒ
ツジ抗血清を順次加えて目的からDNAを検出し
ている。ここで用いたDNA鎖は、天然から取り
出したフラグメントである。 しかし、本発明者らの知るところによれば、こ
のようにして製造されるDNP−ヌクレオチド誘
導体には下記のような問題点がある。 (イ) ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有する
ため、使用オリゴヌクレオチド固有の融解温度
（Tm値）に変化を生じる。 (ロ) 任意でかつ定められた塩基配列をもつDNA
の合成が困難である。 これらの理由によつて、現段階でのDNP−ヌ
クレオチド誘導体は、その応用範囲が狭く、有用
性が限定されているのが現状である。 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、特定のオリゴデオキシリボヌクレオチドのヌ
クレオチド塩基以外に特定部位に２，４−ジニト
ロベンゼンを結合させてなるDNP−ヌクレオチ
ド誘導体によつてこの目的を達成しようとするも
のである。 従つて、本発明によるDNP−ヌクレオチド誘
導体は下式〔〕で示されるDNP−オリゴデオ
キシリボヌクレオチドであること、を特徴とする
ものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意
の自然数であり、R1は２価の直鎖または分岐鎖
の炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチドを構成
する塩基である（Ｂが複数個存在するときは、そ
れらは同一でも異なつてもよい）。〕 効 果 本発明者らの合成したDNP−オリゴデオキシ
リボヌクレオチドは、前記核酸用非放射性アフイ
ニテイプローブの短所を回避することができて、
下記のような長所をもつものである。 (イ) ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有しな
いので、融解温度（Tm値）に変化を生じるこ
とがなくて安定である。 (ロ) いかなる塩基配列をもつDNP−オリゴヌク
レオチドも合成可能である。 (ハ) プローブとして短鎖オリゴマーで十分であ
る。 (ニ) 合成が非常に簡単であつて大量合成が可能で
あり、また長期保存も可能である。 (ホ) プライマー（鋳型合成の際のDNA断片）と
しても利用できる。 最近、板倉らは、鎖長19の合成オリゴヌクレオ
チドを用いてβ−グロビンの遺伝子病の診断を行
なつており（Proc.Natl.Acad.Sci.USA；80、278
−282（1983）、遺伝子中のわずか一つの塩基配列
の違いも検出できる合成オリゴヌクレオチドが各
種遺伝子病解析に有用であることを示している。 彼らは合成オリゴヌクレオチドの検出した放射
性同位元素（32P）を使用したが、代わりに本発
明者らが開発したDNP−ヌクレオチド誘導体を
用いることができれば、非常に有用なことは明白
であろう。 すなわち、たとえば、DNP−オリゴヌクレオ
チドは、非放射性核酸用フアイニテイープローブ
として、あるいはプライマーとして、有用可能で
あることは前記したところであつて、その検出方
法は抗体による沈降、酵素免疫活性測定、螢光性
染色による可視化等々、多様であり、また本発明
のDNP−ヌクレオチド誘導体は放射性プローブ
（32P）に比べて被曝の危険、コスト、廃棄物の処
理および保存性の点でも有用である。 なお、DNP基は、市販のウサギ抗血清（たと
えばMiles Laboratories，Code No.61−006−
１）または、DNPに対するモノクローナル抗体
によつて容易に検出することができる。 このような長所があるところから、本発明の
DNP−ヌクレチオド誘導体の利用方法の拡大も
考えられる。 発明の具体的説明 DNPヌクレオチド誘導体〔〕 本発明によるDNPヌクレオチド誘導体は、前
記の式〔〕で示されるものである。 式中、記号【式】は、2′−デオキシリボヌクレ オシドの3′−および5′−水酸基を除いたデオキシ
リボヌクレオシド残基を示すのに慣用されている
ものであつて、具体的には下記の構造のものであ
る。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示
し、通常はアデニン、チミン、シトシンまたはグ
アニンである。化合物〔〕中にＢが複数個存在
するときは、それらは同一でも異なつてもよい。 ｍおよびｎは、それぞれ０または自然数を示
す。本発明DNPオリゴヌクレオチド誘導体の重
合度がｍ＋ｎで表示されているのは、本発明の好
ましい製造法で重合度がそれぞれｍおよびｎのフ
ラクシヨンを縮合させていることによるものであ
る（詳細後記）。その場合のｍは実用的には０〜
６、特に１〜４、ｎは実用的には０〜40、特に０
〜20、である。 基R1は、化合物〔〕の核酸部分とDNP部分
とを連結する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素
残基である。これは、特に炭素数２〜20程度の直
鎖または分岐鎖のアルキレン基が適当である。好
ましいR1は、炭素数２〜６のアルキレン基であ
る。 化合物〔〕の合成 一般的説明 化合物〔〕、すなわち本発明によるDNP−ヌ
クレチオド誘導体、は合目的的な任意の方法によ
つて合成することができる。 一つの好ましい方法は、下式〔〕で示される
オリゴヌクレオチド誘導体の末端アミノ基に２，
４−ジニトロベンゼンを結合させて下式〔〕で
示されるDNP−オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを得ること、を特徴とするものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意
の自然数であり、R1は２価の直鎖または分岐鎖
の炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチドを構成
する塩基である（Ｂが複数個存在するときは、そ
れらは同一でも異なつてもよい）。〕 すなわち、この方法は、前記の式〔〕のオリ
ゴヌクレオチド誘導体は、すなわちオリゴヌクレ
オチドの5′−末端リン酸基に基R1を介して一級ア
ミノ基が導入されたもの、のアミノ基にDNPを
結合させることからなるものである。 一方、式〔〕の化合物は、オリゴヌクレオチ
ドの合成および生成オリゴヌクレオチドの5′−水
酸基延長上での一級アミノ基の導入からなる方法
で合成することができる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフ
ローチヤートである。フローチヤート中の記号
は、下記の意味を持つ（その意義ないし詳細は、
後記した通りである）。 R0 リン酸基を保護する置換基であつて、通常
オルトクロロフエニル基が用いられる。 R1 二価の炭化水素残基である。 R2 5′−末端水酸基の保護基であつて、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 R3 他のすべての保護基が安定な条件で容易に
脱離されて、リン酸ジエステルを与えることが
できる置換基であつて、通常シアノエチル基が
用いられる。 R4 アミノ基の保護基であつて、通常トリフル
オロアセチル基が用いられる。 ｑ ｎより小さい任意の自然数。 ｍ ０または任意の自然数。 ｎ ０および任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン（すな
わち、保護不要）より選択される。 スペーサーを介した担体であつて、通常は
下記のものである。 （ｐはスチレンの重合度） 化合物〔〕の合成 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、ト
リエステル法、ホスフアイト法およびそれぞれの
固相法および液相法がある。本発明者らは既に固
相法によるオリゴヌクレオチド製造技術を確立し
ており、化合物〔〕の合成には本発明者らの下
記の方法が好ましい。 Tetrahedron Letters1979，3635（1979） Nucleic Acids Research８，5473（1980） Nucleic Acids Research８，5491（1980） Nucleic Acids Research８，5507（1980） Nucleic Acids Research Symposium Series
７，281（1980） また、上記で合成したオリゴヌクレオチドの
5′−水酸基にリン酸基を介して一級アミノ基を導
入する方法、すなわち化合物〔〕の合成法とし
ては、たとえば本発明者らの特願昭57−138136号
明細書記載の方法がある。 化合物〔〕の合成法をその一実施態様につい
て示せば、下記の通りである。すなわち、第１図
に示したように、化合物〔〕の保護基R3を除
去したものと化合物〔〕の保護基R2を除去し
たものとを縮合させ、これらの操作をくり返すこ
とによつて、化合物〔〕を合成する。オリゴヌ
クレオチド化合物〔〕の合成法は、上記の通り
公知である。 一方、本発明者らの方法（特願昭57−138136号
明細書参照）に従つて、式〔〕の化合物を合成
する。すなわち、化合物〔〕のR2を除去して
5′−水酸基化合物とし、これにリン酸化剤（たと
えば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジクロリド
またはホスホジベンゾトリアゾリド等）を作用さ
せてリン酸化し、ついでアミノ基が保護されてい
るアミノアルコール化合物R2−NH−R1−OH
〔この化合物はオメガ−アミノアルコール（NH2
−R1OH）のアミノ基をR2で保護することにより
得ることができる〕を縮合させることにより、化
合物〔〕を得ることができる（詳細は該明細書
参照）。 この化合物〔〕の保護基R3を除去し、化合
物〔〕の保護基R2を除去したものと縮合させ
て、化合物〔〕を合成する。縮合は、化合物
〔〕の合成の際の縮合と本質的には変らない方
法で行なうことができる。 このようにして合成された化合物〔〕の保護
基をすべて除去すれば、化合物〔〕が得られ
る。保護基CO、リン酸トリエステル中のオ
ルト−クロロフエニル基および塩基部分のアシル
基は、0.5Mのテトラメチルグアニジン−ピリジ
ン−２−カルボアルドキシムのジオキサン−水
（９：１，（Ｖ／Ｖ））溶液で処理後、アルカリ処
理（濃アンモニア水）を行なうことにより除去さ
れる。R4がトリフルオロアセチル基の場合は、
アンモニア処理により充分脱離されるが、オルト
ニトロフエニルスルフエニル基である場合はメル
トカプトエタノール処理が必要である。R4とし
て他の保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチ
ド部分が安定な条件で、さらに別の処理を加える
ことも可能である。なお、オリゴデオキシリボヌ
クレオチドの合成法は既に各種のものが公知であ
つて、保護基の種類およびその導入ないし除去な
らびに縮合その他について上記以外の詳細は核酸
の化学合成に関する成書や総説たとえば「ヌクレ
オシド・ヌクレオチドの合成」「丸善1977年）、
「核酸有機化学」（化学同人1979年）、「核酸」（朝
倉書店1979年）、Tetrahedron、34、3143（1978）、
有合化、34、723（1978）および化学の領域、33、
566（1979）等を参照することができる。 化合物の〔〕の合成 DNP−オリゴデオキシリボヌクレオチド（化
合物〔〕）は、上記化合物〔〕の5′−末端延
長上の一級アミノ基に２，４−ジニトロベンゼン
を結合させることによつて得ることができる。 両者の結合は、２，４−ジニトロベンゼンの１
−位と化合物〔〕のアミノ基との間のＣ−Ｎ結
合の形成を実現することのできる任意の方法によ
つて行なうことができる。 両者の結合は、一般に、前者の誘導体、すなわ
ちDNP−Ｘ（Ｘは１−置換基）とアミノ基との間
の脱Ｈ−Ｘ縮合によることがふつうである。Ｘと
しては、ハロゲンが好ましい。Ｘがハロゲンであ
る誘導体、すなわち１−ハロゲノ−２，４−ジニ
トロベンゼンが好ましいのは、一般に、オリゴヌ
クレオチドの塩基部分のアミノ基とは反応しない
で5′−末端延長上の一級アミノ基とのみ選択的に
反応し、しかも反応操作が簡便だからである。と
りわけ、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼ
ンは市販され容易に入手でき、穏かな反応条件で
化合物〔〕のアミノ基との反応が進行する。 １−ハロゲノ−２，４−ジニトロベンゼンと化
合物〔〕との反応は、両者の均一溶液中（溶媒
は、たとえば含水アルコール）あるいは不均一溶
液中（溶媒は、たとえば水）、ハロゲン化水素捕
捉剤（たとえば、炭酸水素ナトリウム、トリエチ
ルアミン、水酸化カリウム等）の存在下に、10〜
50℃程度の温度で実施することができる。目的生
成物は、たとえば抽出によつて回収すればよい。
なおDNP化に関しては、適当な総説、たとえば
「実験化学講座、蛋白質の化学、第118頁」
（1976年丸善(株)発行）等を参照することができる。 実験例 １ フローチヤート 第２図のフローチヤートに従つて、本発明化合
物（同図の化合物）を製造した。 第２図で、記号は次の意味を持つ。 Ｂ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン DMTr ジメトキシトリチル R0 オルトクロロフエニル Et エチル CE−シアノエチル ｍ ２ ｎ 12 ２ 化合物〔〕（第２図の）の合成 実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂〔〕
（樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目
的化合物は外観的には樹脂そのものと変らないの
で、樹脂に担持された当該化合物を以下において
単に樹脂と呼ぶことにする）300mg（0.033mmol）
をイソプロパノール−塩化メチレン（15：85、
Ｖ／Ｖ）溶液10mlで３回洗浄後、臭化亜鉛の
1.0Mのイソプロパノール−塩化メチレン溶液８
mlで５分間ずつ４回反応（脱トリチル化）させて
樹脂〔〕を得る。樹脂〔〕をイソプロパノー
ル−塩化メチレン溶液10mlで３回洗浄し、これに
ジヌクレオチド〔〕15mg（0.1mmol）のピリジ
ン溶液を添加後、共沸させて系を無水とし、メシ
チレンスルホニルニトロトリアゾリド（以下
MSNTと記す）150mg（0.5mmol）と無水ピリジ
ン２mlとを添加して90分間反応（縮合）させる。
反応後、ピリジン10mlで３回洗浄し、触媒量（約
10mg）のジメチルアミノピリジン（以下DMAP）
を含む無水酢酸−ピリジン（１：９、（Ｖ／Ｖ））
溶液10mlを添加し10分間反応させて未反応5′−水
酸基をアセチル化して保護し、これをピリジンで
洗浄して、化合物〔′〕（ｎ＝２）を得る。以上
のような操作を６回くり返して、化合物〔〕
（ｎ＝12）を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔〕
800mg（0.71mmol）とオルトクロロフエニルホス
ホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液
（1.0mmol、６ml）中で２時間反応させ、続いて
トリフルオロアセチル−６−アミノヘキサノール
300mg（1.4mmol）および１−メチル−イミダゾ
ール115mg（1.4mmol）を加えてさらに２時間反
応させる。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をク
ロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリン酸二水
素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および５％の塩化ナトリウム水溶液でそれぞ
れ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。クロ
ロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製
（溶出液として０〜４％のメタノール含有クロロ
ホルムを使用）し、溶出液を濃縮後ペンタン中に
滴下し粉末状の化合物〔〕を得る。 上記で合成した化合物〔〕（ｎ＝12）115mg、
（3.45μmol）を前述と同様の方法で脱トリチル化
したもの〔〕に、化合物〔〕60mg
（0.04mmol）をトリエチルアミン−ピリジン−水
（１：３：１、Ｖ／Ｖ）溶液３mlで処理（脱シア
ノエチル化）した化合物〔〕を加え、無水にし
たのち、MSNT50mg（0.2mmol）およびピリジ
ン１mlを加え90分間反応（縮合）させ、反応終了
後ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥し
て、完全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体
〔〕を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕15mgを0.5M
テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボ
アルドキシムのジオキサン−水（９：１、（Ｖ／
Ｖ）溶液200μ1を加え、遠沈管中、室温で24時間
反応させる。反応後、濃アンモニア水（2.5ml）
を加えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反応終
了後、過し、液を濃縮後、水に溶解させてか
らエーテルで抽出を行なう。水層を濃縮後、セフ
アデツクスＧ−50（φ1.5×120cm、溶出液は0.05M
の重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液PH7.5）
で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体〔〕
を得た。 また同様の方法で実験１−２、１−３および１
−４のようなオリゴヌクレオチド誘導体を得た。
以上で合成した化合物を第１表に示す。 【表】 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。 これら４種の化合物の高速液体クロマトグラフ
イーの結果を第３図に示す。Ａ〜Ｄは、それぞれ
実験１−１〜１−４の化合物についての図であ
る。 ３ ２，４−ジニトロフエニル−ペンタデカアデ
ニル酸〔〕の製造 実験２−１ 上記実験１−１で合成したペンタデカアデニル
酸誘導体〔〕約1.0ODを0.1M炭酸水素ナトリ
ウム水溶液（PH8.3）10μlに溶解し、１−フルオ
ロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液
（50mg／ml）5μl（大過剰）を加えて37℃で２時間
反応させた後、水30μlを加えエーテル150μlで４
回試薬の除去を行ない、２，４−ジニトロフエニ
ル−ペンタデカアデニル酸〔〕を得る。反応の
確認は、高速液体クロマトグラフイーにより行な
つた。 またその際、反応性の比較のため上記で合成し
たオリゴヌクレオチド〔〕を脱保護して得た
5′−水酸基をもつ化合物〔〕も同様に１−フル
オロ−２，４−ジニトロベンゼンと反応させる
（対照実験３−１）。 上記実験１−２、１−３および１−４で合成し
た化合物〔〕についても実験２−１と同様な操
作を行なつて各々について化合物〔〕を製造す
る。この実験をそれぞれ２−２、２−３、２−４
とする。また、反応の比較のため5′−水酸基をも
つ化合物〔〕をも製造し、化合物〔〕と１−
フルオロ−２，４−ジニトロ−ベンゼンとを各々
反応させる。このときの実験を各々実験３−２，
３−３および３−４とした。 実験２で製造した化合物および対照実験３を第
２表に示す。 【表】 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。 以上の結果を第４図（高速液体クロマトグラフ
イーの結果）に示す。 第４図は高速液体クロマトグラフイーの溶出パ
ターンを示すものである。図中、１は何れも反応
前の化合物そのもの、２は何れも化合物と１−フ
ルオロ−２，４−ジニトロベンゼンとを反応させ
たもの、のクロマトグラムである。イは実験３−
１で式〔〕である化合物、ロは実験２−１で式
〔〕である化合物、ハは実験３−２で式〔〕
である化合物、ニは実験２−２で式〔〕である
化合物、ホは実験３−２で式〔〕である化合
物、ヘは実験２−３で式〔〕である化合物、ト
は実験３−４で式〔〕である化合物、チは実験
２−３で式〔〕である化合物について上記のよ
うな操作を行なつた際のクロマトグラムを示す。
なおピーク上の数値は保持時間を示す。 これらの結果からみれば、式で示される5′−
水酸基をもつ化合物（第４図のイ−１、ハ−１、
ホ−１、およびト−１）は１−フルオロ−２，４
−ジニトロベンゼンと反応していないことがわか
る（第４図イ−２、ハ−２、ホ−２、およびト−
２）。 それに対してオリゴヌクレオチド誘導体〔〕
は１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンと反
応させると、高速液体クロマトグラフイーの溶出
パターンに変化が生じて、原料のピーク（第４図
ロ−１、ニ−１、ヘ−１およびチ−１）はなくな
つており、１−フルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼンと反応して新しい化合物（第４図ロ−２、ニ
−２、ヘ−２およびチ−２）ができていることが
わかる。 すなわち、一級アミノ基を有する化合物〔〕
は、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンと
選択的に反応し、5′−水酸基をもつ化合物〔〕
とは全く反応しないことがわかる。 なお、第４図の保持時間５分程度で各々溶出さ
れるピークは、２，４−ジニトロフエノールと考
えられる。 上記において、高速液体クロマトグラフイーは
日本分光HPLC System Tri−Roterを用い、
次の条件により測定を行なつた。 カラム：μ−Bondapak C18（Waters） 流速：２ml／分 溶出液：アセトニトリルを含む、20mM−
TEAA緩衝液（PH7.2） 濃度公配：アセトニトリルの濃度６〜14％／16
分（16分以後は14％を続ける）
ヌクレオチド誘導体に関する。さらに具体的に
は、本発明は、ヌクレオチドの塩基以外の部分に
２，４−ジニトロベンゼンを結合させてなる２，
４−ジニトロフエニルヌクレオチド誘導体に関す
る。 先行技術 放射性同位元素を使わず、特殊な抗体や酵素に
よつて検出することができる、ポリあるいはオリ
ゴヌクレオチド誘導体は、核酸用アフイニテイー
プローブとして興味が持たれている。 近年、Vincentらによつて、２，４−ジニトロ
フエニル（以下DNPと略す）基を核酸に結合さ
せた、DNAプローブが開発されている（Nucl.
Acids Res.，106787−6796（1982））。彼らは、ア
デノシントリリン酸（ATP）のDNP誘導体を
DNA鎖に取り込ませ、相補的塩基配列を持つ
DNAにハイブリダイズさせたのち、DNPに対す
るウサギ抗血清およびパーオキシダーゼで標識し
たウサギ免疫グロブリンＧ型（IgG）に対するヒ
ツジ抗血清を順次加えて目的からDNAを検出し
ている。ここで用いたDNA鎖は、天然から取り
出したフラグメントである。 しかし、本発明者らの知るところによれば、こ
のようにして製造されるDNP−ヌクレオチド誘
導体には下記のような問題点がある。 (イ) ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有する
ため、使用オリゴヌクレオチド固有の融解温度
（Tm値）に変化を生じる。 (ロ) 任意でかつ定められた塩基配列をもつDNA
の合成が困難である。 これらの理由によつて、現段階でのDNP−ヌ
クレオチド誘導体は、その応用範囲が狭く、有用
性が限定されているのが現状である。 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、特定のオリゴデオキシリボヌクレオチドのヌ
クレオチド塩基以外に特定部位に２，４−ジニト
ロベンゼンを結合させてなるDNP−ヌクレオチ
ド誘導体によつてこの目的を達成しようとするも
のである。 従つて、本発明によるDNP−ヌクレオチド誘
導体は下式〔〕で示されるDNP−オリゴデオ
キシリボヌクレオチドであること、を特徴とする
ものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意
の自然数であり、R1は２価の直鎖または分岐鎖
の炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチドを構成
する塩基である（Ｂが複数個存在するときは、そ
れらは同一でも異なつてもよい）。〕 効 果 本発明者らの合成したDNP−オリゴデオキシ
リボヌクレオチドは、前記核酸用非放射性アフイ
ニテイプローブの短所を回避することができて、
下記のような長所をもつものである。 (イ) ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有しな
いので、融解温度（Tm値）に変化を生じるこ
とがなくて安定である。 (ロ) いかなる塩基配列をもつDNP−オリゴヌク
レオチドも合成可能である。 (ハ) プローブとして短鎖オリゴマーで十分であ
る。 (ニ) 合成が非常に簡単であつて大量合成が可能で
あり、また長期保存も可能である。 (ホ) プライマー（鋳型合成の際のDNA断片）と
しても利用できる。 最近、板倉らは、鎖長19の合成オリゴヌクレオ
チドを用いてβ−グロビンの遺伝子病の診断を行
なつており（Proc.Natl.Acad.Sci.USA；80、278
−282（1983）、遺伝子中のわずか一つの塩基配列
の違いも検出できる合成オリゴヌクレオチドが各
種遺伝子病解析に有用であることを示している。 彼らは合成オリゴヌクレオチドの検出した放射
性同位元素（32P）を使用したが、代わりに本発
明者らが開発したDNP−ヌクレオチド誘導体を
用いることができれば、非常に有用なことは明白
であろう。 すなわち、たとえば、DNP−オリゴヌクレオ
チドは、非放射性核酸用フアイニテイープローブ
として、あるいはプライマーとして、有用可能で
あることは前記したところであつて、その検出方
法は抗体による沈降、酵素免疫活性測定、螢光性
染色による可視化等々、多様であり、また本発明
のDNP−ヌクレオチド誘導体は放射性プローブ
（32P）に比べて被曝の危険、コスト、廃棄物の処
理および保存性の点でも有用である。 なお、DNP基は、市販のウサギ抗血清（たと
えばMiles Laboratories，Code No.61−006−
１）または、DNPに対するモノクローナル抗体
によつて容易に検出することができる。 このような長所があるところから、本発明の
DNP−ヌクレチオド誘導体の利用方法の拡大も
考えられる。 発明の具体的説明 DNPヌクレオチド誘導体〔〕 本発明によるDNPヌクレオチド誘導体は、前
記の式〔〕で示されるものである。 式中、記号【式】は、2′−デオキシリボヌクレ オシドの3′−および5′−水酸基を除いたデオキシ
リボヌクレオシド残基を示すのに慣用されている
ものであつて、具体的には下記の構造のものであ
る。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示
し、通常はアデニン、チミン、シトシンまたはグ
アニンである。化合物〔〕中にＢが複数個存在
するときは、それらは同一でも異なつてもよい。 ｍおよびｎは、それぞれ０または自然数を示
す。本発明DNPオリゴヌクレオチド誘導体の重
合度がｍ＋ｎで表示されているのは、本発明の好
ましい製造法で重合度がそれぞれｍおよびｎのフ
ラクシヨンを縮合させていることによるものであ
る（詳細後記）。その場合のｍは実用的には０〜
６、特に１〜４、ｎは実用的には０〜40、特に０
〜20、である。 基R1は、化合物〔〕の核酸部分とDNP部分
とを連結する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素
残基である。これは、特に炭素数２〜20程度の直
鎖または分岐鎖のアルキレン基が適当である。好
ましいR1は、炭素数２〜６のアルキレン基であ
る。 化合物〔〕の合成 一般的説明 化合物〔〕、すなわち本発明によるDNP−ヌ
クレチオド誘導体、は合目的的な任意の方法によ
つて合成することができる。 一つの好ましい方法は、下式〔〕で示される
オリゴヌクレオチド誘導体の末端アミノ基に２，
４−ジニトロベンゼンを結合させて下式〔〕で
示されるDNP−オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを得ること、を特徴とするものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意
の自然数であり、R1は２価の直鎖または分岐鎖
の炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチドを構成
する塩基である（Ｂが複数個存在するときは、そ
れらは同一でも異なつてもよい）。〕 すなわち、この方法は、前記の式〔〕のオリ
ゴヌクレオチド誘導体は、すなわちオリゴヌクレ
オチドの5′−末端リン酸基に基R1を介して一級ア
ミノ基が導入されたもの、のアミノ基にDNPを
結合させることからなるものである。 一方、式〔〕の化合物は、オリゴヌクレオチ
ドの合成および生成オリゴヌクレオチドの5′−水
酸基延長上での一級アミノ基の導入からなる方法
で合成することができる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフ
ローチヤートである。フローチヤート中の記号
は、下記の意味を持つ（その意義ないし詳細は、
後記した通りである）。 R0 リン酸基を保護する置換基であつて、通常
オルトクロロフエニル基が用いられる。 R1 二価の炭化水素残基である。 R2 5′−末端水酸基の保護基であつて、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 R3 他のすべての保護基が安定な条件で容易に
脱離されて、リン酸ジエステルを与えることが
できる置換基であつて、通常シアノエチル基が
用いられる。 R4 アミノ基の保護基であつて、通常トリフル
オロアセチル基が用いられる。 ｑ ｎより小さい任意の自然数。 ｍ ０または任意の自然数。 ｎ ０および任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン（すな
わち、保護不要）より選択される。 スペーサーを介した担体であつて、通常は
下記のものである。 （ｐはスチレンの重合度） 化合物〔〕の合成 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、ト
リエステル法、ホスフアイト法およびそれぞれの
固相法および液相法がある。本発明者らは既に固
相法によるオリゴヌクレオチド製造技術を確立し
ており、化合物〔〕の合成には本発明者らの下
記の方法が好ましい。 Tetrahedron Letters1979，3635（1979） Nucleic Acids Research８，5473（1980） Nucleic Acids Research８，5491（1980） Nucleic Acids Research８，5507（1980） Nucleic Acids Research Symposium Series
７，281（1980） また、上記で合成したオリゴヌクレオチドの
5′−水酸基にリン酸基を介して一級アミノ基を導
入する方法、すなわち化合物〔〕の合成法とし
ては、たとえば本発明者らの特願昭57−138136号
明細書記載の方法がある。 化合物〔〕の合成法をその一実施態様につい
て示せば、下記の通りである。すなわち、第１図
に示したように、化合物〔〕の保護基R3を除
去したものと化合物〔〕の保護基R2を除去し
たものとを縮合させ、これらの操作をくり返すこ
とによつて、化合物〔〕を合成する。オリゴヌ
クレオチド化合物〔〕の合成法は、上記の通り
公知である。 一方、本発明者らの方法（特願昭57−138136号
明細書参照）に従つて、式〔〕の化合物を合成
する。すなわち、化合物〔〕のR2を除去して
5′−水酸基化合物とし、これにリン酸化剤（たと
えば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジクロリド
またはホスホジベンゾトリアゾリド等）を作用さ
せてリン酸化し、ついでアミノ基が保護されてい
るアミノアルコール化合物R2−NH−R1−OH
〔この化合物はオメガ−アミノアルコール（NH2
−R1OH）のアミノ基をR2で保護することにより
得ることができる〕を縮合させることにより、化
合物〔〕を得ることができる（詳細は該明細書
参照）。 この化合物〔〕の保護基R3を除去し、化合
物〔〕の保護基R2を除去したものと縮合させ
て、化合物〔〕を合成する。縮合は、化合物
〔〕の合成の際の縮合と本質的には変らない方
法で行なうことができる。 このようにして合成された化合物〔〕の保護
基をすべて除去すれば、化合物〔〕が得られ
る。保護基CO、リン酸トリエステル中のオ
ルト−クロロフエニル基および塩基部分のアシル
基は、0.5Mのテトラメチルグアニジン−ピリジ
ン−２−カルボアルドキシムのジオキサン−水
（９：１，（Ｖ／Ｖ））溶液で処理後、アルカリ処
理（濃アンモニア水）を行なうことにより除去さ
れる。R4がトリフルオロアセチル基の場合は、
アンモニア処理により充分脱離されるが、オルト
ニトロフエニルスルフエニル基である場合はメル
トカプトエタノール処理が必要である。R4とし
て他の保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチ
ド部分が安定な条件で、さらに別の処理を加える
ことも可能である。なお、オリゴデオキシリボヌ
クレオチドの合成法は既に各種のものが公知であ
つて、保護基の種類およびその導入ないし除去な
らびに縮合その他について上記以外の詳細は核酸
の化学合成に関する成書や総説たとえば「ヌクレ
オシド・ヌクレオチドの合成」「丸善1977年）、
「核酸有機化学」（化学同人1979年）、「核酸」（朝
倉書店1979年）、Tetrahedron、34、3143（1978）、
有合化、34、723（1978）および化学の領域、33、
566（1979）等を参照することができる。 化合物の〔〕の合成 DNP−オリゴデオキシリボヌクレオチド（化
合物〔〕）は、上記化合物〔〕の5′−末端延
長上の一級アミノ基に２，４−ジニトロベンゼン
を結合させることによつて得ることができる。 両者の結合は、２，４−ジニトロベンゼンの１
−位と化合物〔〕のアミノ基との間のＣ−Ｎ結
合の形成を実現することのできる任意の方法によ
つて行なうことができる。 両者の結合は、一般に、前者の誘導体、すなわ
ちDNP−Ｘ（Ｘは１−置換基）とアミノ基との間
の脱Ｈ−Ｘ縮合によることがふつうである。Ｘと
しては、ハロゲンが好ましい。Ｘがハロゲンであ
る誘導体、すなわち１−ハロゲノ−２，４−ジニ
トロベンゼンが好ましいのは、一般に、オリゴヌ
クレオチドの塩基部分のアミノ基とは反応しない
で5′−末端延長上の一級アミノ基とのみ選択的に
反応し、しかも反応操作が簡便だからである。と
りわけ、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼ
ンは市販され容易に入手でき、穏かな反応条件で
化合物〔〕のアミノ基との反応が進行する。 １−ハロゲノ−２，４−ジニトロベンゼンと化
合物〔〕との反応は、両者の均一溶液中（溶媒
は、たとえば含水アルコール）あるいは不均一溶
液中（溶媒は、たとえば水）、ハロゲン化水素捕
捉剤（たとえば、炭酸水素ナトリウム、トリエチ
ルアミン、水酸化カリウム等）の存在下に、10〜
50℃程度の温度で実施することができる。目的生
成物は、たとえば抽出によつて回収すればよい。
なおDNP化に関しては、適当な総説、たとえば
「実験化学講座、蛋白質の化学、第118頁」
（1976年丸善(株)発行）等を参照することができる。 実験例 １ フローチヤート 第２図のフローチヤートに従つて、本発明化合
物（同図の化合物）を製造した。 第２図で、記号は次の意味を持つ。 Ｂ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン DMTr ジメトキシトリチル R0 オルトクロロフエニル Et エチル CE−シアノエチル ｍ ２ ｎ 12 ２ 化合物〔〕（第２図の）の合成 実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂〔〕
（樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目
的化合物は外観的には樹脂そのものと変らないの
で、樹脂に担持された当該化合物を以下において
単に樹脂と呼ぶことにする）300mg（0.033mmol）
をイソプロパノール−塩化メチレン（15：85、
Ｖ／Ｖ）溶液10mlで３回洗浄後、臭化亜鉛の
1.0Mのイソプロパノール−塩化メチレン溶液８
mlで５分間ずつ４回反応（脱トリチル化）させて
樹脂〔〕を得る。樹脂〔〕をイソプロパノー
ル−塩化メチレン溶液10mlで３回洗浄し、これに
ジヌクレオチド〔〕15mg（0.1mmol）のピリジ
ン溶液を添加後、共沸させて系を無水とし、メシ
チレンスルホニルニトロトリアゾリド（以下
MSNTと記す）150mg（0.5mmol）と無水ピリジ
ン２mlとを添加して90分間反応（縮合）させる。
反応後、ピリジン10mlで３回洗浄し、触媒量（約
10mg）のジメチルアミノピリジン（以下DMAP）
を含む無水酢酸−ピリジン（１：９、（Ｖ／Ｖ））
溶液10mlを添加し10分間反応させて未反応5′−水
酸基をアセチル化して保護し、これをピリジンで
洗浄して、化合物〔′〕（ｎ＝２）を得る。以上
のような操作を６回くり返して、化合物〔〕
（ｎ＝12）を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔〕
800mg（0.71mmol）とオルトクロロフエニルホス
ホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液
（1.0mmol、６ml）中で２時間反応させ、続いて
トリフルオロアセチル−６−アミノヘキサノール
300mg（1.4mmol）および１−メチル−イミダゾ
ール115mg（1.4mmol）を加えてさらに２時間反
応させる。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をク
ロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリン酸二水
素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および５％の塩化ナトリウム水溶液でそれぞ
れ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。クロ
ロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製
（溶出液として０〜４％のメタノール含有クロロ
ホルムを使用）し、溶出液を濃縮後ペンタン中に
滴下し粉末状の化合物〔〕を得る。 上記で合成した化合物〔〕（ｎ＝12）115mg、
（3.45μmol）を前述と同様の方法で脱トリチル化
したもの〔〕に、化合物〔〕60mg
（0.04mmol）をトリエチルアミン−ピリジン−水
（１：３：１、Ｖ／Ｖ）溶液３mlで処理（脱シア
ノエチル化）した化合物〔〕を加え、無水にし
たのち、MSNT50mg（0.2mmol）およびピリジ
ン１mlを加え90分間反応（縮合）させ、反応終了
後ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥し
て、完全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体
〔〕を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕15mgを0.5M
テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボ
アルドキシムのジオキサン−水（９：１、（Ｖ／
Ｖ）溶液200μ1を加え、遠沈管中、室温で24時間
反応させる。反応後、濃アンモニア水（2.5ml）
を加えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反応終
了後、過し、液を濃縮後、水に溶解させてか
らエーテルで抽出を行なう。水層を濃縮後、セフ
アデツクスＧ−50（φ1.5×120cm、溶出液は0.05M
の重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液PH7.5）
で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体〔〕
を得た。 また同様の方法で実験１−２、１−３および１
−４のようなオリゴヌクレオチド誘導体を得た。
以上で合成した化合物を第１表に示す。 【表】 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。 これら４種の化合物の高速液体クロマトグラフ
イーの結果を第３図に示す。Ａ〜Ｄは、それぞれ
実験１−１〜１−４の化合物についての図であ
る。 ３ ２，４−ジニトロフエニル−ペンタデカアデ
ニル酸〔〕の製造 実験２−１ 上記実験１−１で合成したペンタデカアデニル
酸誘導体〔〕約1.0ODを0.1M炭酸水素ナトリ
ウム水溶液（PH8.3）10μlに溶解し、１−フルオ
ロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液
（50mg／ml）5μl（大過剰）を加えて37℃で２時間
反応させた後、水30μlを加えエーテル150μlで４
回試薬の除去を行ない、２，４−ジニトロフエニ
ル−ペンタデカアデニル酸〔〕を得る。反応の
確認は、高速液体クロマトグラフイーにより行な
つた。 またその際、反応性の比較のため上記で合成し
たオリゴヌクレオチド〔〕を脱保護して得た
5′−水酸基をもつ化合物〔〕も同様に１−フル
オロ−２，４−ジニトロベンゼンと反応させる
（対照実験３−１）。 上記実験１−２、１−３および１−４で合成し
た化合物〔〕についても実験２−１と同様な操
作を行なつて各々について化合物〔〕を製造す
る。この実験をそれぞれ２−２、２−３、２−４
とする。また、反応の比較のため5′−水酸基をも
つ化合物〔〕をも製造し、化合物〔〕と１−
フルオロ−２，４−ジニトロ−ベンゼンとを各々
反応させる。このときの実験を各々実験３−２，
３−３および３−４とした。 実験２で製造した化合物および対照実験３を第
２表に示す。 【表】 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。 以上の結果を第４図（高速液体クロマトグラフ
イーの結果）に示す。 第４図は高速液体クロマトグラフイーの溶出パ
ターンを示すものである。図中、１は何れも反応
前の化合物そのもの、２は何れも化合物と１−フ
ルオロ−２，４−ジニトロベンゼンとを反応させ
たもの、のクロマトグラムである。イは実験３−
１で式〔〕である化合物、ロは実験２−１で式
〔〕である化合物、ハは実験３−２で式〔〕
である化合物、ニは実験２−２で式〔〕である
化合物、ホは実験３−２で式〔〕である化合
物、ヘは実験２−３で式〔〕である化合物、ト
は実験３−４で式〔〕である化合物、チは実験
２−３で式〔〕である化合物について上記のよ
うな操作を行なつた際のクロマトグラムを示す。
なおピーク上の数値は保持時間を示す。 これらの結果からみれば、式で示される5′−
水酸基をもつ化合物（第４図のイ−１、ハ−１、
ホ−１、およびト−１）は１−フルオロ−２，４
−ジニトロベンゼンと反応していないことがわか
る（第４図イ−２、ハ−２、ホ−２、およびト−
２）。 それに対してオリゴヌクレオチド誘導体〔〕
は１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンと反
応させると、高速液体クロマトグラフイーの溶出
パターンに変化が生じて、原料のピーク（第４図
ロ−１、ニ−１、ヘ−１およびチ−１）はなくな
つており、１−フルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼンと反応して新しい化合物（第４図ロ−２、ニ
−２、ヘ−２およびチ−２）ができていることが
わかる。 すなわち、一級アミノ基を有する化合物〔〕
は、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンと
選択的に反応し、5′−水酸基をもつ化合物〔〕
とは全く反応しないことがわかる。 なお、第４図の保持時間５分程度で各々溶出さ
れるピークは、２，４−ジニトロフエノールと考
えられる。 上記において、高速液体クロマトグラフイーは
日本分光HPLC System Tri−Roterを用い、
次の条件により測定を行なつた。 カラム：μ−Bondapak C18（Waters） 流速：２ml／分 溶出液：アセトニトリルを含む、20mM−
TEAA緩衝液（PH7.2） 濃度公配：アセトニトリルの濃度６〜14％／16
分（16分以後は14％を続ける）
第１図は、本発明の化合物を合成する方法の一
例を示すフローチヤートである。第２図は、実験
例で示した本発明化合物の製造法のフローチヤー
トである。第３図Ａ〜Ｄは、実験例で示した化合
物〔〕の高速液体クロマトグラフイーの結果を
示す図である。第４図は、高速液体クロマトグラ
フイーの溶出パターンを示す図である。
例を示すフローチヤートである。第２図は、実験
例で示した本発明化合物の製造法のフローチヤー
トである。第３図Ａ〜Ｄは、実験例で示した化合
物〔〕の高速液体クロマトグラフイーの結果を
示す図である。第４図は、高速液体クロマトグラ
フイーの溶出パターンを示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下式〔〕で示される２，４−ジニトロフエ
ニル−オリゴデオキシリボヌクレオチドであるこ
とを特徴とする、２，４−ジニトロフエニルヌク
レチオド誘導体。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意
の自然数であり、R1は２価の直鎖または分岐鎖
の炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチドを構成
する塩基である（Ｂが複数個存在するときは、そ
れらは同一でも異なつてもよい）。〕 ２ 塩基Ｂがアデニン、チミン、シトシンおよび
グアニンからなる群より選ばれたものである、特
許請求の範囲第１項記載の２，４−ジニトロフエ
ニルヌクレオチド誘導体。 ３ R1が炭素２〜20の直鎖または分岐鎖のアル
キレン基である、特許請求の範囲第１項または第
２項記載の２，４−ジニトロフエニルヌクレオチ
ド誘導体。 ４ ｍが０または６までの自然数、ｎが０または
40までの自然数である、特許請求の範囲第１〜３
項のいずれか一項に記載の２，４−ジニトロフエ
ニルヌクレオチド誘導体。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP7587883A JPS59204200A (ja) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
| US06/578,678 US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1984-02-09 | Oligonucleotide derivatives |
| EP84101392A EP0119448B1 (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
| DE8484101392T DE3463384D1 (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
| CA000447146A CA1212914A (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
| US06/855,710 US4849336A (en) | 1983-02-14 | 1986-04-25 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7587883A JPS59204200A (ja) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59204200A JPS59204200A (ja) | 1984-11-19 |
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Family
ID=13588975
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7587883A Granted JPS59204200A (ja) | 1983-02-14 | 1983-04-28 | ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59204200A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0972779A3 (en) * | 1987-10-28 | 2004-10-20 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates |
| TW200525026A (en) | 2003-12-25 | 2005-08-01 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
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1983
- 1983-04-28 JP JP7587883A patent/JPS59204200A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59204200A (ja) | 1984-11-19 |
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