PT89835B - Processo para a preparacao de uma formulacao de relaxina humana - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA processo para a que consiste em desde cerca de

GENENTECH, INC.

PROCESSO PARA

HUMANA

O presente invento diz respeito a um preparação de uma composição farmacêutica se formular relaxina humana a um pH ácido até menos de aproximadamente 7.

A PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO DE RELAXINA

A composição, útil no trabalho de parto e na inibição do parto permaturo, inclui um tampão capaz de manter o pH da composição dentro de uma gama pretendida e pode também incluir um agente para tornar a composição isotónica e um agente estabilizador, se necessário. Um exem pio especifico é uma relaxina humana formulada num tampão citrato, pH aproximadamente 5,0, na presença de cloreto de sódio, numa força iónica de cerca de 0,15 μ.

Fundamento do invento

Campo dó invento

Este invento está relacionado com uma formulação estável e homogénea de relaxina humana biologicamente activa e com um método para o tratamento de mamíferos em tal formulação.

Descrição de trabalhos anteriores

A relaxina humana madura é um peptideo hormonal do ovário com aproximadamente 6000 daltons que se sabe ser responsável pela remodelação do aparelho reprodutor antes do parto, facilitando assim o processo do nascimen to. Hisaw, F.L., Pros. Soc. Exp. Biol. Med., 23, 661-663 (1926); Scwabe, C. et al., Biochem. Biophys. Pes. Comm., 75: 503-570 (1977); James , R. et al., Nature, 267: 544:546 (1977)

Esta proteína parece modular a reestru turação dos tecidos conjuntivos nos orgãos alvo para se obter as alterações necessárias na estrutura dos orgãos durante a gravidez e parto. Alguns dos papéis importantes da relaxina como hormona da gravidez incluem inibição do trabalho de parto prematuro e amadurecimento cervical no parto.

Apesar de ser predominantemente uma hormona da gravidez, a relaxina também foi detectada em mulheres não grávidas e no homem. Bryant-Greenwood, G.D., Endocr ine Reviews. 3_: 62-90 (1982) e Weiss, G. , Ann. Rev. Physiol., 46: 43-52 (1984).

A relaxina tem sido purificada a partir de uma variedade de espécies animais incluindo porco, ratinho, cavalo, tubarão, tigre, ratao, cação e homem e apresenta homologia, pelo menos primária e secundária, com a insuli^ na e com o factor de crescimento tipo insulina. No homem a relaxina encontra-se em maior abundância no corpo luteo (CL) da gravidez.

Através da utilização de sondas do gene da relaxina do poro, foram identificados por clonagem genómica duas formas do gene humano (Hudson, P. et al., Nature, 301: 628-631 7~1984 7 e Hudson, P. et al., The EMBO Journal, _3: 2333-2339 /”1984_7 ) , apesar de apenas uma destas formas de genes (H2) ser transcrita em CL.

E pouco claro se o outro gene é expres so num outro sítio do tecido ou se representa um pseudo-gene. Os dois genes da relaxina humana apresentam considerável homologia de nucleotideos e aminoácidos um em relação ao outro, particularmente nos peptideos B e C. No entanto, existem algumas regiões com importantes divergências de sequência, particularmente na região amino-terminal das cadeias A e B.

De modo idêntico em todas as espécies examinadas, o produto primário da tradução da relaxina H2 é uma proprorelaxina consistindo numa sequência sinal de 24 aminoácidos seguido de uma cadeia B de cerca de 29 aminoác_i dos, um peptideo de ligação de 104-107 aminoácidos e uma cadeia A de cerca de 24 aminoácidos.

O facto de a relaxina H2 ser sintetizada e expressa no ovário sugere que esta é a sequência que está envolvida na fisiologia da gravidez.

I

Quando a relaxina (H2) sintética humana e certos análogos da relaxina humana foram testados quanto à actividade biológica, os testes revelaram um núcleo de relaxina necessário à actividade biológica assim como certas substituições de aminoácidos que não afectaram a actividade biológica. Johnson et al., em Peptides: Structure and Func tion, Proc. Ninth American Peptide Symposium, Deber, C.M. et al. , (edsJ (Pierce Chem. Co. 1985).

Foram publicados vários métodos para a aplicação ou introdução de relaxina de porco-corno droga, incluindo administrações intravenosas e intramusculares. Birnberg and Abitol, Obstet. & Gynecol., 10: 366-370 (1957); Eichner et al., Am. J. Obstet. Gyn., 71: 1035-1048 (1956).

Em adição a relaxinasde porco tem sido usada topicamente em ensaios clinicos com humanos para amadurecimento do canal cervical e indução do trabalho de parto. MacLennan et al., Obstetrics & Gynecology, 68: 598-601 (1986); MacLennan et al., The Lancet, i: 220-223 (1980); MacLennan et al., Obstretics & Gynecology, 58: 601-604 (1981); MacLennan et al., Aust. NZ J. Obstet. Gynaec., 25: 68-71 (1985).

Nestes estudos a relaxina de porco em água destilada foi misturada com grânulos de metilcelulose solúveis em água para fazer um gel viscoso. Observou-se que uma dose de 2 mg era eficaz no aumento do amadurecimento cer vical. MacLennan et al., (1981), supra.

Em adição, a relaxina de porco foi mol dada em pastilhas feitas com polietilenoglicol e usada para amadurecer o canal cervical humano. Evans et al., Am. J.

Obstet. Gynecol., 147: 410-414 (1983).

A relaxina de porco também tem sido formulada por suspensão em gel K-Y estéril e em tampão salinode fosfatos e administrado por infusão na abertura cervical através de uma pipeta de inseminação estéril!·.A dilatação do canal cervical aumentou dentro de 8 horas após infusão de 3000 unidades de relaxina na abertura cervical. Peresgrovas and Anderson, Biology of Reproduction, 26: 765-776 (1982).

A Publicação da Pat. Europeia Νθ 101,309 publicada em 22 de Fev. 1984 e Pat. U.S. Nâ 4 758 516 publicada em 19 de Julho de 1988 divulgam respectivamente a clonagem molecular e caracterização da sequência de um gene C£ dificador da relaxina Hl humana e da relaxina H2 humana e seus análogos.

Publ. Pat. Europeia NQ 260 149, publicada em 16 de Março de 1988, descreve as formulações da pero-relaxina humana. Pat. U.S. N° 4 267 101 publicada em 12 de Maio de 1981 , descreve um processo para obtenção da re laxina humana a partir de membranas fetais. A Publ. Pat. Europeia N° 251 615 publicada em 7 de Jan. de 1988, descreve como combinar a cadeia A de relaxina humana reduzida ou aná logo com a cadeia B de relaxina humana reduzida ou análogo em condições gue incluem um pH superior a cerca de 7,0.

Na Pat. U.S. n3 4267 101 está divulgado um processo para a obtenção de relaxina humana a partir de membranas fetais. Sherwood em The Physiology of Reproduc tion, ed. por Knobil e Neill, (New York, Raven Press, 1988), p. 585-673, descreve na pág. 587 que quase todos os processos para a extracção e isolamento da relaxina tiram vantagem da estabilidade da relaxina em solventes acídicos.

-Ί-

Em adição, na página 588 é mencionado que um meio fortemente ácido para a extracção de relaxina minimiza a proteólise quer pelo pH baixo per se quer pela precipitação de proteases de alto peso molecular. Eldridge and Fields, Endocrinology, 117: 2512-2519 (1985) divulgaram que a relaxina de coelho tem um ponto isoeléctrico, conforme determinado por isoelectrofocagem, de aproximadamente 6,5. Isto contrasta com os resultados de Fields et al., Ann. NY Acad. Sei. , 380: 75(1982), que descobriram um ponto isoeléctrico muito mais alto para a relaxina de coelho.

Ainda, a Patente U.S. N° 2 964 448, publicada em 13 de Dezembro, 1960, descreve composições de relaxina injectáveis compreendendo relaxina num óleo injectável , de preferência de acidez baixa, juntamente com um sal de ácido gordo de aluminio.

Constitui um objectivo do presente in vento proporcionar uma formulação biologicamente activa, estável e homogénea de relaxina humana para uso terapêutico, i.e., aplicações tópicas ou parenterais. Um outro objectivo deste invento é proprocionar uma formulação que permita o armazenamento durante um periodo longo num estado liquido, facilitando assim o armazenamento e embalagem e transporte antes da administração.

Ainda um outro objectivo é reduzir a agregação e degradação da relaxina humana e proporcionar uma sua formulação que seja resistente à degradação resultante de flutuações da temperatura. Ainda um outro objectivo é a formulação de relaxina humana como gel para aplicações cervicais. Um outro objectivo é proporcionar uma formulação de relaxina humana que tenham vantagens fisico/quimicas e terapêuticas adicionais.

Estes e outros objectivos deste invento serão aparentes a partir desta especificação como um todo .

Sumário do Invento

Assim, o presente invento proporciona uma composição farmacêutica biologicamente activa útil na modulação da fisiologia da reprodução de mamíferos, compreendendo uma quantidade eficaz de relaxina humana num tampão que mantém o pH da referida composição entre cerca de 4 e menos de 7, de preferência 4,5 - 5,5. Adicionalmente, a for mulação é de preferência isotónica.

A composição pode estar na forma de liquido, liofilizado, liquidoocongelado ou gel. Se a composição estiver na forma de um gel de preferência contem ainda um polissacárido solúvel em água ou polietilenoglicol , de preferência metilcelulose.

Numa outra execução, este invento está relacionado com um método de modulação da fisiologia reprodutora de mamíferos compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composi ção aqui tratada.

Até este invento não foi apreciado que em condições ácidas as velocidades de degradação da relaxina humana conforme testado por HPLC são mais lentas num nivel óptimo. Portanto, a imunogenicidade da formulação pode ser reduzida e a sua segurança aumentada. Como resultado desta observação, a formulação de relaxina humana pode ser preparada de modo a reter actividade biológica, ter uma vida de

prateleira elevada e poder ser administrada terapeuticamente com ou sem liofilização. De preferência a relaxina é formulada a cerca de pH 5 com uma vida de prateleira (assumindo uma redução aceitável de 10% na área do principal pico de

HPLC) a 5°C de pelo menos 2 anos.

Breve descrição dos desenhos

Figs. la-le representam gráficos da fracção do principal pico de RP-HPLC para a relaxina humana em função do tempo para cinco formulações diferentes variando entre pH 3 e 7,5 a diferentes temperaturas.

Fig. 2 representa um gráfico da velocidade de degradação de formulações de relaxina humana em :: função do pH da formulação, conforme medido por PP-HPLC a diferentes temperaturas.

Figs. 3a-3e representam gráficos da actividade de relaxina humana em função do tempo para cinco formulações diferentes variando de pH 3 a 7,5 a três temperaturas diferentes.

Fig. 4 representa um gráfico de barras da velocidade de degradação a 25°C do principal pico de HPLC fase reversa numa formulação de citrato de pH 5 a gue foram adicionados diferentes agentes estabilizadores.

Fig. 5 representa um gráfico da concentração no soro versus tempo para relaxina curta em coelhos prenhes após administração intravenosa, subcutânea e intravaginal.

Fig. 6 representa um gráfico da conceri tração no soro versus tempo para relaxina curta em coelhos prenhes após administração subcutânea com e sem benzopurpuri na.

Descrição das realizações preferidas

Conforme agui é usado, relaxina humana significa uma proteina funcional tendo funções hormonais especificas, tais como, por exemplo, a modulação da fisiologia reprodutora de serès humanos e possivelmente outros mamíferos, incluindo, mas não estando limitados a manutenção da gravidez, realização do trabalho de parto, e aumento da mobilidade dos espermatozóides como auxiliar da fertilização.

Incluem-se como exemplos específicos de tais utilizações a :efectuação de numerosas funções reprodutoras relacionadas com?a gravidez assim como outras funções biológicas tais como preparação do canal de nascimento através, por exemplo, de efeitos na sínfise púbica-ou ligamento púbico e rearranjo dos filamentos de colagéneo assegurando assim o parto; efeitos de compressão do miomátrio; pre paração do endométrio para a implantação; papel na luteólise; crescimento e diferenciação das glândulas mamárias; aumento da mobilidade do esperma; e possível aumento da capacidade do esperma em penetrar no cervix humano.

A funcionalidade da relaxina humana ou das suas variantes é testada através da observação de um efeito positivo na sinfise púbica de murganhos num bioensaio in vitro ou de um aumento nos niveis de cAMP num ensaio in vitro usando uma linha celular uterina. O termo biologicamente activo para definir composições farmacêuticas á aqui usado no contexto estabelecido atrás para a relaxina humana.

A relaxina humana e os seus métodos de preparação, incluindo síntese em culturas de células recombinantes são conhecidos (e.g.

EP 101.309 e 112.149

Incluídas no âmbito do termo relaxina estão as relaxinas humanas derivadas de fontes recombinantes ou nativas assim como variantes de relaxina, tais como varias tes da sequência de aminoácidos.

Encontrou-se por ionização espectroscópica de massa usando bombardeamento com átomos rápidos que as espécies predominantes de relaxina humana no corpo lúteo e soro é a fç>rma de relaxina H2 com uma cadeia B truncada, . i.e., relaxina H2 (B29 A24), em que os quatro aminoácidos C-terminais da cadeia B estão ausentes de modo a que a cadeia B termine com uma serina na posição 29. Esta forma predominante (aqui designada como relaxina curta em oposição à relaxina longa contendo uma cadeia B de 33 aminoácidos) é a preferida para ser usado aqui.

Dentro do âmbito do termo relaxina humana estão incluídos outras inserções, substituições ou delecções de um ou mais resíduos de aminoácidos,,variantes de glicosilação, relaxina humana não glicosilada, sais orgânicos e inorgânicos, derivados covalentemente modificados da relaxina humana, prepro-relaxina humana e pro-relaxina humana .

Através do uso da tecnologia de DNA recombinante podem ser preparados variantes de relaxina por alteração do DNA de base. Todas estas variações ou alterações na estrutura da molécula de relaxina resultando em variantes estão incluídas dentro do âmbito deste invento desde gue a actividade funcional (biológica) da relaxina humana seja mantida.

As variantes de relaxina humana tendo a actividade funcional descrita podem ser facilmente identificados usando os ensaios in vitro atrás referidos.

Podem ser preparados variantes das se quências codificadoras da relaxina que estejamralterados de uma ou mais maneiras para introduzir codões codificadores de ácido aspártico em posições especificas dentro do gene selecionado. As proteinas variantes resultantes podem ser tratadas com ácido diluído para libertar uma proteína ou pep tideo pretendido, tornando assim a proteína mais isolável ou purif icável.

A relaxina pode também ser preparada através da produção de uma proteína de fusão da cadeia de relaxina e ubiquitiva e usando uma ubiquitina-hidrolase para clivar a proteína. Em adição, pode ser empregue um sistema de expressão em levedura para a pro-relaxina usando um vector codificador de proteína de activação trans.

A relaxina aqui tratada pode ser preparada por sintese das cadeias A e B e purificação e montagem delas, como descrito em EP 251 615, publicado em 7 de Janeiro de 1988. Para a relaxina sintética é geralmente em pregue uma proporção molar de 4:1 da cadeia A para Β. O pro duto resultante é então purificado por quaisquer processos conhecidos, incluindo, por exemplo, HPLC de fase reversa, cromatografia de permuta iónica, filtração em gel, diálise ou similares ou quaisquer combinações de tais processos.

A quantidade eficaz de relaxina para ser formulada na composição é seleccionada com base em várias variáveis, incluindo a condição especifica a ser tratada, a história médica do paciente e a via terapêutica e protocolo a ser utilizado.

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Os estados a ser tratados incluem a e pulsão difícil de um feto no fim do tempo, a inibição de tr balho de parto prematuro e o tratamento de certas perturbações do tecido conjuntivo tais como esclerodorme. A via terapêutica inclui administração parenteral, como seja, e.g. administração subcutânea, intraperitoneal, intravenosa e intramuscular .

A dosagem média corrente para o tratamento de um problema de gravidez varia dependendo de numerosos indícios conhecidos do médico, incluindo a via e protoco lo de administração, a fase da gestação, o tipo de relaxina, o estado do paciente a ser tratado, a forma da composição e outras considerações conhecidas do médico. Como exemplo, em clinica, a quantidade eficaz para administração tópica é ad£ quadamente cerca de 5 a 10 ml de-.gel contendo cerca de 1 a 3 mg de relaxina humana. As doses médias administradas intravenosamente estão na gama de cerca de 0,1 ;ug por quilogra_ ma a 1500 mg por quilograma para funções reprodutoras eficazes como seja a preparação do canal de nascimento.

O pH da formulação é mantido entre cer ca de 4 e menos de 7, mais preferido cerca de 4 a 6, ainda mais preferido cerca de 4,5 a 5,5, de preferência cerca de 5. Por sua vez, o pH óptimo dependerá da força iónica e temperatura de armazenamento da formulação.

A formulação é de preferência isotónica e de preferência a força iónica da formulação é de pelo menos cerca de 0,1 p, mais preferido cerca de 0,1 a 0,2 μ, ainda mais preferido cerca de 0,15 μ e a osmolaridade da for mulação é de preferência cerca de 200 a 300 mmol/kg, de pr£ ferência cerca de 240-260 mmol/kg.

Se a temperatura de armazenamento for de cerca de 40°C, o pH é preferencialmente cerca de 4 a menos de 7. Se a temperatura de armazenamento for de aproxima damente 25°C, o pH é de preferência cerca de 4 a 5.

De preferência o pH da solução aqui tratada é mantido através do uso de um tampão capaz de manter o pH dentro da gama pretendida. Se um tampão particular pode ser empregue dependerá da sua capacidade de tampão e mais especialmente do seu valor de pk. Exemplos incluem certos tampões de ácidos orgânicos e histidina.

Tampões de ácidos orgânicos adequados (tampões de ácidos orgânicos e seus sais) incluem e.g. tampões citrato (e.g. mistura de citrato mono-sódico e de citra_ to di-sódico, mistura de ácido citrico e citrato tri-sódico, mistura de ácido citrico e citrato mono-sódico, etc), tampões succinato (e.g. mistura de ácido succínico e succinato mono-sódico, mistura de ácido succínico e hidróxido de sódio, mistura de ácido succínico e succinato di-sódico, etc), tampões tartrato (e.g., mistura de ácido tartárico e tratrato de sódico, ácido tartárico e tartrato de potássio, mistura de ácido tartárico e hidróxido de sódio, etc), tampões mala to, tampões gluconato (e.g. mistura de ácido glucónico e glu conato de sódio, mistura de ácido glucónico e hidróxido de sódio, mistura de ácido glucónico e gluconato de potássio, etc), tampões borato, tampões imidazole, tampões lactato (e.g. mistura de ácido láctico e lactato de sódio, mistura de ácido láctico e lactato de potássio, etc), tampões acetato (e.g. mistura de ácido acético-acetato de sódio, mistura de ácido acético e hidróxido de sódio, etc) .

Os tampões mais preferidos aqui usados são tampões citrato e acetato, de preferência citrato. Deve-se salientar que tampões, tais como, tampões de fosfatos

e tris que têm sido usados tradicionalmente não mantêm o pH da formulação no nivel pretendido.

A formulação aqui tratada tem de preferência a isotomicidade e osnolalidade correctas para poderem ser usadas em aplicações parenterais, particularmente via intravenosa. Se a força iónica e a osmolalidade não estiverem dentro das gamas preferidas atrás mencionadas e se pretenda ajustá-las aquelas gamas, pode-se adicionar um agen te à formulação que ajuste adequadamente a osmolaridade.

Tais agentes incluem, por exemplo, sais de metais alcalinos e sais de metais alcalino terrosos tais como haletos, por exemplo, cloreto de sódio e potássio, brometo de magnésio, etc. e álcoois de açucares poli-hidricos tais como manitol. O agente mais preferido é o cloreto de sódio.

Também se pode adicionar à formulação um agente farmaceuticamente aceitável para estabilização e liofilização da formulação. Os exemplos incluem álcoois de açucares poli-hidricos tais como álcoois tri-hidricos ou superiores, de preferência glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol, assim como álcoois de cadeia linear tais como e.g., etanol e propilenoglicol.

Estes agentes podem ser usados sozinhos ou combinados. De preferência o agente é formulado numa quantidade de cerca de 1 a 25% por peso, e de preferência 2 a 10% por peso, tendo em consideração as quantidades dos outros ingredientes.

Em adição, a composição aqui descrita contem adequadamente um agente para aumentar a absorção pelo cervix ou vagina se a preparação for tópica.

São exemplos de tais estimuladores da adsorção moléculas que tenham uma estrutura semelhante a do colestrol tais comoglicocolato, e.g., glicocolato de sódio, colato, e.g., colato de sódio e ácido fusidico e seus derivados, incluindo sais e ésteres tais como 24,25-tauro-di-hidrofusidato; tensioactivos não iónicos; derivados de ácidos gordos tendo cerca de 7 a 25 átomos de carbono, como seja o ácido oleico; niacinamida; ácido nicotinico ou salicilico ou os seus sais ou ésteres; e azona.

A composição liquida preferida neste caso.é relaxina humana num tampão citrato 10 mM a pH 5, com cloreto de sódio presente para uma força iónica total de cerca de 0,15 μ, representando a osmolalidade correcta.

A formulação aqui descrita pode ser na forma liquida, congelada ou de gel, ou pode ser liofilizada e reconstituída. Um^entendido na matéria será capaz de determinar o tipo e quantidade de qualquer excipiente adicional como seja um álcool de açúcar, que possa ser necessário para optimizar a liofilização.

O manitol é um desses aditivos preferidos. A formulação aqui descrita é estável durante períodos de tempo prolongados e pode ser guardada num estado liquido a várias temperaturas. De preferência, a formulação liquida é guardada em vidro e não em plástico.

Em adição, a formulação pode ser conge lada, descongelada, congelada novamente e outra vez descongelada sem efeitos adversos. Uma temperatura de armazenamen to preferida varia entre cerca de 2 e 8°C. A formulação na forma liquida manterá a actividade biológica durante pelo menos 30 dias e a estabilidade fisica durante pelo menos 2 anos conforme extrapolado a partir dos dados de 1 ano.

Para a obtenção de uma formulação em gel, a composição liquida é tipicamente misturada com uma quantidade eficaz de um polissacárido solúvel em água ou polietilenoglicol para formar um gel com a viscosidade correcta para ser aplicado topicamente.

polissacárido que pode ser usado in clui, por exemplo, derivados de celulose tais como derivados de celulose esterifiçados, incluindo alquil-celuloses, hidroxi-alquil-celuloses e alqui-hidroxiceluloses, por exemplo, metilcelulose , hidroxietil-celulose , carboximetilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose e hidroxipropilcelulose; amido e amido fraccionado; agar, ácido alginico e alginatos; goma arábica; pululano; agarose; carragenano; dextranos; dextrinas; fructanos; inulina; mananos; xilanos; arabinanos; quitosanos; glicogénios; glucanos; e biopolimeros sintéticos; assim como gomas tais como goma xantano; goma guar; goma de alfarroba; goma arábica; goma tragacanta; e goma de Karaya; e seus derivados e misturas.

O agente de gelificação preferido neste caso é um que seja inerte para os sistemas biológicos, não tóxico, simples derpreparar, e não demasiado fluido ou viscoso e que não desestabilize a relaxina nele contida.

De preferência o polissacárido é um derivado esterifiçado da celulose, mais preferencialmente um que seja bem definido, purificado e que faça parte da lis ta da USP, e.g. derivados de metilcelulose e a hidroxialquil-celulose tais como, hidroxipropilcelulose, hidroxietilcelulose e hidroxipropil-metilcelulose. 0 mais preferido é metilcelulose.

polietilenoglicol usado na gelific^ ção é tipicamente uma mistura de polietilenoglicóis de baixo e alto peso molecular para se obter a viscosidade correcta. Por exemplo, uma mistura de um polietilenoglicol de peso rri£ lecular 400 - 600 com um de peso molecular 1500, será eficaz para esta finalidade quando misturados na proporçãoocorrecta para se obter uma pasta.

O termo solúvel em água conforme aplicado aos polissacáridos e polietilenoglicóis pretende iri cluir soluções coloidais e dispersões. Em geral, a solubil_i dade dos derivados de celulose é determinada pelo grau de substituição dos grupos éter e os derivados estabilizadores aqui usados deverão ter uma quantidade suficiente de tais grupos éter por unidade de anidroglucose na cadeia de celul£ se para tornar os derivados solúveis em água. Um grau de su bstituição de éter pelo menos 0,35 grupos éter por unidade de anidroglucose é geralmente suficiente. Adicionalmente, os derivados de celulose podem estar na forma de sais de metais alcalinos, por exemplo, os sais de Li, Na, K ou Co.

Se se empregar metilcelulose no gel, de preferência constitui cerca de 2 - 5% do gel e a relaxina está presente numa quantidade de cerca de 100 - 1000 jug por ml de gel. Mais preferencialmente, a metilcelulose compreen de cerca de 3% do gel e a quantidade de relaxina é de cerca de 300 - 1000 pg por ml de gel.

Também, se a formulação for um gel que seja sensível à luz, de preferência contem um ou mais agentes tais como anti-oxidantes, de preferência ácido ascórbico (de preferência pelo menos 0,5%) e/ou co-solventes, de preferência glicerol e/ou etanol (de-preferência a cerca de 20%), mais preferencialmente glicerol para inibir ou evitar foto-oxidação se o gel for exposto à luz.

Por exemplo, o gel de metilcelulose é guardado num recipiente coberto com papel estanhado ou num recipiente com cor para evitar a entrada da luz.

Os exemplos que se seguem ilustram o presente invento mas não devem ser encarados como limitantes do âmbito do invento.

EXEMPLO I

Os estudos de estabilidade da relaxina humana foram efectuados em vários tampões 10 mM variando entre pH3 e 10 (Estudo 1). Os efeitos do aumento da força iónica na estabilidade das formulações foram também estudados (Estudo 2).

Preparação da amostra

Para os Estudos 1 e 2, a relaxina humana longa (forma H2 com cadeia B de 33 aminoácidos) foi obtida através da sintese das cadeias A e B (divulgado em EP 112 149, supra) usando a metodologia de sintese em fase sólida de Barany, G. and Merrifield et al., (1980) em The

Peptides, _2: 1-284, Gross, E. e Meienhofer, J., eds., Academic Press, New York.

As cadeias foram purificadas por HPLC (gradiente de ácido trifluoroacético (TFA/acetonitrilo) e montadas numa proporção de pesos de 4:1 de cadeia A:B a pH de aproximadamente 10,2 em tampão CAPS 0,2 - 1M (ácido 3-/~ciclo-hexilamino_7 propanossulfónico, Cabliochem), hidrocloreto de guanidina 0,75 M, 10% (v/v) metanol (Burdick e

Jackson) e uma gama de proteína total de 0,25 a 2,0 ^ig/ml.

A solução foi bastante gaseada com azoto e agitada durante a noite (12-18 horas) a 20°C.

A amostra é então dialisada contra um tampão adequado (tampão salino de fosfatos, 0,01% de Tween 20 ou 0,1% de ácido acético) e aplicada numa coluna de HPLC Vydac C-4 usando um gradiente de TFA /acetonitrilo. A fracção de relaxina foi identificada em HPLC e colhida num tampão TFA que foi removido da amostra com vácuo. A relaxina assim obtida foi liofilizada.

124 mg (cerca de 80% por peso como pep tideo) da relaxina longa foi empregue no Estudo 1 e 20 mg (cerca de 67% por peso de peptideo) para o Estudo 2. Ambas as amostras consistiam em pós brancos liofilizados com até 15% por peso de ácido trifluoroacético (TFA). Adicionou-se suficiente água Milli-Q (água desionizada que foi passada através de um sistema de purificação de água consistindo em carvão activado e permuta de iões fabricado pela Millipore Inc.) para se obter uma concentração de cerca de 1 mg/ml de peptideo.

A relaxina longa em água Milli-Q foi passada para o sistema tampão adequado à formulação por diálise a 5°C usando tubo de diálise Spectrator 7 (peso molecu lar de exclusão 3500). Este tubo foi pré-limpo em 2 litros de água Milli-Q contendo 1 ml de β -mercaptoetanol, 3,36 g de EDTA e 4,2 g de NaHCO^ seguido de quatro lavagens em 2 litros de água Milli-Q a 60 - 70°C. A tubagem foi subsequeri temente guardada em etanol 50% (p/v) a 5°C e lavada extensivamente antes da diálise.

As concentrações de todas as amostras imediatamente após a diálise foram determinadas por espectroscopia de absorção de ultravioleta usando um coeficiente de extinção de 2,18 (mg/ml) cm conforme determinado pela análise quantitativa de aminoácidos num análogo de relaxina onde os resíduos de metionina foram substituídos por resíduos de lisina, corrigindo as concentrações para os efeitos de dispersão da luz.

Cada uma das amostras foi esterilizada por filtração numa hote de fluxolaminar através de filtros 0,2 M Millex GV-4 (área de 0,01 polegadas quadradas) para frascos de vidro estéreis em boro-silicato de 100 jul, 300 /jl ou 1,5 ml (Wheaton) com rolhas com vedantes de Teflon e guardadas a 5, 25 e 40°C. As concentrações são indicações precisas do gue foi filtrado para os frascos, pois experiên cias separadas indicam gue a filtração a lmg/ml não resulta num abaixamento significativo da concentração de proteína.

No Estudo 1, os frascos em triplicado para cada tampão foram guardados a cada uma das temperaturas para se obter estimativas de erro e para determinar se as amostras estavam contaminadas quando da amostragem repetida a partir do mesmo frasco.

Para o Estudo 3, empregou-se a relaxina H2(.B33 A24) Apyro-Glu , em que H2 se refere ao gene humano expresso no ovário humano, A e B referem-se às respectivas cadeias da relaxina humana, os numeros a seguir a A ou a B referem-se ao comprimento da cadeia, i.e., numero de aminoácidos que constituem a cadeia A ou B e o superscript que precede o aminoácido designa a cadeia A ou B em? gue o aminoácido está situado e o expoente gue se segue ao aminoácido refere-se à posição na cadeia.

A preparação deste análogo e a recombinação das cadeias estão descritas de um modo geral na Pub. EP N° 251.615, supra. A proteína foi purificada como descrito atrás para os Estudos 1 e 2.

Cerca de 36 ml da relaxina pifoglu humana a cerca de 4,65 mg/ml foi formulado em 10 mM citrato a pH 5,0 como descrito atrás e tornado isotónico pela adição de NaCl. Esta proteina foi diluida a 1 mg/ml (determinado espectrofotometricamente usando um coeficiente de extinção de 2,18). Um total de 1,4 ml de cada formulação foi esterif lizado por filtração numa hote de fluxo laminar para frascos de vidro de 1,5 ml autoclavados equipados com rolhas de Teflon. Num estudo de efeitos de congelação/descongelação a proteina foi também diluida para 2 mg/ml e congelada e em seguida fizeram-se os estudos.

Protocolo de estabilidade

Estudo 1: Porções de vinte ml de rela xina longa a cerca de 1 mg/ml em água foram passados para 20 mM glicina (pH3), 10 mM citrato (pH5), 10 mM acetato (pH5), 10 mM histidina (pH6) e tampão 10 mM Tris (pH 7,5) com as composições exactas descritas na Tabela I , com os ira gredientes do tampão citrato calculados para dar um pH de 5,0. Todos os tampões foram tornados isotónicos (0,154 μ) com a adição de NaCl.

As concentrações foram determinadas como previamente descrito, as amostras esterilizadas por filtração e os frascos cheios de acordo com o protocolo mos trado na Tabela II. Os 135 frascos resultantes de 100 e os 90 frascos de 1,5 ml foram sujeitos a testes de estab_i lidade a 5, 25 e 40°C.

As amostras foram testadas aos 0 , 7, 21 e 30 dias por ensaios de HPLC em fase reversa, ELISA e AMP cíclico. Além destes ensaios as amostras foram também testadas por dicroismo circular perto do UV (near UV CD) , e ultracentrifugação anlitica (UC) nos dias 0 a 30. Em adi_ ção, a formulação de citrato foi analisada durante cinco meses por RP-HPLC a 5°C e durante sessenta dias por RP-HPLC a -20°C.

Estudo 2: Porções de 1 ml de relaxina longa a cerca de lmg/ml em água foram passadas por diálise para tampões 10 mM acetato, citrato e succinato a pH5 sem sal adicional, 0,1 M ou 0,5 M NaCl (composições dos tampões dadas na Tabela I). As nove amostras resultantes foram esterilizadas por filtração, divididas por três volumes iguais e introduzidas em frascos esterilizados de 300 jil em vidro.

Os 27 frascos resultantes contendo cerca de 9 mg foram colocados a 5,25 e 40°C durante até 40 dias para testar a estabilidade. As amostras foram testadas por um ensaio de ELISA e um ensaio de HPLC em fase reversa C4 nos dias 0, 7, 14, 28 e 40. As restantes 3 ml de relax_i na foram mantidos em água Milli-Q a 5°C e usadas como material de referência.

Os resultados no Estudo 1 e nos subsequentes estudos de estabilidade mostraram que esta relaxina é estável em água, demonstrado por HPLC, durante pelo menos cinco meses a 5°C. Estas observações foram repetidas em amostra referência usadas em subsequentes estudos de estabilidade .

TABELA I

FORMULAÇÕES LIQUIDAS PROTOTIPO PARA A RELAXINA A 1,0 MG/ML

FORMULAÇÕES PARA O ESTUDO 1

Formulação

Composição por ml

10	mM Glicina,	pH	3,0	0,74	mg Glicina-HCl (6,66 mM)
				0,25	mg Glicina (3,34 mM)
				8,87	mg NaCl (0,152M)
10	mM Acetato,	pH	5,0	0,25	Acetato de Sódio (2,96 mM)

7,0 pL l,0M Acido acético (7,04mM)

			8,60	mg	NaCl (0,147M)
10	mM	Citrato, pH 5,0	0,69	mg	Acido Citrico Mono-hidra-
			tado	(3	,3 mM)
			1,97	mg	Citrato de sódio Di-hi-
			dratado	(6,7 mM)
			7,25	mg	NaCl (0,124 M)
10	mM	Histidina, pH 6,0	1,12	mg	Histidina-HCl (5,32 mM)
			0,73	mg	Histidina (4,68 mM)
			8,66	mg	NaCl (0,148M)
10	mM	Tris, pH 7,5	1,32	mg	Tris-HCl (8,36 mM)
			0,20	mg	Tris Base (1,64 mM)
			8,52	mg	NaCl (0,146 mM)

*

Todas as formulações sao nica sendo completada pela isotónicas (0,154 μ, a força ióadição de NaCl).

-25-26-

TABELA II

VOLUME (pL) DA FORMULAÇÃO POR FRASCO NECESSÃRIO PARA CADA EN

SAIO NO ESTUDO 1 DA ESTABILIDADE DA RELAXINA

Tempo ELISA UV HPLC AMP Near UV CD UC

Ciclico

0 dia	10	100	10	10	500	50
7 dias	10 .	-	10	10	-	-
14 dias	10	-	10	10	-	-
21 dias	10		10	10		—

1 mês	10	100	10	10	500	50
2 meses	10	100	10	10	500	50
3 meses	10	100	10	10	500	50
4 meses	10	100	10	10	500	50
5 meses	10	100	10	10	500	50
6 meses	10	100	10	10	500	50

100 /41 da proteina formulada para os ensaios de ELISA,HPLC e AMP ciclico nos dias 7, 14~e 21 foram colocados em frascos esterilizados de 100 pil (3 frascos/ensaio x 5 formulações x 3 temperaturas = 45 frascos).

As amostras de 1~, 2” e 3 meses foram agrupados de modo semelhante (45 frascos) e as amostras de 4, 5 e 6 meses foram agrupados de modo semelhante em mais 45 frascos , resultando em 135 frascos de 100 ^11 para estes três ensaios.

A restante proteina formulada foi distribuída por frascos de 1,5 ml de modo a cada frasco contar 0,9 ml, o que foi volume suficiente para os ensaios de CD, UV e UC.

Isto resultou num total de 90 frascos de 1,5 ml (5 formulações x 3 temperaturas χ 6 pontos do tempo ) .

Estudo 3: As formulações com o análogo de relaxina a serem avaliadas foram as seguintes:

1. Tampão citrato 10 mM tornado isotónico com NaCl.

2. Tampão citrato 10 mM tornado isotónico com NaCl dialisado contra um tampão citrato isotónico preparado de fresco. (Isto serve como controle).

3. Tampão citrato 10 mM tornado isotónico com manitol (5,07%) dialisado contra um tampão citrato 10 mM, 5,07% de manitol (sem NaCl).

4 .	Tampão citrato	10	mM tornado isotónico	com	NaCl	a	gue	foi
	adicionado 5% de	etanol absoluto.
5 .	Tampão citrato	10	mM tornado ' isotónico	com	NaCl	a	que	foi
	adicionado 10%	de	etanol absoluto.
6 .	Tampão citrato	10	mM tornado isotónico	com	NaCl	a	que	foi
	adicionado 5% de	glicerol.
7.	Tampão citrato	10	mM tornado isotónico	com	NaCl	a	que	foi
	adicionado 10%	de	glicerol.

8. Tampão citrato	10	mM tornado isotónico	com	NaCl	a	que	foi
adicionado 5% de	propilenoglicol.
9. Tampão citrato	10	mM tornado isotónico	com	NaCl	a	que	foi
adicionado 10%	de	propilenoglicol.
10.Tampão citrato	10	mM tornado isotónico	com	NaCl	a	que	foi
adicionado 0,02%	de EDTA (sal disódico)	•
11.Tampão cittato	10	mM tornado isotónico	com	NaCl	a	que	se

adicionou 5% de manitol.

Estas formulações foram colocadas em triplicado a 5, 25 e 40°C.

Em adição, 1 ml de relaxina a 2 mg/ml no tampão citrato isotónico (NaCl) original foi introduzido, em condições de esterilidade, em 27 frascos de 1,5 ml e con gelado a -20°C. No dia 0, três frascos foram descongelados e testados; nos dias subsequentes três frascos foram descon gelados e testados.

Métodos de ensaio

Ensaio de HPLC: Obtiveram-se cromatogramas em colunas de

TM fase reversa Vydac C4 usando as condições de coluna que se seguem: caudal 1 ml/min., solução A: 0,1% TFA, solução B: 0,1% TFA, 90% acetonitrilo,gradiente de 20% A a 50% B a 1%/ /minuto.

No Estudo 1, as áreas totais dos cromatogramas mantiveram-se constantes dentro do erro das medições, i.e., o decréscimo da área do pico principal foi acompanhado de um aumento das áreas dos picos laterais.

A regeneração subsequente da coluna de HPLC revelou que a maior parte -da relaxina eluiu nas condições de gradiente. Este comportamento contrasta com o que foi observado no Estudo 2 e onde a área total determinada pelo ensaio de HPLC não foi constante ao longo do tempo. Uma vez que o material foi purificado num grau maior, a esta bilidade conforme medidopor HPLC aumentou.

Ensaio de ELISA: As amostras foram diluidas no tampão de diluição para os ensaios de ELISA de modo a que a concentração esperada caísse na gama média da porção linear da curva padrão. O principal anticorpo para o ensaio de ELISA é um anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade induzido contra o peptideo sintético da relaxina humana em que a cadeia A da relaxina humana tem um piro-Glu na posição 2 da cadeia.

As concentrações conforme determinado por ELISA foram normalizadas por uma referência que foi submetida juntamente com as amostras de estabilidade. Os valores determinados por ELISA foram geralmente superiores aos valores esperados baseados na espectroscopia de UV, mas após normalização, foram cerca de 20% inferiores aos valores esperados. No Estudo 1 as amostras em triplicado foram submetidas para cada ponto do tempo por diluição das amostras de cada um dos três frascos.

Ensaio de AMP ciclico: As amostras foram diluidas num tampão de ensaio de células e incubadas com células uterinas de Macaco Rhesus. A suspensão de células resultante foi testada para AMP ciclico usando o processo de ensaio de fabricante da duPont de Nemours, Inc., Wilmington, Del. Usou-se uma curva padrão para relacionar concentração de AMP ciclico com concentração de relaxina.

Esta concentração é teoricamente bioactiva ao contrário da ELISA, que mede uma concentração imuno-reactiva. Uma amostra referência de concentração conhecida foi submetida juntamente com amostras de estabilidade e usada para normalizar as concentrações determinadas de relaxina.

Ensaio de Sinfise Púbica de Ratinho: O bioensaio in vivo do ligamento da sinfise púbica de ratinho mede o efeito remodulador da relaxina sobre o tecido conjuntivo. Ver Steinetz

B.G. et al (1960 ) Endocrinology, 67: 102.

Dicroismo Circular Perto do UV: Amostras de relaxina a cerca de 1 mg/ml foram diluidas a 1:1 com dialisato e o espectro obtido numa couvete cilíndrica termostatizada de 0,5 cm de passo, a 20°C de 320 a 240 nm num espectropolarimetro Cary 60 modificado Aviv Tm. Após colheita dos resultados de CD a amostra foi removida da célula de CD e diluída cinco vezes em tampão salino de fosfatos.

A concentração foi então determinada como antes usando espectroscopia de absorção de UV. O sinal de CD em elipticidade (miligraus) foi convertido em elipticidade média do peso de resíduos conforme descrito por Adler et al., Meth. Enzymol., 27: 675 (1973) usando um peso médio de residuo de 112,9 g para a relaxina humana.

Ultracentrifugação Analítica: As amostras de estabilidade da relaxina foram diluidas quatro vezes com o dialisato adequado e aplicadas em células de ultra-centrifuga de duplo-sector, as quais foram colocadas num rotor analítico An-F de 4 furos. A centrifugação foi efectuada numa ultracentrifuga analítica.Beckman modelo E a 3200 rpm a 20,0°C durante 18 horas.

Em experiências separadas determinou-se que 18 horas foi o tempo suficiente para obter equilíbrio na sedimentação. O gradiente de concentração na célula foi determinado por absorção de UV a 280 nm usando um varredor óptico fotoeléctrico. Os traçados das curvas foram introduzidos num computador Macintosh usando uma almofada

TM de desenho Macintizer . 0 peso molecular médio está relacionado com o gradiente de concentração na célula usando a equação (Teller, Meth. Enzym., 27: 346

M = 2RT/ Γ w^(l-vp) 7 dlnc/dr^ w — — onde M_w é o peso molecular médio, T é a temperatura, R é a constante dos gases, W é a velocidade angular em radianos, v é o volume especifico parcial da proteína, p é a densidade da solução , c é a concentração de proteína e r é a distância radial a partir do centro de rotação. A equação assume uma solução ideal e parece ser adequada à sedimentação da relaxina nas condições de tampão escolhidas.

A análise de regressão de mínimos quadrados do lnc versus r dá o peso molecular médio como média relativamente à gama de concentraçãona célula. Os dados foram também tratados com um polinómio de terceira ordem e os valores para dlnc/dr obtidos para cada concentração foram medidos na célula da centrífuga.

O volume especifico parcial de 0,731 ml/g para a relaxina foi deduzido a partir da composição em aminoácidos usando valores para os resíduos de aminoácidos individuais de acordo com Cohn e Edsall, Proteins and Peptides as lon and Dipolar Ions (Hafner: New York, 1985), pág. 157-175.

-32Resultados

Estudo 1: A degradação da relaxina em função do tempo foi controlada por HPLC de fase reversa. Como a área total de todos os picos de HPLC permaneceram constantes ao longo do tempo, a percentagem da área total foi usado para investigar a cinética da degradação da relaxina.

A fraeção dó pico principal que permaneceu foi calculada a partir de amostras em triplicado (quan do disponíveis) e foram determinadas curvas de primeira ordem da cinética de degradação do principal pico de HPLC para as cinco formulações apresentadas na Tabela I (variando entre 3,0 e 7,5). As cinéticas foram seguidas medindo a velocidade de desaparecimento do pico principal da relaxina por HPLC de fase reversa.

As Figuras la-le são gráficos da fraeção dó pico principal de HPLC versus tempo para as cinco for mulações a estas três temperaturas, indicando a velocidade de degradação. A Fig. 19 é relaxina em 10 mM glicina (pH 3,0), a Fig. lb é relaxina em citrato 10 mM (pH 5,0), a Fig. lc é relaxina em histidina 10 mM (pH 6,0), a Fig. Id é relaxina em acetato 10 mM (pH 5,0) e a Fig. le é relaxina em 10 mM Tris (pH 7,5).

Em cada um dos gráficos os triângulos indicam 5°C, os círculos 25°C e os quadrados 40°C. Estas figuras mostram que a degradação da relaxina pode ser analisada por análise de cinética de primeira ordem. A Fig. 2 mostra o gráfico das constantes de velocidade de primeira ordem determinada para a degradação dó pico principal versus pH para as cinco formulações a 5,(quadrados abertos), 25 (diamantes) e 40°C (quadrados fechados).

Os dados na Figura 2 mostram gue a relaxina humana é mais estável a pH de cerca de 4 a 6 e mais particularmente a pH 5.

Estudo 2: Nas formulações de succinato, acetato, e citrato, a estabilidade da relaxina conforme medida por RP-HPLC e ELISA não é significativamente afectada por variações da for ça iónica conforme obtido usando 0,0 M; 0,1 M e 0,5 M NaCl. A proteína foi formulada a cerca de 0,15 u de força iónica numa osmolabilidade de cerca de 250 mmol/kg para se ser capaz de usar a formulação para injecção intravenosa e intramuscular .

Estudo 3: As Tabelas III e IV mostram, respectivamente, os dados de HPLC em fase reversa relativamente à formulação de citrato a pH 5,0, guardada a 5°C durante 1 ano (a 1 mg/ml de concentração da relaxina) e a -20°C durante 60 dias (a 2 mg/ /ml de concentração da relaxina). Os dados na Tabela III podem ser extrapolados para calcular a estabilidade a 5°C durante pelo menos 2,0 anos (i.e. não mais do gue cerca de 10% da degradação), assumindo cinética de primeira ordem. Ambas as Tabelas indicam que as formulações são estáveis às respectivas temperaturas.

TABELA III

HPLC FASE REVERSA

ESTABILIDADE DA FORMULAÇÃO CITRATO GUARDADA

A 5°C

Tempo (dias)	Tempo de Ret. (min.)	Area (pico principal) Area total Fracção
x 10	x	10 do pico principal
0	20.95	2.84	2.84	.998
0	19.85	2.96	2.98	.995
0	20,88	2.89	2.94	.985
média	20.6 ± 0.6	2.90 + .06	2.92 + .07	.993 +.007
14	19.78	2.68	2.75	.977
14	19.72			.997
média	19.8 + .03	2.60 + .09	2.64 ± .01	.987 + .01
30	20.2	2.57	2.68	.959
30	21.8		2Λ1	^955
média	21.0 ± .8	2.47 ± .1	2.58 + .1	.957 + .002
97	20.2	2.62	2.69	.974
97	2^2	2^2	1Λ1	.984
média	20.2	2.60 + .03	2.65 + .04	.979 + .005
150	20.7	2.84	2.98	.957
150	20.7	2.81	2.92	.961
150	20.7	2.82	2.96	^955
média	20.7	2.82 + .02	2.95 ± .03	.958 + .003
Constantes	de Velocidade	de Primeira Ordem para a	Degradação
do Principal Pico de RP-	HPLC da Relaxina Humana a	pós um ano
a 5°C. Os	resultados de	cada ponto de	tempo são	a média de
triplicados	(quando disponiveis) e tratados: In (	fracção do
pico princi	pal);= A-Kt
intercepção K(	dias-) R	t.9	tl/2(yr)

-0,027 + 0,007

-0,00008 + 0,00004 .746 7 2 yrs >2

TABELA IV

HPLC FASE REVERSA

ESTABILIDADE DA FORMULAÇÃO CITRATO GUARDADA A -20°C

Ttempo (dias) Tempo de Ret. Area (pico principal) Area total Fracção (min. ) χ 10 χ 10 do pico principal

0	19.70	4.25	4.29	.990
0	19.70	4.22	4.24	.995
0	19.72	4J£	4.21	,993
média	19.71 ± .01	4.22 ± .03	4.25 ± .04	.993 ± .003
30	20.22	4.31	4.35	.989
30	20.20	4.29	4.32	,994
média	20.21 ± .01	4.30 + .01	4.34 ± .02	.989 + .005
60	19.82	4.76	4.86	.979
60	19.87	4.61	4.67	.991
60	19.85	4.59	4,63	,992
média	19.85 ± .03	4.65 ± .09	4.72 ± .12 .	987 ± .007

A estabilidade da relaxina em termos da sua bioactividade foi seguida usando um ensaio que mede a produção de AMP cíclico mediada pela interacção da relaxina com células uterinas de macacos rhesus. Os gráficos dos bio ensaios de AMP ciclico da concentração versus tempo estão apresentados nas Figuras'3a-3e, onde a Fig. 3a é relaxina em

-36glicina-HCl (pH 3,0), a Fig. 3b é relaxina em citrato (pH 5,0 a Fig. 3c é relaxina em acetato (pH 5,0), a Fig. 3d é relaxina em histidina (pH 6,0) e a Fig. 3e é relaxina em tampão Tris (pH 7,5).

Em todas as figuras os quadrados abertos são 5°C, os círculos fechados 25°C e os triângulos abertos 40°C e a linha recta é o valor esperado. Dentro dos erros da experiência pai'ece que todas as amostras (pH de 3 a 7,5) têm bioactividade equivalente após 40 diasde armazenamento.

A estabilidade da relaxina relativameri te à sua bioactividade foi também testada usando o ensaio da sínfise púbica de murganho. Uma comparação da bioactividade da relaxina não degradada em tampão citrato a pH 5 relativamente a uma amostra altamente degradada em tampão Tris a pH 7,5, revelou gue dentro dos erros dos ensaios não existem diferenças na bioactividade.

Um ensaio de ELISA e um ensaio de dicroismo circular foram usados para avaliar a conformação da proteína das formulações. Os dados demonstram gue a estrutura terciária da relaxina fica inalterada após 1 ou 2 meses de armazenamento.

Investigou-se a potencial alteração na auto-associação da proteína usando a técnica de sediment£ ção por ultracentrifugação analítica de equilíbrio. A relaxina em acetato 10 mM, 0,1 M NaCl a pH 5 foi analisada por ultracentrifugação analítica a concentrações de aplicação de 0,1; 0,2 e 0,4 mg/ml. O peso molecular médio das três concentrações de aplicação é de cerca de 10000, demonstrando gue a relaxina nestas condições forma dímeros.

Vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis foram adicionados à formulação de citrato 10 mM , pH 5 para investigar o seu efeito na estabilidade da formula ção. A Fig. 4 é um gráfico mostrando a velocidade de degradação do principal pico de relaxina em HPLC de fase reversa para as várias formulações às três temperaturas.

Da esquerda para a direita, amostras ultrafiltradas (cheio) e dialisadas (tracejado denso), foram comparadas com amostras a que se adicionou excipiente como se seque: uma quantidade isotónica (tracejado cruzado) ou 5% (tracejado médio) por peso de manitol, 5% (aberto) ou 10% (cheio) por peso de glicerol, 5% (horizontal) ou 10% (pontea do) por peso de etanol, 5% (tracejado leve) ou 10% (aberto) por peso de propilenoglicol e 0,02% (cheio) por peso de EDTA.

Cada uma delas foi guardada a 5, 25 ou 40°C. Como se pode ver, os excipientes têm um efeito negligivel sobre a estabilidade quando comparado com as testemunhas ultrafiltradas e dialisadas, dentro do erro experimental. As amostras dialisadas e ultrafiltradas também não apresentam diferenças entre elas dentro do erro experimental.

Em adição podem ser preparadas formulações liofilizadas em que a relaxina será reconstituída como solução ácida. Mais especificamente, a relaxina longa foi dialisada contra citrato 10 mM, 0,507% de manitol, pH 5,0, após estar inicialmente presente no tampão da formulação citrato. Esta preparação foi então esterilizada por fil_ tração para nove frascos de 3 ml , introduzindo o volume de 1 ml em cada um.

Estes frascos foram colocados num tabuleiro num liofilizador Lyovac Gt 20. As amostras de relaxina foram arrefecidas até -50°C e depois sujeitas a um primeiro ciclo de secagem de 25 horas a 0°C. Isto foi seguido de um segundo ciclo de secagem de 17,5 horas a 25°C. No fim da liofilização, um frasco foi reconstituído com um sal de água Milli-Q e ficou bastante limpido, sem turvidez, indicando uma boa reconstituição. Assim, os restantes frascos foram sujeitos a provas de estabilidade a 5°C e 25°C.

A relaxina longa que foi passada para tampão de liofilização , antes da liofilização foi usada como um controle de pré-liofilização. Além da amostra reconstituída no tempo zero, as amostras foram reconstituídas após 2 semanas, um mês e três meses de armazenamento a 5°C e 25°C. Todas as amostras foram analisadas quanto aos produtos de degradação por RP-HPLC conforme previamente descrito.

A média das injecções em triplicado foi feita sempre que possível. A % dó pico principalificou inalterada (ver Tabela IVa) para todas as amostras indepen^ dentemente do tempo de armazenamento na forma liofilizada, indicando ausência de perda de estabilidade após 3 meses a 25°C.

Em adição, a análise espectrofotométrica de todas as amostras, indicou não haver aumento na % de dispersão da luz após 3 meses de armazenamento na forma liofilizada a 25°C.

-39Amostra

TABELA IVa % Pico Principal

Testemunha pré-liofilização:	9 7,3%
Reconstituição tempo zero:	97,8 ± 0,7%
z semanas, 5 C	98,3 ± 0,3%
2 semanas, 25°C:	98,1 ± 0,4%
1 mês, 5°C:	97,8%
1 mês 25°C :	97,6%
3 meses, 5°C:	98,0 + 0,5%
3 meses, 25°C:	98,8 ± 0,4%

Estudos preliminares de congelação-des congelação indicam que a proteina pode ser congelada numa formulação liquida a -20 e -60°C, numa concentração de 2 mg/ /ml a pH 5 sem se observar quaisquer alterações no ensaio de HPLC.

Em adição , a Tabela V proporciona os resultados de estabilidade de RP-HPLC para a formulação de citrato, pH 5,0, congelada, depois descongelada, retirando-se uma amostra, depois congelada imediatamente e mantida congelada durante 30 dias, depois descongelada durante 5 horas à temperatura ambiente. Não se observou alterações nos resultados de HPLC quando da descongelação.

-40TABELA V

HPLC FASE REVERSAύ(CONGELAÇÃO-DESCONGELAÇÃO)

ESTABILIDADE DA FORMULAÇÃO CITRATO GUARDADA A -20°C

Itempo (dias) Tempo Ret. Area (pico principal) Area total Fracção

	(min.)	x 10	x 10	pico prin pal
	AMOSTRA	RECONGELADA	TEMPO ZERO
30	20,18	4,50	4,54	.989
30	20,18	4,51	4,56	.989
30	20,20	4,48	4,53	.987
MEDIA	2C,19 ± .01	4,50 í .02	4,54 ±.02	.988 ±.001
	5 HORAS	A TEMPERATURA	AMBIENTE *
0	19,82	4,76	4,86	.979
0	19,87	4,61	4,67	.991
0	19,85	4,59	4 ,63	.992
MEDIA	19,85 ± .03	4,65 ± .09	4,72 ± .12	.987 ± .007
5 horas	19,88	4,60	4,65	.989

*: amostra congelada durante 60 dias a -20°C foi guardada durante 5 horas à temperatura ambiente e testada novamente.

Concluindo, a integridade estrutural da relaxina humana conforme medido por RP-HPLC é afectada pelo pH a que é formulada e a degradação ocorre a pH 7 e superior. O ensaio de HPLC revela que das cinco formulações investigadas, a relaxina é mais estável num tampão acetato ou citrato a pH 5 do que noutros tampões e o tampão citrato a pH 5 é mais estável a 5 e -20°C dutante até cinco meses. A bioactividade é afectada.

EXEMPLO II

Numa comparação de relaxina H2 de porco e humana, os resultados do peso molecular médio mostraram que a relaxina humana se associa em solução a pH 5 num grau muito maior do que a relaxina de porco. Os dados da relaxina humana obtidos a diferentes concentrações de aplicação foram semelhantes, sugerindo que a agregação é uma auto-asso ciação reversível. Os resultados também mostram que a auto-associação para a relaxina humana é menos extensiva a pH3 do que a pH 5.

EXEMPLO III

Encontrou-se que a forma natural da relaxina é uma que tem uma cadeia B com 29 aminoácidos (relaxina curta) em vez de 33 aminoácidos (relaxina longa). A finalidade deste estudo foi determinar se a relaxina curta tem caracteristicas de estabilidade e adsorção semelhantes quando comparadas com a forma longa.

Em adição, as duas formas de relaxina foram comparadas relativamente aos seus coeficientes de extinção de UV a 200 nm e estrutura secundária usando CD afastado do UV.

A relaxina curta empregue nestas experiências foi obtida por proteólise limitada da relaxina longa (sintetizado no Exemplo 1) de modo a obter-se 29 aminoác_i dos na cadeia B. Após sintese da relaxina longa, esta foi apliçada'numa coluna de HPLC usando um gradiente de TFA e d£ pois coluna de permuta iónica mono S. Os fragmentos contendo relaxina foram então diafiltrados para um tampão de formulação .

Ao tampão (contendo 200 mg de relaxina) adicionou-se uma parte de trpsina para 2000 partes por peso de relaxina e a proteólise decorreu durante cerca.de 40 minutos. Em seguida, adicionou-se 50 jul de uma solução a 16,9 mg/ml de carboxipeptidase B (70 ji/mg) ao produto de digestão.

A solução resultante foi deixada durante 1 hora à temperatura ambiente, depois acidificada usando ácido citrico e purificada por HPLC e colunas mono S. A relaxina assim purificada foi diafiltrada para citrato 10 mM isotónico com cloreto de sódio pH 5 a 1,0 mg/ml e gua£ dado congelada a -60°C (1 ml em frasco de vidro Tipo I de 3 cn?) . Uma porção deste lote foi também fornecida como liquido e designada como amostra não congelada.

Estabilidade e Temperatura: A estabilidade da relaxina em citrato 10 mM isotónico a pH 5 foi testada seguindo a cinética de primeira ordem da redução do principal pico de HPLC em fase reversa.

-43Obtiveram-se cromatogramas numa coluna TM de fase reversa SynChropak C4 usando as seguintes condiçoes: caudal 1 ml/min., gradiente de 20% da solução A a 50% da Solução B durante trinta minutos (Solução A é 0,1% de ácido trifluoroacético e Solução B é 0,1% de ácido trifluoroacético, 90% de acetonitrilo).

A Tabela VI mostra uma comparação da cinética entre relaxina longa e relaxina curta. As constantes de velocidade de primeira ordem para a relaxina longa foram determinadas a partir dos dados de estabilidade relativos a 1 ano e as da forma curta a partir dos resultados de 6 meses para amostras congeladas-descongeladas e dados de 2 meses para amostras não congeladas.

Os valores de t ₉ e stão incluídos juntamente com as constantes de velocidade de primeira ordem determinadas. A estabilidade -de forma curta é pelo menos tão boa quanto a da relaxina longa e pode ser melhor uma vez que não existe estabilidade superior a 2 anos a 25°C para a amostra congelada-descongelada. Conforme previamente observado para a relaxina longa, a congelação e descongelação não afecta a estabilidade da relaxina curta.

TABELA VI

Constantes de Velocidade de Primeira Ordem para a degradação do Pico Principal de RP4HPLC de relaxina longa e curta

Média de triplicados usados para adaptar:

In(fracção do pico principal)=A-Kt

Tampão Intercepção

K(dias'^L)

t.9(dias) tl/2(dias)

Forma longa

5*C	-0.027+0.007	-0.000082+0.000037	>2 anos	>2 anos
25*C	-0.028+0.010	-0.000591+0.000055	178.2	>2 anos
40*C	-0.028+0.024	-0.002603±0.000132	40.5	266.3

Forma curta (Não congelada)

5*C	-0.007+0.005	-0.000116+0.000132	>2 anos	>2 anos
25’C	+0.002±0.004	-0.000516±0.000106	204.1	>2 anos
40*C	-0.001+0.008	-0.003988+0.000194	26.4	173.8

Forma curta (congelada-descongelada)

5*C	-0.005+0.003	-0.000037+0.000032	>2 anos	>2	anos
25‘C	-0.005+0.006	-0.000478+0.000220	>2 anos	>2	anos
40*C	-0.001±0.007	-0.002773+0.000247	52.4	345	.0

Estabilidade e Luz: Dois frascos de relaxina curta foram colocados numa caixa de luz com voltagem de 1600 pé-velas durante 7 dias. Um dos frascos foi protegido de luz com folha de aluminio e serviu como controle. Os tempos de retenção (R^_) dos picos principais de relaxina da relaxina lon_ ga foram normalizados para os da forma curta e estão apresen tados na Tabela VII.

Todos os tempos de retenção dos picos de degradação foram então relacionados com este valor norma lizado. Como se pode ver, os tempos de retenção normalizados para a relaxina curta e longa estão de acordo, sugerindo a ocorrência de vias semelhantes de degradação em ambas as proteínas. No entanto, a velocidade de degradação da re laxina longa parece ser maior do que a da relaxina curta.

TABELA VII

Estabilidade à luz da relaxina curta e longa

Forma Longa____ ____Forma Curta dias exposição à luz de 1600 velas

	% Pico Principal * Remanescente		% Pico-Principal Remanescente * *
19,34±0,01	64,07 ± 0,53	19,34 ± 0,01	78,56 ±0,64
17,62 ±0,08	7,38 ±0,20	17,67 ±0,02	8,56 ±0,16
17,20 ±0,08	11,26 ± 0,19	17,38 ± 0,01	4,90 ± 0,022

15,49±0,03 4,68±0,13

Testemunha

Rt^	% Pico Principal * Remanescente	Rt^	% Pico Principal * Remanescente
19; 33 ±0,02	97,16 ±0,37	19,33 ±0,02	97,09 ± 0,26
19,13 ± 0,02	1,88 ± 0,15	19,02 ± 0,02	2,03 ± 0,16

3# Os tempos de retenção do pico principal estão normalizados relativamente ao de forma curta e os dos picos de degradação estão relacionados com o valor normalizado.

*

Picos com áreas inferiores a 2% da área total foram omitidos por questões de clareza.

Estabilidade e Agitação: Um frasco de relaxina curta foi agitado à temperatura ambiente durante sete dias num agitador Glas-Col modelo S-500 regulado para 2,5 unidades. Um frasco testemunha foi mantido sem perturbações à temperatura ambieri te. A estabilidade da relaxina foi testada por HPLC de fase reversa conforme descrito atrás para o ensaio de estabilidade e temperatura.

A Tabela VIII mostra a percentagem do pico principal de relaxina após sete dias dè ^.agitação. Estes dados indicam gue não há alteração significativa detectada por HPLC de fase reversa na amostra agitada quando comparado com a testemunha não agitada, quer na relaxina longa quer na curta.

TABELA VIII

Estabilidade à agitação de relaxina curta e comprida

Forma Longa

Forma Curta

Rt % Pico Principal Remanescente

Rt % Pico Principal

Remanescente

Testemunha

19,9710,02 97,84 10,17 19,2610,04 98,50 10,28

Agitada

19,97 1 0,02 98,53 1 0,43

19,17 1 0,03 98,45 1 0,23

Estudo de adsorção: A relaxina foi diluida para cerca de 10 ^ng/ml determinado por espectof otometria ?de UV em soro fisiológico normal. Dois pés de tubo Silastic de 0,02 polegadas de diâmetro interno x 0,037 polegadas de diâmetro externo foi ligado a uma bomba de infusão Harvard equipada com uma seringa de vidro de 5 ml e uma agulha de 22 G.

A infusão da relaxina fez-se a 100 pl/ /min. através do tubo com uma amostra de 100 pl colhida minuto a minuto durante os primeiros dez minutos, seguido de uma amostra de 100 pl entre cinco e cinco minutos e 30 em 30 minutos, para 900 μΐ de tampão de ensaio ELISA (EAB). Esta diluição de 1:10 foi diluida a 1:4000 por duas diluições subsequentes em EAB. A diluição de 1:4000 foi submetida a determinação da concentração de proteina por ELISA.

A relaxina adsorveu à tubagem. No entanto, após cinco minutos de infusão através da tubagem a con centração de relaxina manteve-se perto da concentração espe rada de 10 pg/ ml conforme determinado por ELISA. A integração da área sob as curvas mostrou uma perda de cerca de 5% da massa total de proteina devido à adsorção à superfície do tubo. Não parece haver uma diferença significativa na adsorção à tubagem de Silastic érifrê às duas formas de relaxina .

Determinação do Coeficiente de Extinção: Os coeficientes de extinção para as relaxinas longa e curta foram calculadas por análise quantitativa de aminoácidos a partir de duas determinações separadas como sendo 2,04 ou 2,14 cm /mg para a relaxina longa e 2,25 ou 2,30 cm /mg para a relaxina curta.

Os coeficientes de extinção molares calculados para a relaxina longa e curta foram de 13000 í 200 M'^cm’\

Este resultado sugere que a remoção dos quatro aminoácidos do extremo C tem pouco efeito no ambiente imediato dos dois triptofanos e uma tirosina. Isto também sugere que as conformações das duas formas de relaxina sejam semelhantes.

Dicroismo Circular: Os espectros de dicroismo circular de 240 a 190 nm da relaxina longa (a 0,8 mg/ml) e da relaxina curta (a 1 mg)ml) em citrato 10 mM isotónico a pH 5 foram d£ terminados com um espectropolarímetro. As amostras foram termostatizadas em cuvetes de guartzo cilíndricas de 0;01 cm de passo.

O CD saido em miligramas foi convertido em elipticidade média de pesos de resíduos usando um peso de residuo médio de 113 e concentrações de relaxina que foram obtidas usando absorção de UV a 278, 4 nm. A concentração de relaxina foi determinada usando coeficientes de extiii ção de 2,04 e 2,25 cm /mg para a relaxina longa e curta, res pectivamente. Os cálculos da estrutura secundária foram determinados pelo método de Chang et al., Anal. Biochem., 91: : 13-31 (1978).

A análise dos espectros de CD longe dos Uv pelo método de Chang et al., supra, resultou em 50% de hélice alfa, 47% de folha beta e 3% de enrolamento ao acaso para a relaxina curta. As diferenças nos espectros para a relaxina curta e comprida estão dentro do erro experimental e sugerem fortemente gue a estrutura secundária da relaxina curta e longa seja muito semelhante.

Conclusão: A estabilidade térmica da relaxina curta é comparável e talvez exceda a da relaxina longa na formulação l_i guida. Ainda, a estabilidade relativamente à exposição à luz e agitação são também semelhantes nas duas proteínas.

As ptopriedades físicas tais como extiri ção molar, estrutura secundária e adsorção a superfícies também parecem ser idênticas.

EXEMPLO IV

Este exemplo ilustra a preparação e propriedades de formulações de relaxina em gel.

Preparação de Relaxina Liquida

A relaxina curta ( com a cadeia B de 29 aminoácidos) preparada e formulada como descrito no Exemplo III foi usada nesta experiência. Assim, a relaxina estava numa concentração de 1,0 mg/ml, 1 ml em citrato 10 mM, isotónico com NaCl, pH 5,0. Esta formulação foi guardada congelada em frascos a -60°C até ser usada.

A relaxina destes frascos foi concentrada para mais de 2,4 mg/ml (conforme determinado por espec troscopia de UV , assumindo e=2,04 ml/mg.cm) por centrifugação a 4000 rpm durante uma a duas horas num microconcentrador de 2 ml Amicon Centricon. (O tempo exacto depende do volume inicial de relaxina que precisa de ser concentrada).

Preparação do Gel a 4% de Methocel

Um gel de 4% de metilcelulose foi reconstituído a partir de pó de metilcelulose Methocel A 4M (dow Chemical) de acordo com o seguinte protocolo:

(a) 10 ml de tampão de formulação citrato (descrito no Exemplo I) foi aquecido até perto da ebulição (n->90°C) num copo de 40 ml provido de barra magnética e depois retirado do calor .

(b) adicionou-se 0,8 g de pó Methocel ao copo, agitou-se du rante alguns segundos para dispersar as partículas.

(c) O copo foi então colocado num agitador magnético na câmara fria a 5°C. Imediatamente antes do liquido começar a engrossar adicionou-se mais 10 ml de tampão de formulação citrato frio removendo quaisquer partículas secas das paredes do copo.

(d) Após 20 minutos de agitação continua, a viscosidade do liquido aumentou até se formar num gel homogéneo de 4% de metilcelulose.

(e) Para os dois últimos estudos de estabilidade, o gel de 4% de metilcelulose foi autoclavado, não só para esterilizar o gel , mas também para remover qualquer oxigénio dissolvido presente no gel. Após saida do autoclave o gel foi agitado sob azoto para re-homogenizar o geilsem introduzir mais oxigénio .

Preparação de Relaxina Tópica

Um gel homogéneo de 3% de Methocel com 600 jug/ ml de relaxina foi obtido seguindo o protocolo abaixo :

(a) Duas seringas de 10 ml esterilizadas foram taradas na balança. A uma seringa adicionou-se 3 g do gel de 4% de Methocel. A outra seringa, adicionou-se a formulação de relaxina liquida a 2,4 mg/ml a um terço do volume do gel (lml).

(b) Os êmbolos retornaram às duas seringas e estas foram ligadas por um dispositivo de ligação esterilizado Rainin 47-FLU , 'que comprime em direcção aos extremos das duas seringas .

(c) A solução de relaxina é dispersa na metilcelulose empur rando para dentro o êmbolo de uma seringa, seguido doêmbolo de outra seringa, 20-25 vezes até ao ponto em que se formou um gel homogéneo. (No entanto, nas duas ultimas experiências, o gel foi então transferido para tubos Eppendorf de 1,5 ml por facilidade de armazenamento e remoção da amostra). A concentração final de relaxina no gel foi de 600 ^ig/ml. 0 gel também continha 3% de metilcelulose, citrato 10 mM, pH 5,0 e isotónico com cloreto de sódio.

Ensaio de ELISA

As amostras de relaxina no gel foram diluídas com o mesmo diluente de ELISA usado no Exemplo I em passos sucessivos de 10 vezes para chegar a uma concentra ção de 6 jug/ml de relaxina. Pareceu não haver efeito até 0,25% de Methocel Gel sobre a concentração de relaxina confor me determinado por ELISA.

O ensaio de ELISA descrito atrás revelou que as concentrações de relaxina no gel foram 25% inferiores às esperadas, com base na espectroscopia de UV (as sumindo um coeficiente de extinção de 2,04). Este resultado é devido ao ensaio padrão ser com a relaxina de cadeia B completa e as amostras testadas serem de relaxina de cadeia B encurtada.

Análise da Relaxina Tópica por HPLC método de RP-HPLC usado para análise da formulação de relaxina liquida, descrito no Exemplo I, foi modificado para usar com amostras de relaxina tópica. Devido à elevada viscosidade do gel, as amostras foram dilu_i das dez vezes com água, agitados com vortex durante ru 5 minutos para homogenizar o gel e deixadas em repouso para as bolhas subirem.

A análise destas amostras foi efectuada por injecção de 250 pl numa coluna (4,6 x 250 mm) SynChro pak C4-300 à temperatura ambiente. O tampão de equilíbrio inicial foi 18% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluoroac£ tico. A eluição foi efectuada fazendo correr um gradiente linear crescente de acetonitrilo a 1%/min. para uma concentração final de 45% de acetonitrilo após 30 minutos. O cau dal foi mantido constante a 1,0 ml/min. e a absorvência foi controlada a 214 nm.

O passo deabrandamento (o tempo gue demora a passar o gel viscoso para o sistema) foi aumentado de 36 para 270 minutos. Observou-se que antes de aumentar o passo de abrandamento significativamente menos de 250 /11 de gel estava de facto a ser injectado devido à sua elevada viscosidade.

No decurso destas experiências, a coluna SynChropak começou a perder a sua capacidade para resolver picos. Assim, as ultimas injecções foram feitas numa coluna Vydac C4-300.

Fizeram-se três experiências de estabilidade significativas para a formulação tópica de relaxina. A primeira foi medir a estabilidade destas preparações após serem deixadas à temperatura ambiente durante cinco semanas. A amostra permaneceu na seringa original, sujeito às flutuações de temperatura e luz.

A análise por RP-HPLC revelou que o pico principal de relaxina não degradada foi sujeito a quan tidades crescentes de degradação com o tempo conforme evidenciado pelo decréscimo na % de área do pico principal e um aumento no número e % de área dos picos de degradação que eluem mais cedo. O decréscimo na % da área do pico prin cipal foi quantificado e normalizado relativamente a % do pico principal no tempo zero (antes de se colocar a relaxina no gel). Um gráfico logarítmico do pico da fracção principal normalizado versus tempo revelou gue a relaxina tópica sofreu cinética de degradação de primeira ordem.

Tanto o principal pico de relaxina como o maior pico de degradação foram colhidos do efluente de HPLC e liofilizados sob vácuo no Savant Speed-vac durante ru 1 hora. Estas amostras foram então reconstituídas em Tioglicerol e ácido acético, reduzidas na sonda para separar as cadeias A e B e analisadas por espectrometria de massa.

A análise de espectrometria de massa destas duas amostras revelou que o ião molecular para a cadeia A de ambas as amostras era idêntico e estava de acordo com o valor previsto de (XJ 2657. No entanto, os iões molecu lares das cadeias B eram diferentes. O ião molecular para a amostra do pico principal está de acordo com o valor teórico de CU 3314.

ião molecular para a cadeia B do pico de degradação foi de nJ 3330. Este aumento de 16 corresponde exactamente ao que seria esperado se um resíduo na cadeia B tivesse ficado oxidado.

A relaxina de porco derivada dos ovários de porco, a 6,6 mg, foi reconstituída em tampão de for mulação citrato, centrifugada durante 3 minutos para sedimentar material insolúvel e misturada a 3,19 mg/ml em 0,248 ml de tampão de formulação citrato com 4% de Methocel conforme descrito acima para dar um gel a 3% com 600 pg/ml de relaxina de porco. Ao contrário da relaxina humana de cadeia B encurtada, a formulação de relaxina de porco degradou-se muito pouco guando sujeita à análise por HPLC como descrito atrás.

O segundo estudo foi uma medida da es tabilidade da relaxina tópica em condições bem controladas a 5°C e 25°C. Em adição, o Methocel Gel para este estudo foi autoclavado para esterilização e remoção de qualquer oxiqénio dissolvido no gel que possa causar oxidação. As amostras de relaxina tópica foram transferidas para quatro tubos Eppendorf , dois guardados a 5°C e dois guardados a 25°C.

Após 144 horas, a relaxina tópica a 5°C começou a degradar enquanto o material a 25°C manteve-se relativamente não degradado conforme determinado por análise de HPLC. A análise subsequente revelou que a luz na câmara fria a 5°C eram muitas vezes deixadas ligadas enquanto a caixa a 25°C estava completamente protegida de qualquer fon te de luz.

Para determinar se esta luz era responsável pela formaçãodos picos de degradação a 5°C, uma

das duas amostras foi embrulhada em folha de aluminio para se proteger da luz. Após mais 360 horas a 5°C a relaxina e£ posta tinha-se degradado completamente enquanto que a relaxina protegida se continuou a degradar a uma velocidade muito mais lenta, conforme determinado por HPLC.

Assim, a presença de luz pareceu afectar a estabilidade, com protecção de luz protegendo totalmen te a relaxina tópica, mas a exposição à luz e protecção pro vocou continuação da degradação mas a uma velocidade mais baixa. A espectrometria de massa das colecções dos picos largos na relaxina tópica guardada durante 672 horas (tanto coberta como exposta à luz) revelou que a cadeia permaneceu inalterada mas que a cadeia B pareceu sofrer uma primeira e depois uma segunda oxidação.

A terceira experiência foi para comparar directamente a estabilidade da relaxina tópica relativa_ mente à da relaxina na formulação liquida, ambas expostas e protegidas da luz. Após armazenamento durante 816 horas a 5°C, os cromatogramas de Rp-HPLC indicaram que quando protegida da luz a relaxina tópica era tão estável quanto a re laxina na formulação liquida tendo ambas 96% do pico princ_i pal.

No entanto, quando exposta à luz a relaxina tópica foi dramaticamente mais suceptivel à degradai ção do que a relaxina na forma liquida.

Estudos de Eficácia

A finalidade deste estudo é determinar a eficácia da relaxina curta em relação ao amadurecimento do canal cervical de coelho. Escolheu-se o coelho porque estudos sugeriram que este animal é um modelo razoavelmente

bom para a investigação do comportamento mecânico do cervix e porque o cervix de coelho parece ser comparável ao cervix humanonas suas respostas fisiológicas.

Estudaram-se coelhos fêmea New Zealand prenhes maduros pesando 4,5 a 6,0 kg. No dia 26-27 da gravidez, os coelhos (4 por grupo) foram tratados com o gel da relaxina humana curta ou com o gel da relaxina humana curta ou com o gel da relaxina de porco preparado como descrito atrás num gel de 3% de metilcelulose. Tanto a relaxina huma na curta como a relaxina de<porco foram formuladas em doses de 100, 200, 300,,600 e 1000 jug/ml de relaxina por animal.

Ambas as hormonas foram aplicadas intravaginalmente por meio de uma seringa e de um cateter num volume de 0,5 ml. Os animais testemunha receberam apenas veiculo. Após 16-18 horas os animais foram mortos usando uma dose letal de fenobarbital. O útero, o segmento inferior e o cal cervical foram removidos e fixados para exame histo lógico em 10% de NB Formalin. As secções de parafina foram cortadas e coradas com hematoxilina /eosina e alcina blue PAS .

Avaliaram-se as secções quanto a morfo logia geral e especificamente guanto ao grau de separação de tecido muscular e fibrilhas de colagénio na submucosa e quan to à presença de células gigantes positivas para PAS caracteristicas , as quais são células multinucleadas de origem macrofágica que normalmente se infiltram no cervix durante o parto. A medição de células gigantes é conseguida usando o processo descrito por MacLennan et al., Am.J. Obstet. Gyne Col._f 152: 691-696 (1985).

t'm estudo inicial que se usou uma con centração de 300 jjg/ml de relaxina humana ou de porco numa formulação tópica sugeriu que nesta dose ambas as hormonas induzem alterações na morfologia doccanal cervical prenhe consistente com o amadurecimento. Dezoito horas após aplicação no cervix, observou-se significativa dilação e amadurecimento cervical.

A avaliação histológica de secções de cervix coradas mostrou separação marcada de mucosa muscularis com acumulação de material ligeiramente enriquecido em proteína nos espeços intercalados, separação dos feixes de fibras de colagénio (um decréscimo da densidade de colagénio), aumenttrda substância da base e edema submucosal com dilata^ ção dos vasos linfáticos. Também células gigantes caracteristicas positivas para PAS, as quais são raras nos animais testemunha, eram abundantes nos grupos tratados com relaxina.

Tais células eram vistas mais regularmente à volta dos vasos sanguíneos e na camada subepitelial, se bem que possam ser encontradas ao longo da profundidade do canal cervical. Estudos subsequentes em que tentou definir a dose mais baixa, e se possível mais alta, eficaz de relaxina mostraram-se discordantes em relação aos primeiros resultados, sem se ter observado eficácia a 300 ou 600 Mg/ml e a eficácia só foi claramente observada com a dose de 1 mg/ml.

Estudos de Farmacocinética objectivo deste estudo foi determinar a biodisponibilidade da relaxina curta em coelhos pranhes após administração singular intravenosa, subcutânea ou intra vaginal.

Os coelhos empregues foram coelhos bran cos fêmeas New Zeeland múltiplos prenhes pela 16° vez (Elkhorn), 4-5 kg. No dia 20 da gestação quatro animais (Grupo I) receberam 100 jug/kg de relaxina curta por bolus intravenoso (iv) atràvés de um cateter Abbocath-T numa veia da orelha.

Três animais (GrupoII) receberam uma dose subcutânea de 100 ug/kg de relaxina curta em soro fisi<3 lógico na coxa. Três animais (Grupo V) receberam uma dose de 100 yug/kg de relaxina curta em 1% de benzopurpurina. Quatro animais (Grupo III) receberam uma dose intravaginal de 100 jjg/kg de relaxina curta em 3-metilcelulose.

A concentração da solução da dose iv e se foi de 500 ug/kg de um liquido límpido de relaxina curta a 1 mg/ml de relaxina. As diluições foram feitas com soro fisiológico isotónico estéril ou 1% de benzopurpurina em (BPP) em soro fisiológico. O volume da dose foi aproximadamente 1 ml e foi calculado individualmente de acordo com a seguinte equação:

Volume da dose = (100 jug/kg) (kg) / (500 pg/ml).

-60Para administração intravaginal um total de 3 mg de gel Methocal (4%) foi misturado com 0,487 ml de relaxina curta (descrito através) e 0,513 ml de tampão de formulação citrato seguindo o protocolo descrito atrás , para dar uma relaxina curta a 600 ;ig/ml , 3% de gel de metilcelulo se. 0 volume de dose intravaginal foi de 0,5 ml.

Retiraram-se amostras de sangue (1 ml) de um cateter Viggo Secalon na artéria da orelha. Retiraram-se amostras de sangue nos tempos: (iv) 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 40, 60, 80, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600, 660 e 720 minutos; (sc e intravaginal) 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600, 660 e 720 minutos. Deixou-se coagular as amostras de sangue e colheu-se o soro por centrifugação As amostras foram congeladas em neve carbónica e guardadas a -70°C até serem testadas por ELISA. O ensaio varia entre 20 e 1280 pg/ml.

O parâmetros individuais de farmacocinética iv foram calculados por adaptação dos resultados indi^ viduais de concentração no soro imuno-reactiva-tempo a um modelo exposencial de grau 3 usando um programa de adaptação a curva não linear (NONLIN 84, Statistical Consultants, Inc., Lexington, KY). Os dados das vias de administração extravasculares foram adaptados, usando um programa RS-1 (Bolt, Bermak § Newman, Cambridge MA). A área sob a curva concentração no soro-tempo (ALJC) foi calculada pelo método trapezoidal a partir de t+0 até à última concentração de soro mensurável.

A AVC a partir de Ct até ao tempo infinito foi calculado por extrapolação: Ct foi dividido pela constante de velocidade de eliminação terminal. A eliminação do soro (CL) foi calculada pela equação CL=Dose/AVC (iv). O volume inical de distribuição (Vc) foi calculado a partir de: Vc=Dose/C(o) foi a soma dos coeficientes da equação exponencial de grau 3 descrevendo os dados de concen tração no soro - tempo.

O volume de distribuição no estado es tacionário (Vdn) foi calculado como: Cl* AUMC/AVC, onde AUMC foi a área sob a curva momento, i.e., a curva (concentração no soro)*-(tempo) vs. tempo. as semi-vidas no soro foram calculadas dividindo 0,693 pela respectiva constante de velocidade de disposição. A biodisponibilidade foi dete£ minada-pelo método da razão de áreas:

(AUC(extravascular)/AUC(iv) * 100.

Os perfis de concentração no soro -tempo para relaxina curta a 100 pg/kg em coelhos prenhes após administração iv, sc , e intravaginal estão apresentados na Figura 5, onde os circulos fechados são iv, os quadrados abertos são sc e os circulos abertos são administração intravaginal .

A Figura 6 mostra uma comparação dos perfis de concentração no soro - tempo para a relaxina curta a 100 pg/kg, administrada subcutâneamente a coelhos prenhes com (circulos fechados) e sem (quadrados abertos) BPP. A Tabela X apresenta uma lista dos parâmetros farmacocinéticos calculados para todas as vias de administração. A eliminação do soro (CL) após administração intravenosa foi de 2,95 ± 0,88 ml/min./kg.

Os volumes de distribuição inicais (Vc) e do estado estacionário (Vdss) foram de 89 ±22 e 209 ± 30 mg/ /kg, respectivamente. Foram necessários três termos exponen ciais para descrever os resultados de concentração no soro (iv) - tempo de modo a que as semi-vidas (t 1/2) foram de 8,4 ±2,7, 59,1 ±8,7 e 279±128 min., respectivamente.

A administração subcutânea de relaxina humana resultou numa concentração de pico média no soro de 76,20 ± 17,80 ng/ml aos 180 minutos e uma biodisponibilidade 76,0 ± 20,6% (com relaxina iv tendo 100% de biodisponibilidade ) . A relaxina humana administrada sc com BPP deu uma concentração de pico média no soro inferior (41,67 ±16,32 ng/ /ml) e mais tarde (420 min.) do que o observado com a reiaxina humana administrada sc sozinha. A biodisponibilidade subcutânea com BPP foi de 59,4 ±6,7%.

A relaxina humana pareceu ser francamente absorvida sistematicamente após administração intravaginal. As concentrações sistémicas do soro foram muito ba£ xas (0,34±0,16 ng/ml aoâ 98 min.) e a biodisponibilidade resultante foi de apenas 1,0 ±0,8%.

TABELA X

Parâmetros farmacocinéticos para 100 ug/kg hRlx em coelhos prenhes após administração iv, sc e intravaginal

Via	1) AUC 2) CL	3) Vc (ml/ke)	4) Vdss (ml/kg)
(nE-min/ml)	(ml/min/kg)
iv la	55.21	1.81	80	179
lb	31.77	3.10	69	188
lc	25.23	3.96	120	228
ld	34.19	2.93	85	241
média	36.60	2.95	89	209
SD	12.97	0.88	22	30
sc 2a	24.25
2b	21.67
2c	36.47
média	27.46
SD	7.91
top 3a	0.20
3b	0.80
3c	0.33
3d	0.14
média	0.37
SD	0.30
sc+BPP5a	19.01
5b	23.60
5c	23.76
média	22.12
SD	2.70

SD = desvio padrão top = tópica

Via	5) tl/2(l)	6) tl/2(2)	7) tl/2(3)
	(nln)	(min)
iv la	10.1	69.3	439
lb	5.8	51.1	168
lc	11.3	52.7	184
ld	6.5	63.3	325
média	8.4	59.1	279
SD	2.7	8.7	128

8) tl/2Absorção ímirú sc 2a

2b

2c média

SD top 3a 3b

3c 3d média

SD sc+BPP5a 5b

5c média

SD

45.6

57.1

85.9

62.9

20.8

55.8 119.0

37.1

21.3

58.3

42.9

75.2

76.9 131.0

94.4

31.7

SD = desvio padrão top = tópica

9) tl/2(term)@ 10) Cpeak® 11) Tpeak* 12) BA*

Via__(min) (nz/ml)_____(ffiln)--------(41 lv la lb lc ld

média
SD
sc 2a	73
2b	72
2c	176
média	107
SD	60 ------
top 3a	479
3b	1484
3c	504
3d	582
média	762
SD	483
sc+BPP5a	229
5b	266
5c	490
média	328
SD	141

95.30	120	66.4
59.90	180	62.0
73.40	240	99.7
76.20	180	76.0
17.80 ----		------ 20.6
0.26	240	0.6
0.55	75	2.2
0.38	120	0.9
0.18	75	0.4
0.34	98	1.0
0.16		0.8
40.80	240	51.9
58.40	420	61.5
25.80	420	64.9
41.67	420	59.4
16.32		6.7

pico médio da concentração no soro tempo médio para o pico médio da concentração no soro & biodisponibilidade;

β * terminal aparente para a dose extravascular

SD = desvio padrão top = tópico

Após completadas as experiências de farmacocinética (12 hr.) , os animais foram mortos e o sistema reprodutor removido e preparado para exame histológico. Os tecidos foram fixados em 10% NBF , embebidos em parafina e corados com os corantes Η & E e PAS/Alcian Blue. As secções histológicas dos cervices de coelho foram examinados sem conhecimento do grupo de tratamento.

Para fins deste estudo, os principais critérios avaliados foram (1) compacticidade relativa da la. mina própria e muscularis (2) presença de células gigantes e (3) localização na região cérvica. As cérvicas foram divididas em três categorias: Positiva, para lâmina própria frou xa e soljacente musulosa com aumento obvio das células gigantes; Questionável para a presença de algumas alterações mas num grau menos marcado ou localização não cervical e Negativa para cérvix sem alterações.

A conclusão tirada dos estudos histolcí gicos é que não existe uma clara associação entre o tratamen to e a alteração histológica.

Efeito de Antioxidantes e Co-solventes

Este estudo destina-se a testar a capacidade de várias formulações de adjuvantes para estabilizar a relaxina em gel de metilcelulose. Uma vez que a degradação ocorre via foto-oxidação, estudaram-se antioxidantes tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio.

Em adição, devido a uma possivel fonte de radicais livres sêr os peróxidos da metilcelulose , estudaram-se co-solventes, tais como glicerol e etanol, para de terminar se eles estabilizam a formulação através do decré^ cimo de interacção entre metilcelulose e relaxina.

Finalmente, foi estudado o efeito da activação do gel sobre a oxidação da relaxina por exposição do gel à luz antes da sua utilização na preparação da formu lação.

Preparação do Gel: Preparou-se quatro por cento (p/v) de gel de metilcelulose através da adição de 4 g de pó Methocel (Dow Chemical) a 100 ml de citrato 10 mM, tampão pH5 (tornado isotónico com NaCl). Após o pó ter sido disperso no tam pão a 85°C, a solução foi autoclavada a 121,5°C durante 30 minutos. No final colocou-se sobre o gel azoto e deixou-se durante a noite na câmara de 5°C para hidratar.

Para formulações que contêm glicerol e etanol os co-solventes foram adicionados directamente ao tampão de formulação. O gel activado foi preparado colocando a 4% autoclavado na caixa de luz fluorescente a 34°C durante 24 horas antes de ser misturado com relaxina.

Protocolo de Estudo: A Tabela XI faz uma lista das condições , 'ingredientes e composições para cada formulação estudada .

TABELA XI

Composição de Formulações de Relaxina usadas neste estudo

Formulação

Metilcelulose Outro Ingrediente Exposição à luz

3%

3%

3% +

4	:3%	0,5% ácido ascórbico + stock de ácido ascórbico (Aldrich Chem Co.)
5	3 %	0,2% metabissulfito + (Fischer'Scientific Corp)
6	3%	20% glicerol (Mallinckrodt)
7	3%	20% etanol (Mallinckrodt)

3% (activado)

A solução de relaxina foi fornecida a mg/ml e concentrada para 2 mg/ml via uma unidade de ultrafiltração Amicon. As amostras foram preparadas misturando o concentrado de relaxina a 2 mg/ml em tampão citrato 10 mM pH 5 e 4% de gel Methocel de acordo com uma proporção de vo lumes de 1:4. A solução e o gel a 4% foram distribuídos por duas seringas separadamente e a mistura foi conseguida empurrando o conteúdo ao longo das seringas para a frente e para trás, 20 vezes através de um ligador de entrosamento , conforme descrito acima.

Na solução de relaxina foram incorporados ácido ascórbico e metabissulfito antes da mistura com

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o gel. A preparação de gel final foi distribuida e autocla vada em frascos de vidro de HPLC de 1,5 ml em porções de aproximadamente 0,25 ml. Os frascos foram tapados, selados e colocados direitos na câmara fria a 5°C sob luz fluorescen te. As amostras nas formulações^ 1 e dr- 8 foram envolvidas em folha de estanho enquanto que as amostras na formulação 3 foram desgaseadas brevemente e cheias em azoto.

A degradação da relaxina do gel foi quantificada por RP-HPLC. Uma vez que a viscosidade do gel evita a aplicação directa das amostras no HPLC, diluiu-se 5 vezes com tampão de formulação antes da injecção. As con dições do método de cromatografia foram as seguintes: Instrumento: HP 1090L

Coluna: Vydac C4-300 , 4,6 x 150 mm

Caudal: 1 ml/min.

Comprimento de onda: 214 nm

Volume de injecção: 200 ul

Temperaturas: Ambiente

Fase móvel: (A) 0,1% TFA (B) 90% acetonitrilo, 0,1% TFA

Velocidade de Gradiente: 20% B aumentado para 50% B em 30 minutos.

Resultados: A Tabela XII apresenta os resultados iniciais do estudo que mostra a percentagem dó pico principal detectada nos respectivos pontos de tempo.

TABELA XII

Estabilidade de Relaxina em diferentes formulações de gel:

% Pico Principal de Relaxina a vários pontos de tempo

Formulação% Pico Principal

T = 0 T=5 T = 11 (dias)

Testemunha-luz	100	97	95,9
Testemunha + luz	98,7	33 ,3	0
Testemunha + luz com	99,1	38,6	0
Testemunha + luz + acido ascórbico	100	73	54,4
Testemunha + Luz + 20% glicerol	100	95,5	89,4
Testemunha + luz + 20% etanol	100	85	59,7
Gel Activado - Luz	100	95,8	90,9

Após 11 dias o controle que estava prc> tegido da luz manteve 96% da área do seu pico principal enquanto que o controle exposto à luz se de gradou completamen te. O azoto não retardou a degradação 0,5% de ácido ascórbico e 20% de etanol pareceram estabilizar a relaxina aproxi^ madamente no mesmo grau. Ao fim de 11 dias a percentagem de relaxina remanescente era de 55 a 60%.

melhor resultado foi obtido com a formulação de 20% de glicerol: 90% do pico principal foi recuperado após 11 dias de exposição à luz. A amostra de gel activado apresentou uma perda de 9% na proteina activa, mesmo quando protegido da luz. Comparado com o controle ne_ gativo (a formulação de gel protegida de luz) é evidente que aactivação do gel acelerou a degradação da proteina.

Isto implica que a exposição excessiva à luz não é recomendada durante a produção do próprio gel. O resultado da formulação contendo metabissulfito não é apre sentada devido ao pico da relaxina não se poder detectar nestas amostras e ter sido subsequentemente retirado do estudo. E possivel que o metabissulfito tenha reagido com re laxina resultando em perda de proteina total.

E obvio, a partir destas experiências que a exposição à luz desempenhe um papel essencial na iniciação do processo de degradação. A inclusão de 20% de gl_i cerol na formulação foi o que mais eficazmente protegeu a relaxina da oxidação induzida pela luz. Num grau menor o ácido ascórbico e o metanol também estabilizam a formulação.

O efeito do etanol neste estudo pode ser subestimado devido a uma porção significativa adicionada poder ter-se evaporado durante a dispersão do pó de metilce lulose. Combinações de glicerol, etanol e ácido ascórbico podem proporcionar mais estabilização.

Os resultados acima mostram que a foto-oxidação da relaxina no gel de metilcelulose pode ser eficazmente retardada pela incorporação de glicerol, etanol ou ácido ascórbico. Uma formulação final com uma vida de pra teleira aceitável poderá ser projectada tirando partido destes adjuvantes e protegendo o produto da exposição excessiva à luz.

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1§. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica biologicamente activa, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz de relaxina humana num tampão capaz de manter o pH da composição desde aproximadamente 4 até abaixo de aproximadamente 7.
2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pH variar de cerca de 4 a 6.
3. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o tampão ser tampão citrato ou acetato.
4. 4ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3,.caracterizado por se incluir ainda na referida composição um sal de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso ou um álcool de açúcar.
5. 5â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se incluir ainda na referida composição um álcool de açúcar poli-hidrico, etanol ou polipropilenoglicol.
6. 6ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se preparar uma composição que se apresenta na forma de um gel.

   -737â. - Processo de acordo com a reivin dicação 6 , caracterizado por se incluir ainda na referida composição um polissacarídeo solúvel em água ou polietilenoglicol.
7. 8ê. - Processo de acordo com a reivin_ dicação 7, caracterizado por o polissacarídeo ser metilcelulose numa quantidade de aproximadamente 2-5% e a relaxina estar presente numa quantidade de aproximadamente 100-1000 pg por ml de gel.
8. 9â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 8, caracterizado por se incluir ainda na referida composição um antioxidante ou co-solvente ou uma mistura deles.

   lOâ. - Processo de acordo com a reiviri dicação 9, caracterizado por o antioxidante e/ou co-solvente ser ácido ascórbico,etanol ou glicerol ou uma mistura deles. Lisboa, 24 de Fevereiro de 1989