JPH03503761A

JPH03503761A - 腫瘍組織成長の制御に関する改良

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Publication number: JPH03503761A
Application number: JP1503762A
Authority: JP
Inventors: ロバーツ，ジヨン・ジエイ; ノツクス，リチヤード・ジエイ; フリードロス，フランク
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-02-22
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1991-08-22
Also published as: EP0330432A1; AU3439889A; EP0429454A1; ZA891363B; GB8804068D0; WO1989007592A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】膿瘍組織成長の制御に関する改良本発明は、腫瘍組織（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ）の成長の制御に関するものであり、更に詳しくは、新規な抗腫瘍剤の提供及び抗腫瘍プロドラッグを抗腫瘍剤に転化することができる酵素に関する。

アルキル化剤５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド（以後ＣＢ１９５４と名付ける）は、殆ど２０年間にわたり、独特の選択性を持った興味ある実験化合物として知られてきＩ；。ＣＢ１９５４は比較的広い範囲の活性を有する多数の他の公知のアルキル化剤に構造的に極めて密接な関連があるけれども、ＣＢ１９５４は生体内又は生体外でウォーカー腫瘍細胞に対する相当な活性を有するが、他の腫瘍に対しては実質的に不活性であると考えられる。

ＣＢ１９５４はそれ自体は抗腫瘍剤ではないが、事実上、ウォーカー細胞で見出されるニトロレダクターゼ酵素により発生される抗腫瘍剤のプロドラッグであるという点で、我々はＣＢ１９５４の選択性に対する説明を見出したと考える。我々は、このウォーカー細胞酵素及び該酵素によりＣＢ１９５４から発生される抗腫瘍剤の性質を検討した。本発明はこの研究の両方の面を指向する。・我々がＣＢ１９５４から単離しｔ：酵素を我々が最初に特性を決定したのは、下記の特性を有する分子量約３３．５００ダルトンの酵素であった。

１、それは、ＣＢ１９５４を（ＮＡＤＨの存在下に）５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドに還元する能力を有している。この還元は空気又は窒素下で同じ速度で起こる。

２、その吸収スペクトルは、４５０ｎｍにピークを有しており、これはこのタンパク質にフラビン捕因子を暗示する特徴的な黄色を与える。

３．５６℃で２０分間加熱すると、フラビン捕因子をこのタンパク質から分離することができそして限外濾過により単離することができる。

スペクトルデータは、この７ラビンが７ラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であることを示唆し、そしてこのことはビニツタ（Ｐｉｅｔｔａ）等、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ）　・２２９　、４４５−４４９（１９８２）、の方法により確かめられＩ；。

４、、：（７）酵素は２．４−ジニトロフェノールを還元しないが、補因子としてのＮＡＤＨ又はＮＡＰＨと共に２．６−シクロロフエノールインドフエノールを還元するであろう。

５、この酵素はＣＢ１９５４の２−二トロ基を容易には還元しない。

我々は単離した純粋な酵素の配列を決定したとき、それはＥＣ，ｌ。

６．９９．２、ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル−ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ）　・２６土、１５７９４−１５７９９（１９８６）参照、として現在分類されているＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）との極めて実質的な配列相同性を有することを見出だした。配列相同性の程度は、他の試験と一緒になって、我々がウォーカー腫瘍細胞から単離しそして従来新しい酵素であると思っていた３３゜５Ｋｄ酵素は、実際には、ロバートソン等のＥＣ，１，６，９９，２と同じであるという結論に我々を導いた。しかしながら、ロバートソン等（１９８６）は、ウォーカー腫瘍細胞中にこの酵素の存在又は我々がそれについて見出だしたＣＢ１９５４転化に対するその選択性を開示していない。

この新しい酵素がＣＢ＋９５４を４−ヒドロキシルアミノ誘導体として同定された抗腫瘍化合物に転化することができるということは、ＣＢ１９５４のウォーカー細胞酵素転化により得られた生成物と同一であることが示されｔ二５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドの明瞭な合成により確かめられた。

本発明で使用される酵素は、ウォーカー細胞を抽出し、この抽出物を引き統〈ゲルー過及びイオン交換高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、ウォーカー腫瘍の細胞から単離することができる。

天然のソースからの回収に替わるものとして酵素の比較的小さなサイズが与えられる場合には、酵素は慣用のペプチド合成、例えば固相メリフィールド合成又は該酵素をコードしているＤＮＡを適当な宿主細胞中で発現させることによる組換えＤＮＡ法により合成的に製造することができる。この酵素をコードしているＤＮＡは、酵素をコードする合成ポリヌクレオチドを製造することにより得ることができる。別法として、ウォーカー細胞から単離された伝令ＲＮＡと共に逆転写酵素を使用する慣用の方法を用いることができる。

この酵素は、特に、その相対的に低い細胞毒性によりプロドラッグとして潜在的な臨床用途を有するが、しかしこの酵素の作用下に、はるかに毒性の高い４−ヒドロキシルアミノ誘導体に転化されるＣＢ１９５４の用途分野を増加させるのにこの酵素を使用することができるということは特に興味深い。我々の発見の結果として、種々の腫瘍細胞に対するＣＢ１９５４の活性について更なる研究がなされ、そして我々は、種々の卵巣、直腸、乳房及び肺腫瘍細胞に対する活性（ＣＢ１９５４として又はその代謝物として）を見出だしｔ；。

抗腫瘍プロドラッグと共に酵素の使用は、今や癌化学療法の分野で興味が増加している技術である。プロドラッグとその薬剤との細胞毒性比が十分に大きい抗腫瘍プロドラッグに対して特に興味が集中する。ＣＢ１９５４のような一官能性アルキル化剤を、ＣＢ１９５４自体の細胞毒性よりも相当大きい細胞毒性を有する二官能性剤に転化することができる酵素の発見は、癌化学療法においＣ明らかに重大な顕著な進歩である。

この酵素の入手可能性は、細胞毒性プロドラッグを細胞毒性薬剤に転化するのに一般的技術として使用することができるという点において価値があるのみならず、腫瘍関連抗原と結合する抗体、特にモノクローナル抗体にこの酵素を結合させることが可能であるという点でも価値がある。この方法においては、酵素を腫瘍部位に指向させることができ、そして腫瘍の領域に酵素を局在化させることができる。細胞毒性プロドラッグのその後の投与は、腫瘍の領域に細胞毒性薬剤を局在化させると共に、身体の他の部分においては細胞毒性薬剤の濃度を対応して低くし且つ毒性が少ないプロドラッグの濃度を高くすることを確実にするであろう。この酵素は、該酵素に対する抗体、特にモノクローナル抗体を慣用の方法により発生させることができ、そしてこの抗体がＣＢ１９５４に感受性の腫瘍の検出を助けるという点でも興味深い。

本発明に従えば、５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２ −ニトロベンズアミド及びその誘導体である新規な抗腫瘍化合物が提供される。

誘導体とは、ヒドロキシ基の誘導体、例えばエステル及びエーテル誘導体を意味する。

本発明のエステル誘導体は、本質的に、ヒドロキシルアミンの低級アルカン酸、例えば１−６個の炭素原子を含む低級アルカン酸との工２ステルであり、この範ちゅうにおいては、飽和アルカン酸、特に２−４個の炭素原子の直鎖を含む飽和アルカン酸のエステル、例えば酢酸エステル及びプロピオン酸エステルが重要である。他の酸とのエステル、例えばリン酸エステル及び硫酸エステルも本発明の範囲内に入る。ヒドロキシルアミンのエーテル誘導体は、好ましくは、ｌ−６個の炭素原子の炭化水素エーテル基を含むエーテル誘導体、特に、炭化水素基がメチル又はエチルなどのＣ，−Ｃ，アルキル基であるエーテル誘導体が好ましい。

式中、ＲはＨ又はアシル基、例えば６個までの炭素原子のカルボキシルアシル基、特に、アセチル基であるか、又はＲはホスフェート基又はサルフェート基である、の化合物である。

本発明のヒドロキシルアミンは、対応する４−ニトロ化合物、即ちＣＢ１９５４の還元により製造することができる。我々は、４−ニトロ基の最も満足な選択還元の方法は、シアーマン（」ａｒｍａｎ）等、ノ（イオメディカル・マス・Ｚペタトロメトリー（Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｓｓ、Ｓｐｅｃｔｒｏｍ）、１９８３．１Ｏ１１９８３の方法に従ってアセトン中の亜鉛微粉末と酢酸アンモニウムを使用することである。上記の選択還元法により得られた４−ヒドロキシルアミンを、次に、適当なエステル化剤又はエーテル化剤を使用してそれ自体公知の方法によりそのエステル誘導体又はエーテル誘導体に転化することができる。

本発明のヒドロキシルアミンを製造する他の方法は、もちろん、酵素ＥＣ，１，６，９９，２を使用してＣＢ１９５４の直接還元及び得られる４−ヒドロキシルアミノ化合物を単離することによる。

本発明の更なる観点は、最初に酵素ＥＣ，１，６，９９，２を宿主に投与し、該酵素は場合により腫瘍関連抗原に結合する抗体と結合させていてもよく、ついで細胞毒性プロドラッグ、例えばＣＢ１９５４を、例えば約１２．５ｎ＋ｇ乃至］００ｍｇの臨床投与量に相当する約０．２−１．６ｍｇ／ｋｇ体重の割合で静脈内注射により投与することを含む方法で、酵素ＥＣ，１，６，９９，２の使用により細胞毒性プロドラッグを生体内で細胞毒性薬剤に転化することによって、ヒト又は動物における腫瘍組織の成長を制御する方法より成る。特定の投与方式は、２５ｍｇを注射し、続いて３日目毎に更に１２．５＋ｏｇを注射することを含む。

本発明の更なる観点は、非経口投与に適した処方で本発明のヒドロキシルアミノ又はそれらのエーテル及びエステル誘導体を含有して成る製薬学的組成物より成る。このような組成物は、普通は静脈内投与に適した形態で製造される。

本発明は、膿瘍組織成長を制御する処理を必要としているヒトに、有効量のＣＢ１９５４及びＥＣ，１，６，９９，２を、例えば静脈内経路により、投与することによって、腫瘍組織の成長を制御するための処理方法にも及ぶ。

他の態様では、本発明は、５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドが生体内で５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキンルアミノ −２−ニトロベンズアミドに転化されるような量で、（２）酵素ＥＣ，１，６，９９，２と共に（１）非経口投与に適しｔ；形態の５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドを含をして成る、ヒトの腫瘍組織の成長を制御するのに使用するプロドラッグ／酵素系を提供する。

図面の説明第１図は、実施例２に記載の細胞毒性試験の結果を示す。

第２図及び第２Ｂ図は、実施例３及び４に記載の細胞毒性試験の結果を示す。

第３図及び第４図は、実施例６に記載の細胞毒性試験の結果を示す。

本発明を下記の実施例により更に説明する。

実施例１本実施例は、ウォーカー腫瘍細胞からのＥＣ，１，６，９９，２酵素の単離を説明する。

撹拌された懸濁培養物中で増殖しているウォーカー２５６細胞を氷冷したＰＢＳ＋１％アプロチニン中に２ＸｌＯ”細胞／ｍΩで懸濁させそして音波処理により破壊した。遠心分離（６０，０００ｇ、４℃で１時間）後に得られＩ；淡黄色上澄液（５ｍＱ）をＴＳＫ　　Ｇ３０００ＳＷＧ（２１，５Ｘ６００ｍｍ）ゲルー過カラムに注入し、周囲の温度で、０．ＯＩＭＮａＨ。

ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４ｐＨ７で溶離しく３ｍ１２７分）、３ｍｆｆの両分を集めた。レダクターセ活性を、酵素の存在下にＣＢ１９５４の損失（ＨＰＬＣにより決定して）により検出した。ＰＢＳ中のＣＢ１９５４（３００μＭ）及びＮＡＤＨ（５ｍＭ）の溶液を、カラムからの両分（５０μＩ２）と共にインキュベージオンし、混合物を３７℃で１時間インキュベージオンし、次いでアリフォート（１０ｐ＋２）を、逆相ＨＰＬＣカラムに注入し、２５％メタノール中の０．１　Ｍ　Ｎ　Ｈ４０Ａ　ｃ（ｐ　Ｈ７）で平等に（１ｍ（１７分）溶離させた。溶離液を３２５ｎｍで連続的に監視し、ＣＢ１９５４は約７分後に単一の分離したピークとして溶離する。レダクターゼ活性を含有する両分をプールしそしてポリスルホン膜（ミリポア　ウルトラフリー３０゜００ＯＮ、Ｍ、Ｗ、Ｌ、）を通す遠心分離により濃縮し、濃縮物（２ｍＱ）を上記カラムに再注入した。活性な画分を再びプールし、濃縮し、ＴｓＫ　　ＤＥＡＥ−５ＰＷ（７，５Ｘ７５ｍｎ＋）アニオン交換カラムに注入しく２ｍの、ＮａＨ２ＰＯ，／ＮａＨＰＱ、、ｐＨ７、中のＮａＣ１勾配液（４０分間にわたりＯ−０，５Ｍ線状）で溶離しくＩｒ１２／分）、０．５ｍａｔｙ＞画分を集めＩ：。活性画分をプールし、濃縮し、再注入し、精製したタンパク質を一２０℃で保存しｔ；。タンパク質純度（〉９５％）は、３３．５Ｋａの単一バンドとしてＰＡＧＥにより確かめられた。収率は約１０ｍｇ／　１０　”細胞であった。このタンパク質は、１ｍｇ／ｍＱが０．１２５の吸光度（１０關路長）を与える所定の４５０ｎｍでのその吸光度により定量されｔ；。

この黄色の酵素を５６＠で２０分間加熱し、分離しＩ；フラビン捕因子を限外ｐ過ｌ二より純粋なタンパク質から除去した。次いで約３３．５Ｋｄの分子量を有する純粋なタンパク質をアミノ酸組成分析にかけて、下記の結果が得られた。

濃度ｎｍｏｌｅｓ／ｍＱＡＳＰ　　　　　　　３５１．６９６ＴＨＲ１７８，３９５ＳＥＲ３０６，７５３ＧＬＵ　　　　　　　６５２．７０１ＰＲ０３３０，５７７ＧＬＹ　　　　　　　４０５．３１４ＡＬＡ　　　　　　　４２１．８６２ｃｙｓ本　　　　　　　１８．５９４ＶＡＬ　　　　　　　３４８．１３７ＭＥＴ東　　　　　　９１．２４８ＩＬＥ　　　　　　　２２６．８３４ＬＥＵ　　　　　　　５４４．６５５ＬＥＴＹＲ２２４，３２８ＰＨＥ　　　　　　　３２４．１８１Ｈ１ｓ　　　　　　　　１１０．１８１ＬＹ５　　　　　　　４２９．６２４実施例２ＣＢ１９５４の酵素還元生成物の細胞毒性（Ｕ−”Ｈ）ＣＢ　ｌ　９５４（３０７７Ｍ；　１４０　、ｕｃｉ／ｍＭｏ１）、ＮＡＤＨ（５００μＭ）及び酵素（５０ｎｇ）の混合物を、ＰＢＳ（１ｍ（＋）中で３７°Ｃでインキュベージオンした。種々の時間に、試料（２００μＱ）を取り出し、０ＤＳ−５逆相ＨＰＬＣカラムに注入し、０．１ＭＮａ！ＨＰＯ，／ＮａＨ，ＰＯ，中のメタノール勾配液（３０分間にわたり０−３０％線状、１０分間にわたり３０−１００％線状）で溶離した（１ｍ＜１／分）。試料（１ｍＩ２）を集め、各々のトリチウム活性をシンチレーシ〃ン計数により決定した。結果を第１図に示す。図において、Ａは０分、Ｂは９０分、Ｃは１８０分の値を示す。上記により同定された生成物も又細胞毒性であるかどうかを決定するために、ＣＢ１９５４（２００μＭ）、ＮＡＤＨ（５ｍＭ）、及び酵素（１００ｎｇ）をＰＢＳ（６００μＱ）中で３７℃ でインキュベージオンした。２時間の後、アリフォート（５００μＱ）をＨＰＬＣカラムに注入し、上記の如（して溶離しｔ；。試料（１ｍ１２）を集め、個々に、０．２μＭフィルタを通過させることにより滅菌し、そしてウォーカー２５６細胞（１０ｍ（１／　２　Ｘ　Ｉ　Ｏ’／ｍ１２）に加え（５００Ｃ１）、これを３７℃で２時間のインキュページ自ンの後、コロニー形Ｉｔ能力ｌ；ついてアッセイしｔ：。結果を第１Ｄ図に示されＩ；ようにカラム画分番号に対する生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）としてプロットする。ＣＢ１９５４の合成ヒドロキシルアミノ誘導体のチャイニーズハムスター細胞に対する細胞毒性は、上記の方法に類似しＩ；方法により確かめられ！；。２及び４−ヒドロキシルアミンの等景況合物の２００μＭ溶液の試料（２００μＱ）をＨＰＬＣカラムに注入し、得られる両分の細胞毒性を上記の如くして決定しそして結果をｇｔＥ図に示した。

実施例３この実施例は、ＣＢ１９５４及び生物的活性化性酵素混合物により処理したチャイニーズハムスター細胞のＤＮＡにおける架橋の形成を示す。

細胞を、＋４（チミジン（５０μＣ４／ｍ（１；５４０ｍＣ１／ｍＭ）の存在下に２４時間の増殖、続いて標識の不存在下に２時間の増殖により標識し、ＣＢ１９５４（１０μＭ）及びＮＡＤＨ（ｌ　ＯＯμＭ）及び種々の量の酵素で１８時間処理し、洗浄しくＰＢＳ）、照射しく５Ｇｙ）、そしてそれらのＤＮＡをスクロース勾配沈降により分析した、結果を第２Ａ図に示す。第２Ａ１１！ｌに８いては、記号は、（０）酵素なし、（◆月μｇ／ｒｒｏ２；（０月θμｇ／ｍＱ：（ム）１００μｇ／ｍＩ２レダクターゼ酵素を示す。

実施例４本実施例は、５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドで処理したチャイニーズハムスター細胞におけるＤＮＡの架橋の形成を示す。細胞を実施例３の如くして標識し、ＰＢＳで洗浄し、照射しく５Ｇｙ）、実施例３に記載の如きアルカリ性スクロース勾配沈降に付した。結果を第２Ｂ図に示す。第２Ｂ図においては、記号は、（Ｏ）未処理；（ム）５μＭ；（ロ）２０／ＪＭヒドロキシルアミンを示す。沈降は左から右にであった。

東墓五５５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミド（３）の合成ブルーカーＡＣ２５０機器（Ｂｒｕｋｅｒ　ＡＣ２５０ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用してＩＨ−ＮＭＲスペクトル（２５０ＭＨｚ）を得た。薄層クロマトグラフィーでは、シリカゲル６０Ｆ−２５４（メルクＸ０　、０２５ｏ＋ｎ＋）で被覆したガラスプレート（５Ｘ　２０ｃｍ）を使用した。カラムクロマトグラフィーの詳細を下記に示す。融点はコフラーのホットステージＣＫｏｆ１ｅｒ　ｈｏｔ−ｓｔａｇｅ）により決定しｔ；。

アセトン（４０ｍ１２）中の５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド（１，１，００８ｇ、４ミリモル）の激しく撹拌した溶液に、Ｚｎ微粉末（５００ｍｇ）及びＮＨ，０Ａｃ（５００ａｇ）を加えＩ；。その際Ｚｎは繰り返し添加し、Ｎ　Ｈａ　ＯＡ　ｃは２．４．６分の後に添加した。８分の後、固体を一過により除去した。橙赤色ｐ液をＣＨ，ＣＩ、（６０ｍ（１）で希釈し、溶液を焼結ガラス７リツトを通る溶媒の流速を速くするＩ；めの粗いシリカ（１０ｇ、　Ａｒｔ、　７７３４）及びその上に置かれＩ；もつと微細な銘柄のシリカ（７０ｇ％Ａｒｔ、　９３８５）の層より成るシリカゲルのカラム（２５％３ｃｍ）に加えＩ；。カラムを、僅かな圧力下に（Ｎ、）、約２０ｍ＜１／分の流速で、アセトン−〇Ｈ２Ｃｌ２（１：ｌ）により溶離しｔ；。前溶離（１４０ｍ１２）の後、１（７７０＋ｎｇ）が溶離され、次いで５−（アジリジン− １−イル）−２−ヒドロキシルアミノ−４−ニトロベンズアミド（２Ｘ１４０ｍ１２）、２及び５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２− ニトロベンズアミド（３Ｘ８０ｍＱ）次いで３（２４０ｍＱ）が溶離されｔ；。

２を含む画分を約５ｍＱに濃縮し、然る後２（１７ｍｇｓ消費されｔ；ｌを基準として７．８％）をガーネット色の斜方晶として分離し、このものは、２００℃ 以上で溶融することなく暗色化しＩ；。’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（Ｍｅ２Ｓ〇−心） δ２．２０　（ｓ、４Ｈ，アジリジニルＨ）、７．４２　（ｓ、ＩＨ，Ｈ−６）、７．６３　（ｓ、ＩＨ，Ｈ−３）、７．７１　（ｓ、ＩＨ，アミドＮＨの他方）、８．２３　（ｓ、ＩＨ，アミドＮＨの一方）、８．８５　（ｄ、ＩＨ，ＯＨ，Ｊ２．２Ｈｚ）、９．１２（分解能の劣ったｄ、ＩＨ，Ｎ旦ＯＨ）、分析（ＣｓＨ＋ｏＮ４０４）Ｃ，Ｈ，Ｎｏ　３を含む画分を約２０ｍ（ｌに濃縮すると、微細な黄色針状晶として３（２９ｍｇ、消費されたｌを基準として１３％）が得られｔ；。この針状晶は２００℃以上で溶融することなく暗色化した。

’ＨＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−す、）８２．１４　（ｓ、４Ｈ，アジリジニルＨ）　、６．９４　（ｓ、ＩＨ，Ｈ−６）、７．４３　（ｓ、ｌＨ，Ｈ−３）、７．４５　（ｓ、ＩＨ，アミドＮＨの他方）、７．８９　（ｓ、ＩＨ，アミドＮＨの一つ）　、８．５７　（ｂ　ｒ、ｓ、ＩＨ，Ｎ旦ＯＨ）　、８−８８　（ｄ、ＩＨ，ＯＨ，Ｊ　１．５Ｈｚ）、分析Ｃ，Ｈ，Ｎ。

異性体アミノニトロ誘導体（４及び５）の’ＨＮＭＲスペクトルアミノニトロ誘導体は、ジャーマン（Ｊａｒｍａｎ）等、バイオケミカル・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ）、　１９７６．２４７５、の方法により製造されＩ；。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（Ｍｅ、　Ｓ　Ｏ−ｄ　ｓ）　　：　２−アミノ−５−（アジリジン −１−イル）−４−ニトロベンズアミド　（４）５２．１１　（ｓ、４Ｈ，アジリジニルＨ）　、６−４６　（ｓ、２Ｈ，ＮＨ２）、７．２４　（ｓ、ＩＨ，Ｈ −６）、７．３２　（ｓ、ＩＨ，Ｈ−３）　、７．４６　（ｓ、ｌＨ，アミドＮＨの他方）、８．０６　（ｓ、ＩＨ，アミドＮＨの一方）：４−アミ／−５−（アジリジン−１−イル）−２−ニトロベンズアミド　（５）２．１９　（ｓ、４Ｈ。

アジリジニルＨ）　　５．３３（ｓ、２Ｈ，ＮＨｚ）、６．６（ｂｒ　　ｓ、ＩＨ。

アミドＮＨの他方）、６．９８　（ｓ、ｌＨ，Ｈ−６）、７．２　（ｂｒ　　ｓ、ＩＨ，アミドＮＨの一つ）、７．２２　（ｓ、ｌＨ，Ｈ−３）。

種々の試験細胞の懸濁液をμＭ濃度の作用剤ＣＢ１９５４及びその４−ヒドロキシルアミノ誘導体（ＲがＨである、式■の化合物）に２時間暴露し、然る後、この作用剤を除去し、細胞の生存能力をコロニー形成能力によりアッセイした。結果をＣＢ１９５４については第３図に示しそしてその４−ヒドロキシルアミノ誘導体については第４図に示す。

ＣＢ１９５４（ａ）に対する応答は２つの主要な群内に入ることが分かる。第一に、架橋感受性ウォーカー腫瘍細胞（ＷＳ）により以前に例示されＩ；如き感受性細胞タイプ及び架橋抵抗性のそのサプライン（ｓｕｂｌ　１ｎｅ）（ＷＲ）があり、その群にはＨ５Ｎ、ＢＬ８及びＪＢＩ、すべてのラット膿瘍細胞が包含される。第２に、最初チャイニーズ／・ムスターＶ７９細胞により例示されたが、今はＬ１２１０（マウス白血病）、Ｈｅ１ａ（良く確立されているヒト腫瘍細胞系）、ＨＦＬ（普通のヒト細胞）、ＭＡＷＩ（ヒト結腸癌細胞）、及びＯＥＭ（ヒトリンパ腫細胞）を包含する抵抗性のグループがある。ＤＴジアホラーゼにおいて高いことが知られているヒト肝癌細胞であるＨｅｐ−Ｇ２は、このグループのものより幾分感受性が高い。

ＣＢ１９５４の４−ヒドロキシルアミノ誘導体に対するこれらの試験細胞の幾つかのものの応答は、ＣＢ１９５４及びヒドロキシルアミンに対してＷＲと同等に感受性であることが分かる。これらの特定の架橋感受性により、ＷＳ細胞はやはり幾分感受性が高い（ＣＢ１９５４に関して）保持時間　（分）［ＣＢ　１９５４］　）ＩＭ１４−ＮＨＯＨ−ＣＢ１９５４１）１Ｍ国際調査報告一會−ＩＡ８−よ−−一噛、ＰＣＴ／ＧＢＥ１９１００１フ９国際調査報告ＧＢ　８９００１７９Ｓ＾　　　２７５９３

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒは、Ｈ、又は６個までの炭素原子を有するアシル基又は炭化水素基である、の化合物。２．ＲがＨである、請求の範囲第１項記載の化合物。３．Ｒが、６個までの炭素原子を有するカルボキシルアシル基である、請求の範囲第１項記載の化合物。４．５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドを酵素ＥＣ１．６．９９．２の作用に付し、得られる５−（アジリジン−１−イル）−４− ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドを単離することより成る、ＲがＨである請求の範囲第１項記載の式Ｉの化合物の製造方法。５．５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドを亜鉛及び酢酸アンモニウムで選択的に還元することより成る、ＲがＨである請求の範囲第１項に記載の式Ｉの化合物の製造方法。６．４−ヒドロキシルアミノ基をエステル化又はエーテル化して、Ｒがアシル又は炭化水素基である対応する式Ｉの化合物を得る工程が続く、請求の範囲第４又は５項記載の方法。７．請求の範囲第１項乃至３項のいずれかに記載の化合物を製薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と共に含有して成る製薬学的組成物。８．非経口投与に適した請求の範囲第７項記載の組成物。９．静脈内投与に適した請求の範囲第８項記載の組成物。１０．手術又は治療によりヒト又は動物の身体を処置する方法又はヒト又は動物の身体に対して実施される診断に使用するための請求の範囲第１項乃至３項のいずれかに記載の化合物。１１．腫瘍組織の成長を制御するためにヒト又は動物の身体を処置する方法に使用するための、請求の範囲第１項乃至３項のいずれかに記載の化合物。１２．腫瘍組織の成長を制御する処置を必要としているヒト又は動物宿主に、有効量の請求の範囲第１項乃至３項のいずれかに記載の化合物を投与することより成る、腫瘍組織の成長を制御するためのヒト又は動物の身体を処置する方法。１３．腫瘍組織の成長を制御するためにヒトの身体を処置する方法において、酵素ＥＣ．１．６．９９．２と共に使用するための５−（アジリジン−１−イル） −２，４−ジニトロベンズアミド。１４．腫瘍組織の成長を制御する処置を必要としているヒト宿主に、酵素ＥＣ．１．６．９９．２．と共に有効量の５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドを投与することより成る、腫瘍組織の成長を制御するためにヒト又は動物の身体を処置する方法。１５．５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドが生体内で５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドに転化されるような量で、（２）酵素ＥＣ．１．６．９９．２．と共に（１）非経口投与に適した形態の５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドを含有して成る、ヒトの腫瘍組織の成長を制御するのに使用するプロドラッグ／酵素系。１６．酵素ＥＣ．１．６．９９．２．に対する抗体。