JPH03503602A

JPH03503602A - スブチリシンの突然変異

Info

Publication number: JPH03503602A
Application number: JP1504388A
Authority: JP
Inventors: ブライアン，フィリップ・エヌ; パントリアノ，ミカエル・ダブリュー
Original assignee: ジェネックス・コーポレーション
Priority date: 1988-04-12
Filing date: 1989-04-10
Publication date: 1991-08-15
Also published as: US5013657A; EP0409878A4; EP0409878A1; WO1989009830A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】スブチリシンの突然変異発明の分野本発明は、増強された熱安定性を有する改良型のスブチリシン酵素、および該スブチリシン酵素をコードしている遺伝子に関する。

発明の背景タンパク質はアミノ酸の線状ポリマーである。タンパク質を生成する重合反応によってそれぞれのアミノ酸から水１分子が失われることになるので、タンパク質はアミノ酸「残基」で構成されていると表現されることが多い。天然のタンパク質分子は２０種はどの異なるアミノ酸残基を含むことができ、そのそれぞれは特有の側鎖を含有している。タンパク質中のアミノ酸配列はタンパク質の１次構造を指定している。

タンパク質は３次元構造に折り畳まれている。この折り畳みは、アミノ酸の配列によって、およびタンパク質の周囲環境によって決まる。タンパク質の顕著な性質は、このタンパク質の３次元の立体配座に直接依存している。即ち、この立体配座が、酵素の活性または安定性、結合タンパク質の能力および特異性、ならびに受容体分子の構造的特性を決定している。

タンパク質の３次元構造は多数の方法で調べることができる。タンパク質の構造を調べるための最良の既知の方法には、恐らくＸ線結晶学的方法の使用が含まれる。この方法の優れた概説を、Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂ　１ｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ［Ｖａｎ　Ｈｏ１ｄｅ、に、Ｅ、（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、ＮＪ　（１９７１）　ｐｐ２２１−２３９）　；この文献は本明細書の一部を構成する］に見ることができる。この方法を用いて、極めて精度高く３次元構造を解明することができる。また、円偏光二色性、光散乱を用いて、または放射エネルギーの吸収および放出を測定することによって、タンパク質の３次元構造を精査することができる［Ｖａｎ　Ｈｏ１ｄｅ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ、　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、　ＮＪ　（１９７１）］。さらに、中性子デフラクションの技術を用いて、または核磁気共鳴によって、タンパク質の構造を調べることができる［Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　４ｔｈ　Ｅｄ、　Ｍｏｏｒｅ、　Ｗ、　Ｊ、　、　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−）ｔａｌｌ、　ＮＪ　（１９７２）　；この文献は本明細書の一部を構成する］。

移しい数の天然タンパク質の３次元構造を調べることによって、多数の繰返しパターンが明らかになった。αヘソックス、平行βシート、および非平行βシートが、観察される最も普通のパターンである。このようなタンパク質パターンの優れた記述は、Ｄ　１ｃｋｅｒｓｏｎ。

Ｒ，Ｅ、等がＴｈｅ　Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ［１１，Ａ、Ｂｅｎｊａｗｉｎ、　Ｉｎｃ、　、　ＣＡ　（１９６９）］に記載している。各アミノ酸をこれらパターンの１つに割り当てると、タンパク質の２次構造が決まる。タンパク質の２次構造のへリックス、シートおよび折り返しが一緒になって夕・ンパク質の３次元構造が生じる。多くのタンパク質の３次元構造は、内部表面（タンパク質が通常見い出される水性環境から離れるように配回している）および外部表面（水性環境にすぐ近接して存在する）を有するものと特徴付けることができる。多数の天然タンパク質の研究により、疎水性残基（トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、インロイシン、バリン、またはメチオニンなど）は、タンパク質分子の内部表面に最も多く見い出されることがわかった。対照的に、親水性残基（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタメート、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グリシン、およびプロリンなど）は、外部タンパク質表面に最も多く見い出される。アミノ酸アラニン、グリシン、セリンおよびトレオニンは、内部および外部タンパク質表面の両方に等しい頻度で見い出される。

タンパク質は、折り畳まれた秩序ある状態と折り畳まれていない無秩序の状態の間の動的平衡の状態で存在する。この平衡の一部は、タンパク質の構造を安定化させる傾向にあるポリペプチド鎖の異なるセグメント間の短い範囲の相互作用、およびその一方の、分子のランダム化を促進する傾向にある熱力学的な力を反映している。

天然タンパク質の最大の群は酵素を構成している。通常、それぞれの酵素は別種の化学反応を触媒し、その機能が極めて特異的であるのが普通である。酵素が研究され、酵素の３次元構造とその活性または安定性の間の関係が調べられた。

酵素のアミノ酸配列が酵素の性質を決定し、酵素のアミノ酸配列は該酵素をコードＩ７ている遺伝子のヌクレオチド配列によって指定される。酵素のアミノ酸配列を変化させるど、アミノ酸配列中の変化の位置、性質および／または強さに応じて、程度を変えつつ酵素の性質を変化させることができ、また、酵素を不活性にすることすらできる。

ある生物種内の別種類の天然酵素においてわずかな変異が存在することがあるが、通常、同一の種の生物によって産生される特定の種類の酵素は、基質特異性、熱安定性、種々の条件下（例えば、温度およびｐＨ）での活性レベル、酸化安定性などについては実質的に同一である。このような天然あるいは「野生型」酵素の性質は、酵素の天然環境外で利用する際には、必ずしも最適なものではない。

従って、酵素の天然の性質を変えて酵素のある種の性質を特定の使用のために、または特定の環境において使用するために最適化することが望ましいこともある。

発明の要約本発明は、増強された熱安定性を有する改良型のスブチリシン酵素に関する。さらに、本発明は、野生型スブチリシンを越える増強された熱安定性を有する少なくとも１つのアミノ酸置換を有するスブチリノン物質をコードしているクローンされた突然変異遺伝子に関する。

定−負本発明を説明する際に次の定義を用いる。

タンパク質：タンパク質は生細胞によって産１生され、アミノ酸によって構成されるヘテロポリマーである。通常のタンパク質は１００〜１０００個のアミノ酸からなる。アミノ酸の正確な配列がタンパク質の構造および機能を決定する。

アミノ酸ニアミノ酸はタンパク質のビルディングプロ、りである天然の化合物である。通常、天然アミノ酸は３文字または１文字のどちらかに短縮して表される。最も普通のアミノ酸とそれらの記号を第１表に挙げる。アミノ酸は頭部から尾部に結合されて長い主鎖を形成する。それぞれのアミノ酸種は異なった側鎖を有している。

アスパラギン酸　　　　　　　Ａｓｐ　　　　　　　　Ｄ阪五各：すべでのアミノ酸は主鎖に同じ原子を有し、側鎖においてのみ異なっている。主鎖の原子は１個の窒素、２個の炭素、および１個の酸素である。最初の原子は窒素であり、Ｎで示される。次の原子は炭素であり、α−炭素と呼ばれる。側鎖の基はこのα− 炭素に結合している。α−炭素はＣで示されるカルボニル炭素に結合している。

Ｃはカルボニル酸素（０で示される）に結合し、そして次の残基のＮに結合している。側鎖基の原子には、元素記号（Ｃ１０、Ｎ、Ｓ）、ギリシャ文字（α、β 、γ、δ、ε、ζおよびη）、そして側鎖基が分岐しているときには恐らくはアラビア数字からなる名称が与えられる。

発明の詳細な説明本発明は、スブチリシン酵素をコードしている種々のヌクレオチド配列に突然変異を加えることによって修飾したスブチリシン酵素に関する。本発明の修飾されたスブチリシン酵素は増強された熱安定性を有している。

本発明のスブチリシン酵素は、プロテアーゼとして知られている酵素群に属する０プロテアーゼは、ペプチド結合の切断のための触媒である。この切断の例を以下に挙げるニブロチアーゼの１種はセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、活性部位に必須のセリン残基が存在しているペプチド結合の加水分解を触媒する。セリンプロテアーゼは、フェニルメタンスルホニルフルオリドによって、およびジイソプロピルフルオロホス７エートによって阻害することができる。

スブチリシンはグラム陽性細菌または菌類によって産生されるセリンプロテアーゼである。７種のスブチリシンのアミノ酸配列が知られている。これらには、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株由来の５種のスブチリシンが含まれる（スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン・アミロサラカリチフス、およびメセンチコペブチダーゼ）［ｒＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の中性プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼの遺伝子はシグナル配列と成熟タンパク質をコードしている領域の間に大きいオープン・リーディング・フレームを含有しているＪ　（Ｖａｓａｎｔｈａ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１５９：　８１１−８１９（１９８４））　；　　ｒＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のスブチリシン・カールスバーグの発現およびクローニング配列決定Ｊ　（Ｊａｃｏｂｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　：　８９１３−８９２６（１９８５））；「スブチリシンＤＹの全アミノ酸配列の決定ならびにスブチリシンＢＰＮ’、カールスバーグおよびアミロサラカリチフスの一次構造との比較Ｊ　（Ｎｅｄｋｏｖ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ　３６６：　４２１−４３０（１９８５））　；　　ｒスブチリシン・アミロサラカリチフスＪ　（Ｋｕｒｉｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４７　：　５６１９−５６３１（１９７２））　；および「アルカリ・メセンテリコペプチダーゼの全アミノ酸配列Ｊ　（Ｓｖｅｎｄｓｅｎｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１９６：　２２ｇ−２３２（１９８６））］。

Ｔ　ｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓ由来のスブチリシン・サーミターゼのアミノ酸配列も既知である［　ｒ　ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏＩＩｌｙｃｅｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓ由来のサーミターゼの全１次構造およびスジチリシン型プロテアーゼ類に対する構造的特徴Ｊ　（Ｍｅｌｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１８３：　１９５−２００（１９８５））コ。

次の２種類の菌類プロテアーゼのアミノ酸配列が既知である：即ち、Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ由来のプロテア−ゼＫ　［ｒ　Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｎａｌｂａｍ　Ｌｉｍｂｅｒ由来のプロテア−ゼＫ　Ｊ　（Ｊａｎｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

Ｈｏｐｐ、ｅ−８ｅｙｌｅｒ　３６６　：　４８５−４９２（１９８５））］ならびに好熱性菌類Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ　ｐｕｌｃｈｅｌｌａ由来のサーモミコラーゼ［［エンドペプチダーゼ類：サーモミコリンＪ　（Ｇａｕｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　４５＋　４１５−４３３（１９７６））］である。

これらの酵素は、それらの１次配列および酵素的性質によってだけでなく、Ｘ線結晶学データの比較によっても、スブチリシンＢＰＮ′に関連していることがわかった［「スブチリシン・カールスバーグと複合したヒル由来の阻害物質ニグリンの結晶および分子構造」（ＭｃＰｈａｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１８８　：　５５−５８（１９８５））ならびに「菌類のプロテア−ゼにの３次元構造は細菌性スブチリシンとの類似性を示すＪ　（Ｐａｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、　３：　１３１１−１３１４（１９８４））コ。

「突然変異が為されたか、または修飾が加えられたスブチリシン酵素（群）」なる用語は、本発明で用いるときには、増強された熱安定性を有し、本発明のスブチリシン酵素と相同な、突然変異が為されたセリンプロテアーゼを含むものとする。また、本明細書ではこの突然変異が為されたか、または修飾が加えられたスブチリシン酵素を、「スブチリシン物質」とも記載する。本明細書で用いる際には、および突然変異が為されたかもしくは修飾が加えられたスブチリシン酵素またはスブチリシン物質の定義のもとでは、本発明の突然変異は、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン・アミロサラカリチフス、メセンチコベブチダーゼ、サーミターゼ、プロテア−ゼに、またはサーノ酸配列相同性を有し、従って相同とみなすことができるあらゆるセリンプロテアーゼ中に導入してよい。

本発明の突然変異が為されたスブチリシン酵素は、天然あるいは野生型スプチリシンを凌ぐ増強された熱安定性を有している。熱安定性は、タンパク質の全般的な強靭さの良好な指標である。熱安定性の高いタンパク質は、カオトロピック物質、デタージエントの存在下で、およびタンパク質を不活性化する傾向にあるその他の条件下で安定であることが多い。従って、熱的に安定なタンパク質は、高温、厳しい溶媒条件に対する耐性、または長期の貯蔵寿命が要求される多（の工業および治療分野で有用であると予想される。

本発明においては、熱不活性化に対する耐性は、２組の代表的な条件下での熱不活性化に対する耐性によって測定した。第１のものは１０ｎ＋Ｍの塩化カルシウムの存在下、６５°Ｃであり、第２のものは溶液から遊離のカルシウムを除去する１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下、４５°Ｃである。カルシウムはスブチリシンを安定化することが知られている。これら両極端のカルシウム濃度のもとての安定性の測定は、安定なスブチリシンの可能性ある産業上の利用にはカルシウム量か異なって存在する条件が含まれるために行ったものである。

野生型ＢＰＮ’スブチリシンのＴ１／２は、１０ｍＭＣａＣρ、６５°Ｃでは５９±３分であり、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、４５°Ｃでは１４．４±０．０５分である。突然変異が為されたスブチリシンの熱安定性は、ＴＩ／２（突然変異体）をＴＩ／２（野生型）で割った比で表示する。

第２表に挙げた突然変異スブチリシン酵素は熱的に安定であることがわかった。

本発明の突然変異スブチリシン酵素は、熱安定性を増強する少なくとも１つの特定のアミノ酸置換を有している。第２表は、このスブチリシンを分泌する宿主細胞の菌株名称を示している。突然変異はアミノ酸置換であり、始めに天然のアミノ酸およびその位置数を示し、右への矢印がアミノ酸置換を示している。野生型のＴ１／２に対する突然変異体のＴ１／２の比を次に示している。

最後に、オリゴヌクレオチドが示されている。この最後の欄の最初の行は、特定のオリゴヌクレオチドを示す番号（＃）である。オリゴヌクレオチド番号の下の２番目の行は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列または塩基対配列である。突然変異はスブチリシンＢＰＮ’を用いて行った。しかし、本明細書において説明するように、これらの突然変異は、オリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発を用いてセリンプロテアーゼ中の同様の位置に導入することができる。

！ｚ老突然変異スブチリシンＢＰＮ’ｆ素１０ｍＭ　ＣａＣＱ　　１．　ＯｍＭ　ＥＤＴＡＧＸ７１３０　　野生型　　　　　　１．（１１，０−−−ＧＸ７１７４　　ＶＡＬ８　−ＩＬＥ　　　２．０　　　　０．８　　　　＄２０１０２１−ｍａｒＣＣＴ　ＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴｒＧＸ７１７５　　ＧＬＹ１６９−ＡＬＡ　　　５．９　　　　１．１　　　　＃２０１１２１− ｍａｒＧＧＣＴＡＣＣＣＴ　Ｇ圓ＡＡＡ　ＴＡＣＣＣＴＧＸ７１９５　　ＴＹＲ２１７−ＬＹＳ　　　３Ｊ　　　　　　２．７　　　　　ｆｔ１９２８１９−ｍｅｒＣＧＧ　　ＧＧＣＧＡＡ　　ＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＡＣＧＧＸ８３Ｑ３　　ＭＥＴ　５０　　→ＰＨＥ　　　０．７６　　　　１．４　　　　　Ｈ２Ｏ７１９−ｍａｒＧＡＧ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＧ　ＴｒＣＣＴｒ　ＣＧＸ８３０９　　ＳＥＲ２４ｇ−ＡＳＰ　　　１．５　　　　　０．７５　　　　ｆｔ２２０８２４−ｍａｒＣＡＡ　ＧＴＣＣＧＣＧＡＣＡＧＡ　ＴｒＡＧＡＡ　ＡＡＣＳＥＲ２４９−ＡＲＧ　　　　　　　　　　　　　　　　＃２２０８２４−ｍｅｒＧＸ８３１４　　ＧＬＮ　２０６　→ＣＹＳ　　　２．４　　　　　５．１　　　　　＃２１８１１９−ｍｅｒＧＴＡ　ＴＣＴ　ＡＴＣＴＧＴ　ＡＧＣＡＣＧ　ＣＧＸ８３３０　　ＴＹＲＺ１７→ＬＥＵ　　　　２．０　　　　　１．８　　　　　＃２３３１１９−ｍｅｒＣＧＧ　ＧＧＣＧＣＴ　ＴＡＡ　ＣＧＧ　ＴＡＣＧＧＸ８３３６　　ＧＬＮ２（１８→７Ｍ！　　　　１．１　　　　　１．７　　　　３２４２２１９−ｍａｒＧＴＡ　ＴＣＴ　ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＧ　ＣＧＸ８３５２　　ＳＥＲ６３→ＡＳＰ　　　６．３　　　　　　　　　　　　ｆｔ２４９４２ｌ−ｎｅｒＧＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＧＧＡ　ＡＣＴＴＹＲ２１７→ＬＹＳ　　　　　　　　　　　　　　　　＃１９２８１９−ｍｅｒＧＸ８３５４　　ＧＬＩ＋　２７１　→ＧＬＵ　　　１．３　　　　　　　　　　　　＃２５２２１？−ｍａｒＣＡＡ　ＣＯＴ　ＡＧＡ　ＡＧＣＧＧＣＡＧＧＸ８３６３　　ＴＨＲ２２→ＬＹＳ　　　１．３　　　　　２．１　　　　：１２５２４１８−ｍｅｒＡＧＧ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＴＣＡＡＡＡＳＮ　７６　　→ＡＳＰ　　　　　　　　　　　　　　＃２４６３２０−ｍｅｒＣＧＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＧＸ８３７６　　ＴＹＲ１０４−ＶＡＬ　　５．０　　　　１．６　　　　＃２３３２１９−ｍａｒＣＧＧ　ＣＣＡ　ＡＧＴ　ＴＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＣＧＬＹ　１２８　→ＳＥＲ１１２：（３８１９−ｍａｒＧＣＣＴＣＧ　ＧＣＴ　ＣＴＣＣＴＴ　ＣＴＧ　Ｇ第２表のスブチリシン酵素突然変異の情報を用いて、例えばスブチリシン・カールスバーグなどの密接に関連した他のプロテアーゼ類を改良することができる。関連の深さはアミノ酸配列の比較によって調べる。タンパク質配列を並べる方法は多数存在するが、関速度が非常に小さいときにそれらの相違が明白になるにすぎない。Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｍａｒｇａｒｅｔ　Ｏ，Ｄａｙｈｏｆｆ、１ｉ１ＷA Ｖｏｌ、５　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　２．１９７６、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，、ｐ、３ｒｒ、標題５ＥＡＲＣＨａｎｄ　ＡＬＩＧＮ］に記載されている方法は関速度を定義している。当分野で周知であるように、関連タンパク質は、錆止のアミノ酸の数ならびに各アミノ酸の種類において異なることができる。即ち、２つの構造を酷似性が最大になるように並べたときに削除または挿入が存在し得る。例えば、スブチリシン・カールスバーグは２７４個のアミノ酸を有しているが、一方、スブチリシンＢＰＮ’は２７５個のアミノ酸を有している・この２つの配列を並べると、カールスバーグはスブチリシンＢＰＮ’ のＡＳＮ　　５６に対応する残基を含んでいないことがわかる。このように、例えばカールスバーグのアミノ酸配列は、位置５６にギャップが示されていなければ、ＢＰＮ’とは非常に違って見えるであろう。従って、スブチリシン・カールスバーグの位置２１７においてＬＹＳの代わりにＴＹＲを置換すると熱安定性が増大するであろうことを、高い信頼度で予想することができる（ただし、カールスバーグ中の残基はＢＰＮ’との相同性によって数が付されているものとする）。

２つの相同なスブチリシンの一方がギャップを有しているときには、その位置で構造が異なっていると推論するにちがいない。そのような相違の例は当分野では周知である。これらの局所的な相違の故に、どちらかのスブチリシンが突然変異の部位に、またはその部位にすぐ隣接してギヤノブを有しているときには、安定化突然変異を移動させるべきではない。従って、アミノ酸配列を並べた後に、ギャップでの、またはギヤツブの次の突然変異を望ましい突然変異のリストからはずし、突然変異を行わすイ。

この方法を用いて、本明細書に記載した熱安定性突然変異の全てを他の相同なセリンプロテアーゼに移すことができる。

簡単に説明すると、本発明の増強された熱安定性突然変異（群）を導入するためには、通常、所望のスブチリシン物質をコードしている遺伝子を始めにその天然の供給源から単離し、クローニングベクター中にクローンする。別法によれば、所望の遺伝子から転写されるｍＲＮＡを供給源細胞から単離し、クローニングベクター中に挿入するために逆転写によってｃＤＮＡに変換することができる。クローニングベクターはファージまたはプラスミドであってよく、通常、微生物のゲノムとは独立した微生物中のベクターの自律的な複製のためのレプリコンを含有している。クローニングベクターは、ベクターで形質転換された微生物の選択を助けるために、■またはそれ以上の抗生物質耐性をコードしているＤ　Ｎ　Ａなどの表現型マーカーを含有しているのが好都合である。

ＤＮＡまたはｃＤＮＡをクローニング用のベクター中に挿入するための方法は当分野で周知である。通常、これらの方法は、スブチリシン物質をコードしている遺伝子をベクター中の開裂された制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することを含み、この遺伝子の末端にデオキシヌクレオチドのホモポリマー尾部を付加してこの遺伝子を相補性のホモポリマー尾部を有するクローニングベクターの開裂された末端に結合させることを含むこともある。次いで、オリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発によってスブチリシン遺伝子に突然変異を行うことができる。

部位指向性の突然変異誘発とも呼ばれるオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発はＢ　ｒｙａｎ等［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３　：　３７４３−３７４５（１９８６）　：この文献の開示は本明細書の一部を構成する］が詳細に記載している。

本発明の突然変異スブチリシン物質は、クリーニング、特に布類のクリーニングに用いられる清浄剤などの洗浄調製物への添加物とｌ７°Ｃ用いることができる。本発明の突然変異スブチリシン物質は野生型のスブチリシン物質よりも熱的に安定であり、従って清浄剤を含む溶液中で保存したとき、あるいはクリーニングで使用中に高温にかけたときに野生型と同じように早く活性を失うことはない。

本発明の突然変異スブチリシン物質を洗浄調製物の添加物として用いることによって、織物のタンパク質性の汚れの除去が改善される。

洗浄調製物への添加物として用いることができる突然変異スプチリノン物質の量は、当分野で周知であり、通常の実験によって容易に確かめることができる。酵素濃度の最適範囲が、酵素のコストおよび要求されるクリーニング結果に関係しているのは勿論である。通常、洗浄調製物に添加される突然変異スブチリシン物質の量は、約２０００〜約４０００　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｄｅｌｆｔ　Ｕｎｉｔｓ／洗浄調製物の重量（ＡＤＵ／９）であろう。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

大湾應」−熱安定性の検討Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（スブチリシンＢＰＮ ’）由来のスブチリシン遺伝子をクローンし、予め配列決定し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓにおいてその天然のプロモーター配列から高Ｌ／ベルで発現させた［Ｖａｓａｎｔｈａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１５９　：　８８１（１９８４）　：　Ｙｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＮｕｅＩｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　７９１１（１９８３）］。突然変異を、プラスミド１こコードされているスジチリシン遺伝子中にインビトロで導入し、変異酵素の熱安定性に及ぼす作用を分析した。

全ての突然変異体遺伝子をｐＵＢｌｌｏに基づく発現プラスミド中に再クローンし、これを用いてＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓを形質転換した。宿主として用いるＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ株はそのスブチリシン遺伝子の染色体欠失を含んでおり、従ってバ・ツクグラウンドの野生型活性を生成しない。全ての突然変異酵素がこのベクターから効率的に発現され、約１９／Ｑの濃度で培養培地に分泌された。この系ではスブチリシンが主な分泌タンパク質であり、全細胞外タンノくり質のほぼ８０％を構成する。

捧−型突然変異スブチリシン酵素を、次の３段階精製法によって細胞不含の発酵ブロスから精製した：（１）粗製の発酵ブロスのＤＥＡＥクロマトグラフィー。固体の２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（Ｍｅｓ）を加えることによってブロスをｐＨ７，０に調節し、２０１１１ＭのＭｅｓ緩衝液（ｐＨ７，０）で予め平衡化しておいたＤＥ−５２セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）のベッド（１３Ｘ５（Ｊ）に付した。

これらの条件のもとでは、スブチリシンは遅滞なく洗い流される。

（２）ＤＥＡＥ溶出液のアセトン分画。アセトン（−２０°Ｃ）を４°ＣでＤＥＡＥ溶出液と撹拌ｌまた。スブチリシンは５０〜７０％のアセトンで沈澱する。

０〜５０％アセトンの沈澱分画は捨てた。

（３）アセトン沈澱物のＳ　Ｅ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）クロマトグラフィー。

アセトン沈澱させたスブチリシンを２０＋ｌ１ＭのＭｅｓｌ衝液（ｐＨ６，０）に溶解し、同じ緩衝液で平衡化した５Ｅ−５３セルロースのカラム（２，５ｘ　１６ｃｘ）に付した。直線の塩勾配（０〜０．２Ｍ　Ｎａ（Ｊ）を用いてスブチリシンを溶離した。

最も高い比活性を含む分画を集め、７０％イソプロパツールまたは５０％硫酸アンモニウム沈澱物のどちらかとして一２０°Ｃで保存した。

酵素活性５０ｍＭ　　トリス−ＨＣ（２（ｐＨ８，０）、５０ｍＭＫＣｆｆ中、２５℃で、基質スクシニル−（Ｌ）−Ａｌａ−（Ｌ）−Ａｌａ　　（Ｌ）−Ｐｒｏ　　（Ｌ）−Ｐｈｅ−１）−ニトロアニリド（Ｓ　Ａ　Ａ　Ｐ　Ｆ　−ｐＮ　Ａ　；　Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅｖ＋）のｌ。

ＯａｉＭ溶液の加水分解をモニターすることによってスブチリシン活性を検定した。１単位の活性は、これらの条件下で１分間あたりに１％モルの基質を加水分解する酵素量に対応している。加水分解産物の１つであるｐ−ニトロアニリドは４１０ｎｍで８８００　Ｍ−’ｃｒ’の消衰係数を有しており、従って、酵素反応のモニターを容易にする［Ｄｅｌｍａｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ａ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、岨：　３１６−３２０（１９７９）］Ｄスブチリシン濃度は、ＥＯ（０，１％）＝１．１７を用い、２８Ｏｒ＋ｍで調べた［０ｔｔｅｓｅｎ　＆　５ｖｅｎｄｓｏｎ、唾ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９７６）、ｐ、２０７］。

熱不活性化に対する耐性突然変異スブチリシン酵素を、溶液中での熱不活性化に対する耐性について試験した。熱不活性化の検討は、１０ｍＭ　ＣａＣＣａＣｌ２−１５Ｑリス−ＨＣＣ ’（ｐＨ８，０）または１．ＯｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）に溶解したスブチリシン溶液をインキコベートすることによって行った。ＣａＣＱ、の存在はスブチリシンを安定化する。１０ａ＋ＭのＣａＣＱｌの存在下、６５°Ｃで、または１ｍＭのＥＤＴＡの存在下、４５°Ｃで平衡化した、サーモスタット調節の循環水浴中に浸漬したガラス製Ｄ　ｕｒｈａｍ管に試料を入れた。試料管からの蒸発を、パラフィルムでシールすることによって防いだ。その一部を種々の時間に採取し、検定溶液により２５°Ｃで検定した。０時間の測定は、試料を温浴に浸漬する前の５ＡＡＰＦ−ｐＮＡの加水分解速度であった。その後の基質の加水分解速度の全ては、浴に浸漬した後に測定した。残存活性と時間の対数プロットは、その大部分が、３半減期にわたって直線であることを示した。即ち、１次の速度式を適用することができる。１０　ｍＭ　ＣａＣ（ｂ、５０ｍＭＫＣρ、および５０ｍＭ　　トリス−ＨＣρ（ｐＨ８，０）の存在下、６５℃での、菌株７１３０由来の野生型酵素およびスブチリシンの失活速度は５９±３分の半減期を有することがわかり、これは、同様の条件に対して文献に報告されている値とよく一致した［Ｖｏｏｒｄｏｕｖ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　：　３７１６−３７２４（１９７６）］。この速度は野生型酵素の基準点１．０を与えた。熱不活性化の半減期（ＴＩ／２）を突然変異スブチリシン酵素について測定した。この結果を上記の第２表に示した。

上記の発明を明確にし、理解を助けるために例を示して説明したが、ある種の変化および修飾を本発明の範囲内で行い得ることは明らかであり、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

国際調査報告ｔｅｌ＠ｍ＊ｍａｓｌ　Ａ１１＠ｌ＋ｃａｅ７、。ＰＣ？／υ５８９１０１４７５’−ｍＡｍ＝Ｉｋｌ−ＰＣＢ１０ｓ８９１０１４７５

Claims

【特許請求の範囲】

１．アミノ酸位置８にイソロイシンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
２．アミノ酸位置１６９にアラニンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
３．アミノ酸位置２１７にリジンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
４．アミノ酸位置５０にフェニルアラニンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
５．アミノ酸位置２４８にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２４９にアルギニンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
６．アミノ酸位置２０６にシステインを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
７．アミノ酸位置２１７にロイシンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
８．アミノ酸位置２０６にチロシンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
９．アミノ酸位置６３にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２１７にリジンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
１０．アミノ酸位置２７１にグルタミン酸を含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
１１．アミノ酸位置２２にリジンおよびアミノ酸位置７６にアスパラギン酸を含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
１２．アミノ酸位置１０４にバリンおよびアミノ酸位置１２８にセリンを含有するスブチリシン物質をコードしている突然変異スブチリシン遺伝子。
１３．請求項１〜１２のいずれかに記載の突然変異スブチリシン遺伝子によってコードされているスブチリシン物質。
１４．スブチリシン物質がスブチリシンＢＰＮ′、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンＤＹ、スブチリシン・アミロサッカリトリクス、およびメセンテリコペブチダーゼからなる野生型スブチリシン群から選ばれるスブチリシンである請求項１３記載のスブチリシン物質。
１５．スブチリシン物質がスブチリシンに相同な突然変異セリンプロテアーゼである請求項１３記載のスブチリシン物質。
１６．請求項１３記載のスブチリシン物質を２，０００〜４，０００Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｄｅｌｆｔ　Ｕｎｉｔｓの濃度で含有する洗浄調製物。
１７．織物を請求項１６記載の洗浄調製物と接触させ、該洗浄調製物で汚れた織物をクリーニングすることを特徴とする、織物のタンパク質性の汚れの除去を改善するための方法。
１８．オリゴヌクレオチド突然変異誘発によってスブチリシン物質に突然変異を誘発して以下に挙げるアミノ酸置換の少なくとも１つを行うことを特徴とする、スブチリシン物質の安定化方法：アミノ酸位置８にイソロイシン；アミノ酸位置１６９にアラニン；アミノ酸位置２１７にリジン：アミノ酸位置５０にフェニルアラニン；アミノ酸位置２４８にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２４９にアルギニン；アミノ酸位置２０６にシステイン；アミノ酸位置２１７にロイシン；アミノ酸位置２０６にチロシン；アミノ酸位置６３にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２１７にリジン；アミノ酸位置２７１にグルタミン酸；アミノ酸位置２２にリジンおよびアミノ酸位置７６にアスパラギン酸；またはアミノ酸位置１０４にバリンおよびアミノ酸位置１２８にセリン。
１９．（ａ）スブチリシンのアミノ酸配列を得；（ｂ）該スブチリシンのアミノ酸配列をスブチリシンＢＰＮ′のアミノ酸配列と並べ：（ｃ）突然変異が（ａ）のスブチリシンのアミノ酸配列中のギャップのところに、またはギャップの隣に来ないような条件のもと、該スブチリシンをオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発によって突然変異させて、以下に示す突然変異の少なくとも１つを行い：アミノ酸位置８にイソロイシン；アミノ酸位置１６９にアラニン；アミノ酸位置２１７１にリジン；アミノ酸位置５０にフェニルアラニン；アミノ酸位置２４８にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２４９にアルギニン；アミノ酸位置２０６にシステイン；アミノ酸位置２１７にロイシン；アミノ酸位置２０６にチロシン；アミノ酸位置６３にアスパラギン酸およびアミノ酸位置２１７にリジン；アミノ酸位置２７１にグルタミン酸；アミノ酸位置２２にリジンおよびアミノ酸位置７６にアスパラギンのためのアスパラギン酸；またはアミノ酸位置１０４にバリンおよびアミノ酸位置１２８にセリン；そして（ｄ）熱的に安定な突然変異スブチリシン物質を製造すること；によって得られる熱的に安定な突然変異スブチリシン物質。