JPH03502794A - ヒトレラキシン製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒ　　ト　　し　　ラ　　キ　　シ　　ン　製　開本発明は安定、均質、かつ生 物学的に活性なヒトレラキシン製剤および該製剤による哺乳類の治療法に関する 。

従来技術 成熟ヒトレラキシンは約６０００ダルトンの卵巣ホルモンペプチドであって、分 娩に先立って産道を再形成し、出産過程を容易にする働きがある［ハイソウ（Ｈ ｉｓａｖ、　Ｆ、　Ｌ、）、　　Ｐｒｏｓ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、、２３，６６１−６６３（１９２６）；シニワベら（Ｓ　ｃｈｗａｂｅ ＋Ｃ，）、　Ｂｉｏｃｂｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏａａ＋、、　、 ７５　：　５０３−５７０（１９７７）：ジェームズら（Ｊａｍｅｓ、Ｒ，）、 　Ｎａｔｕｒｅ、　　２６７　：　５４４−５４６（１９７７）］。このタンパ ク質は妊娠および出産期間中に必要な器官構造の変化をもたらすよう、標的器官 の結合組織の再構築を調節するようである。妊娠ホルモンとしてのレラキシンの 重要な役割には、未熟児出産の防止と分娩の際の子宮頚部の熟成が含まれる。

主として妊娠ホルモンであるが、レラ牛シンは非懐妊女性および男性にも検出さ れている［ブライアント−グリーンウッド（Ｂ　ｒｙａｎｔ：　４３−５２（１ ９８４）］。

レラキシンはブタ、ネズミ、ウマ、フカ、トラ、ラット、サメおよびヒトを含む 様々な種から精製されており、少なくとも１次または２次構造は、インシュリン およびインシュリン様成長ホルモンと相同（ホモロジー）であることが明らかに された。ヒトにおいては、レラ牛シンは妊婦の黄体（ＣＬ）に最も豊富に存在す る。

ブタレラキシン遺伝子から得たプローブを用いるゲノムクローニングによって２ 種類の形のヒト遺伝子が同定された［ハドソンら（Ｎ３−２３３９（１９８４） ］が、一方の遺伝子形（Ｎ２）のみがＣＬ内で転写されることが分かった。もう 一方の遺伝子が他の組織部位で発現されるか、またはそれが偽遺伝子であるのか は、明らかでない。

両ヒトレラキシン遺伝子は、互いに、ヌクレオチドおよびアミノ酸の相当な相同 性を示し、とりわけ、ＢおよびＣ両鏡がかなりの相同性を示した。しかしながら 、幾つかの注目すべき配列の分散があり、とりわけＡ鎖およびＢ鎖のアミノ末端 領域にみられ−る。

試験した全ての種に類似していることは、Ｎ２レラキシンの１次翻訳産物は２４ アミノ酸のシグナル配列、次いで、約２９アミノ酸からなるＢ鎖、１０４−１０ ７アミノ酸からなる結合組織、および約２４アミノ酸のＡ鎖からなるプレプロレ ラキシンであるということである。

卵巣でＮ２レラキシンが合成され、発現されるという事実はこれが妊娠の生理学 に関与する配列であることを示唆している。合成ヒトレラ牛シン（Ｎ２）および ある種のヒトレラキシン類似体の生物学的活性を試験し、その結果、生物学的な 活性に必要なレラキシンコア（核）、並びに生物学的活性に影響しない、アミノ 酸によるメチオニンの置換が明らかになった［ジョンストンら（Ｊｏｈｎｓｔｏ ｎ）、　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆ　ｕｎｃ ｔｉｏｎ、　　Ｐｒｏｃ、Ｎ１ｎｔｈ　Ａ＠ｅｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓ 　ｙｍｐｏｓｉｕｍ、デバーら（Ｄｅｂｅｒ、　Ｃ，Ｍ、）！、　（Ｐｉｅｒｃ ｅ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ。

１９８５）］。

静脈内および筋肉的投与を含む、ブタレラキシンを薬物として適用または導入す る様々な方法が発表された。バーノバーグ（Ｂｉｒｎｂｅｅｔ、　Ｇ　ｙｎ、　 、　ヱ↓：　１０３５−１０４８（１９５８）。さらに、ブタレラキシンは、ヒ トにおける臨床試行として、子宮頚部の熟成および出産の誘導のために局所的に 用いられている。マクレナンら（Ｍａｃ＆　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、　　５旦： ６０１−６０４（１９８１）；マクレナンら（ＭａｃＬｅｎｎａｎ）、　Ａｕ５ ｔ、ＮＺ　　Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎａｅｃ、、　　２旦＝６８−７１（１９ ８５）。これらの研究では蒸留水中のブタレラキシンを水溶性メチルセルロース 顆粒と混合して粘性のゲルを調製する。頚管のスコアを改善するには用量２ｍ９ で十分であった。マクレナン（１９８１、前掲）。

さらに、ブタレラキシンをポリエチレングリコール製ペレット内で成形し、ヒト 頚管の熟成に用いた。エバンスら（Ｅｖａｎｓ）、　Ａｍ、　Ｊ。

Ｏｂｓｔｅｔ、　Ｇ　ｙｎｅｃｏｌ、　、上４７：４１０−４１４（１９８３） 。また、滅菌に−Ｙゲルおよびりん酸緩衝化食塩水にブタレラキシンを懸濁して 製剤化し、滅菌した人工受精用ピペットで頚骨に注入した。３０００単位のレラ キシンの頚骨への注入から８時間以内に頚部の拡張が増大した。ブレズグラバス （Ｐ　ｅｒｅｚｇｒｏｖａｓ）およびアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、　　 Ｂｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　　２６　　：　　７ ６５−７７８（１９８２）。

欧州特許公開第８６．６４９（１９８３年８月２４日公開）にはブタプレブロレ ラキシン、ブタブロレラキシン、およびブタレラキシンの製造法が記載されてい る。オーストラリア特許第５６１，６７９（１９８７年８月２６日発行）、欧州 特許公開第８８，３７５（１９８３年１月５日公開）およびハーレー（Ｈａｌｅ ｙ）、　　ＤＮＡ、　　１　：　１５５−１６２（１９８２）にはブタレラキシ ンの製造法が記載されている。

欧州特許公開第１０１，３０９（１９８４年２月２２日公開）および米国特許第 ４，７５８，５１６（１９８８年７月１９日発行）の各々にはヒトＨルラキシン およびヒト上２レラキシンおよびその類似体をコードする遺伝子配列の分子クロ ーニングおよび特性が開示されている。欧州特許公開第２６０，１４９（１９８ ８年３月１６日公開）にはヒトブロレラキシンの製剤が開示されている。米国特 許第４．２８７．１０１（１９８１年５月１２日発行）には胎児膜からのヒトレ ラキシンの調製方法が開示されている。欧州特許公開第２５１゜６１５（１９８ ８年１月７日公開）には還元したヒトレラキシンＡ鎖またはその類似体と、還元 したヒトレラキシンＢ鎖またはその類似体とを、ｐＨ７，０以上のｐＨ等の条件 下で結合させる方法が開示されている。

胎児膜からのヒトレラキシンの調製は米国特許第４．　２６７、　１０１に開示 されでいる。シェアウッド（Ｓ　ｈｅｒｗｏｏｄ）は、「生殖の生理学（Ｔｈｅ 　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）ｊ（Ｋｎｏｂｉｌ およびＮｅｌｌｌ編。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　　１９８８．　５８５−６７ ３頁）の５８７頁で、レラキシンの抽出および単離はレラキシンが酸性溶媒中で 安定であるということを利用するものであると指摘°した。さらに、５８８頁で はレラキシンを強酸性媒質で抽出すると低ｐＨであることと、高分子量プロテア ーゼが沈澱するという２つの理由からレラキシンの分解（減成）が最小限になる と述べている。エルドリッジ（Ｅｌｄｒ　ｉｄｇｅ）およびフィールズ（Ｆ　１ ｅｌｄｓ）、　Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１上ユニ２５１２−２５１９（ １９８５）は等電点電気泳動でウサギレラキシンの等電点が約６．５であること を報告した。これは、フィールズら（Ｆｉｅｌｄｓ）、　Ａｎｎ、ＮＹ　Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、、　　３８０　：　７５（１９８２）が見い出した、より高いウサ ギレラキシンの等電点の値と対照的である。

さらに、米国特許２，９６４，４４８（１９６０年１２月１３日発行）は好まし くは低酸性の、レラキシンと脂肪酸のアルミニウム塩とを注射用オイル中に含有 する注射可能なレラキシン組成物を開示した。

本発明は生物学的に活性で、安定かつ均質な治療用のヒトレラキシン製剤、即ち 、局所または非経口投与用製剤を提供することを目的とするものである。本発明 はまた、長期間、液状で保存可能であって、投与前の貯蔵および運送が容易な製 剤を提供す°ることを目的とするものである。さらにまた本発明は、ヒトレラキ シンの凝集および分解を減じ、温度変化による分解に抵抗性を有するヒトレラキ シン製剤を提供することを目的とするものである。さらにまた本発明は、頚部投 与のためにヒトレラキシンゲル製剤を提供することを目的とするものである。さ らにまた本発明は、治療および生理学／化学的な利点が付加されたヒトレラキシ ン製剤を提供することを目的とするものである。

これらの、および他の目的は本明細書全体から明らかであろう。

Ｒ服五！旬 即ち、本発明は、哺乳類の生殖生理の調整に有用な、生物学的に活性な医薬組成 物であって、該組成物のｐＨを約４から約７以下、好ましくは４．５−５．５に 維持するバッファー中に治療有効量のヒトレラキシンを含有する組成物を提供す るものである。さらに、好ましくは、製剤は等優性である。

この組成物は液体、凍結乾燥品、凍結溶液、またはゲルの形状であってよい。組 成物がゲル形である場合、好ましくは水溶性多糖類（ポリサツカリド）またはポ リエチレングリコールを含有し、最も好ましくはメチルセルロースを含有スる。

本発明はまた、哺乳類の生殖生理の調整法であって、哺乳類に治療有効量本発明 組成物を投与することからなる方法を提供するものである。

本発明において初めて、ＨＰＬＣによる評価で、ヒトレラキシンの分解速度が酸 性条件下で最適レベルまで低下することが見いだされた。従って、製剤の免疫原 性が減少し、その安全性が改善され得る。この発見の結果、生物学的活性を保持 し、有効期間（シエルフライフ）が長く、凍結乾燥し、またはせずに治療用に投 与することができるヒトレラキシン製剤が調製された。好ましくは、５℃におけ る有効期限が少なくとも２年（ＨＰＬＣの主ピーク面積の１０％減少を許容減少 量としたとき）であるよう、約ｐＨ５でレラキシンを製剤化することが好ましい 。

図面の簡単な説明 図１ｇ−１ｅは５種類の異なる製剤（ｐＨ３からｐＨ７，５まで）に関する、３ 種の異なる温度でのＲＰ−ＨＰＬＣにおけるヒトレラキシンの主要ピークフラク ションを時間の関数として表したグラフである。

図２は３種の異なる温度においてＲＰ−ＨＰＬＣで測定した、ヒトレラキンン製 剤の分解速度を製剤のｐＨの関数として表したグラフである。

図３ａ−３ｅは５種類の異なる製剤（ｐＨ３からｐＨ７，５まで）に関する、３ 種の異なる温度でのＲＰ−ＨＰＬＣにおけるヒトレラキシンの活性を時間の関数 として表したグラフである。

図４は種々の安定化剤を添加したクエン酸製剤中の逆相ＨＰＬＣにおける主ピー クの２５℃での分解速度を表す棒グラフである。

図５は妊娠ウサギへの静脈内、皮下、および膣内投与後の短いレラキシンの血清 濃度対時間のグラフである。

図６は妊娠ウサギへのベンゾプルプリンの存在下、または非存在下での皮下投与 後における短いレラキシンの血清濃度対時間のグラ本明細書中、ヒトレラキシン とは、特異的なホルモン作用を示すタンパク質であって、それは人類および、お そらく他の哺乳類の生殖生理学の調整、例えば、妊娠の維持、分娩の有効化およ び精子運動を高めて受精を助ける等のホルモン作用（ただしこれらに限定されな い）を示すタンパク質を指す。そのような使用の具体例には、以下の妊娠に関連 した多くの生殖作用、並びに生物学的作用が含まれる。例えば恥骨結合または恥 骨靭帯への作用、およびコラーゲン性フィラメントの再配列によって分娩を有効 にする；子宮筋層の抑制；着床に先立つ子宮内膜の調製；黄体崩壊における役割 ；乳腺の成長および分化；精子運動性の増進；および可能な精子のヒト頚管通過 能力の増強。ヒトレラキシンまたはその変異体の機能性を、インビトロのバイオ アッセイでネズミの恥骨結合に正作用を示すか、子宮細胞系を用いるインビトロ アッセイでｃＡＭｐＨ度を増大するかについて調べた。本明細書中、医薬製剤の 定義において用いる“生物学的に活性”という語句は、上記のヒトレラキシシに 関する文脈で定義される。

ヒトレラキシンおよびその製造方法（組換え培養による合成をも含めて）は既知 である（例、欧州特許１０１，３０９および１１２，１４９、前掲）。

“レラキンン”という語句には、組換えまたは天然起源のレラ牛シン、並びにア ミノ酸配列変異体等のレラキシン変異体が包含される。

高゛速原子衝撃イオン化によるイオン化マススペクトルで黄体および血清中のレ ラキシンとして優勢なものはＢ鎖の先端が切断された形のＨ２レラキシン、即ち レラキンンＨ２（Ｂ２９Ａ２４）であり、Ｂ鎖のＣ末端４アミノ酸が存在しない のでＢ鎖が２９位のセリンで終わっているものであるということが分かった。こ の優勢な形のもの（本明細書中、３３アミノ酸残基からなるＢ鎖を含有する“長 しラキシン”に対して“短縮レラキシン”と称する）が、本発明において用いる のに好ましい。

また、本発明において“ヒトレラキシン”という語句は１またはそれ以上のアミ ノ酸残基の挿入、置換、または欠失、グリコジル化の変異体、非グリコジル化ヒ トレラキシン、有機または無機塩、共有結合を介し修飾されたヒトレラキシン、 ヒトプレブロレラ牛シン、およびヒトプロレラキシンを包含する。組換えＤＮＡ 法を用いて、既存のＤＮＡを変化させることで変異体を得ることができる。その ようなレラキシン分子の構造の変異または変化による変異体も、ヒトレラキンン の機能（生物学的）が維持されている限り、本発明の範囲に含まれる。そのよう な既述の生物学的作用を有するヒトレラキシン変異体は上記したインビトロアッ セイによって容易に同定される。

変異体は、１またはそれ以上の方法によって、選択した遺伝子の特定の部位（１ 以上）にアスパラギン酸をコードするコドンを導入するよう改変することにより 、レラキシンコード化配列から調製される。得られた変異体タンパク質を希酸で 処理して所望のタンパク質またはペプチドを遊離し、タンパク質が単離および精 製され易いようにする。

レラキシンはまた、レラキシン鎖とユビキチンとの融合タンパク質を生成させ、 ユビキチン加水分解酵素を用いてタンパク質を開裂することにより調製すること ができる。加えて、トランス活性化タンパク質をコードするベクター用い、プロ レラキシンのための酵母発現系を利用して得ることもできる。

本発明のレラ牛シンは欧州特許２５１，６１５（１９８８年１月７日公開）記載 のごとくＡ鎖およびＢ鎖を合成し、精製し、結合させることにより生成される。

合成レラキシンについては、一般にＡ鎖とＢ鎖を４：１のモル比で用いる。得ら れた生成物を、次いで、逆相ＨＰＬｃ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ 過、透析等の既知の方法、またはそれらの任意の組み合わせからなる方法で精製 する。

組成物として製剤化する上で有効なレラキシンの量は治療の具体的な状況、患者 の病歴、治療経路、および投与計画等、幾つかの変数に基づいて決定される。治 療対象となる状況には、妊娠期間末期の出産困難、および未熟児出産の防止が含 まれ、さらに強皮症のようなある種の結合組織異常の治療が含まれる。治療経路 には例えば、皮下、腹腔内、静脈内、および筋肉内投与等の非経口投与が含まれ る。

現在、問題のある妊娠の治療に用いられている平均用量は通常の臨床医ならばよ く知っている様々な指標、例えば投与経路、投与計画、妊娠期間、レラキシンの 型、治療される患者の状態、組成物の形状、その他、医師にとって既知の勘案す べき条件に基づいて変化される。例えば、臨床での局所投与の有効量はヒトレラ 牛シン約１〜３ｍｇを含有するゲルを約５〜１０Ｉｌｌ１２用いることが適当で ある。産道の調製等、生殖機能のへの作用の場合、静脈投与の平均用量は約０． １μ９７ｋｇから約１５００ｍ？／ｋｇの範囲である。

製剤のｐＨは約４から約７以下、好ましくは約４．５〜５．５、最も好ましくは 約５とする。至適ｐＨはまた製剤のイオン強度および保存温度に依存する。製剤 は等優性であることが好ましく、製剤のイオン強度は少なくとも約０．１μ、よ り好ましくは０．１〜０．２μ、最も好ましくは、約０．１５μであり、製剤の 浸透圧は好ましくは約２００〜３００　ｍｍｏｌ／ｋＸｓより好ましくは２４０ 〜２６０ａ＋ｍｏ１／ｋｇである。保存温度が約２５℃であれば、ｐＨは約４〜 ５であることが好ましい。

所望の範囲にｐＨを維持し得るバッファーを用いて本発明の製剤のｐＨを維持す ることが好ましい。特定のバッフ１−を用いることができるか否かはバッファー の能力、より詳細にはそのｐＫ値に依存する。例として、ある種の有機酸バッフ ァーおよびヒスチジンが含まれる。適当な有機酸バッファー（有機酸とその塩の バッファー）には、例えば、クエン酸（塩）バッファー類（例、クエン酸−ナト リウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物 、クエン酸−クエン酸−ナトリウム混合物）、コハク酸（塩）バッファー類（例 、フハク―−コハク酸−ナトリウム混合物、コハク酸〜水酸化ナトリウム混合物 、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物）、酒石酸（塩）バッファー（例、酒 石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−水酸 化ナトリウム混合物）、マレイン酸（塩）バッファー、グルコン酸（塩）バッフ ァー（グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウ ム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物）、ホウ酸（塩）バッファー 、イミダゾールバッファー、乳酸（塩）バッファー（乳酸−乳酸ナトリウム混合 物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物）および酢酸（ 塩）バッファー（酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物 ）が含まれる。

本発明にとって最も好ましいバッファーはクエン酸バッファーおよび酢酸バッフ ァーであり、なかでもクエン酸バッファーが最も好ましい。注目すべきことは、 従来用いられているりん酸バッファーやＴｒｉｓバッファーでは製剤のｐＨを所 望のレベルに維持することができないということである。

本発明の製剤は非経口投与、とりわけ静脈投与に有用なように適当な等優性およ び浸透圧を有することが好ましい。もしもイオン強度および浸透圧が上記の好ま しい範囲になければ、浸透圧を調節する試薬を製剤に添加し、上記範囲内に調節 することが望ましい。そのような試薬には、例えば、塩化ナトリウムおよび塩化 カリウム、臭化マグネシウム等のハロゲンのアルカリ金属塩およびアルカリ土類 金属塩、並びにマンニトールのような中性多価糖アルコールがある。最も好まし い試薬は塩化ナトリウムである。

製剤の安定化および凍結乾燥のために、薬学的に許容される物質を製剤に加えて も良い。例えば、３価またはそれ以上の多価糖アルコール、好ましくはグリセリ ン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、アラビトー ル、およびマンニトール、並びにエタノールおよびプロピレングリコール等の直 鎖アルコールが含まれる。これらの物質は単独で、もしくは混合物として用いる ことができる。好ましくは、他の成分を考慮して、これらの物質を約１〜２５　 ｖ／　ｗ％、より好ましくは２〜Ｌｏｗ／ｖ％用いる。

さらに、本発明の組成物は、それが局所適用されるものである場合、子宮頚部ま たは膣からの吸収を促進する物質を含有することが好ましい。そのような吸収促 進剤の例として以下のものを挙げることができる。コレステロールと類似構造を 有する分子、例えば、グリココール酸ナトリウム等のグリココール酸の塩、コー ル酸ナトリウム等のコール酸の塩、２４．２５−タウロジヒドロフシデート等の フシジン酸の塩、およびエステル等の誘導体；非イオン性表面活性剤；オレイン 酸等の約７〜２５炭素原子からなる脂肪酸誘導体；ナイアシンアミド：ニコチン 酸またはサリチル酸、またはその塩またはエステル；およびアゾン類。

本明細書中、好ましい液状組成物は、全イオン強度が約０．１５μとなるように 塩化ナトリウムを含有し、適当な浸透圧を示す、クエン酸バッファー（ｐＨ５） 中ヒトレラキシン含有組成物である。

本発明の製剤は液体、凍結品、またはゲル状、あるいは凍結乾燥され再構築され るものであってよい。当業者ならば、他の添加物、例えば最適な凍結乾燥に必要 な糖アルコールなどのタイプおよび量を決定することができる。そのような好ま しい添加物の１つはマンニトールである。本発明の製剤は長期間安定で種々の温 度で液体状態のまま保存できる。本発明製剤をプラスチックでなくガラス容器内 に保存することが好ましい。また、本発明製剤は凍結、解凍、再　　゛凍結、再 解凍してもなんら悪影響はない。好ましい貯蔵温度は一２０〜３０℃であり、最 も好ましい貯蔵温度は約２〜８℃である。液状の本発明製剤の生物学的活性は少 なくとも３０日間維持され、生理学的安定性は１年間の結果から外挿して少なく とも２年間である。

ゲル製剤を得るためには、通常、液状組成物を有効量の水溶性多糖類またはポリ エチレングリコール“と混合して局所適用に適した粘度のゲルをＭｌする。多糖 類には、例えば以下のものが含まれる。

メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース 、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース 等の、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒド ロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース等のセルロース誘導体； デンプンおよび粉砕デンプン；寒天；アルギン酸およびアルギネート；アラビア ゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；デキストラン；デキストリン；フル クタン；イヌリン：マンナン；キシラン：アラビナン；チトサン；グリコーゲン ；グルカン；および合成バイオポリマー：並びにゴム類、例えばキサンタンゴム ；グアゴム；ローカストビーンゴム；アラビアゴム；トラガカントゴム：カラヤ ゴム；およびそれらの誘導体および混合物。本発明にとって好ましいゲル化剤は 生物学的な系で不活性であって、無毒、調製が容易であり極端な流動性や粘性を 示さず、その中に含有するレラキシンの安定性を損なわない物質である。

好ましくは多糖類がエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは、十分に規定 され、精製された米国特許に記載の、メチルセルロースおよびヒドロキシアルキ ルセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチル セルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースである。本発明にとっ て最も好ましいものはメチルセルロースである。

ゲル化に有用なポリエチレングリコールは通常、適当な粘度を得るための低分子 量および高分子量ポリエチレングリコールである。

例えば、分子量４００−６００のポリエチレングリコールと分子量１５００のポ リエチレングリコール−個の、ペーストを得るのに適当な比率の混合物が本目的 に適する。

多糖類およびポリエチレングリコールに関して“水溶性”という語句は、コロイ ド溶液および分散液を含む。一般に、セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の 置換率により決定され、本発明にとって有用な安定化誘導体は誘導体が水溶性に なるよう、セルロース鎖のアンヒドログルコース単位あたり十分な数のエーテル 基を含有している必要がある。エーテル置換率はアンヒドログルコース単位あた り少な（とも０．３５個のエーテル基で十分である。さらに、セルロース誘導体 はアルカリ金属の塩、例えばＬｉ、Ｎａ、ＫまたはＣｓの塩であってもよい。

ゲルにメチルセルロースを用いる場合、そのゲル中濃度は約２−５％であり、レ ラ牛シンのゲル中濃度は約１００−１０００μ９／−であることが好ましい。さ らに好ましくは、メチルセルロースのゲル中含有量が約３％であって、レラキシ ン濃度が約３００−１０００μ９／−である。

また、光感受性のゲル製剤の場合、抗酸化剤、即ち、好ましくはアスコルビン酸 （好ましくは少なくとも０．５％）、および／または補助溶媒、好ましくはグリ セロールおよび／またはエタノール（好ましくは約２０％）、最も好ましくはグ リセロール等、ゲルが光に暴露されたとき、該ゲルの光酸化を防止する１または それ以上の物質を含有させる。例えば、メチルセルロースゲルをホイルで覆って 、または着色ビンに入れて保存し、光の侵入を阻止する。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明するが、これらの実施例は本発明の範 囲を限定するものではない。

実施例１ ヒトレラキシン安定性の研究はｐＨ３から１０までの数個の１０ａ＋Ｍバッファ ーを用いて行った（研究１）。製剤の安定性に及ぼすイオン強度の増大による影 響も調べた（研究２）。

試料の調製 研究１および２のために、ヒト長しラキシン（３３アミノ酸のＢ鎖を有するＨ２ 型）を、固相合成法［バラニー（Ｂａｒａｎｙ、Ｇ、）およびメリーフィールド （Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ら、　　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　　２　＋　１ −２８４、グロス（Ｇ　ｒｏｓｓ、　Ｅ　、）およびメイエンホーフｙ　−（Ｍ ｅｉｅｎｈｏｆｅｒ。

Ｊ、）ら＆ｉ、　　Ａｃａｄｉｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８ ０’）コによってＡおよびＢ鎖を合成することにより得た（欧州特許１１２．１ ４９（前掲）に開示）。鎖をＨＰＬＣ精製しくトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／酢 酸グラジェント）、Ａ：Ｂ鎖を重量比４：ＩＴ混合し、０．２−ＩＭＣＡＰＳバ 、ファー（３−［シクロへキシルアミノ」プロパンスルポン酸、Ｃａｌｂｉｏｃ ｈｅｒ５）、０．７５Ｍ　　グアニジン塩酸塩、１０％（ｖ／ｖ）メタ／−ル（ ＢｕｒｄｉｃｋおよびＪ　ａｃｋｓｏｎ）中、ｐＨ約１０．２において、全タン パク質量０．２５〜２．０ｍ９／ｍ１２で結合させた。溶液を完全に７索洗浄し 、２０’Ｃで一夜（１２−１８時間）撹拌した。次いで試料を適当なバッファー （りん酸緩衝化食塩水、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０ｓまたは０．１％酢酸）に対 して透析し、Ｖｙｄａｃ　Ｃ−４ＨＰＬＣカラムに適用し、ＴＦＡ／アセトニト リルグラジェントで溶離した。ＨＰＬＣのレラ牛シンフラクションを同定し、Ｔ ＦＡバッファーに採取し、試料から減圧下に除去した。このようにして得たレラ キシンを凍結乾燥した。

長しラキシンを、研究１には１２４ｍ９（ペプチドの約８０重量％）、研究２に は２０＋＋＋９（ペプチドの約６７重量％）用いた。いずれの試料もトリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）を１５重量％含有する白色の凍結乾燥粉末である。十分量のＭ ｉｌｌｉ−Ｑ水（活性炭およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｉ　ｎｃ。

供給のイオン交換からなる水精製系を通しておいた脱イオン水）を加えてペプチ ド濃度を、約１ｍ９／−とした。

Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の長しラキシンを５℃でＳ　ｐｅｃｔｒａｐｏｒ　７　（分 子量限界３５００）透析チュービングを用いて透析することにより適当な製剤系 バッファーに入れた。このチュービングをβ−メルカプトエタノール１ｍ１２． 　ＥＤＴＡ　　３．３６ｇ、およびＮａＨＣＯ＊　４．２９を含有するＭｉｌｌ ｉ　　Ｑ水２ａ中で洗浄し、次いで６０〜７０°Ｃで４回、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に より洗浄した。チュービングを５０％ｈ／　ｖ）　ｘ　９　／−ル中、５°Ｃで 保存し透析前に十分に洗浄した。

透析直後の全試料の濃度を、メチオニン残基がリジン残基で置換されているレラ キシン類似体の定量アミノ酸分析で得た値の吸光係数２．１８（ｍｌ？／ｍｆ） −’ａｍ−’を用いて紫外吸収スペクトル測定により求め、濃度を光散乱効果に 関して補正した。各試料を層流フード中、０、２　ｔｔ　Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ− ４（０，０１平方インチの面積）フィルターを通して滅菌ろ過し、テフロンを張 ったネジ式のフタのついた滅菌ホウケイ酸ガラスビン（Ｗｈｅａｔｏｎ、　　１ ００　ｕ（１，３ｏｏμＱおよび１．５−）に入れ、５．２５および３０℃にお いて保存した。別の１　ｍｇ／ｄで行った実験におけるろ過ではタンパク質濃度 の有意な低下を認めなかったことから、１度は何がビンにろ過されたかというこ とを正確に示唆している。

研究１では、誤差評価を得るとともに、同一ビンからの繰り返し試料採取によっ て、不純物が混入されるか否かを決定するために各バッファーについて３重反復 試験用のビンをそれぞれの温度で貯蔵した。

研究３ではレラキシンＨ２（Ｂ３３　Ａ２４）ＡＰｙｒｏ−Ｇｌｕ’を用いた。

ここにＨ２はヒト卵巣で発現されたヒト遺伝子を指し、ＡおよびＢはヒトレラキ シンのそれぞれの鎖を指し、ＡまたはＢの後方の数字は鎖の長さ、即ち、Ａ鎖ま たはＢ鎖を構成するアミノ酸の数を指し、アミノ酸の前方の下付き文字はアミノ 酸が位置するＡまたはＢ鎖、アミノ酸後方の上付き文字は鎖中の位置を表してい る。こや類似体の調製および鎖の組換えは欧州特許公開第２５１，６１５（前掲 ）に記載されている。タンパク質を上記研究１および２に記載した方法で精製し た。

約４．６５ｍｇ／貢ｇのヒトピログル（ｐｙｒｏｇｌｕ）レラキシン約３６１１ １ｃを上記のごと＜１０ｍＭクエン酸（ｐＨ５）で製剤化し、ＮａＣ１を加えて 等優性にした。このタンパク質を１ｍｇ／ｘｆｆ（吸光度係数２．１８を使用し 、分光光度計で測定）に希釈した。各製剤、合計１．４ｍ１２を層流フード内で テフロンストッパー付きのオートクレーヴ処理した１、５−のガラスビンに滅菌 ろ過して入れた。凍結および解凍による影響を調べる実験では、タンパク質を２ 　ｚｇ／　ｘ（ｌに希釈し、凍結し、次いで、実験を行った。

安定性実験法 研究１：約１　ｘｇ／　ｘ（ｌの水中長しラキシン各２０３ＩＣを透析によって 、クエン酸バッファー成分がｐＨ５，０を与えるという計算に基いて、表Ｉ記載 の正確な成分を有する以下の各バッファー：１０ｍＭグリノン（ｐＨ３）、１０ ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５）、１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）、１０ｍＭヒスチジン（ ｐＨ８）および１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐ）（７，５）の各バッファーに交換した 。全バッファーにＮａＣｊを加えて等優性（０，１５４μ）に調節した。前記の ごとくにして濃度を決定し、試料を滅菌ろ過し、表■記載の手順に従ってビレに 詰めた。得られた１３５個の１００μＣ′Ｉ＆量（マイクロ）バイアルと９０個 の１．５Ｒ（バイアルを安定性試験のために５．２５および４０’Ｃに放置した 。試料を、０．７．２１および３０日ロー逆相ＨＰＬＣ，ＥＬＩＳＡ、およびサ イクリックＡＭＰアッセイで分析した。これらのアッセイに加えて、Ｏおよび３ ０日ロー試料を近紫外円２色性（近ＵＶ　ＣＤ）および分析的超遠心（ＵＣ）で も分析した。さらに、クエン酸塩製剤を５°ＣにおいてＲＰ−ＨＰＬＣで５箇月 間、−２０°ＣにおいてＲＰ−ＨＰＬＣで６０日間分析した。

研究２：約１ｘｇ／ｘＱの水中長しラキシン各１ｘ（ｌを透析によって、それぞ れｐＨ５の１０ｍＭ酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩バッファーであって、塩魚 添加、０．ＩＭ　ＮａＣＱ、および０，５Ｎ　ＮａＣｆ２含有バツフアー（バッ ファー組成は表Ｉに記載）に移した。得られた９個の試料をそれぞれ滅菌ろ過し 、等容量に３分割し、滅菌した３００ｇｇのガラス製マイクロバイアルに充填し た。得られた、約９ｘｇを含有する２７個のバイアルを安定性試験のために５． ２５および４０℃で４０日間放置した。０，７．１４．２８および４０日ロー試 料をＥＬｒＳＡ分析およびＣ４逆相ＨＰＬＣで分析した。残った３１１ｇのレラ キシンをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に５℃で保存し、比較物質として用いた。研究１およ び以後の安定性試験の結果、この水中レラキシンが、５°Ｃで少なくとも５箇月 間安定であることが逆相ＨＰＬＣで示された。これらの観察は、以後の安定性研 究に用いた比較試料に関しても繰り返された。

表■ プロトタイブレラキシン液状製剤（１、０ｘｇ／　ｘＱ）研究１のための製剤 製　　剤　　　　　　　　　　　　組　　成／酎１０ｍＭグリシン０．７４ｔｇ グ！／　シフ　−ＨＣ＆（６，６６ｓ＋Ｍ）ｐＨ３，００，２５ｍｇグリシン（ ３４４ｍＭ）８．８７ｔｇ　ＮａＣ１２（０，１５２Ｍ）１ｈＭ酢酸塩　　　　 ０．２５ｍｇ酢酸ナトリウム（２，９６ｍＭ）ｐＨ５，０７、ＯｕＬ　１．０ｋ ｌ酢酸（７，０４ｍＭ）１６０ｘｇ　Ｎ　ａＣ（１（０，１４７Ｍ）１０ｍＭク エン酸塩　　０．６９ｍｇクエン酸−水和物（３，３＋＋＋Ｍ）ｐＨ５，０１， ９７＋ｙｇクエン酸ナトリウムニ水和物（６，７ｎＭ）７、２５ｘｇ　Ｎ　ａＣ １２（０，１２４Ｍ）１０ａ＋Ｍ　ヒスチジン　　１．１２１１ｇヒスチジン− ＨＣ（！（５，３２＋＋＋Ｍ）ｐＨ６，０Ｏ，７３ｍｇヒスチジン（４，６８ｍ Ｍ）８、６６ｘｇ　Ｎ　ａＣｆｆ（０，１４８Ｍ）１０ａＭ　　）リス１．３２ ｍｇ　）リス−ＨＣｅ（１３６ｍＭ）ＰＨ７，５０，２０ｘｇ　トリス塩基（１ ，６４ｍＭ）８．５２ｘｇ　Ｎ　ａＣＣ（０，１４６Ｍ）＊金製剤は等優性（０ ，１５４μ、他のイオン強度はＮａＣｌ２を添加して調節）である。

研究２のための製剤 １０ｍＭ酢酸塩　　　　０．５４ｘｇ酢酸ナトリウム（３，４２ｍＭ）ｐＨ５， ０３，４２μＬ　１．０Ｍ酢酸（６，５１１ｔｍＭ）１０ａ＋Ｍ　コハク酸塩　 　０．５１ｘｇコハク酸（４，２５ｍＭ）ｐＨ５，０１，５５ｘｇフハク酸二ナ トリウム・６水和物（５，７５ｓＭ）１０ｍＭクエン酸塩　　０．５３ｍｇクエ ン酸（２，７１１１ｍＭ）ｐＨ５，０２，１２ｘｇクエン酸ナトリウムニ水和物 （７，２２Ｍ）全ての３バツフｙ　−＋　Ｏ，１Ｍ　ＮａＣｌ２　　　５，８４ ｘｇ　Ｎａ（Ｊ！全ての３バツフｙ　−＋　０．５Ｍ　’ＮａＣｌ２　　　２９ ．２２ｘｇ　ＮａＣｌ２表■ シラキシン安定性研究１の各アッセイにおいて、バイアルあたり必要な製剤量（ μＩ２）時間　　　　　ＥＬＩＳＡ　　　　　ＵＶ　　　　ＨＰＬＣｆイクリ７ ９ＡＭＰ　　　　近　ＵＶＣＤ　　　　　ＵＣＯ（日）　　　　１０　　　１０ ０　　１０　　　　１０　　　　　　５００　　　５０７（日）　　　　１０　 　　−−−　　１０　　　　１０　　　　　　−−−　　　−−１４（日）　　 　　１０　　　−−−　　１０　　　　１０　　　　　　−−−　　　−−２１ （日）　　　　１０　　　−−−　　１０　　　　１０　　　　　　−−−　　 　−−１（月）１０　　　１００　　　ｔｏ　　　　　１０　　　　　　５００ 　　　５０２（月）　　　　１０　　　１００　　１０　　　　１０　　　　　 　５００　　　　５０３（月）　　　　１０　　　１００　　１０　　　　１０ 　　　　　　５００　　　５０４（月）　　　　１０　　　１００　　１０　　 　　１０　　　　　　５００　　　　５０５（月）　　　　１０　　　１００　 　１０　　　　１０　　　　　　５００　　　　５０６（月）　　　　１０　　 　　ｉｏｏ　　　１０　　　　１０　　　　　　５００　　　　５０７．１４お よび２１日口のＥＬ　Ｉ　ＳＡ、ＨＰＬＣおよびサイクリックＡＭＰアッセイの ための製剤化タンパク質１００１１１２を１００μｇの滅菌マイクロバイアルに 入れた（３バイアル／アッセイＸ５製剤×３温度＝４５バイアル）。１．２およ び３箇月用試料も同様にしてグループ分けしく４５バイアル）、さらに４．５お よび６箇月試料も同様に４５バイアルにグループ分けした。合計１３５個の１０ ０μｇバイアルがこれら３種のアッセイ用に得られた。残る製剤化タンパク質を 各１．５ｘＱバイアルに、ＣＤ、ＵＶおよびＵＣアッセイにとって十分な量であ る０、９ｚＱづつ入れた。この結果、９０個の１．５１１＋！バイアルが得られ た（５製剤×３温度×６回の測定時間（タイムポイント））。

研究３：評価すべきレラキシン類似体製剤は以下の通りである。

１、ＮａＣ（！で等優性にした１０１Ｍクエン酸バッファー。

２、　　ＮａＣｌ２で等優性にした１０ｍＭクエン酸バッファーであって調製し たばかりの等強性クエン酸バッファーに対して透析したもの（これは対照となる ）。

３．１０ｍＭクエン酸バッファー、５．０７％マンニトール（ＮａＣ１２不含） に対して透析した、マンニトール（５，０７％）で等優性にした１０＋＊Ｍクエ ン酸バッファー。

４．５％無水エタノールを添加した、ＮａＣ＆で等優性にした１０１１１Ｍクエ ン酸バ・ノファー。

５．１０％無水エタノールを添加した、ＮａＣＱで等優性にした２０＋ａＭクエ ン酸バブファー。

６．５％グリセロールを添加した、ＮａＣＱで等優性にした１０ｍＭクエン酸バ ッファー。

７．１０％グリセロールを添加した、ＮａＣｌ２で等優性にした１０輪Ｍクエン 酸バッファー。

８．５％プロピレングリコールを添加した、ＮａＣ（ｌで等優性にしたｌＯａ＋ Ｍクエン酸バッファー。

９．１０％プロピレングリコールを添加した、ＮａＣρで等優性にした１０ｍＭ クエン酸バッファー。

１０．０．０２％ＥＤＴＡにナトリウム塩）を添加した、ＮａＣｇで等優性にし た１０ａ＋Ｍクエン酸バッファー。

１１．５％マンニトールを添加した、ＮａＣ（ｌで等優性にした１０ｏＭクエン 酸バッファー。

これらの製剤を３重反復実験（トリプリケート）のために５．２５および４０℃ に置いた。

さらに、元の等優性（ＮａＣのクエン酸バッファー中２　ｘｇ／　ｘ（ｌのレラ キシン１１１２を２７個の１．５．ｗＩ２バイアルに滅菌充填し、−２０℃で凍 結した。０および３日目にバイアルを解凍し、分析した。以後の日には３個のバ イアルを解凍し、分析した。

分析法 ＨＰＬＣ分析：　Ｖ　ＹｄａｃＴ′４Ｃ４逆相カラムを用い、以下のカラム条件 下でクロマトグラムを得た。流速１　ｘ（１重分。溶液Ａ　：　０．１％ＴＦＡ 、溶液Ｂ　：　０．１％ＴＦＡ、９０％アセトニトリル、２重％Ａから５０％Ｂ までのグラジェント（１％／分）。

研究１では、クロマトグラムの全面積は測定誤差の範囲内で一定であった。即ち 、主ピークの面積の減少は副ピークの面積増大によるものであった。続＜ＨＰＬ Ｃカラムの再生によって大多数のレラキシンがグラジェント条件下で溶離するこ とが分かった。この挙動はＨＰＬＣ分析で決定された全面積が時間に対して一定 でない、研究２の観察結果と対照的であった。物質がより高度に精製されると、 ＨＰＬＣ測定による安定性も改善された。

ＥＬＩＳＡ分析二標分析線標準曲線分の中央に予測濃度が達するよう、試料をＥ ＬＩＳＡアッセイ用に希釈した。ＥＬＩＳＡアッセイのための１次抗体はアフィ ニティー精製した、ヒトレラキシンＡ鎖が鎖の１位にｐｙｒｏ−Ｇｌｕを有して いる合成ヒトレラキシンペプチドに対して惹起されたウサギポリクローナル抗体 である。

ＥＬＩＳＡ法で測定した濃度を、安定性試料と一緒に用いた比較試料によって標 準化した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって測定した値は通常ＵＶスペクトル測定に基（ 予測値よりも大きかったが、標準化の後には予測値よりも２０％低かった。研究 １では、３個のバイアルの各々から得た試料を希釈することにより、各タイムポ イントに３重反復試験試料を充当した。

サイクリックＡＭＰアッセイ：試料を細胞アッセイバッファー中で希釈しアカゲ ザルの子宮細胞と一緒にインキコベートした。得られた細胞懸濁液をデュポン・ ドウ・ネムア（Ｄｕｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ＋Ｉ　ｎｃ、、　Ｗｉｌｍ ｉｎｇｔｏｎ、　Ｄｅｌ、）供給のアッセイ法を用い、サイクリックＡＭＰに関 して分析した。サイクリックＡＭＰ濃度をレラキシンａ度と関連付けるために標 準曲線を作成した。この濃度は“免疫反応性濃度”測定にがかるＥＬＩＳＡのそ れに対して、理論的には“生物活性”濃度である。既知連間の比較試料を安定性 試料と一緒に用い、レラキシン濃度測定値を標準化した。

マウス恥骨結合アノセイ：ネズミ恥骨結合靭帯のインビボバイオアッセイによっ てレラキシンの結合相識再形成作用を測定した。スタイネノツら（Ｓ　ｔｅｉｎ ｅｔｚ、　Ｂ、　Ｇ、）、　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　　６７　：　１ ０２（１９６０）。

近ＵＶ円２色性：　Ａｖｉｖ”改良Ｃａｒｙ６０分光偏光計を用い、約１ｘｇ／ ｘＱのレラキシン試料を透析液で１・１希釈し０．５ｃｍ光路長で、恒温に維持 した円筒キュベツト中、２０’Ｃで３２０〜２４０１１１においてスペクトラム を得た。ＣＤデータを得た後、試料をＣＤセルから出しりん酸緩衝化食塩水中で ５倍希釈した。次いで、以前と同様にＵＶ分光光度計を用いて濃度測定を行った 。楕円偏光のＣＤシグナル（ミリ度）をアドラーら［Ａｄ］ｅｒ、　Ｍｅｔｈ、 　Ｅｎｚｙｍ、＋　　２７　＋　６７５（１９７３）］の方法で、ヒトレラキシ ンの平均残基を１１２．９９として、平均残基重量楕円偏光（ｍｅａｎ　ｒｅｓ ｉｄｕｅ　ｗｅｉｇｈｔ　ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）に変換した。

分析的超遠心分Ｎ：レラキシン安定性試料を適当な透析液で４倍希釈し、ダブル セクター超遠心セルに入れ、それをＡｎ−Ｆ４ホール分析用ローターに入れた。

遠心分離はＢ　ｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　Ｅ分析的超遠心機を用い、３２．　 ＯＯＯｒｐｍで２０’Ｃにおいて１８時間行った。

別の実験で、沈降平衡に達するのに１８時間で十分であることが分かった。セル 内の濃度グラジェントは光電光学スキャナーを用い、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸 収によって決定した。曲線トレースを、ＭａｃｉｎｔｉｚｅｒＴＮトレーシング パッドを用い、マノキントッンユのコンピューターに入力した。以下の等式（Ｔ ｅｌｌｅｒ、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、　　２７　：　３４６（１９７２）） を用い、重量平均分子量をセル内の濃度勾配と関連させた。

Ｍｖ−２ＲＴ／　［ｖ’（１−ｖｐ）］ｄｉｎｅ／　ｄｒ”ここに、Ｍｙは重量 平均分子量、Ｔは温度、Ｒは気体常数、Ｗはラジアンで表した角速度、■はタン パク質の部分比容、ｐは溶液の密度、Ｃはタンパク質濃度、ｒは回転中心からの 放射距離を表す。この等式は理想的な溶液を想定したものであり、選択したバッ ファー条件はレラキシン沈降に適当と思われる。ｉｎｃ対ｒ！の最小２乗回帰分 析で、セル内の濃度域の平均値として、重量平均分子量を得た。このデータも３ 次多項式でならし、遠心セル内で測定した各濃度についてｄｌｎｃ／ｄｒ”値を 求めた。レラキシンに関する部分比容０．７３１　ｘＱ１９をコーンおよびニド サル［Ｃｏｈｏｎ　＆　Ｅｄｓａｌｌ、　”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｎ＋ｉｎ。

Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ｉ　ｏｎｓ　ａｎｄ　Ｄｉｐｏ ｌａｒ　Ｉ　ｏｎｓ″、　（Ｈａｆｎｅｒ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９６５）１５ ７−４７５頁］の方法に従い、個々のアミノ酸残基の値を用い、アミノ酸組成に ついて計算した。

結果 研究１ニレラキシンの分解を時間の関数として逆相ＨＰＬＣでモニターした。全 ＨＰＬＣピーク面積は時間を通して一定であり、全面積の割合（％）を用いてレ ラキシン分解速度を調べた。残存する主ピークのフラクションを３重反復試験試 料から計算しく可能な場合）、表Ｉ記載の５製剤（３，０から７．５まで）につ いてＨＰＬＣ主ピークの分解速度の１次プロ／トを求めた。反応速度を逆相ＨＰ ＬＣにおけるレラキシン主ピークの消滅速度測定によって追跡した。図１８−１ ｅはこれら３種の温度における５種の製剤に関するＨＰＬＣ主ピーク対時間グラ フを示し、分解速度を表している。図１８は１Ｏ寓Ｍグリシン（ｐＨ３，０）中 レラキシン、図１ｂは１０ａ＋Ｍクエン酸塩（ｐＨ５，０）中レラキシン、図１ ｃは１０ｎＭヒスチジン（ｐＨ８，０）中レラキシン、図１ｄは１０ｍＭ酢酸塩 （ｐＨ５，０）中レラキシン、図１ｅｉｔ　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５） 中レラキシンを表す。各グラフにおいて、三角は５°Ｃ１円は２５℃、四角は４ ０℃を表す。これらの図はレラキシン分解速度が１次反応速度分析によって解析 し得ることを意味している。図２は５種類の製剤の、５°Ｃ（白色方形）、２５ °Ｃ（ひし形）および４０℃（黒色方形）における、ｐＨに対する主ピークの分 解を求めた１次反応速度定数をプロットした図である。図２のデータはヒトレラ キシンがｐＨ約４から６で安定であり、特にｐＨ５で最も安定であることを示し ている。

研究２：フハク酸、酢酸およびクエン酸製剤中のレラキシンの安定性は、ＲＰ− ＨＰＬＣおよびＥＬＴＳＡで測定した場合、０．０Ｍ、０．１Ｍおよび０．５Ｍ のＮａＣ（ｌを用いて得られ゛るイオン強度の変化では有意に変化しなかった。

静注および筋注製剤として用い得るよう、タンパク質をイオン強度約０．１５μ 、浸透圧約２５０　ｍｍ。

１重ｋｇで製剤化した。

研究３：表■および表■は、それぞれ、ｐＨ５，０のクエン酸製剤を温度５℃で １年間（レラキシン濃度１ｙｇ／ｉの、−２０℃で６０日間（レラキシン濃度２ 　ｘｇ／　ｘＱ＞保存して得た、逆相ＨＰＬＣデータである。表■のデータを外 挿し、１次反応式を前提として、５℃で少なくとも２．０年間安定（即ち、分解 は約１０％を越えない）と見積もることができる。２つの表は製剤がそれぞれの 温度で安定であることを示している。

表■ 逆相ＨＰＬＣ ５℃で保存したクエン酸製剤の安定性 時間　保持時間　面積（主ピーク）　合計面積　　主ピーク（日数）　　（分） 　　　　　　Ｘ１Ｏ−一一−−−−−−−−−−−−−−−乙上且−７５２上、 ７０　　２０．９５　　　　２．８４　　　　　２．８４　　　　０．９９８Ｄ 　　　Ｉ９．８５　　　　２．９８　　　　　２．９８　　　　０．９９５０　 　２０．８８　　　　２．８９　　　　　２．９４　　　　０．９８５−−一− １■−−一杓−−■―■町− ａｖｇ、　　　　２０．６　　±０．６　　　　２．９Ｏｆ０．０Ｂ　　　　　 　２．９２±０．０７　　、　０．９９３±０．０（１７１４１９，７８２，６ ８２，７５０，９７７１４１９，７２２，５１２，５２０，９９７−−−−−― −■−−■―−―−■−−−ａｖｇ、　　　　１９．８　　±０．０３　　　２ ．６０±０．０９　　　　　２．６４ｆ０．０１　　　　０．９８７＋０．０１ ３０　　２０．２　　　　２．５７　　　　　２．６８　　　　０．９５９３０ 　　２１．８　　　　２．３６　　　　　２，４７　　　　０．９５５−一−■ −−一一一一−−園一一　　　　　　　　　　　−−−１■−ａｖｇ、　　２１ ．０±０．８　　２．４７±０．１　　　２．５８±０．１　　０．９５７±０ ．００２９７２０．２　　　　２．６２　　　　　２．６９　　　　０．９７４ ９７　　２０．２　　　　２．５７　　　　　２．６１　　　　０．９８４−開 −−―−■−−−　　　　　　　　　　―■−−町ａｖｇ、　　　　２０．２　 　　　　　　　　２．６０土０．（１３２，ＢＳ＋−０，０４０，９７９±ｏ、 　ｏｏｓ１５０　　２０．７　　　　２．８４　　　　　２．９８　　　　０． ９５７１５０　　２０．７　　　　２，８１　　　　　２．９２　　　　０．９ ６１１５０　　２０．７　　　　２．８２　　　　　２．９６　　　　０．９５ ５―■−一−―−一一−―■−−−−−−−−ａｖｇ、　　２０．７　　　　２ ．１３２±０．０２　　２．９５±０．０３　　０．９５ｇ±０．００３ａｖｇ 、　＝平均 ５℃で１年間後のヒトレラ牛シンのＲＰ−ＨＰＬＣ主ピークの分解に関する１次 反応速度定数。各タイムポイントにおけるデータは３重反復試験（可能な場合） の平均値であって以下に適合するように用いた。

Ｉｎ（主ピークフラクション）＝Ａ−ｋｔ逆相ＨＰＬＣ ＝２０°Ｃで保存されたクエン酸製剤の安定性時間　保持時間　面積（主ピーク ）　合計面積　　主ピーク（日数）　　（分）　　　　　ＸＩＯＸＩＯフラクシ ョン０　　１９．７０　　　　４，２５　　　　　４．２９　　　　０．９９０ ０　　１９．７０　　　　４．２２　　　　　４．２４　　　　０．９９５０　 　１９．７２　　　　　リ　　　　　Ｌ君　　　　唄ａｖｇ、　　１９．７１± ０．０１　４．２２±０．０３　　４．２５±０．０４　　０．９９３±０．０ ０３３０　　２０．２２　　　　４．３１　　　　　４Ｊ５　　　　０．９８９ ３０　　２０．２０　　　　　翻　　　　　リ　　　　項遺りａｖｇ、　　２０ ．２１±０．０１　４ＪＯ±０．０１　　４．３４±０．０２　　０．９８９± ０．００５６０　　１９．８２　　　　４．７６　　　　　４．８６　　　　０ ．９７９６０　　１９．８７　　　　４．６１　　　　　４，６７　　　　０． ９９１６０　　１９．８５　　　　４，５９　　　　　４．６３　　　　０．９ ９２ａｖｇ、　　　１９．８５±０．０３　４．６５±０．０９　　４．７２± ０．１２　　０．９８７±０．００７レラキシンのいわゆる生物活性の安定性を 、レラキシンとアカゲザルの子宮細胞の相互反応によって生成するサイクリック ＡＭＰの生産を測定する方法を用いて追跡した。サイクリックＡＭＰ分析による 濃度対時間曲線を図３ａ−３ｅに示す。図３８はグリシン−ＨＣＱ（ｐＨ３，０ ）中のレラキシン、図３ｂはクエン酸塩（ｐＨ５，０）中のレラキシン、図３ｃ は酢酸塩（ｐＨ５，０）中のレラキシン、図３ｄはヒスチジン（ｐＨ６，０）中 のレラキシン、図３ｅはＴｒｉｓ／’ｙフｙ　−（ｐＨ７゜５）中のレラキシン を表す。すべての図で白丸は５℃、黒丸は２５℃、三角は４０°Ｃ１直線は予測 値を表す。全試料（ｐＨ３から７．５）は４０日間の保存後にも実験誤差の範囲 内で等しい生物活性を有すると想われる。

レラキシンの生物活性に関する安定性を、マウス恥骨結合アッセイで評価した。

クエン酸バッファー（ｐＨ５，０）中の未分解レラキシンの生物活性とＴｒｉｓ バッファー（ｐＨ７，５）中の高度に分解されたレラキシンの生物活性とを比較 し、分析誤差の範囲内で生物活性には差異がないことが分かった。

ＥＬＩＳＡおよび円二色性分析は製剤のタンパク質コンホメーションの評価に用 いた。データはレラキシンの三次構造が１および２力月の保存後にも変化してい ないことを示した。

タンパク賃が自己会合して変化する可能性は沈降平衡分析的超遠心法によって調 べた。１０ｍＭ酢酸塩、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＣ５ｐＨ５中のレラキシンを、負 荷濃度０．１．０．２および０．４ｍ９／ｍＮで分析的超遠心法によって分析し た。重量平均分子量はこれら３種の負荷濃度で約１０．０００であり、これらの 条件下でレラキシンが二量体を形成していることを示した。

種々の薬学的に許容し得る賦形剤を１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５製剤に加え、そ の製剤の安定性への効′果を調べた。図４は様々な温度における、種々の製剤の 逆相ＨＰＬＣで見られるレラキンン主ピークの分解率を示す。左から右へ、超遠 心（黒）および透析（ａい）・ノチ゛ング（線形））試料と、以下の賦形剤を添 加した試料とを比較した二等優性量（交差）・ノチング）または５重量％（中程 度の）・・ノチング）のマンニトール、５重量％（白）または１０重量％（黒） のグリセロール５重量％（水平平行線）または１０重量％（点描）のエタノール 、５重量％（薄いハツチング）または１０重量％（白）のプロピレングリコール 、および０．０２重量％（黒）のＥＤＴＡである。それぞれを５．２５または４ ０’Ｃで保存した。理解され得るように、賦形剤の安定化効果は、超遠心および 透析対照と比較して、誤差範囲の、無視し得る程度にすぎない。透析および超遠 心試料間の差異も誤差範囲内である。

また、レラキシンを酸性溶液として再構成し得る凍結乾燥製剤を調製することも できる。より詳しくは、当初、クエン酸製剤バッファー中に含有された長しラキ シンを１０ｍＭクエン酸塩、０．５０７％マンニトール、ｐＨ５，０に対して透 析した。次いで、この調製物ヲそれぞれ容量１−づつ、９個の３ｃｃバイアルに 滅菌ろ過して入れた。

これらのバイアルをＬｙｏｖａｃ　ＧＴ　２０凍結乾燥機内のトレーに置いた。

レラキシン試料を一９０℃に冷却し、０℃で２５時間、−次乾燥サイクルに付し た。次いで、２５℃で１７．５時間の二次乾燥サイクルに付した。凍結乾燥終了 後、１個のバイアルをＭｉｌｌｉ−Ｑ水１７！で再構成したところ、極めて清澄 で濁りがなく、再構成が成功したことを示していた。残るバイアルを５℃および ２５℃での安定性のために供した。

プレ凍結乾燥対照として凍結乾燥前に凍結乾燥バッファー内に移し変えた長しラ キシンを用いた。０時間における再構成試料の外、５°Ｃおよび２５℃での保存 後、２週間、１力月、および３力月後に試料を再構成した。全試料に関して、既 述のＲＰ−ＨＰＬＣによって分解産物を分析した。可能な場合はすべて、３重反 復注入試験の平均をとった。全試料に関し、凍結乾燥保存時間の長さと無関係に 、主ピークの％は変化せず、２５℃で３力月後も安定性が失われていなかった（ 表■ａ）。また、全試料の分光光度計分析は、凍結乾燥して２５°Ｃで３力月間 の保存後も、光散乱物質（％）が増加していないことを示していた。

（以下余白） 表■ａ 試　　料　　　　　　　　％主ピーク（％）プレ凍結乾燥対照：　　　　　　　 ９７．３０時間再構成二　　　　　　　　９７．８±０．７２週間、５℃：　　 　　　　　　　９ｇ、　３±０．３２週間、２５°Ｃ：　　　　　　　　９１１ １．１±０．４１力月、５°Ｃ：　　　　　　　　　　９７．８１力月、２５℃ ：　　　　　　　　９７．６３力月、５℃：　　　　　　　　　　９ｇ、　Ｏ± ０．５３力月、２５℃：　　　　　　　　、９１１１．８±０．４第１に、凍結 −解凍研究により、タンパク質を液体中濃度２ｍ９／−１ｐＨ５において、−２ ０および一６０°Ｃで凍結することができ、ＨＰＬＣ分析で観察される変化がな いことが示された。さらに、表■はクエン酸塩ｐＨ５，０製剤を凍結し、次いで 解凍し、試料をとり、即座に凍結し、３０日間凍結しつづけ、室温で５時間解凍 したもののＲＰ−ＨＰＬＣ安定性データを示している。解凍に際して、ＨＰＬＣ データには変化が見られない。

表Ｖ 逆相ＨＰＬＣ（凍結−解凍） 一２０℃で保存したクエン酸塩製剤の安定性時間　保持時間　面積（主ピーク） 　合計面積　　主ピーク（日数）　　　　）　　　　　ＸＩＯｘｔＯフラクショ ン再凍結試料で０時間 ３０　　２０．１８　　　　４．５０　　　　　４．５４　　　　０．９８９３ ０　　２０．１ｇ　　　　　４．５１　　　　　４．５６　　　　０．９８９３ ０　　２０．２０　　　　４．４８　　　　　４．５３　　　　０．９８７ａｖ ｇ、　　２０．１９±０．０１　４．５０±０．０２　　４．５４±０．０２　 　０．９８ｇ±０．００１室温で５時間 ０　　１９．８２　　　　４．７６　　　　　４．８６　　　　０．９７９０　 　１９．８？　　　　　４．６１　　　　　４．６７　　　　０．９９１０　　 １９．８５　　　　４．５９　　　　　４．６３　　　　０．９９２ａｖｇ、　 　　　１９．８５±０．０３　　　４．６５±０．０９　　　　　４．７２±０ ．１２　　　　０．９８７±０．００７５時間　１９．８１！　　　　　４．６ ０　　　　　４．６５　　　　０．９８９＊：凍結状態で６０日間保存した試料 を室温で５時間保存し、再度分析した。

結論として、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定したヒトレラキシンの構造の完全さはそれが 形成されるｐＨに影響され、分解はｐＨ７およびそれ以上で起きる。検査した５ 種の製剤のＨＰＬＣ分析の結果、レラキシンは他のバッファーよりも酢酸バッフ ァーおよびクエン酸バッファー（ｐＨ５）中で安定であり、５℃および一２０℃ で５力月間、クエン酸バッファー（ｐＨ５）中で最も安定であった。生物活性は 影響さブタおよびヒトレラキシンの比較実験で、重量平均分子量データから、ｐ Ｈ５の溶液中で、ヒトレラキシンはブタレラキシンより、はるかに会合し易いこ とが分かった。種々の負荷濃度で得たヒトレラキシンに関するデータは同様であ り、凝集が可逆性の自己会合であることを示唆していた。データはまた、ヒトレ ラキシンの自己会合はｐＨ５よりもｐＨ３で少ないことを示した。

実施例３ 天然型のレラキシンは３３アミノ酸のＢ鎖を有するもの（長しラキシン）ではな く、２９アミノ酸のＢ鎖を有するもの（短縮レラキシン）であることが分かった 。本研究の目的は短縮レラキシンが、長しラキシンと同様の安定性と吸着特性を 有するかを調べることにある。さらに、２つの型のレラキンンの、２８０ｎｍに おけるＵＶ吸光係数と、ＵＶ　ＣＤによる二次構造とを比較した。

これらの実験に用いた短縮レラキシンは長しラキシン（実施例１で調製）を制限 的にタンパク分解してＢ鎖が２９アミノ酸からなるようにすることによって調製 した。長しラキシンを合成した後、ＴＦＡグラジェントを用いるＨＰＬＣカラム に適用し、次いで、ｌ１ｌｏｎＯＳイオン交換カラムに適用した。レラキシン含 有フラグメントを製剤バッファーにディアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）　 した。レラキシン２００ｍ９を含有するバッファーにレラキシンに対して１重量 部から２０００重量部のトリプシンを加え、約４０分間タンパク分解を行った。

次いでカルボキシペプチダーゼＢ（７０ｕ／ｍｙ）の１６．９ｍ９／ｍ１２溶液 ５０μｇを消化物に加えた。得られた溶液を室温で１時間放置し、クエン酸を加 えて酸性にし、ＨＰＬＣおよびｍｏｎｏｓカラムで精製した。このようにして精 製したレラキシンを塩化ナトリウムで等優性にした１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５ に１　、０　ｍｇ／−でディアフィルターし、−６０°Ｃで凍結保存した（３　 ｃｃ　Ｉ型ガラスビン中１ｄ）。

このロフトの一部を液体として得、これを非凍結試料と称する。

温度安定性：１０ｍＭ等張性クエン酸塩中レラキシンのｐＨ５での安定性を逆相 ＨＰＬＣ主ピークの減少に関する１次反応速度式により評価した。以下の条件下 、Ｓ　ｙｎＣｈｒｏｐａｋＴＸＣ４カラムを用いてクロマトグラムを得た。流速 、１−７分、３０分間の２０％溶液Ａから５０％溶液Ｂまでのグラジェント（溶 液Ａは０．１％トリフルオロ酢酸、溶液Ｂは０．１％トリフルオロ酢酸および９ ０％アセトニトリル）。

表■は長しラキシンと短縮レラキシンとの動力学の比較である。

長しラキシンの１次速度定数は１年間の安定性データから、短縮レラキシンのそ れは６力月間の凍結−解凍試料のデータ、および非凍結試料の２力月間のデータ から決定した。１次反応速度定数にはｔ。

９とｔ１／２の値が含まれる。短縮型の安定性は、少なくとも長しラキシンのそ れと同様に良好であるが、凍結−解凍試料について２５°Ｃで２年間以上の安定 性が示されているので、それ以上に良好であり得る。先の長しラキシンに関する 観察と同様、凍結および解凍は短縮レラキシンの安定性に影響しなかった。

表■ 長および短縮レラキシンのＲＰ−ＨＰＬＣ主ピークの分解に関する１次速度定数 式：Ｉｎ（主ピークフラクション）＝ｌ−ｋｔに適合するよう、３重反復試験の 平均値を用いた。

バッファー　　　切片　　　　　　　ｋ（日’）　　　　　ｔ、９　　　ｔｌ／ ２５　　　−０．０２７±０．００７　−０．００００８２±０．００００３７ 　　＞２ｙｒｓ　　＞２ｙｒｓ２５　　　−０．０２８±０．１１１１０　−０ ．０００５９１±０．００００５５　１７８．２　　＞２ｙｒｓ４０　　　−０ ．０２８±０．０２４　−０．００２６０３±０．０００１３２　４０．５　２ ６６．３短縮型（非−凍結） ５　　　−０．０７±０．００５　−０．０００１１６±０．０００１３２　　 ＞２ｙｒｓ　　＞２ｙｒｓ２５−０゜００２±０．００４　−０．０００５１６ ±０．０００１０６　２０４．１　　＞２ｙｒｓ４０　　　　　　　−０．００ １±０．００８　　　−０．００３９８８±０．０００１９４　　　２６．４　 　１７３．８短縮型（凍結−解凍） ５　　　　　　　−０．００５±０．００３　　　−０．００００３７±０．０ ０００３２　　　＞２ｙｒｓ　　　＞２ｙｒｓ２５　　　−０．００５＋０．０ ０８　−０．０００４７８±０．０００２２０　　＞２ｙｒｓ　　＞２ｙｒｓ４ ０　　　−０．００１±０．００７　−０．００２７７３±０．０００２４７　 ５２．４　３４５．０光安定性・短縮レラキシンの２個のバイアルを１６００フ イ一ト本ヤンドル（ｆｏｏｔ　ｃａｎｄｌｅｓ）の等級の光ボックスに７日間入 れた。１個のバイアルをアルミホイルで遮光し対照とした。長しラキシンの主ピ ークの保持時間（Ｒｔ）を短縮レラキシンのそれに対して標準化し、表■に示し た。次いで、分解ピークの全保持時間をこの標準化した値に関連させた。理解さ れ得るように、短縮および長しラキシンに関する標準化保持時間は極めて良く一 致しており、両方のタンパク質の分解が同一の過程で起きることを示唆していた 。しかしながら、長しラキシンの分解速度は短縮レラキシンのそれよりも幾分大 きいようである。

表■ 短縮および長しラキシンの光安定性 １９、３４±０．０１　　６４．０７±０．５３　　　１９．３４±０．０１　 　７８．５６±０６４１７、６２±０．０８　　　７．３ｇ±０．２０　　　１ ７．６７±０．０２　　　８．５６±０．１６１７．２０±０．０８　　１１． ２６±０．１９　　　１７．３８±０．０１　　　４．９０±００２２１５．４ ９±０．０３　　　４．６８±０．１３１９、３３±０．０２　　９７．１６± ０．３７　　　１９．３３±０．０２　　９７．０９±０．２６１９．１３土０ ．０２　　　　　　１．８８．：０．１５　　　　　　１９．０２±０．０２　 　　　　　２．０３±０．１６＃：主ピークの保持時間は短縮型のものについて 標準化し、分解ピークのそれを標準化した値と関連させた。

＊：全面積の２％以下の面積のピークは解析から除外した。

撹拌に対する安定性：短縮レラキシンのバイアルを室温下、Ｇ１ｍ５−　Ｃｏｌ 　ｍｏｄｅｌ　Ｓ　−５００アジテータ−を用い２．５単位のセツティングで７ 日間撹拌した。対照試料は室温で撹拌せずに置いた。安定性は温度に対する安定 性に関して述べた上記方法に従い、逆相ＨＰＬＣで測定した。

表■は７日間の撹拌後残ったレラキシン主ピークの比率（％）を表す。これらの データは撹拌試料と非撹拌対照とを比較した場合、長および短縮レラキシンのい ずれにも、逆相ＨＰＬＣでは有意な変化が検出されないことを示している。

表■ 長および短縮レラキシンの撹拌に対する安定性１９、９７±０．０２　　９７． ８４±０．１７　　　１９．２６±０．０４　　９８．５Ｇ±０，２８道−荘 １９、９７±０．０２　　９８．５３±０．４３　　　１９．１７±０．０３　 　９８．４５±０．２３吸１研究：Ｕｖスペクトル測定に基づいて、ノーマルセ ーラインによりレラキシンを約１０μ９／−に希釈した。内径０．０２ｉｎ、、 外径０．０３７ｉｎ、の２フイートのＳ　１ｌａｓｔｉｃ”チューブを５７！の ガラスシリンジと２２Ｇの針を備えたＨ　ａｒｖａｒｄインフニージョンポンプ に連結した。チューブを通してレラキシンを１００μＱ／分で注入し、最初の１ ０分間は１分ごとに１００μＱづつ、以後３０分間は１００μａ試料を５分ごと に、９００μＱのＥＬＩＳＡア・ノセイバ・ノファー（Ｅ　Ａ　Ｂ）中に採取し た。この１：１０希釈をさらに２回、ＥＡＢで希釈することにより１　：　４０ ００に希釈した。１：４０００希釈をＥＬＩＳＡによるタンパク質濃度測定に用 いた。

レラキシンはチューブに吸着した。しかしながら、チューブからの５分間の注入 の後、ＥＬＩＳＡ測定でのレラキシン濃度は予測された１０ｎｇ／＋ａ１２に近 付いた。曲線下方の面積の積分によって、全タンパク質の約５％がチューブ表面 への吸着により失われたことが分かった。Ｓ　１ｌａｓｔｉｃ”チューブへの吸 着に関して、前記の２種のレラキシン相互に有意な差異はないようであった。

吸光係数の決定：長および短縮レラキシンの吸光係数を、定量的アミノ酸分析に より、２つの別個の測定で求め、長しラキシンについては２．０４または２　、 １４　ｃｔｓ”／　ａ９、短縮レラキシンについては２．２５または２　、３０ 　ｃｔａ”／　ｍ９を得た。長および短縮レラ牛シンについて計算したモル吸光 係数は１３．　ＯＯＯ±２００Ｍ−’ｃ＋ａ−’であった。この結果はＣ末端か らの４アミノ酸の除去が２個のトリプトファンと１個のチロシンの直接の環境に 殆ど影響しなｔ）ことを示唆している。また、この結果は２つの型のレラキシン のフンホメーションが同様であることをも示唆している。

円２色性＝２４０〜１９０ｎｍの円２色性測定を長しラ牛シン（０゜８ｍｇ／ｍ ｆ）および短縮レラキシン（１１１９／＋Ｊ）について、等優性クエン酸塩（ｐ Ｈ５）中、Ａｖｉｖ　Ｃａｒｙ６０スペクトロポーラリメータ−（分光偏光計） を用いて行った。試料を光路長０．０１ｃｍの円筒形水晶キューベｙト内で恒温 に保った。ＣＤ出力（ミリ度）を、平均残基重量１１３と、２７８．４ｎａでの ＵＶ吸収で得たレラキシン濃度とを用い、平均残基重量楕円偏光に変換した。吸 光係数から求めたレラキシン濃度は、長しラキシンが２　、０４　ｃａｒ”／　 Ｈ１短縮レラキシンが２．２５　ｃｍ’／ｌａｇであった。チャンら（Ｃｈａｎ ｇ）、　　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　９１　：１３−３１（１９７８ ）の方法に従って２次構造を推定した。

チャンら（前掲）の方法による、遠ＵＶＣＤスペクトルの解析の結果、長しラキ シンに関しては、５０％アルファへリックス、４７％ベータシートおよび３％ラ ンダムコイル、短縮レラキシンに関しては、５０％アルファへりックスおよび５ ０％ベータシートという結果を得た。短縮および長しラキシンのスペクトル間の 相違は十分、実験誤差の範囲内であり、短縮および長しラキシンの２次構造が非 常に似通ったものであることを示唆している。

結論：液状製剤中での短縮レラキシンの温度安定性は長しラキシンのそれと匹敵 するか、おそらくそれ以上である。さらに、光照射および撹拌に対する安定性は これら２タンパク質間で同様であった。

モル吸光係数、２次構造、および表面への吸着等の物理学的特性も同一と思われ る。

本実施例ではレラキシンゲル製剤の製造と性質を例示する。

液状レラキシン製剤 短縮レラキシン（２９アミノ酸Ｂ鎖を有するレラキシン）を実施例３記載のごと く製剤化し、本実験に用いた。Ｎ　ａ　ＣＩ２で等優性にした１０ｍＭクエン酸 塩（ｐＨ５，０）にレラキンンを濃度１　、０　ｍ９／−で含有させた。この製 剤を使用直前まで、バイアル中、−６０℃で保存した。これらバイアルのレラキ シンを２ｄ　Ａｍ１ｃｏｎＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０　ｍ１ｃｒｏｃｏｎｃｅｎ ｔｒａｔｏｒを用い、４０００ｒｐｍで１〜２時間遠心して、２　、４　ｍｇ／ −以上に濃縮した（ＵＶスペクトル測定により推定；ｅ−２，０４ｘ（１／ｕ・ ＣＺと仮定）。正確な時間は濃縮すべきレラキシンの初期容量に依存する。

４％Ｍｅｔｈｏｃｅｌ製剤 ４％メチルセルロースゲルをＭｅｔｈｏｃｅｌＡ　　４　Ｍメチルセルロース粉 末（ＤｏｖＣｈｅｍｉｃａｌｓ）から、以下の方法で再構築した。

（ａ）クエン酸製剤バッファー（実施例１記載）１０−を４０−の撹拌棒を入れ たビーカー中で沸点近く（約９０℃）に加熱した後、熱から外した。

（ｂ）ビーカーにＭｅｔｈｏｃｅｌ粉末０．８ｇを入れ、数秒間旋回させて粒子 を分散させた。

（ｃ）　次いで、ビーカーを５℃の涼しい部屋でマグネチノクスターラーの上に おいた。直ぐに、液体が粘度を増す前に冷却したクエン酸製剤バッファー１０ｍ １を追加し、ビーカーの壁面からすべての乾燥粒子を流し落とした。

（ｄ）連続撹拌の２０分後液体の粘度が増大し、均質な４％メチルセルロースゲ ルが形成された。

（ｅ）最後の２つの安定性研究のために、４％メチルセルロースゲルをオートク レーブに入れ、滅菌と同時にゲル内の溶存酸素を除去した。オートクレーブから 出した後、ゲルを窒素雰囲気下（ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｈｅａｄ　５ｐａｃｅ）で 撹拌し、新たな酸素の混入がない状態で均質なゲルを得た。

局所レラキシンの調製 ６００μｇ／ｄレラキシンの均質な３％Ｍｅｔｈｏｃｅｌゲルを以下の方法で調 製した。

（ａ）２本の滅！１１０ｃｃシリンジを秤量した。１個のシリンジに４％Ｍｅｔ ｈｏｃｅｌ　３９を入れた。もう１個のシリンジにゲル（１ｄ）容量の１／３の 液状レラキシン製剤２．４　ｍｙ／　ｄを入れた。

（ｂ）プランジャーを２本のシリンジに戻し、２本のシリンジを、両端を２本の シリンジの端にネジ式に嵌め込んで連結する、滅菌Ｒａ１ｎｉｒ＋　４７−Ｆ　 ＬＵコネクターにより、連結した。

（ｃ）２０−２５回、１個のシリンジプランジャーを押し込んだ後、もう１個の ／リンジを押し込むことでレラキシン溶液をメチルセルロースに拡散させると、 均質なゲルが形成された。（しかしながら、後の２つの実験では、保存と試料除 去を容易にするために、ゲルを１５献のエノペンドルフチコーブに移した。）ゲ ル中のレラキシンの最終濃度は６００μｇ／ｄであった。このゲルは３％メチル セルロース、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５，０および等強化のためにＮａＣＱを 含有している。

ＥＬｒＳＡアッセイ 実施例１記載と同様のＥＬＩＳＡ希釈剤でゲル中しラキシン試料を連続的に１０ 倍段階希釈し、レラキシン濃度６ｎｇ／ｍｆ！とした。ＥＬＩＳＡ測定によると ０．２５％のＭｅｔｈｏｃｅｌゲルは、レラキシン濃度に影響を及ぼさないよう であった。上記のＥＬＩＳＡアッセイはゲル中のレラキシン濃度が、ＵＶスペク トル測定に基づいて（吸光係数を２．０４と算定し）予測される値よりも低いこ とを示した。この結果は完全な長さのＢ鎖を有するレラキシンがアッセイの標準 であるのに対して、用いた試料が短縮Ｂ鎖しラ牛シンであったことに起因する。

局所レラキシンのＲＰ−ＨＰＬＣ分析 液分析液状シラキシン製剤に用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例１記載）を局所レラ キシン試料に用いるように改良した。ゲルが高粘性であるために、試料を水で１ ０倍希釈し、約５分間ポルテックス撹拌してゲルを均質化した後、静かに放置し て気泡を上昇させた。これらの試料の分析は、２５０μＱをＣ４−３００Ｓ　ｙ ｎＣｈｒｏｐａｋ（４。

６Ｘｂ ファーは１８％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸である。

溶離は、１％／分の漸増濃度のアセトニトリルを３０分間で最終濃度が４５％ア セトニトリルとなるように流すことからなる線状アセトニトリルグラジェントで 行った。流速は１．０ｔ１！／分の一定速度であり、２１４ｎｍで吸光度をモニ ターした。“スローダウン”ステップ（粘性ゲルが計量器に挿入される時間）を ３６から２７０分に増加した。実際には、′スローダウン”ステップが増加する 前に注入されたゲルは、その粘性の故に２５０μＣ以下であることが明らかにな った。

これらの実験過程で、Ｓ　ｙｎＣｈｒｏｐａｋカラムはピークの分離機能を失い 始めた。従って、最後の数回の注入をＣ４−３００Ｖｙｄａｃカラムで行った。

３回の重要な安定性実験を局所レラキシン製剤について行った。

第１は、室温で５日間これら製剤を放置した後、安定性を測定することである。

試料を元のシリンジに入れたまま保ち、温度と光の変動にさらした。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、主ピーク面積％の減少と初期に溶出する分解ピー クの数および面積％の増大によって示される、分解されていないレラキシン主ピ ークの分解が時間と共に増大することが分かった。主ピーク面積％の減少を定量 し、時間０（レラキシンをゲルに入れる前）のときの主ピーク面積％に関して標 準化した。

標準化フラクシテン主ピークを、時間に対してプロットした対数曲線は局所レラ キシンが１次分解速度反応式に従うことを示した。

レラキシン主ピークと、最大の分解ピークの両者をＨＰＬＣ溶出液から採取し、 Ｓ　ａｖａｎｔ　Ｓ　ｐｅｅｄ　−ｖａｃ内で約１時間真空凍結乾燥した。次い で、これらの試料をチオグリセロールおよび酢酸中で再構成し、プローブ上で還 元してＡおよびＢ鎖を分離しマススペクトル分析にかけた。これら２試料のマス スペクトル分析の結果、両試料のＡ鎖の分子イオンは同一であって、予測値約２ ６５７と一致した。

しかしながら、Ｂ鎖の分子イオンは異なっていた。主ピーク試料の分子イオンは 理論値約３３１４と一致した。分解ピークからのＢ鎖の分子イオンは約３３３０ であった。この１６という増加は、Ｂ鎖の残基が酸化されたと予測した場合の値 と正確に対応している。

ブタの卵巣から得たブタレラキシン６．６＋ｅ９をクエン酸塩製剤化バッファー に再構成し約３分間遠心分離してあらゆる粒子をベレット化し、上記のごとく４ ％Ｍｅｔｈｏｃｅｌゲルと共にクエン酸塩製剤化バッフｙ−０，２４８ａｆｆに 濃度３　、１９　ｆｆｉ？／ｍｆで混合し、８００　ａ９／−ブタレラキシン含 有３％ゲルを得た。短縮Ｂ鎖のヒトレラキシンと対照的に、ブタレラキシン製剤 は上記のＨＰＬ’Ｃ分析にかけたとき、殆ど分解していなかった。

第２の研究は局所適用用レラキシンの、５℃および２５℃の十分にコントロール された条件下での安定性を測定することである。さらに、この研究のためのＭｅ ｔｈｏｃｅｌ　Ｇｅｌをオートクレーブによって滅菌し、あらゆる可溶性の酸化 をもたらし得る酸素をゲルから除去した。局所レラキシン試料を４個の工・ノペ ンドルフチューブに移し、２個を５°Ｃで、２個を２５℃で保存した。１４４時 間後、ＨＰＬＣ分析の結果、５℃保存の局所レラキシンは分解し始めたが、２５ ℃の物質は比較的分解されていなかった。以後の分析で、５°Ｃの涼しい部屋で は光が当たっており、２５℃の箱は完全に光源から遮断されていることが分かっ た。

光が５℃での分解ピークの形成に寄与しているかどうかを決定するために、２個 の試料の内、１個をアルミニウムホイルで包装して光を遮蔽した。さらに５°Ｃ で３６０時間放置した後、ＨＰＬＣ分析にかけると、暴露されていたレラキシン は完全に分解されていたが、遮蔽したレラキシンはより遅い速度で分解し続けて いた。このように、光の存在は安定性に影響し、光の遮蔽によって完全に局所レ ラキシンが保護されるが、光暴露の後、遮蔽した場合には、はるかに遅い速度で あるが分解が続くようである。局所レラキシンの広いピークを収集し６７２時間 保存しくいずれも光を遮蔽、光に暴露）、マススペクトル分析したところ、Ａ鎖 は影響されずＢ鎖は、第１の、次いで、第２の酸化を受けることが分かった。

第３の実験では、いずれも光に暴露し、光から遮蔽した局所レラキシンと液状に 製剤化したレラキシンの安定性を比較した。８１６時間５℃で保存した後のＲＰ −ＨＰＬＣクロマトグラムは、光から遮蔽した場合、局所レラキシンは液状製剤 化レラキシンとまさに同等の安定性を有し、いずれも９６％の主ピークを有した 。しかしながら、光に暴露すると、局所レラキシンは液状製剤化レラキシンに比 較して極めて分解され易いことが分かった。

有効性研究 本研究の目的は短縮レラキシンのウサギ子宮Ｒ管の熟成における有効性を決定す ることにある。種々の研究で、ウサギ頚管は生理学的応答に関してヒト頚管に匹 敵することから、頚管の挙動の機構を調査する上でウサギ頚管がかなり良好なモ デルであることが示唆されていたために、ウサギを用いた。

成熟妊娠雌性二二−ジランドラビノト（４，５〜６．０ｋｇ）をＦｉｆ究に用い た。妊娠２６−２７日にウサギ（１群あたり４匹）を、上記のごとく調製した３ ％メチルセルロースゲル中、短縮ヒトレラキシンゲルまたはブタレラ牛シンゲル で処置した。短縮ヒトレラキシンおよびブタレラキンンを１００．２００．３０ ０．６００および１．　ＯＯＯμｇ／ｚ（！レラキシン／動物の用量で処方した 。両ホルモンをシリンジおよびカテーテルを用い、０．５１用量で経膣的に適用 した。

対照動物にはビヒクルのみを与えた。１６−１８時間後、動物に致死量のベンド パルビタールを与えて殺した。予言、より低いセグメント、および子宮頚管を摘 出し、組織学的検査のために１０％ＮＢホルマリンに固定化した。パラフィン切 片を切り取り、ヘマトキシリン／エオシンおよびアルシン・ブルーＰＡＳ染色し た。切片を総合的には形態学を、および具体的には粘膜下の筋肉組織およびコラ ーゲン原線維の分離の程度、並びにマクロファージ由来の多核細胞であって、通 常は頚管をろ過されないＰＡＳ陽性巨細胞の存在を示す特徴に関して評価した。

巨細胞の測定はマツクレナンら［ＭａｃＬｅｎｎａｎ、　　ＡｔＪ、０ｂｓｔｅ ｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ、、　　１５２　：　６９１−６９６（１９８５）〕の方法 を用いて行った。

局所製剤中に濃度３００μｇ／ｗＱのヒトレラキシンまたはブタレラキシンを用 いる最初の実験では、この用量で、いずれのホルモンも妊娠頚管に、熟成に一致 する変化をもたらすことが示唆された。

頚管への適用後１８時間で有意な拡張と頚管熟成が観察された。染色した頚管切 片の組織学的検査で、介在空間内にタンパク質に富む物質の僅かな存在を伴う属 性粘膜の著しい分離、コラーゲン線維束の分離（コラーゲン密度の低下）、細胞 間質の増加、およびリンパ管の拡張に伴う粘膜下浮腫が示された。また、対照動 物には希である、特徴的なＰＡＳ陽性巨細胞が、レラキシン処置動物には多量に 認められた。そのような細胞は血管周囲と上皮下層に最も一般的に認められたが 、頚管深部全般を通しても認められた。レラキシンの最少有効量および最大有効 量を定義するための以後の研究は初期の研究と対照的に、３００または６００　 ｔｔｇ／ｘＱテは効果なく、ｌｚｇ／Ｊでのみ、効果が明らかに認められた。

薬動力学的研究 本研究の目的は妊娠ウサギへの短縮レラキシンの、１回の静脈注射、皮下注射お よび経膣投与後の生体内利用効率（バイオアベイラビリティ−）を決定すること にある。

使用したウサギは１６回の経度雌性ニュージランドホワイトラビノト（Ｅ　］、 ｋｈｏｒｎＸ４−５　ｋｇ）である。妊娠２６日目に４匹の動物（１群）に、耳 静脈へのＡ　ｂｂｏｃａｔｈ　−Ｔカテーテルを通して、静脈内ポーラス（ｉｖ ）で短縮レラキシンを１００μｇ／に９で与えた。３匹（■群）に、大腿へ滅菌 食塩水中の短縮レラキシン１００μ／ｋｇを皮下（ｓｃ）投与した。３匹（５群 ）に、１％ベンゾプルプリン中短縮レしキシン１００μ／に９を５ｃｔｆｋ与し た。４匹（３群）に、３−メチルセルロース中短縮しラキシン１００μｇ／ｋｙ を経膣投与した。ｉｖおよびｓｃ投与溶液の濃度は、５００μｇ／ｘＱ清澄短縮 レラキシン溶液１ｇ／ｚｃであった。希釈は滅菌等強性食塩水または食塩水中１ ％ペンゾプルブソン（ＢＰＰ）で行った。投与容量は通常、１＋＋（であり、以 下の等式に従って、個別に計算した。

用量＝（１００μｇ／　ｋｇ）　（ｋｇ）／　（５００μｇ／ｘＱ＞経膣投与の ために、上記の手順に従い、全量３ＨのＭｅｔｈｏｃｅｌゲル（４％）を短縮レ ラキシン０．４８７ｍ（（上記）およびクエン酸製剤バッファー０．５１３９と 混合し、短縮レラキシン６００μｇ／ｘ（。

３％メチルセルロースゲルを得た。経膣投与容量は０．５１であっ血液試料（１ ｍ１２）を耳動脈のＶ　ｉｇｇｏ　Ｓ　ｅｃａｌｏｎカテーテルで採取した。血 液試料の採取時間は以下の通りである。（ｉｖ）　０．１．２．３．４．５．７ ．１０．２０．４０．６０．８０．１２０，１８０．２４０．３００．３６０． ４２０，４８０．５４０，８００．６６０、および７２０分目；　　（ｓｃおよ び経膣）０．１．２．３．５．７．１０．１５．２０．３０．４０．５０．６０ ．７５．９０．１２０．１８０．２４０，３００，３６０、’　４２０．４８０ ，５４０．６００．６６０および７２０分目。血液試料を凝固させ、遠心分離し て血清を採取した。試料をドライアイス上で凍結しＥＬＩＳＡアッセイまで、− ７０℃で保存した。このアッセイは２０〜１２８０ｐｇ／ｍＱの範囲であった。

非線状曲線適合プログラム（ＮＯＮＬＩＮ８４．　５ｔａｔｉｓｃａｌ　Ｃｏｎ ５ｕｌｔａｎｔｓ、　　Ｉ　ｎｃ、　；　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　　ＫＹ）を用 い、個々の免疫反応性血清の濃度一時間データを３−指数関数モデルと比較する ことで個々のｉｖ薬助動力学的パラメーター評価した。血管外の投与経路から得 たデータをＲ３−１プログラム［ボルト、バーナツクおよびニューマン（Ｂｏｌ ｔ、　　Ｂｅｒｎａｋ　＆　Ｎｅｖｍａｎ）、　　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ コに従って適合させた。血清濃度一時間曲線（ＡＵＧ）下の、１＋０から最後の 測定可能な血清濃度（Ｃｔ）に至る面積を台形法で計算した。Ｃｔから無限の時 間までのＡＵＧを外挿した。Ｃｔをターミナルエリミネーション（最終消滅）速 度定数で割った。血清クリアランス（ＣＬ）を等式：％式％（） から求めた。

分散の初期容量（Ｖｃ）は式： ％式％（） （式中、Ｃ（０）は血清濃度一時間データを表す３−指数関数の係数である。定 常期における分散容量（Ｖｄｓｓ）は、式：％式％ （式中、ＡＵＭＣはモーメント曲線（すなわち、血清濃度＊時間／時間曲線）下 方の面積である。

によって計算された。血清半減期は０．６９３をそれぞれの配置（ｄｉＢｐｏｓ 　ｉｔ　１ｏｎ）速度定数で割って求めた。生体利用率は面積比法：（Ａ　Ｕ　 Ｇ　（血管外）／　Ａ　Ｕ　Ｇ　（ｉｖ））Ｘ　１００で求めた。

妊娠ウサギに、短縮レラキシン１００μｇ／に９を１ｖＳＳＣ，および経膣投与 した後の血清濃度一時間像は図５に示されている。図中、黒丸はｉｖ、白四角は ＳＣ１白丸は経膣投与を表す。図６は妊娠ウサギに短縮レラキシン１００μｇ／ に９をＢＰＰの存在下（黒丸）または非存在下（白四角）で皮下投与した後の血 清濃度一時間像を表す。表Ｘに全投与経路における助動力学的パラメーターを列 挙した。ｉｖｖ与後の血清クリアランス（ＣＬ）は２．９５±０　、８８　ｚｇ ／　ｘＱ／　ｋｇＱあった。初期の分散容量（Ｖｃ）および定常期の分散容量（ Ｖｄｓｓ）は、それぞれ、８９±２２および２０９±３０　ｘｇ／　ｋｇであっ た。ｉｖｖ清濃度一時間データを表すために３つの指数期間（ｔｅｒｍ）が必要 であり、半減期（ｔｌ／２）はそれぞれ、８．４±２．７．５９．１±８．７、 および２７９±１２８分であった。ヒトレラキシンの皮下投与における平均の血 清ピーク濃度は１８０分において７６．２０±１７．８０ｎｇ／ｍＱであり、生 体利用率は７６．０±２０．６％（ｉｖレラキシンの生体利用率を１００％とし て）であった。ＢＰＰと一緒にｓｃ投与したヒトレラキシンは、ヒトレラキシン ＳＣ単独投与によって得られた値と比較して、平均ピーク血清濃度が低く（４１ ，６７±１６．３２ｎｇ／ｍａ）、遅かった（４２０分）。ＢＰＰと一緒ノｓｃ 生体利用率ハ５９．４±６．７％であった。

ヒトレラキシンは経膣投与によっては全身的には殆んど吸収されないようである 。全身の血清濃度は非常に低く（９８分で０．３４±０．１６ｎｇ／ｄ）、得ら れた生体利用率は１．０±０．８％にすぎなかった。

（以下余白） 表Ｘ 妊娠ウサギへのｈＲｌｘ　１００　ａｇ／に９のｉｖ。

ｓｃおよび経膣投与後の助動力学的パラメーター経路　　　１）ＡＵＣ２）ＣＬ 　　　３）Ｖｃ　　４）Ｖｄｓｓ（ｎｇ−分／ｉｃ）　　（Ｉｆｆ／分／＆９） 　　（ｘＭ＆９）　　（ｚ＆／＆ｖ）ｉｖｌａ　　　５５．２１　　　１．８１ 　　　　８０　　　１７９１ｂ　　　　　３１．７７　　　３．１０　　　　６ ９　　　１８８１ｃ　　　　　２５．２３　　　３．９６　　　１２０　　　２ ２８１ｄ　　　　　３４．１９　　　２．９３　　　　８５　　　２４１ｍｅａ ｎ　　　　３６．６０　　　２．９５　　　　８９　　　２０９ＳＤ　　　　　 Ｉ２．９７　　　０．８８　　　　２２　　　　３０ｓｃ２ａ　　　２４．２５ ｍｅａｎ　　　　２７．４Ｂ ＳＤ　　　　　　　　７．９１ ｔｏｐ３ａ　　　　Ｏ，２０ ｍｅａｎ　　　　　　　Ｏ，３７ ＳＤ　　　　　　Ｏ，３０ ｓｃ＋ＢＰＰ５ａ　　　１９．　Ｏ１ ５ｂ　　　　　　　２３．６０ ５ｃ　　　　　　　２３．７６ ｍｅａｎ　　　　　　２２．１２ ＳＤ　　　　　　　　２．７０ ＳＤ＝標準偏差 ｔｏｐ−局所適用 表　Ｘ（続き） 経路　　　ｔｌ／２（１）　　　ｔｌ／２（２）　　ｔｌ／２（３）　　　ｋｌ ／２（Ａｂｓｐ）（分）　　　　（分）　　　　（分）　　　　　（分）ｉｖｌ ａ　　　１０．１　　　６９．３　　４３９１ｂ　　　　　５．８　　　５１． １　　　１６８１ｃ　　　　１１．３　　　５２．７　　　１８４１ｄ　　　　 　６．５　　　６３．３　　３２５ｍｅａｎ　　　　　８，４　　　５９．１　 　　２７９ＳＤ　　　　　２．７　　　　８．７　　　１２８ｍｅａｎ　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６２．９ＳＤ　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　２０．８ｔｏｐ３ａ　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　５５．８ｍｅａｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　５８．３ＳＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２．９ｓ ｃ＋ＢＰＰ５ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　、２ＳＤ− 標準偏差 ｔｏｐ−局所適用 表　Ｘ（続き） ・ 経路　　　９）　ｔｌ／２（期間）　　　１０）Ｃ〔−り’１１）ＴＥ−り”　 　　１２）　ＢＡ＃−（分）　　　　　　（分）　　　　（分）　　　　（分） ｉｖ　ｌａ ｂ Ｃ 】ｄ ＳＤ ｓｃ２ａ　　　　　　７３　　　９５．３０　　１２０　　６６．４２ｂ　　　 　　　　７２　　　５９．９０　　１８０　　６２．０２ｃ　　　　　　１７６ 　　　７３．４０　　２４Ｑ　　　９９．７ｍｅａｎ　　　　　　１０７　　　 ７６．２０　　１８０　　７６．０ＳＤ　　　　　　　６０　　　１７．８０　 　　　　　　２０．６ｔｏｐ３ａ　　　　　４７９　　　　０．２６　　２４０ 　　　０．６３ｂ　　　　　１４．８４　　　　０．５５　　　７５　　　２． ２３ｃ　　　　　　５０４　　　　０．３８　　１２０　　　０．９３ｄ　　　 　　　５８２　　　　０．１８　　　７５　　　０．４ｍｅａｎ　　　　　　７ ６２　　　　０．３４　　　９８　　　１．０ＳＤ　　　　　　４８３　　　　 ０．１６　　　　　　　　０．８ｓｃ＋ＢＰＰ５ａ　　　　２２９　　　４０． ８０　　２４０　　５１．９５ｂ　　　　　　２６６　　　５８．４０　　４２ ０　　６１．５５ｃ　　　　　　４９０　　　２５．８０　　４２０　　６４． ９ｍｅａｎ　　　　　　３２８　　　４　］−，６７４２０５９，４ＳＤ　　　 　　　Ｉ４１　　　　１６．３２　　　　　　　　６．７ａ・平均ピーク血清濃 度 ＊：平均ピーク血清濃度の平均時間 ＃゛生体利用効率 ＠′血管外投与における見掛けの終末ｔ１／２゜ＳＤ−律準偏差 ｔｏｐ−局所適用 助動力学的実験の完了（１２時間）後、動物を殺し、生殖管を摘出し組織学的検 査のために調製した。組織を１０％ＮＢＦに固定化し、パラフィン包囲し、Ｈ＆ ＥおよびＰ　Ａ　Ｓ　／　Ａ　Ｉｃ１ａｎ　Ｂ　ｌｕｅ染料で染色した。ウサギ 頚管の組織学的切片を処置群未知の状態で試験した。

この研究における基本的な判定基準は以下の通りである。（１）固有層および筋 層の相対的コンパクトネス（つまり具合）、（２）巨細胞の存在、および（３） 頚管領域への局在化。頚管を３つのカテゴリーに分けた。陽性、固有層および下 方の筋層の配列がばらばらで巨細胞が明らかに増加している；疑わしい、何等か の変化が存在するが明らかな程ではなく、また頚管外に存在する；陰性、頚管に は何の変化もない。

組織学的研究から、処置と組織学的変化にはなんら明確な関連性がないと結論さ れた。

抗酸化剤および補助溶剤の影響 本研究では、種々の製剤アジュバントの、レラキシンのメチルセルロースゲル中 での安定化能力を評価する。分解は光酸化によって起きるので、アスコルビン酸 およびソディウム　メタビサルファイト等の抗酸化剤を研究した。さらに、遊離 ラジカルの起源がメチルセルロースの過酸化物である可能性があるので、グリセ ロールやエタ／−ル等の補助溶剤がメチルセルロースとレラキシンの相互作用を 減少して製剤を安定化し得るか否かを知るために研究した。最後に、製剤に用い る前にゲルを光にさらし、レラキシン酸化におけるゲル活性化の影響を研究した 。

ゲル製剤：　Ｍｅｔｈｏｃｅｌパウダー（Ｄｏｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）４９を１ ０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ５（ＮａＣ（で等強性にしておいたもの）、１ ００−に加えて４％（Ｖ／Ｖ）メチルセルロースゲルを調製した。粉末をバッフ ァーに８５℃で分散させた後、溶液を１２１．５℃で３０分間オートクレーブ処 理した。完了後、ゲルの上に窒素ヘッドを配置し、５℃のインキュベーターに一 夜放置して水和した。グリセロールおよびエタノールを含有する製剤の調製のた めに、補助溶剤を直接製剤バッファーに加えた。レラキシンと混合する前に、オ ートクレーブ処理した４％ゲルを３４℃で２４時間、蛍光ボックス中に置くこと により“活性化”ゲルを調製した。

研究手順：表℃は研究に用いた各製剤における条件、含有成分、および組成を表 す。

表■ 本研究に用いたレラ牛シン製剤の組成 製剤　メチルセルロース　　　他の成分　　　　　　　光暴露４　　　　３％　 　　０．５％アスコルビン酸　　　　　十ストック（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｗ 、　Ｃｏ、　）５　　　　３％　　　０．２％メタとサルファイド　　　＋（Ｆ ｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ、）６　　　　３％　　　２０％ グリセロール（Ｍａｌ　１ｉｎｃｋｄｒｏｄｔ） ７　　　　３％　　　２０％エタノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｄｒｏｄｔ） ８　　３％活性化　　　　　−一−− レラキシン溶液は１ｘｇ／ｘＱで得、Ａｍ１ｃｏｎ限外濾過ユニツトによって２ 　ｗｇ／　ｘ（ｌに濃縮した。試料の調製は、レラキシン濃度２ｘｇ／ｘ（ｌの １０ｍＭクエン酸バッフｙ−（ｐＨ５）と４％Ｍｅｔｈｏｃｅｌゲルとを容量比 １：４で混合して行った。上記のごとく、溶液と４％ゲルを別々に２個のシリン ジに入れ、シリンジを横切るように、インターロッキングコネクターを通して２ ０回、内容物を前後に移動させることにより混合した。ゲルと混合する前にレラ キシン溶液にアスコルビン酸とメタビサルファイトを導入した。最後に、ゲル調 製物をオートクレーブ処理した１、５１１０のＨＰＬＣガラスバイアルに０゜２ ５−づつ入れた。バイアルの蓋をし、密閉し、蛍光照射下、５℃の冷涼な室に上 向きに置いた。製剤＃１および＃８の試料はホイルに包んだが、製剤＃３の試料 は短時間真空にした後、窒素を充填しておいた。

ゲル中でのレラキシンの分解をＲＰ−ＨＰＬＣで定量した。ゲルの粘性が試料を ＨＰＬＣに直接適用することを妨げるので、注入前にゲルを製剤バッファーで５ 倍希釈した。クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。

機器：ＨＰ１０９０Ｌ カラム：Ｖｙｄａｃ　Ｃ４−３００，４，６Ｘ１５０ｍｍ流速：１ｍｇ／分 波長：２１４ｎｍ インジェクシッン容量：２００μｍ７ 温度：室温 移動相：（Ａ）０．１％ＴＦＡ （Ｂ）９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡグラジェント速度：３０分間に２ ０％Ｂ→５０％Ｂの増大。

結果：表■に研究当初の結果を列挙する。表はそれぞれのタイムポイントにおい て検出された主ビーク（％）を示す。

（以下余白） 表■ 種々のゲル製剤中のレラキシンの安定性：種々のタイムポイントにおけるレラキ シン主ピーク（％）対照−光　　　　　　１００　　　　９７　　　　９５．９ 対照＋光　　　　　　　９８．７　　　３３．３　　　　０対照＋光および　　 　　９９．１　　　３８．６　　　　０窒素ヘツドスペース 対照＋光＋　　　　　１００　　　　７３　　　　５４．４アスコルビン酸 対照＋光＋２０％　　１００　　　　９５．２　　　８９．４グリセロール 対照＋光＋２０％　　１００　　　　８５　　　　５９．７エタノール 活性化ゲル−光　　　１００　　　　９５．８　　　９０．９１１日後、光から 保護された対照はその主ピーク面積の９６％を維持していたが、光に暴露された 対照は完全に分解されていた。窒素へノドスペースによる分解の遅延はなかった 。０．５％アスコルビン酸および２０％エタノールはほぼ同程度にレラキシンを 安定化するようであった。１１日ロー、レラキシン残存率（％）は５５−６０％ の範囲であった。最も良い結果は２０％グリセロール製剤の場合に得られた。光 照射１１日１に主ピークの９０％が回収された。

“活性化”ゲル試料は、光から保護されている場合でも、活性タンパク質の９％ の損失を示した。負対照（光から保護された単純なそのままのゲル製剤）と比較 して、ゲルの“活性化”はタンパク質の分解を早めるようである。これは、ゲル の製造中における過剰な光への暴露が好ましくないことを暗示するものである。

メタビサルファイトを含有する製剤については、これら試料においてレラキシン のピークが検出されず、後に研究対象から除外されたので、ここに結果を示して いない。メタピサルファイトとレラキシンとが反応して全タンパク質の喪失を招 いた可能性がある。

これらの実験例から明らかに、光暴露は分解過程の開始に重要な役割を担ってい る。レラキシンを光−誘導酸化から保護するには、製剤中にグリセロールを２０ ％含有させることが最も効果的である。

アスコルビン酸およびエタノールも、より低い程度に製剤を安定化する。メチル セルロース粉末の分散時に、添加エタノールのかなりの部分が蒸発すると思われ るので、本研究におけるエタノールの効果はまだ評価されていない。グリセロー ル、エタノール、およびアスコルビン酸の組み合わせで相加的な安定化が得られ るかもしれない。

上記の結果はメチルセルロースゲル中のレラキシンの光酸化がグリセロール、エ タノール、またはアスコルビン酸の製剤への導入で遅延され得ることを示してい る。これらの賦形剤の利点と、生産物の光への過剰な暴露からの保護により、許 容し得る存効期限（シェルフライフ）を有する最終的な製剤を設計することがで きる。

国際調査報告 一一一−＾−一一・ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００５０２ｍ−＋−ｗ　ｈ＊ｍｔｍ− −ｓ＠、　　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００５０２国際調査報告　　　ＰＣＴ／ＵＳ 　８９１００５０２

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．組成物のｐＨを約４から約７以下に維持し得るバッファー中に有効量のヒト レラキシンを含有する生物学的に活性な医薬組成物。
2. ２．ｐＨ域が約４から６の範囲である請求項１記載の組成物。
3. ３．ｐＨが約５である請求項１記載の組成物。
4. ４．バッファーが有機酸バッファーまたはヒスチジンバッファーである請求項１ 記載の組成物。
5. ５．バッファーがクエン酸バッファーまたは酢酸バッファーである請求項４記載 の組成物。
6. ６．イオン強度が少なくとも０．１μ、浸透圧が約２００〜３００ｍｍｏｌ／ｋ ｇである請求項１記載の組成物。
7. ７．イオン強度が０．１〜約０．２μの範囲であり、浸透圧が約２５０ｍｍｏｌ ／ｋｇである請求項６記載の組成物。
8. ８．イオン強度が約０．１５μである請求項７記載の組成物。
9. ９．等張性である請求項１記載の組成物。
10. １０．さらに、組成物を等張性にする物質をも含有する請求項９記載の組成物。
11. １１．物質がアルカリ金属の塩またはアルカリ土類金属の塩、あるいは糖アルコ ールである請求項１１記載の組成物。
12. １２．物質がアルカリ金属またはアルカリ土類金属のハロゲン化物、またはマン ニトールである請求項１１記載の組成物。
13. １３．物質が塩化ナトリウムである請求項１２記載の組成物。
14. １４．バッファーがクエン酸バッファーであって、ｐＨが約５である請求項１３ 記載の組成物。
15. １５．さらに、多価糖アルコール、エタノール、またはポリプロピレングリコー ルをも含有する請求項１記載の組成物。
16. １６．多価糖アルコールが、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラ ビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールからなる群から選択 されるものである請求項１５記載の組成物。
17. １７．糖アルコールが組成物に対して約１〜２５重量％の量で加えられている請 求項１６記載の組成物。
18. １８．糖アルコールが組成物に対して約２〜５重量％の量で加えられている請求 項１７記載の組成物。
19. １９．滅菌されている請求項１記載の組成物。
20. ２０．液状形である請求項１記載の組成物。
21. ２１．凍結乾燥形である請求項１記載の組成物。
22. ２２．凍結液体の形である請求項１記載の組成物。
23. ２３．ゲル形である請求項１記載の組成物。
24. ２４．さらに、水溶性の多糖類またはポリエチレングリコールをも含有する請求 項２３記載の組成物。
25. ２５．多糖類がメチルセルロースである請求項２４記載の組成物。
26. ２６．メチルセルロースがゲルの約２−５％を構成し、レラキシンがゲル中約１ ００−１０００μｇ／ｍｌの量で存在する請求項２５記載の組成物。
27. ２７．メチルセルロースがゲルの約３−４％を構成し、レラキシンがゲル中約３ ００−１０００μｇ／ｍｌの量で存在する請求項２６記載の組成物。
28. ２８．ゲルが滅菌されている請求項２３記載の組成物。
29. ２９．さらに、組成物で処置されている宿主へのレラキシンの供給を増大する物 質をも含有する請求項２３記載の組成物。
30. ３０．物質がオレイン酸、ナイアシンアミド、ニコチン酸またはサリチル酸、ま たはその塩またはエステル、アゾン、グリココーレート、コーレート、フシジン 酸、またはフシジン酸の塩またはエステルである請求項２９記載の組成物。
31. ３１．さらに、ゲルの光酸化を防止する物質をも含有する請求項２３記載の組成 物。
32. ３２．物質が抗酸化剤または補助溶剤、あるいはその混合物である請求項３１記 載の組成物。
33. ３３．物質がアスコルピン酸、エタノールまたはグリセロール、あるいはその混 合物である請求項３２記載の組成物。
34. ３４．哺乳類の妊娠および分娩期間中における生殖の生理学を調節する方法であ って、哺乳類に請求項１記載の組成物を治療有効量、投与することからなる方法 。
35. ３５．哺乳類がヒトである請求項３４記載の方法。
36. ３６．哺乳類の妊娠および分娩期間中における生殖の生理学を調節する方法であ って、哺乳類に請求項２３記載の組成物を治療有効量、投与することからなる方 法。
37. ３７．哺乳類がヒトである請求項３６記載の方法。