JPH03503605A

JPH03503605A - ヒトパピローマウイルス分類法および該方法に使用する核酸プローブ

Info

Publication number: JPH03503605A
Application number: JP1504996A
Authority: JP
Inventors: ジョージ　アルバート　エル　ジュニア; グロッフ　デニス　イー
Original assignee: オンカー　インコーポレーテッド
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1991-08-15
Also published as: EP0408658A1; WO1989009940A1; EP0408658A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本出願は１９８８年４月４日登録の米国特許第０７　／１７７、４０４号の継続出願である。

本発明は遺伝子工学およびウィルス同定の分野に関する。本発明はヒトパピローマウィルス分類法および該方法で使用する新しい相補的核酸プローブに関する。

現時点で、ヒトのがんの誘導に関するウィルスの研究は挫折している。初期の研究ではウィルスががんと関係しているということを直接示したものはなかった。

しかし１９３０年代コツトンテールラビットのパピローマウィルスはその宿主の腫瘍原であることが実験的に証明された。その他の動物パピローマウィルスも引きつづいて実験動物に腫瘍を作ることが示され、またそのいくつかは培養細胞への形態学的形質転換が可能であった。

分子生物学におけるより企みな技術を用い多くのウィルスがヒトのがんウィルスとなりうることが示された。その１つのウィルスがヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）である。最近の分子ウィルス学的および免疫学的研究でＨＰＶ感染および子宮頚部の異形底の関係が示された。これらの観察の意義はこの異形底が子宮がんへの前駆障害であると考えられる事実により強調される。

ＨＰＶは電子顕微鏡により観察された最初のウィルスの１つであるにもかかわらず最近までそのウィルスの生物学に関してほとんど情報が得られなかった。

子宮がんの病因は不明であるが、流行病学的研究は子宮がんおよびその前駆障害、異形底および原位置のかん腫瘍は性的に転位する病気としてふるうことを示した。最近の２．３年でヒトのバピローマウイルスは長い間認識されている腫瘍（性殖いぼ）の原因であるばかりでなく約８５％の子宮上皮的腫瘍および侵略性がんと関係しているという証拠が蓄積してきている。これらの障害由来の不定型細胞は一般に剥脱子宮細胞学テストまたはＰａｐミルテスト出される。

Ｐａｐミルテスト形成および悪性細胞を検出する効果的方法であることが分っており、かつもっとも広く用いられているがんスクリーニングテストである。しかし障害が形態学だけではどのようにふるまうか予測できない。この予測不能性は初期異形成の退化もしくは存続する性質と混っている。ある異形成は侵略性が強くかつ子宮がんに迅速に進行するという証拠が増えている。進行性障害をもつ女性は侵略性がんが発達する前にＰａｐスミアスクＩＪ−ユング法によって同定されることは少ない。大規模スクリーニングプログラムが子宮がんの発生を減少する一方、定期的スクリーニングにもかかわらず不検出の障害をもつ有意な女性がいる。さらに、子宮障害をもつ患者由来の単−Ｐａｐスミアは不適当なサンプリングもしくは不正確な細胞学的解釈によりネガティブとなる可能性がある。組織学的に明白な障害をもつ女性の単−Ｐａｐスミアに対するネガティブな判断ミスは５０％にもなりつる。

ヒトのパピローマウィルス（ＨＰＶ）は環状二本鎖ゲノムをもつ顕著に異質な小型ＤＮＡウィルスであり、これは鱗状上皮に感染し種々の増殖性障害を起こす。

７種のＨＰＶが性殖系障害と関連している。ＨＰＶ−６および１１は外陰、膣および子宮の腫瘍と関係している。一般にこれらの障害は悪性度が低いが長期腫瘍の５〜１５％ががんへ転換する。ＨＰＶ１６．１８．３１．３３および３５型は子宮頚部の異形成（これは前悪性と考えられている状態）と関連している。ＨＰＶ−１６ＤＮＡ配列を含む異形成は異常有糸分裂活性および異数性と関連していることが示されている。さらに、これらのウィルス由来のＤＮＡは侵略性子宮がんで高い割合いで検出されている。侵略性子宮がんのおよそ５０％がＨＰＶ−１６ＤＮＡ配列を含んでいるので、このウィルスによる感染が子宮がんの発達における危険因子であるようだ。６型およびｌｌ型は子宮に感染し得るにもかかわらず、それらは侵略性障害に有意に関連していない。これらの予備的観測に基づき、ＨＰＶ−６および１１は良性の障害と関連しているが他の性殖系ＨＰＶはより大きな腫瘍原性を有しているらしい。

もし子宮がんが特異的ＨＰＶに感染した女性でより頻繁に発生するならＤＮＡハイブリダイゼーションによるそのような感染の早期発見は侵略性障害の発生する危険にある女性を発見するのに役立つ。予備的実験はＨＰＶ配列の検出に子宮から剥離した細胞へのＤＮＡハイブリダイゼーションの使用を示した。これらの実験はフィルター上への細胞の収集および細胞溶解およびＤＮＡ固定化後の全長ゲノムプローブを用いたハイブリダイゼーションによりＨＰＶ配列の検出を示している。この結果はクラス■−■のＰａｐミルスミア９〜８３％が限定したＨＰＶプローブを用いるとＨＰＶ　　ＤＮＡポジティブであることを示した。最近ロリンクス（Ｌｏｒ　１ｎｃｚ）等は（１９８５）フィンランド、クオピオにおけるパピローマウィルスのワークショップで不定型性を示したＰａｐミルスミアつ女性の９４％にサウザーンプロット分析によりＨＰＶＤＮＡが検出されたことを報告した。これらのＤＮＡのほとんどは非分類型ＨＰＶに由来しており、かつ低ストリンジェント条件下でのみ検出し得たので、この分野でのプローブの開発の必要性が強調されている。

ヒトの臨床サンプルにおける感染物の検出は大きく進歩している０しかし、これらの感染物のほとんどは繁雑な培養または免疫技術により検出される。ヒトのパピローマウィルスは培養では増殖せず、かつその存在は病理学、構造ポリペプチドの発現または核酸の検出によってのみ検出される。ＨＰＶは病状を示さない° 正常”な組織に存在し得、およびＨＰＶが潜伏性ウィルス感染としても存在し得ることからその一番後者の方法が唯一の信頼できる検出法である。構造ポリペプチドは初期前悪性障害の十分に分化した細胞中で発現されるが、常に発見されるものではない。

女性の性殖系のＨＰＶ感染に対する迅速で信頼性のある診断テストの必要があることは明白である。子宮サンプルにおけるＨＰＶ配列検出用の分子ハイブリダイゼーションプローブは単純な細胞学的テストより少なくとも２つの利点がある。

第１に、ハイブリダイゼーションによってスクリーニング可能な細胞数は、マニュアルによるスクリーニングにより一般に検出可能な数より有意に大きい。そして第二に、ハイブリダイゼーションを用いたデータ解釈は不定型細胞の観察より主観的ではない。

完全なゲノムＨＰＶ　　ＤＮＡプローブはこの分野では知られている。たとえばギスマン（Ｇｉｓｓｍａｎｎ）、Ｌｌ等（″喉頭腫瘍由来のヒトパピローマウィルスの分子クローニングおよび特徴１、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　％　１９８２．８月、ｐ、３９３−４００）は全ゲノムＨＰＶ−１１ａＤＮＡプローブの調製を公開している。

デースト（口ｕｒｓｔ）、Ｍｌ等（“子宮がん由来のパピローマウィルスＤＮＡおよび種々の地理学的領域由来のがん生検サンプル内のその普及″Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ％　１９８３．６月、８０、ｐ　３８１２−３８１５、）は全ゲノムＨＰＶ−１６ＤＮＡプローブの調製を公開している。ポジヤード（Ｂｏｓｈａｒｔ）、Ｍｌ等（“新しいタイプのパピローマウィルスＤＮＡ、性殖器がん生検および子宮がん由来の細胞内のその存在”　　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　、１９８４、旦、５号、ｐ１１５１−１１５７）！を全’ｒ’／ＡＨＰＶ−１８ＤＮＡ　　Ｈｐｖ−１８ＤＮＡプローブの調製を公開している。

不幸にもこれらの全ゲノムプローブは診断に用いるとき有意な短所を有している。現在生物学的サンプル中のＨＰＶの存在の検出には電気泳動が用いられる。全ゲノムプローブを電気泳動で用いたとき、有意な量のクロスハイブリダイゼーションが種々のタイプのパピローマウィルスで起った。すなわち１つのタイプのＨＰＶに特異的な全ゲノムプローブが別のＨＰＶとクロスハイブリダイズするという類似性がある。したがって、種々のＨＰＶ遺伝子型間の高度なホモロジーのためタイプ特異的プローブが必要である。ＨＰＶ−６と１１には約７５％のホモロジーがあり、特定の領域ではそのホモロジーは９０％を越え、かつＨＰＶ−１６と３１の領域間にも同様のホモロジーが存在する。異なるタイプのＨＰＶ間の高度の類似性により臨床検体のテスト用には全ゲノムプローブは望ましくない。他の遺伝子型のＨＰＶと実質的にクロスハイブリダイズしないタイプ特異的プローブの必要性は明らかである。

さらに、ゲノムプローブを用いたＨＰＶ遺伝子型テストのための現在の診断操作においてはＨＰＶ６．１１．１６．１８．３１．３３および３５など主要なタイプの生殖ＨＰＶを区別するのに多くのハイブリダイゼーションが必要である。このことは患者から相当量の検体を必要とし、同時に非常に時間が消費される操作である。それゆえ、臨床サンプル中で実質的にクロスハイブリダイズしないプローブを用いたＨＰＶ　　ＤＮＡの同時分析が必要なことは明白である。

１９８４年８月、日本、京都におけるパピローマウィルスに関するインターナショナルワークショップおよび１９８５年４月にもようされた分子および細胞生物学“パピローマウィルス二分子的および臨床的特性′に関するＵＣＬＡシンポジウムにおいてトー７ス　［ブローカー（ＴｈｏｌＩＩａｓ、　Ｒ，Ｂｒｏｋｅｒ）は電子顕微鏡によるヘテロ二重鎮分析を用いたヒトパピローマウィルスゲノム間のホモロジー領域を述べた２つの概要に関するルイスＴ、チョー（Ｌｏｕｉｓｅ　Ｔ、　Ｃｈｏｗ）の共著者である。ブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）はヒトパピローマウィルスゲノム間のホモロジーおよび非ホモロジー領域の存在およびこれらの領域の選択への電子顕微鏡の使用を示した。またブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）およびチヨ−（Ｃｈｏｗ）はＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ　　（（１９８６）ｐ５８９−５９４）に゛性殖系粘膜のヒトパピローマウィルス：ＨＰＶタイプ６．１１および１８で形成されるＤＮＡへテロ複合体の電子顕微鏡分析”と称する報告を示した。１９８６年９月、ニューヨーク、コールドスプリングハーバ−、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−でもようされたかん細胞に関する第４回コールドスプリングハーバ−会議“パピローマウィルスに関する国際ワークショップ”においてブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）はサブゲノムＨＰＶプローブおよび原位置でのハイブリダイゼーションにおけるそれらの使用に関する２つの概要の共著者となった。ブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）はタイプ特異的プローブの生成に失敗した。ブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）のプローブ中に存在する核酸配列はいくつかのＨＰＶの遺伝子型または種にホモロジーを持っていた。ストリンジェント条件下でさえ有意な量のクロスハイブリダイゼーションが起った。したがって、ブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）およびチヨ−（Ｃｈｏｗ）により考えられたプローブは特異的ＨＰＶ遺伝子型を同定するには有用ではなかった。この分野で分子ハイブリダイゼーションを行う際に他の遺伝子型のＨＰＶと実質的にクロスハイブリダイズしないタイプ特異的ＨＰＶ核酸プローブの必要性がある。

その他の２つの研究チームはＨＰＶを検出するためのプローブ使用の可能性を考えた。ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０５８１６はパピローマウィルス検出用のプローブの構築にテンプレートとしてカプシドたん白質（Ｌｌ）をコードするオーブンリーディングフレームを用いることを示している。

ヨーロッパ特許出願第０２３５００４号は新しい２つのタイプのパピローマウィルスすなわちＨＰＶ−ＩＦ５およびＨＰＶ−ＩＦ５を公開している。またパピローマウィルス感染のウィルス学的診断に適したＨＰＶ　　ＤＮＡも述べられている。これらのＤＮＡは種々のタイプのＨＰＶに由来するＤＮＡ混合物である。本発明はこれまで当分野で知られているものを有意に越えた利点を提供する。

（本発明の概要）本発明の一般的目的は生物学的サンプルにおける特異的遺伝子型のヒトパピローマウィルスの同定法を提供することである。

本発明の主要な目的は前悪性子宮上皮内腫瘍における特異的遺伝子型のヒトパピローマウィルスＤＮＡを検出するための原状態でのハイブリダイゼーションを用いた方法の開発である。

本発明の別の目的は単一のハイブリダイゼーションテストで臨床的に重要な核酸配列を検出し得るプローブまたはプローブセットの開発である。

本発明の別の目的はその存在を検出する必要のない他の核酸を含む生物サンプル中のＨＰＶ核酸の存在を検出するためのプローブで検出する必要のある核酸とハイブリダイズする相補的核酸配列を含むプローブの開発である。

本発明の特定の目的は、ストリンジェント条件下池の遺伝子型のＨＰＶと実質的にクロスハイブリダイズしない新しいタイプの特異的核酸プローブの提供である。ハイブリダイゼーションの条件は目的とする核酸領域へのハイブリダイゼーションを制限する。

本発明の別の目的は種々の検出技術と組合せて使用し得、かつＨＰＶ感染の迅速で信頼性のある診断テストに応用するのに十分な特異性および感度を有するサブゲノムタイプ特異的プローブの開発である。

別の目的は、評価する生物サンプルが新鮮な組織かまたは固定化した組織である場合のサウザンハイプリダイゼーション、ドツトプロットハイブリダイゼーションおよび、原状態ハイブリダイゼーションなど多くのテストで使用し得る実質的に純粋なプローブの開発である。

さらに本発明の目的はタンデムにＨＰＶのサブゲノムタイプ特異的配列を含む混成プローブの開発である。

さらに本発明の別の目的はタイプ特異的ＨＰＶ合成オリゴヌクレオチドプローブの調製である。

さらに本発明の別の目的は、主要性殖系ＨＰＶタイプ６．１１．１６．１８．３１．３３および３５を単一のハイブリダイゼーションステップで区別し得る臨床サンプル中のＨＰＶ　　ＤＮＡの同時分析である。

従って本発明は、（ａ）ヒトのパピローマウィルスＤＮＡをヒトのパピローマウィルスＤＮＡを切断して特異的遺伝子型のヒトパピローマウィルスの消化パターンを生ずる部位特異的試薬またはそれらの組合せで消化すること、ら）特定の遺伝子型のヒトパピローマウィルスＤＮＡの配列に相補的な、Ｌ−１オープンリーデイングフレームとは異なる領域に由来するラベル化プローブで、ストリンジェント条件下で他の遺伝子型のヒトパピローマウィルスＤＮＡとは実質的にクロスハイブリダイズしえないプローブを用いたゲノムブロッティングにより（ａ）の消化物中の特異的ヒトパピローマウィルスＤＮＡを検出すること、および（Ｃ）ら）で得たゲノムブロッティングパターンを前記部位特異的試剤および同じラベル化核酸プローブを用いて得られた前記ヒトパピローマウィルスＤＮＡ配列に対する標準ゲノムブロッティングパターンと比較することを含むヒトパピローマウィルスＤＮＡ制限フラグメント長に基づく特異的ヒトパピローマウィルス遺伝子型を検出するヒトパピローマウィルス分類法に関する。

また本発明は（ａ）固体サポート上に少なくとも１つの遺伝子型のヒトパピローマウィルスを含むヒト細胞を含む生物検体を固定する、Ｑ））この検体を前記ヒトパピローマウィルスの配列に対応するラベル化したタイプ特異的ヒトパピローマウィルス核酸プローブで、ストリンジェント条件で他の遺伝子型のヒトパピローマウィルスＤＮＡと実質的にクロスハイブリダイズし得ないプローブを用イテハイブリダイゼーションする、そして（Ｃ）前記生物検体における前記ラベル化プローブの存在を検出する、以上（ａ）〜（Ｃ）を含む原状態におけるハイブリダイゼーション法を用いるヒトパピローマウィルス分類法に関する。

（図面の簡単な説明）第１図は入れ予成のプローブを示している。

第２図は標準ＤＮＡと４種の制限酵素で消化したタイプ特異的ＨＰＶプラスミドＤＮＡを電気泳動したアガロースゲルの写真である。ラベルは指示されているようにＨＰＶタイプ６（プローブＢ）、１１（プローブＡ）、１６および１８（プローブＢ）に特異的である。ＭはマーカーＤＮＡでＨｉｎｄＩ［Ｉで消化したバタテリオファ−シラムダＤＮＡである。

第３図はサウザーンプロットを調製し、ＨＰＶタイプ６（プローブＢ）、１１（プローブＡ）、１６および１８（プローブＢ）にタイプ特異的プローブを別々にハイブリダイズし、本発明のプローブの特異性および感度を示した写真である。

第４図はサウザーンプロットを調製し、診断制限切断としてＰｓｔＩ消化を用いてＨＰＶタイプ６．１１および１６の混合物またはＨＰＶタイプ６（プローブＢ）、１１（プローブＡ）または１６にタイプ特異的プローブを別々にハイブリダイズした写真である。

第５図はタイプ特異的ＨＰＶＩＩプローブ（プローブＡ）による再構築および臨床サンプルのスロットプロットハイブリダイゼーションの結果を示している。

第６図はＨＰＶタイプ６．１１．１６および１８にタイプ特異的な伸長したラベル化合成オリゴヌクレオチドの写真である。

第７図は３０塩基からなる８種の合成オリゴヌクレオチドの配列を示しており、Ａ）およびＢ）はタイプ６に特異的であり、Ｃ）右よびＤ）はタイプ１１に特異的であり、Ｅ）およびＦ）はタイプ１６に特異的であり、そしてＧ）およびＨ）はタイプ１８に特異的である。

第８図は５０塩基からなる８種の合成オリゴヌクレオチドの配列を示しており、Ａ）およびＢ）はタイプ６に特異的であり、Ｃ）およびＤ）はタイプ１１に特異的であり、Ｅ）およびＦ）はタイプ１６に特異的であり、そしてＧ）およびＨ）はタイプ１８に特異的である。

第９図はタイプ特異的ＨＰＶタイプ６ＤＮＡプローブＡのヌクレオチド配列を示している。

第１０図はタイプ特異的ＨＰＶタイプ６ＤＮＡプローブＢのヌクレオチド配列を示している。

第１１図はタイプ特異的ＨＰＶタイプｌｌＤＮＡプローブＡのヌクレオチド配列を示している。

第１２図はタイプ特異的ＨＰＶタイプｌｌＤＮＡプローブＢのヌクレオチド配列を示している。

第１３図はタイプ特異的ＨＰＶタイプ１６ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列を示している。

第１４図はタイプ特異的ＨＰＶタイプ１８ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列を示している。

第１５図はタイプ特異的ＨＰＶタイプ１８ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列を示している。

第１６図はＨＰＶ６フーカーフラグメントおよびその特異的プローブを示している。

第１７図はＨＰＶＩＩマーカーフラグメントおよびその特異的プローブを示している。

第１８図はＨＰＶｌ　６マーカーフラグメントおよびその特異的プローブを示している。

第１９図はＨＰＶ１８マーカーフラグメントおよびその特異的プローブを示している。

第２０図はＨＰＶ３１マーカーフラグメントふよびその特異的プローブを示している。

第２１図はＨＰＶ３３マーカーフラグメントおよびその特異的プローブを示している。

第２２図はＨＰＶ３５マーカーフラグメントおよび特異的プローブを示している。

第２３図はＨＰＶ３３マーカーフラグメントのヌクレオチド配列を示している。

第２４図はＨＰＶ３３タイプ特異的プローブのヌクレオチド配列を示している。

第２５図は同時ＨＰＶ分類テストの結果の写真を示している。

（好ましい態様の説明）本発明のＨＰＶ分類法では第１にヒトの細胞を含む生物検体を固定サポート上に置きこれを固定する。本発明の実行に適した固体サポートにはニトロセルロース、ガラス、ＤＢＭペーパー、プラスチックたとえばナイロンなどが含まれる。

またこの固体サポートはビーズでもよい。ＨＰＶ核酸プローブをこのピース上を動かすことによりハイブリダイゼーション工程を自動化するのが容易となろう。

残りの溶液からラベルしたプローブを洗浄および分離するのがより簡単である。

またサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイも行いえる。

サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイには２種のプローブを使用する。

１つのプローブはビーズ上に支持され、もう１つは検出用のラベルを含んでいる。両プローブとも同じタイプのＨＰＶに特異的なものである。

本発明の方法に使用する生物検体の調製には当分野でよく知られている技術を使用する。たとえばこの生物検体は遠心されたり、もしくは当分野で知られている自動化した方法で調製される。適当な固定化技術にはメタノール−酢酸、クロロホルム−塩酸、バラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノールなどが使用される。

ＤＮＡ分解を排除する条件下で核をなす細胞からＤＮＡを単離するための多くの方法が知られている。

１つの方法にはＤ　Ｎ　Ａ　ａｓｅ活性をおさえる温度および条件下でＤＮＡを攻撃しないプロテアーゼで細胞を消化し、つづいて有機溶剤でその消化物を抽出することを含む。核をなす細胞からのＤＮＡ単離はカン（Ｋａｎ　）等（“α− サラセミアにおける非欠失欠陥の同定”　、Ｎ％Ｅｎｇ％Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９７、ｐ１０８１−１０８４（１９７７））およびテーラ−（Ｔａｙｌｏｒ）等（ホモ接合サラセミアにおける遺伝子障害（ハイドロブス・フェタリス）″、Ｎａｔｕｒｅ。

２５１、ｐ３９２−３９３　（１９７４））により示されている。

抽出したＤＮＡは透析、クロマトグラフィー、沈殿化またはポリヌクレオチドを精製するためのその他の方法により精製される。

評価するＤＮＡはヒトＤＮＡとヒトパピローマウィルスＤＮＡの混合物となろう。

このように得たＤＮＡを特異的部位で核酸を切断する１つ以上の試剤でインビトロで加水分解する。このような部位特異的試剤には制限エンドヌクレアーゼ、修飾した合成オリゴヌクレオチドおよび当分野でよく知られているその他の部位特異的試剤が含まれる。部位特異的試剤はドレイヤー（Ｄｒｅｙｅｒ）等（“−木調ＤＮＡの配列特異的切断：オリゴヌクレオチド−ＥＤＴＡ−Ｐｅ（Ｉｌ）”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２．　ｐ　９６　ｇ　−９７２（１９８５））およびチュー　（Ｃｈｕ）等（′一本木調ＮＡの非酵素的配列特異的切断”　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８２、ｐ９３６−９６７（１９８５））によって示されている。

どの場合も、その部位特異的試剤は研究中のヒトパピローマウィルス部位と関連する消化パターンを生ずるものであることが重要である。適当な制限エンドヌクレアーゼにはＢａｔａＨｌ、　Ｐｓｔｌ。

Ｎｅｄｌ、ＥｃｏＲＩ％ＰｖｕＩ［，５ａｕ３ａ％Ｋｐｎｌなどが含まれる。

種々の特異的ＨＰＶプローブが作用する部位に制限フラグメントを生成する好ましい制限エンドヌクレアーゼにはＢａ５ＨＩ、Ｐｓｔ■およびＢａｍＨｒによびＰｓｔＩの組合せがある。ＨＰＶ　　ＤＮＡの臨床的同時分析のための細胞ＤＮＡは粗患者サンプルから得るか、または当分野で知られている方法に従って抽出および精製される。さらにその細胞ＤＮＡを種々の長さのフラグメントを作るため診断制限酵素を用い当分野でよく知られている方法に従って切断する。従って特異的プローブに対する種々の大きさのフラグメントを生成する１つ以上の制限酵素が使用される。

出願者はＨＰＶタイプでホモロジーの最も低いＨＰＶ　　ＤＮＡ領域からそれらのプローブを調製した。適当な領域にはＬ−２オーブンリーデイングフレーム、Ｅ−１オーブンリーデイングフレーム、Ｅ−６オーブンリーデイングフレーム、Ｅ−７オーーｊンリーデイングフレームおよびしばしば上流調節領域といわれる非コード領域が含まれる。本発明はＬ−１オーブンリーデイングフレームが高すぎるホモロジーを示し、したがって種々のタイプのＨＰＶとクロスハイブリダイゼーションを起こすことからこの領域には依存していない。さらにＬ−１は非常に小さい特異的ヌクレオチド配列をコードしている。

一方本発明のプローブはより長い塩基をもつプローブを使用する。それゆえサンプル中のより少ないＨＰＶが検出できかつＨＰ　Ｖの検出に少量のプローブで足りることからこれらのプローブはより感度が高い。

部位特異的試剤による核酸の消化または加水分解は核酸切断に都合のよい条件下水性媒体中で行なわれる。部位特異的試剤による核酸の消化に必要な特定の条件、バッファまたは添加物は選択した部位特異的試剤に依存する。たとえば制限エンドヌクレアーゼの場合、一般に製造業者がその市販のエンドヌクレアーゼとともに適当なバッファを提供する。また部位特異的試剤は種々の条件または物質の存在下でより良く働く。このような物質にはマグネシウムイオンや他の無機イオンのようなイオン類、ＡＴＰまたはＳ〜アデノシルメチオニンのような共因子が含まれる。

一般的に消化混合物中のＤＮＡ債は重さで０．００５％〜０．１％の範囲にある。たとえば完全消化される総細胞ＤＮＡｆ！５〜２０マイクログラムが分類に最も適当なサンプル量である。通常ＤＮＡ１マイクログラム当り１〜５ユニツトと、制限エンドヌクレアーゼによる加水分解には過剰の試剤が推薦される。しかし、選択する部位特異的試剤とは無関係に、一般に完全な加水分解には過剰量の部位特異的試剤が必要とされる。もし必要ならばゲノムブロッティングまたは溶液ハイブリダイゼーションにかける前にその制限消化物を沈殿化および再懸濁する。

それからこの制限消化物を当分野で知られている方法で分析する。核酸をメンブレン上に置く種々の方法が知られている。適当な方法にはゲノムブロッティング、サウザンブロッティング、バキュームトランスファー、エレクトロトランスファー、溶液ハイブリダイゼーションなどが含まれる。サウザンブロッティングにおいてはその消化産物を電気泳動し、転移後核酸を結合する支持体に固定して適当にラベルした核酸プローブでハイブリダイズする。ラベル化したハイブリッドはオートラジオグラフィー、観察または他の技術で検出する。

特定の遺伝子型のＨＰ　Ｖの分類には、その分析はそのウィルスの遺伝子型のみにユニークなりＮＡ配列を検出する。

ＤＮＡ加水分解産物は電場下、そのサイズ、形、荷電、構造またはその他のパラメータにより支持媒体中を電気泳動させることにより分離する。一般にアガロースまたはアガロース・アクリルアミドなどのゲルシートまたはスラブが電気泳動用の支持媒体として用いられる。その電気泳動条件は望ましい程度のフラグメントの分解能が得られるよう設定する。通常１００塩基対はどのサイズの差があるフラグメントを分離する分解能があれば十分である。電気泳動を行うには、その消化物をゲルスラブの一端（一般に“オリジン”と呼ばれる）にロードし、ゲル内を通って電気的に移動させることによりフラグメントが分離される。最も短かいフラグメントはオリジンからスラブの他端（アノード）へと最も早く電気泳動する。種々の線型ＤＮＡフラグメントが移動する距離はその分子量に依存する。

したがってプローブに相補的配列を含むフラグメントは一般にそのサイズにより分離される。必要ならばシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）等（Ｃｅ１１．３７、ｐ６７−７５（１９８４））およびカール（Ｃａｒｌｅ）等（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１２、ｐ５６４７−５６６４　（１９８４）　）によって報告されているパルスフィールドゲル電気泳動またはインバージョンフィールドゲル電気泳動などの方法により、長さで数百刃ＤＮＡ塩基対の範囲のかなり巨大なりＮＡ分子も分離できる。

上述の電気泳動によるＤＮＡ分子の分離後、そのゲルをＤＮＡ変性液、簡便には弱アルカリ、一般には約０．２〜ＩＭの水酸化物、好ましくは０．５Ｍ　Ｎａ　ＯＨに入れ、ＤＮＡ＃Ｊを解離してハイブリダイゼーションの準備をする。通常まずそのＤＮＡを部分的に脱プリン化またはニックを入れることによりゲルからのＤＮＡの移動を可能にする。変性後、そのゲルを中和液に入れ、弱酸性のｐＨにまで中和する（たとえばニトロセルロースメンブレンを使用するなら）。必要ならばそれからＤＮＡを一般にニトロセルロースペーパー、ナイロンまたはＤＢＭペーパーなどの材質でできた物質に転移させる。これはＤＮＡのペーパーへの転移および共有または非共有結合を促進するたとえばバッファなどの試剤の存在下で、かつたとえば軽量、真空および約Ｏ℃〜２５℃などの条件下でそのゲルをペーパーに接触させることにより行う。このような試剤および条件はサウザー７　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　Ｅ、　Ｍ、　　（Ｊ、　　Ｎｏ！！。

Ｂｉｏｌ、９８．ｐ５０３−５１７　（１９７５））およびＵ、　Ｓ、特許！　４．３０２．２０４号により示されている。臨床サンプルのＨＰＶＤＮＡ同時分析ではナイロンハイブリダイゼーションメンブレンなどの固体サポートを使用するのが望ましい。その転移が完了した後、そのペーパーをゲルから離し、そのゲルを乾燥させる。そのペーパー上の分離された一重鎖ＤＮＡのＨＰＶプローブへのハイブリダイゼーション（アニーリング）はそのペーパーをハイブリダイズ条件下でそのプローブとインキュベートすることにより行う。このハイブリダイゼーションは一般的にホルムアミドなどの極性溶媒を含む水性バッファ溶液中で行う。塩化ナトリウム、フェン酸ナトリウムおよび硫酸デキストランなどノ１イブリダイゼーションを促進するその他の添加物も使用される。バックグランドを減少するため血清アルブミン、ラウリル硫酸ナトリウムおよび変性したサケ精子ＤＮＡなど超音波処理した変性ＤＮＡがこのハイブリダイゼーション媒体に含められる。

１つのＨＰＶヌクレオチド配列に特異的な相補的核酸プローブがこの分類法のハイブリダイゼーションステップで使用される。

しかし、種々の遺伝子型のＨＰＶヌクレオチド配列に特異的な１つ以上のプローブも使用される。各プローブは異なるラベルを有し、種々のＨＰＶ遺伝子型に対するプローブを区別するのが可能である。同時分析によるＨＰＶタイプの検出においてはそのメンブレンは第１６図〜第２４図に示したタイプ特異的ＨＰＶプローブでハイブリダイズする。

部位特異的核酸プローブは従来法で調製される。タイプ特異的ヒトパピローマウィルス配列を決定する１つの方法はホモロジーマトリクス解析を用いた直接的ヌクレオチド配列の比較によるものである。パステル（Ｐｕｓｔｅｌｌ）およびカファタス（にａｆａｔａｓ）、“高速、高容量ホモロジーマトリクス、ＳＶ４０およびポリオーマによるズーミング″Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０、ｐ　４７６５−４７８２（１９８２））参照。この方法では特定のタイプのヒトパピローマウィルスの特定の核酸配列は共通するＤＮＡ配列分析、すなわち化学的シーケンシングおよび、またはグイデオキシ法により決定された。存在するパピローマウィルスに対するその特定の核酸配列のホモロジーまたは類似性が既知のタイプのヒトパピローマウィルスと比較される。それから非相同的または非類似的領域を制限酵素を用いて単離する。別法では非相同的領域を合成し精製する。非相同的領域の決定に適した制限酵素を以下の第１表にあげた。

第１表ＨＰＶタイプ　　タイプ特異的プローブの作成に使用される酵素タイプ　６ＢａｍＨＬ　Ｐｓｔｌタイプ１１　　　　　ＢａｍＨＩ％ＮｄｅｌＳＫｐｎｌ、ＰｓｔＩタイプ１６　　　　　ＥｃｏＲＩ　、　ＰｖｕＩＩタイプ１８　　　　　Ｂａａ＋ＨＩ、　５ａｕ３ａ精製した非相同的領域はラベルされ、標的としての既知ヒトパピローマウィルス配列を用いた従来のＤＮＡプロッティング操作におけるプローブとして使用される。このことはこのようにして入手したタイプ特異的核酸プローブが他のタイプのヒトパピローマウィルスとクロスハイブリダイズしないことを確かめるために行う。

このプローブは適当なベクター、たとえば市販のＳＰ６／Ｔ７ベクターまたはｐＢＲ３２２ベクターにクローニングする。ＳＦ３およびＴ７様ベクターはそのクローン化ＤＮＡをインビトロで非常に特異的活性を示すＲＮＡに転写する能力を有する。これらのベクターの使用は同じ構築物からＤＮＡおよびＲＮＡの両プローブの調製を可能にする。

また本発明を遂行する上でタンデムプローブも有効である。タンデムプローブは１つのベクター内で２つ以上のタイプ特異的ＨＰＶプローブを共有結合で結合することにより構築する。

本発明を実行するのに適した核酸プローブにはＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、合成オリゴヌクレオチドプローブ、チオエステルプローブなどが含まれる。ＲＮＡプローブはチミンがウリジンと交換していること以外はＤＮＡプローブと同じ配列を有している。

プローブは従来法を用いてそれらを検出可能な原子、リガンドなどでラベル化することで検出可能とする。適当なラベル化法には、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、カイネーシング、光反応、スルホン化、ヨウ素化、化学反応、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ）、ポリーＡトランスフェラーゼ、インビトロ転写などが含まれる。適当なラベルには”Ｈ１ｓＳＳ％”Ｐ％　１Ｃ％１２ｍ１．１１＋１１イオウ化合物、修飾ヌクレオチド（たとえばビオチン）などが含まれる。そのラベルは発光、オートラジオグラフィー、量子、酵素的検出、ストレプトアビジン結合酵素、アビジン結合酵素、抗原または抗体結合酵素、金または銀増強した金など種々の検出技術により検出される。

先に述べたサブゲノムプローブの代替物は合成オリゴヌクレオチドであるＯ合成オリゴヌクレオチドの使用にはいくつかの利点がある。それらは大量に合成でき、つづいてＨＰＬＣで高度に精製できる。第２に性殖系を汚す大腸菌のベクタ一様配列の検出から誤ってポジティブの結果を生ずるベクター配列がない。しばしば臨床サンプルは大腸菌ＤＮＡおよびｐＢＲ３２２関連プラスミドＤＮＡに汚染されており、したがってこれらベクタ一様配列にホモロジーをもつ配列が容易に検出され誤った結果に導く。さらにその利点には配列の給体的に限定できること、制限酵素認識部位で容易に限定されない配列を検定可能なこと、および生産の一貫性などが含まれる。

プローブはそれを使用するに当り最高の融通性があるように構築される。各配列に対し各３０塩基長の２つのオリゴヌクレオチドが合成される。この配列は第１図に示されているように１つの３′端の１０塩基は他の５端の１０塩基と相補的となるように選ばれる。このように合成されたオリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイズし、ＤＮＡ修復合成のテンプレートとして用いたとき入れ子のプローブを作る。したがって５０塩基対のオリゴヌクレオチド配列は３０塩基対のオリゴヌクレオチドから合成される。

適当な３０塩基対のオリゴヌクレオチドは第７図にあげた。適当な５０塩基対のオリゴヌクレオチドは第８図にあげた。

ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブの洗浄に必要な条件はサブゲノムプローブの条件とは異なる。文献から入手し得る実験的に測定された公式でオリゴヌクレオチド解離温度（Ｔｄ　）を評価し得る。この公式はプローブ混合物のスクリーニングのためのハイブリダイゼーション条件を決めるのに使うことができる。またオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは（ｉ）そのプローブの長さと（ｉｉ　）そのＧＣ含量を含むいくつかの因子に依存する。混合物中のプローブの長さが同一なときでもそのＧＣ含量やＴｄでそれらは異なる。

望ましい塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドプローブは多くの従来法により合成される。適当な方法にはシアノエチル法またはエチルホスホロアミダイド法が含まれる。

合成オリゴヌクレオチドの特異性はゲノムプロット分析におけるハイブリダイゼーションプローブとしてそれを用いることにより決定し得る。もちろんプローブ特異性を決定するその他の方法も使用できる。

次にメンブレン（または溶液ハイブリダイゼーションの場合はゲル）上のラベル化ハイブリッドが同定される。放射性ラベルを含むハイブリッドを検出するのにはオートラジオグラフィーがよく使われる。この方法は、一枚の放射線感受性フィルム（Ｘ線フィルム）上にそのメンブレンを乗せるものである。そのラベルの崩壊はフィルム内に銀粒子を析出させる。このフィルムを現象し、そのラベル化フラグメントのパターンを同定する。そのプローブと使用した特定の制限エンドヌクレアーゼの特異性がパターン内に出現するフラグメントの数を決定する。タイプ特異的プローブは１つの単離したバンドをもつパターンを与える。もちろんこのことは核酸がハイブリダイズする化合物に依存する。全ゲノムプローブを用いたときは１つ以上のバンドが出現し、その結果を解釈するのを困難にする。

本発明のプローブはストリンジェントハイブリダイゼーションの条件下でその評価を受ける。種々のＨＰＶ遺伝遺伝子宮にわずかなポモロジーがあり、それゆえクロろハイブリダイゼーションが起こるのでストリンジェントハイブリダイゼーション条件でりイブ特異的プローブを評価するのが好ましい。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を用いることにより、ホモロジーを有する領域を検出する可能性を少なくし、クロスハイブリダイゼーションの可能性も最少にすることができる。ストリンジェントハイブリダイゼーションはＴｍ−２０℃と限定する。これらの条件下では１４％以下のミスマツチを有する熱的に安定なハイブリッドが形成する。Ｔｍとは融触温度で分子の半分がハイブリダイズもしくは変性している温度である。Ｔｌ１１は次の関係で決定される。

Ｔｎ＋　＝８１．５＋　（１６，６ｘ　ｌｏｇ　［Ｎａ”）　）　−（０，４１ＸＯ％〔％Ｇ＋Ｃ］−（０，７２Ｘ％ホルムアミド）この関係式の中でＧはグアニン、Ｃはシトシンである。これから、４５％Ｇ＋Ｃ含量のＤＮＡに対し、ＩＭＮａ”または６ＸＳＳＣ中でのＴｍは９９．９５℃（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ１．０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）であると決定できる。ノ１イブリダイゼーション反応中のホルムアミドはＴｍを１％ホルムアミド当り０．７２℃の割合で減少させる。それゆえ、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーションにおいてはＴｍ＝１００℃−３６℃＝６４℃となる。最高のハイブリダイゼーション率はＤＮＡ二本鎖のＴｒａよりも２０℃低い温度で起こる。

それゆえ標準的高ストリンジエンシーハイブリダイゼーションは６ｘＳＳＣ，５０％ホルムアミド中４５℃の最高の条件で行なわれる。

ハイブリダイゼーション後の洗浄の間も、上記式を用いて同様の高ストリンジエンシーを維持するため、そのプロットは０、ｌＸ５ＳＣ中５２℃でインキュベートすべきである。

ハイブリダイゼーション実験のためＤＮＡは基本的にサウザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）によって述べられたものと同じ固体サポートに移される。新しく構築したサブゲノムプローブのタイプ特異性を評価するため、それらをＨＰＶタイプ６．１１．１６および１８の制限酵素消化ゲノムプロットにハイブリダイズすることにより正しいハイブリダイゼーションパターンを確認してドツトプロットを行った。

ＤＮ、ｌよびＲＮＡの両プローブの性能はこの方法で綿密に調べうる。ＲＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション反応におけるＳＮ比は潜在的に２つの理由でＤＮＡプローブの場合よりも大きい。ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖はＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖よりも安定で結果的にそれらはＤＮＡハイブリッドよりもより高ストリンジェント条件下で形成され洗浄し得る。またＲ　Ｎ　Ａ　ａｓｅを非特異的結合ＲＮＡを除くのに使用できる一方、それはＲＮＡ−ＤＮ・ＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖はそのまま維持する。インビトロで合成したＲＮＡプローブを用いる別の利点はそれらが含む汚染ベクター配列の量が極めて低いことである。基本的にこのことはこのシステムで使用するＲＮＡポリメラーゼ（それら自身のプロモーターに対するＳＦ３またはＴ７）の特異性による。

好ましい特異的核酸ＨＰＶプローブはクローニングの容易さ、すなわち使用可能な制限部位の位置、非相同的領域のサイズ、およびタイプ特異的核酸プローブがハイブリダイズする制限フラグメントサイズの一貫性に基づき選択した。

ＨＰＶタイプ６．１１．１６、および１８の基本的にまたは実質的にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で非相同的な領域が同定された。

さらに以下の実施例は本発明の種々の特徴を説明している。これらの実施例は本発明を制限するものではない。

タイプ特異的プローブの目的は存在するサブタイプとは無関係にＨＰＶ６．１１．１６および１８の遺伝子型を区別するものである。それゆえ、我々はＨＰＶ６サブタイプＡとＨＰＶ６サブタイプＢ１あるいはＨＰＶＩＩサブタイプＡとＨＰＶＩＩサブタイプＢとは区別しない。本出願者がＨＰＶ６．１１．１６および１８に対してなしたことはタイプ特異的プローブであり得る各遺伝子型の２つの領域を決定することである。各々の場合でこれらをプローブＡおよびプローブＢと命名した。各プローブの使用はこのテストの実際の態様に依存する。

（実施例１）（サブゲノムＨＰＶプローブの構築）ＨＰＶタイプ６．１１．１６および１８のゲノムの特定の領域を同定し上記第１表に示した酵素を用いてプラスミドベクタージェミニ（ＧＥＭＩＮＩ）シリーズ（プロメガバイオチク製）の多重クローニング部位にサブクローンした。ＨＰＶタイプ６．１１．１６および１８に対するそのフラグメントを第２図に示す。第９図から第１５図はタイプ特異的ＨＰＶプローブを示している。このベクターシステムは（１）多重クローニング部位にある隣接する制限酵素部位を用いてベクター配列由来のＨＰＶ　　ＤＮＡ挿入物を除去することによりＤＮＡプローブを構築すること、および（支））ジエミニ多重クローニング部位に隣接するＳＦ３およびＴ７プロモーターからの転写によりＲＮＡプローブを生成することを可能にする。通常この方法で生成したＲＮＡプローブはいくらかのベクター配列を含むがこれは分析における問題とはならない。

ＤＮＡプローブは制限酵素を用いたベクターからの挿入物の切り出し、アガロースゲルによる電気泳動、特定バンドの電気溶出、アフィニティークロマトグラフィー（エルチップ−ｄＳＳ＆ＳｌｌまたはＮＡＣ３−３７、ＢＲＬ製）による精製およびニックトランスレーションによる３２Ｐまたはビオチンを用いたラベル化により調製した。典型的にはＤＮＡマイクロダラム当り３−６ＸＩＯ’ｄｐｍの比活性をもつ３２Ｐラベル化プローブが得られた。

ＨＰＶタイプ特異的フラグメントに相補的なＲＮＡをその挿入物の片側に位置するプロモーターを用いたセルフリーシステムで合成した。一般にプラスミドＤＮＡはその挿入物およびプロモーターの末端の部位の制限酵素による切断で線状化し、またＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼにより合成した。ＳＦ３またはＴ７バクテリオフアージプロモーターなどの特異的プロモーターを使用することで対応する（ＳＦ３またはＴ７）ＲＮＡポリメラーゼの使用が可能となる。そのＲＮＡが相補的であるＤＮＡ鎮の選択は挿入したＨＰＶ　　ＤＮＡに対するプロモーターを選ぶことで決定した。

ＲＮＡプローブはＳ　Ｐ　６　ＲＮＡポリメラーゼによるＳＰ６プロモーターからの挿入ＤＮＡの転写によって生成した。このＤＮＡはＳＰ６プロモーターおよび挿入物の末端のＭＣ３中の制限消化により線型化し、”Ｐ−ＣＴＰまたは”Ｐ −ＵＴＰを用いる標準的方法により転写し、ついでセファデックスＧ−５０のスピンカラムで精製した。この転写法で生成したＲＮＡはＲＮＡＩマイクログラム当り２．５Ｘ１０”ｄｐｍの比活性を有していた。

（実施例２）（サブゲノムＨＰＶ　　ＤＮＡプローブの特異性および感度の評価）タイプ特異的ハイブリダイゼーションは他のＤＮＡへのクロスハイブリダイゼーションが起こらない特定の条件で観測するべきである。このことは高い配列ホモロジーをもつ領域がリラックスハイブリダイゼーション条件下ではクロスハイブリダイゼーションを起こすことがらＨＰＶを区別するのに特に重要である。ストリンジエンシーの一般的議論はロー（Ｌａｗ　）等（“パピローマウィルスゲノム間の保存されるポリヌクレオチド配列”、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　３２、ｐ１９９−２０７　（１９７９））の報文に示されている。

ハイブリダイゼーションパラメーターを決めるため各プローブのＴｍを次の式を用いて計算した。

ＴＯ＋＝８１．５＋（１６，６Ｘｌｏｇ　［Ｎａ”〕）＋（０，４１Ｘ％ＣＧ＋Ｃ））−（０，７２ｘ％ホルムアミド）最初に精製したタイプ特異的ＨＰＶ挿入ＤＮＡがサウザンプロットのメンブレンに結合しており、かつｍ２ｐ−ラベル化ゲノムＨＰＶクローン化ＤＮＡをプローブとして用いた場合の高ストリンジェントハイブリダイゼーション（Ｔａ＋　− １０℃；ＩＭＮａ”、５０％ホルムアミド中５５℃のハイブリダイゼーション、６２℃、１７ｍＭＮａ＋での洗浄）を行った。このＨＰＶ挿入物はホモロガスなウィルスタイプだけを用いてハイブリダイズした。異種タイプＨＰＶにはハイブリダイゼーションは検出されなかった。

この実験は標準的高ストリンジエンシーハイブリダイゼーション条件（Ｔｍ−２０℃：ＩＭＮａ”、５０％ホルムアミド中４５℃でのハイブリダイゼーション、５２℃、１７ｍＭＮａ＋での洗浄）でくり返した。この結果は同じであった。それゆえ、推定上のタイプ特異的ＨＰＶプローブはサウザンプロット上の標的ＤＮＡとして望ましい特性を有しているようである。

＄２ｐ−ラベル化プローブとしてサブゲノム挿入物を用い一連のサウザンプロットを標準的高ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズしそのプローブの特異性および感度を測定した。

ハイブリダイゼーションの特異性は２００コピー量の制限酵素消化したクローン化ゲノムＨＰＶ　　ＤＮＡを消化した胎盤ＤＮＡ１０マイクログラムと混合し、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、かつサウザンブロッティングによりナイロンメンブレンに転移させる再構成プロットで測定した。

第３ａ図から分るように、タイプ特異的ＨＰＶ６プローブＢ（ＴＳ６）ＤＮＡプローブはＨＰＶ６由来の挿入ＤＮＡとのみハイブリダイズし、同様にタイプ特異的ＨＰＶＩＩプローブＡ（ＴＳｌ　１）　、９４ブ特異的ＨＰＶ　１６　（ＴＳ　１６）　＃ヨびタイプ特異的ＨＰＶ１８−７’０−ブＢ　（ＴＳ　１８）　ハ相同的ＨＰＶタイプとのみハイブリダイズした。ヘテロなレーン内に見られるハイブリダイゼーションはプローブ中に混入したベクター配列によるものでＨＰＶ　　ＤＮＡ配列へのクロスハイブリダイゼーションによるものではない。さらに、タイプ特異的ＨＰＶプローブ（ＴＳ６、ＴＳｌｌ、ＴＳｌ６またｔｔＴｓ１８）によるＨＰＶｌ、ＨＰＶ２、ＨＰＶ４、胎盤ＤＮＡ、イーストＤＮＡまたはバタテリオファージラムダＤＮＡに対するクロスハイブリダイゼーションは観察されなかった。

タイプ特異的ＨＰＶプローブの検出感度は先に概説したように１００．１０．１および０．１の再構成コピーを含むサウザンプロットについて測定した。その結果を第３ｂ図に示す。

タイプ特異的ＨＰＶプローブは再構成プロットにより特異的であるらしいことからそれらを性殖器障害から精製したＤＮＡサンプルについてテストした。診断的制限切断としてｐｓｔＩ消化を用いサウザンプロットを調製し、第４図に示したようにＴＳ６、ＴＳｌｌ、およびＴＳｌ６で別々にハイブリダイズした。またサウザンプロットはＴＳｌ８でも別個にハイブリダイズした（データ示さず）。ゲノムプローブを用いることにより同定かつ分類された障害のうちの各々はタイプ特異的ＨＰＶプローブにより期待されるハイブリダイゼーションを起こした。さらに最初にネガティブと診断された４つの障害はＴＳ１６プローブを用いた１、８キロベースのＰｓｔＩフラグメントのハイブリダイゼーションでポジイティブな結果を与えた。これら４個のＤＮＡサンプルのＨＰＶ１６ゲノムプローブによる再分析もこれらサンプルのうちの３個に少量のＨＰＶｌ６の存在を確認した。

第５図でタイプ特異的ＨＰＶＩＩプローブＡについて示したようにタイプ特異的ＨＰＶ　　ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション特性をスロットプロット方式で分析した。細胞ＤＮＡを変性し、マニホールド■装置（Ｓ＆Ｓ製）を用いてナイロンメンブレン上で濾過した。それからこのメンブレンを独立にタイプ特異的ＨＰＶ　　ＤＮＡプローブとハイブリダイズした。再構成りＮＡ１未感染ＤＮＡおよび性殖器障害由来のＤＮＡの分析は細胞当り約１０コピー以上のＨＰＶ　　ＤＮＡのポジイティブハイブリダイゼーションシグナルを示した。この実施例の条件下でのスロットプロット方式はサウザンプロットはど感度はよくなかった。

（実施例３）（サブゲノムＨＰＶ　　ＲＮＡプローブの特異性および感度の評価）タイプ特異的ＨＰＶ　　ＤＮＡクローンからインビトロで転写した３２ｐ−ラベル化ＲＮＡを実施例２でＤＮＡプローブについて述べたのと同様の実験でハイブリダイズプローブとしての能力を分析した。その結果はほとんど同じであった。タイプ特異的ＲＮＡプローブはサウザンプロットにおいて同じタイプのＨＰＶに対し特異的ハイブリダイゼーションを示した。またこのＲＮＡプローブはタイプ特異的ＨＰＶ　　ＤＮＡプローブがハイブリダイズする性殖器障害由来の同様のＤＮＡ　（これらには最初にゲノムプローブでネガティブであった４個のサンプルが含まれる）に対しポジティブなハイブリダイゼーションを示した。

サウザンプロットにおけるバックグランドノイズはＲＮＡプローブの方がより少ないようである。しかし、このことはスロットプロットにおける感度の増加にはならずその信頼できる感度の限界は細胞当り１０コピーのままである。またハイブリダイゼーション後のフィルターのＲＮＡａｓｅＡ処理は検出感度を増加しなかった。

（実施例４）（タンデムプローブ）ＨＰＶ６．１１．１６および１８に対するサブゲノムタイプ特異的ＨＰＶプローブ全てを多重クローニング部位中の適合部位を用いてジェミニベクターにクローニングした。これはＥＣＯＲＩ　−ＨｌｎｄｌＩ［の二重消化でベクター配列から放出される２、２キロベースの挿入物である。この挿入物をサブゲノムＤＮＡ挿入物について先に述べたのと同様に精製し、サウザンブロットハイプリダイゼーションにおける５ｘｐ−ラベル化プローブとしてテストした。

再構成実験において、タンデムプローブはタイプ特異的ＤＮＡプローブがそれぞれ独立に行ったように４つ全てのＨＰＶタイプの同じ制限フラグメントにハイブリダイズした。性殖器障害由来のＰｓｔｌ消化ＤＮＡに対するタンデムプローブのハイブリダイゼーシａ　７ＧｔＨＰＶ　６　（１，５ｋｂ）　、ＨＰＶ　１１　（１，６ｋｂ）およびＨＰＶ　１６　（１，８ｋｂ）に対して期待されるバンドを与えた。障害および細胞系列を含むＨＰＶｌ８は種々の大きさのバンドを与えた。このことはＨＰＶｌ　８の予想される５、７ｋｂ　　ＰｓｔＩバンドが悪性進行の際通常ＨＰＶ１８に起こる取り込みの領域を含み、かつテストするＨＰＶ１ｇサンプルが侵略性がん腫に由来するものであることから期待されたことである。

（実施例５）（合成オリゴヌクレオチド）タイプ特異的ＨＰＶプローブとしての合成オリゴヌクレオチドの有効性を測定するため、ＨＰＶタイプ６．１１．１６および１８のＥ６領域の配列に特異的な１組のオリゴヌクレオチドを合成した。以前に述べられたパステル（Ｐｕｓｔｅｌｌ）およびカファタス（Ｋａｆａｔａｓ）のホモロジーマトリクス分析を用い、ＨＰＶタイプ間で最も配列ホモロジーの少ない５０塩基対の領域を確認した。

タイプ特異的ＨＰＶオリゴヌクレオチドは重複する相補的３゜塩基の対をなす分子として合成した（＊７図）。各対の各分子の３′末端の１０塩基は互いに相補的である。それゆえ、オリゴヌクレオチドをアニールすることによりＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ修復合成のテンプレートができる。

このオリゴヌクレオチドをラベル化する条件はダイデオキシヌクレオチド三リン酸を省くこと以外サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法（サンｊｆ　−（Ｓａｎｇｅｒ）等、′チェーンターミネーションインヒビターを用いたＤＮＡシーケンシング″ 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、工４．　ｐ５４６３−５４６７　（１９７７）　）によるＤＮＡシーケンシングに用いる条件と同じである。オリゴヌクレオチドをタレ／−ＤＮＡポリメラーゼＩ、５０ｍＭ　　ｄＮＴＰ、５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１、？＋ｏＭＭｇＣ β２．７１１１Ｍ）リス　（ｐＨ７，５）　、５ｍＭ　　ＤＴＴと２２℃で反応させるこきによりその３０マー（第７図）の約９５％の５０７−（第８図）への転換が見られた（第６図）。３２Ｐ−ラベル化ｄＮＴＰを用いることによりＤＮＡマイクロダラム当り１．５×１０ｓｄｐＩ１１の比活性が達成された（理論的には８×１１０５ｄｐ　／マイクロダラムが可能である）。別法としてオリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドキナーゼを用いてラベル化した。

実施例１の標準的高ス）　ＩＪンジェント条件を用いた再構成サウザンプロットへのハイブリダイゼーションは異種ウィルスへのクロスハイブリダイゼーションを検出することなく同じＨＰＶタイプへの特異的ハイブリダイゼーションを示した。また、単一コピー再構成のプロトコールを用いると等価の検出感度が一晩露光で可能であった。

５０塩基対のタイプ特異的ＨＰＶプローブを用いると高い感度が達成された。

タイプ特異的ＨＰＶオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を確認するためこれらのプローブをサウザンプロット方式を用い性殖器障害由来のＤＮＡサンプルにハイブリダイズした。

サブゲノムＤＮＡおよびＲＮＡプローブを用いたときと同様にＨＰＶオリゴヌクレオチドは先に観測されたのと同様のハイブリダイゼーション特異性および感度を示した。

（実施例６）（臨床サンプルのＨＰＶ　　ＤＮＡの同時分析）単一のハイブリダイゼーションステップでＨＰＶタイプ６．１１．１６．１８．３１．３３および３５を区別するため、以下の７ステツプに従った：１、サンプルを患者から採取し実験室に移した。

２、細胞性ＤＮＡを抽出し精製した。

３６　　純粋なりＮＡを診断用制限酵素で消化し種々の長さのフラグメントを作った。

４、そのＤＮＡフラグメントを電気泳動で分離し、固体サポートに移した。

５、そのメンブレンにタイプ特異的ＨＰＶプローブをハイブリダイズした。

６、　　”Ｐ〜ラベル化プローブを用いた場合はオートラジオグラフィーで、また非アイソトーププローブを用いたききは酵素的にハイブリダイズしたＨＰＶ処理物を検出した。

７、　その結果は各ＨＰＶ遺伝子型により異なるバンドサイズから解釈した。各ゲルには分子量マーカーおよびハイブリダイゼーションコントロールをともに流した。

ハイブリダイゼーションコントロールは既知の位置に泳動する各タイプ特異的ＨＰＶバンドを有するバーコードを生ずる。そのバーコードを患者由来のバンドを並べることによりＨＰＶのタイプを決定した。第２５図はＨＰＶタイプ６．１１．１６および１８に関する本分析の例である。

サウザンハイブリダイゼーションテストを用いたＨＰＶＤＮＡの同時分析のための上述の操作に従うと、Ｂａａ＋ＨＩ＃よびｐｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼの組合せは以下のようなタイプ特異的バンドを生ずる；ＨＰＶ　　６：　　　　０．６９ｋｂＨＰＶ　１１　：　　　　１．４４ｋｂＨＰＶ　１６　：　　　　１．７８ｋｂＨＰＶ１８：　　　　１．０５ｋｂＨＰＶ３１　：　　　　２．８１ｋｂＨＰＶ３３：　　　　２．０１ｋｂＨＰＶ３５：　　　　０．４８ｋｂＨＰＶ３１＃よびＨＰＶ３３についてはタイプ特異的プローブは上述のバンドを得たデータを生ずる一群のマーカーフラグメントからなる。ＨＰＶ３５の場合、全マーカーフラグメントがタイプ特異的プローブとして使用し得る。さらに、タイプ特異的ノ１イブリダイゼーションを示す一群のＨＰＶ３５　０．４８ｋｂフラグメントがこのテストで用いることができた。

このタイプのサンプルの同時分析はＢａｍＨＩおよびｐｓｔＩの組合せの使用に制限されるものではなく、またＨＰＶ　　ＤＮＡ分析についてここで述べられている特異的プローブに制限されるものでもない。特異的プローブに対して異なる大きさのフラグメントを生ずるどの制限酵素またはどの組合せの制限酵素も、その特異的プローブが検出するものに関するサンプルの同時分析に使用し得る。

さらに、このタイプの同時分析はＨＰＶのみのテストに制限されるものではない。またこの同時アッセイは肝炎、性病など種々の感染症状を診断するのに使用し得る。同時アッセイを行いうる典型的性病にはヘルペス、淋病、クラミジア症、梅毒、エイズなどがある。

遺伝子工学、遺伝学、分子生物学、生化学、細胞生物学および、または免疫学における専門家にとって明らかな上述の方法および物質の修正は本発明の範囲にある。

浄書（内容に変更なし）入れ子プローブＨＰＶタイプ特異的プラスミドＭ６１１＋６１８特異性ＴＳ６　　　　　　　ＴＳＩＩ　　　　　　ＴＳ１６　　　　　　ＴＳｌＢ感度臨床サンプルーサウザンブロットハイプリダイゼーシランＴＳ１１　　　　　　　　　　　　　ＴＳ１６スロットブロットハイプリダイゼーシジン再構成　　　　　　　　　　　　　　　　　臨床サンプル伸長したＨＰＶ合成オリゴヌクレオチド轡３ＱｎｔＨＰＶ入れ子のための合成オリゴヌクレオチド（３０塩基　）Ａ＋　　　５’　　ＣＴＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＴＡＴＣＣＡ　３’Ｂ）　　　５’　　ＣＡＧＣＡＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＧ　３’Ｃ）　　　５’　　ＣＴＡＡＡＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＡＡＣＴＴＴＣＣＣ３’Ｄ）　　　５’　　ＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＣＧＣＴＣ；ＣＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＧ　３’Ｅ）　　　５’　ＴＴＡＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡ　３’Ｆ）５’　　ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣＡＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＣＡ　３’Ｇｌ　　　５’　　ＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＡＴＡＣＣＧ　３’Ｈ１５’　　ＣＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴＡＴＡＣＴＧ　３’Ｅｌ　　　５’　　ＴＴＡＴＣＣＡＴＡＧＴＡ丁ＡＴＡＧＡＧＡＴ’ ＧＣＧＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧ　　３{ Ｆｌ　　　５’　　ＣＡＴＴ丁ＡＴＣＡＣＡＴＡＣＡＣｉＣＡＴＡ丁ＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＴＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＴＡＡ　　３f Ｈ１５’　　ＣＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧ丁ＡＴＡＣＴＣｉ？ＣＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＡＡ　　３’ＨＰＶタイプ６ＤＮＡプローブＡのヌクレオチド配列ＨＰＶ９イブ６プローブＢのヌクレオチド配列ＨＰＶＩＩＤＮＡプローブＡのヌクレオチド配列ＨＰＶタイプｌｌＤＮＡプローブＢのヌクレオチド配列ＨＰＶタイプ１６ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列ＴＴＧＴＧ丁ＧＡ丁ＴＴＧ丁ＴＡＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴ丁ＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＣ，ＴＣｄ；ＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡ丁ＧＴＣ丁ＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣｉＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＨＰＶタイプ１８ＤＮＡプローブＡのヌクレオチド配列ＨＰＶタイプ１８ＤＮＡプローブＢのヌクレオチド配列ＨＰＶ６マーカーフラグメントー■■■■　特異的プローブＨＰＶＩＩマーカーフラグメント１■■■Ｉｌ　特異的プローブＨＰＶ１６マーカーフラグメントー園閤■１１特異的プローブＨＰＶｌ　８マーカーフラグメント −■園−特異的フラグメントＨＰＶ３１タイプ特異的ブローブＨＰＶ３３マーカーフラグメント一一一一特異的プローブＨＰＶ３５マーカーフラグメントーー■−特異的プローブ）（ｐＶ３３７−カーフラゲメントのヌクレオチド配列ＨＰＶ３３特異的プローブのヌクレオチド配列同時ＨＰＶ分類テスト特許庁長官　植　松　　　敏　殿ｉ、特許出願の表示　　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０１３１８３、特許出願人名　称　　　オンカー　インコーホレーテッド浄書（内容に変更なし）請求の範囲（υ　ヒトパピローマウィルスＤＮＡ制限フラグメントの長すにづき特異的ヒトパピローマウィルス遺伝子型を検出するヒトパローマウィルス分法であって、ｆａｔ　　ヒトパピローマウィルスＤＮＡｔ−該ヒトパピローマウイルスＤＮＡを切断し得る部位特異的試剤またはそれらの試剤の組合せ物で消化し、特定の遺伝子型のヒトパピローマウィルスの消化パターンを作成する工程、（ｂｌ　　特定の遺伝子型の該ヒトパピローマウィルスＤＮＡの配９すと相補的なＬ−１リーデイングフレーム以外の領域由来のタイプ特異的ラベル化核酸プローブを用いたゲノムブロッティングで（ａｌの消化物中の特定のヒトパピローマウィルスＤＮＡ発現型を検出する工程であって、該ラベル化核酸プローブはストリンジェント条件下池の遺伝子型のヒトパピローマウィルスＤＮＡとは実質的にクロスハイブリダイズし得ないもである工程、及びｔＣ）（ｂｌで得られたパターンを前記部位特異的試剤および等価ラベル化核酸プローブを用いて得られた前記ヒトパピローウイルスＤＮＡ配列に関する標準パターンと比較する工程、を含む方法。

（２）前記ラベル化核酸がヒトパピローマウィルスタイプ６と相的である請求の範囲第１項記載のヒトパピローマウィルス分法。

手続補正書（方式）％式％３、補正をする者事件との関係　　出願人名　称　　　オンカー　インコーホレーテッド５、補正命令の日付　　自　　　発平成　　年　　月　　日特許庁長官　植　松　　　敏　殿１、事件の表示　　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０１３１８３、補正をする者事件との関係　　出願人名　称　　　オンカー　インコーホレーテッド５、補正命令の日付　　自　　　発７、補正の内容　　　　別紙のとおり国際調査報告