JPH03503763A - 一般的な癌‐関連ｓｃｍ‐認識因子、調製品及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 °−一般的癌−関連ＳＣＭ−認識因子。

調製品及び使用方法 技術分野 この発明は、癌に関連（関係）した一般的なＳＯＭ−認識因子、該ＳＣＭ−認識 因子を８０Ｍ試験に使用する方法、癌細胞の画像診断方法、抗癌剤を癌細胞に指 向さす方法１等に関する。

背景技術 ヒト及び動物に発生する多くの病気は、特に血液中に存在する病気又は状態と特 別に関係する異質物質によって検出することができる。そのような病気の結果と して生成される抗原又は他のそのような物質の試験は、抗原や他の物質を生成し た特定の病気の早期検出および治療の診断手段として極めて有望である。かかる 物質の検出方法は、健康管理提供者に対して実際的な診断方法を構成するために 信頼性と再現性があると共に感度が良くなければならない。

かかる方法は１通常の技術を有し研究方法において訓練を受けている人々によっ て迅速かつ低コストで実施できなければならない。

例えば、一般に癌といわれるヒトおよび動物を苦しめる種々の悪性腫瘍の治療に おいて、特に大部分の治療方法は病気の比較的早期においてのみ有効であるから 早期の検出が有効な治療の鍵である。例えば、悪性腫瘍細胞に有毒である多くの 化学療法用薬剤は正常な細胞にも有毒であって、癌の治療或いはさらに進行した 場合の癌の進行阻止に必要な高投与は不快および深刻な副作用をもたらす。また 手術は殆んどの場合に、病気が広がる又は転移する前だけが有効である。極めて 沢山の癌の症例は、有効な治療には余りにも遅過ぎたことだけが報告されている 。

従って、初期段階で癌を診断できる信頼性のある試験の要求が極めて強い、そし てこのために極めて多くの研究がされてきた。これに関して、癌の診断を早期に するために新しい試験および方法が開発されている。

かかる試験の極めて望ましい特徴の１つは、使用する材料に依存して、全てのタ イプの癌を一般的に検出できるか又は特定のタイプの癌を検出できる能力である 。かかる試験の前者の用途は、ルーチンの健康診断で行われるように大きな患者 人口の集団スクリーニングにおいて極めて重要である。かかる集団スクリーニン グにおいて、特定のタイプの癌に依存する試験は文字通り数百種の癌があるから 望ましくない、そして１つまたは数種の病気のみを見つけることかできる試験は 多くの場合の癌を極めて見落しがちである。一般に、これらの患者は特定のタイ プの癌に容易に関係づけれない症状を示さないか。

又は不明瞭な全身症状を示すので、特定のタイプを疑うおよびそのタイプに特定 の試験を行う基準はない。

一方、悪性腫瘍の存在が一旦わかる又は強く疑われる場合には、特定のタイプの 悪性腫瘍を正確に決定できる試験を有することが望ましい。かかる試験は、化学 治療のような最も効果的な癌治療の多くは１種類の癌又はせいぜい悪性の場合だ けに有効であるから、有効な治療に著しく貢献する。従って潜在的な臨床効果を 有する。

この要求を満たすと共に、ヒトおよび動物の体の癌の診断および早期検出を改善 する研究において。

植物性血球凝集素又は癌−関連抗原にさらさねたときに生きたリンパ球の細胞形 質マトリックスの組織化度（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｎｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｏ ｙｔｏｈｌａｓｍｉｃ　Ｍａｔｒｊｘ（ＳＣＭ）　）における変化の測定を含む 試験方法が開発されている。この方法は次の刊行物に記載されている： Ｌ、０ｅｒｃｅｋ、　Ｂ、０ｅｒｃｅｋ、　ａｎｄ　Ｃ，１，Ｖ、　Ｆｒａｎｋ ｌｉｎ。

“Ｂｉｏｐｈｙ＊１ｃａｌ　　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅ ｎ　ＬｙｍｐＯＣｙｔｅｓｆｒｏｍ　Ｈｅａｌｔｈｙ　Ｄｏｎｏｒｓ　、　Ｐａ ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＭａｌｉｇｏｎｔＤｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　０ｔｈ ｅｒ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、０ａｎｃｅｒ“Ａｐｐｌｉｃａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｏｆ　Ｃｈａｎｇｅｓ　１ｎ ｔｈｅ　５ｔｒｕｅｔｕｒｅｄｎｅｓｓ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｍａ ｔｒｉｘ（ＳＣＭ）ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｍａｌｉｇａｎ ｔ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：　ａ　Ｒｅｖｉｅｗ”。

この方法によって、潜在的にＳＣＭに反応する１ノンパ球の細分割集団を被試験 患者の血液試料力）ら分離して、リン、＜球を悪性腫瘍組織と装置する又は悪性 腫瘍組織を抽出する。その血液試料提供者カニ悪性腫瘍で苦しんでる場合には、 悪性腫瘍で苦しんでいない提供者からのリンノ（球のＳＣＭ反応と区別できる特 徴的なＳＣＭ反応がある。そのＳＣＭ反応は。

ＳＣＭに反応するリンノ（球の細胞間のフルオレセイン螢光偏光作用における変 化を測定することによって決定される。

８０Ｍ試験に見られる変化は、リンノ（球の内部構造の変化を反映すると考えら れる。これらの変イヒは。

偏光を用いて細胞内に存在するフルオレセインを励起するとき、細胞の螢光偏光 作用における減少（低下）として表われる。螢光偏光は細胞間の岡１１性の目安 であって、細胞間の移動度カニ大きい程、　Ｉｌｌ定される螢光偏光作用は小さ くなる。観察される螢光偏光ギーを生起するオルガネラ）の立体配座の変化から 生じるものと考えられる。ミトコンドリアの変化はミドコシドリアの膜のクリス テ（内膜のひだ）の収縮から生じると考えられる。ＳＣＭは高分子と、水の分子 、イオン、三リン酸アデノシン、および環状リン酸アデノシンのような小分子間 の相互作用の力を反映する。これら相互作用の摂動がＳＯＭの変化をもたらす。

８０Ｍ試験は比較的少量の悪性細胞に反応することができる。体重約７０職のヒ トで約１０細胞は８０Ｍ試験においてリンパ球を悪性腫瘍の固有パタ−ンで十分 反応させる。マウスにおいて、　７．５ｘｌＯと少量のエールリッヒ腹水（腫瘍 ）細胞が移植されると、８０Ｍ試験における反応パターンが変わ＃）：癌に特異 の抗原に対する反応が誘導され、一方ＰＨＡに対する正常な反応は実質的に排除 される（　Ｌ、　０ｅｒｃｅｋ　＆　Ｂ。

０ｅｒｃｅｋ、　”　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ＳＣＭ−Ｒｅｓｐｏｒｓｅｓ　ｏ ｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎ　Ｍｉｃｅ　Ａｆｔｅｒ　Ｉｍｐｌａｎｔａｔ ｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｅｈｒｉｌｉｃｈ　ＡｓｃｉｔｅｓＳＣＭ試験は、血液試料 を採取することを除いて患者に比較的小さな不快感を与えるだけで従来の方法よ りも著しく早期に癌の検出をすることができる。

しかしながら、この方法には欠点がある。例えば。

癌組織、等から粗抽出物を調製したり、癌に関係した抗原の源として癌組織自体 を使用する必要がある。

８０Ｍ試験にお＾て癌組織又は該組織の抽出物の使用はいくつかの問題がある。

必要な量の組織を得ることが困難な場合がある。全組織又は組織の粗抽出物の使 用は試験過程に妨害物質を導入する。これらの妨害物質は試験の感度に悪影響を 与えたり、試験結果自身に悪影響を与える。これらの妨害物質の存在又は非存在 は癌組織のバッチ毎に容易に変わジ。

８０Ｍ試験に有害な変動をもたらす。さらに、妨害物質は全組織又は粗抽出物に 存在するので、それらの同定又は定量は極めて困難である。

従って、ＳＯＭに反応するリンパ球によって反応を誘発する因子を同定１分離お よび精製することが極めて望ましい。かかる精製された因子の使用は、妨害物質 が存在しないからＳＯＭ癌スクリーニング試験を促進し、癌の研究を助けること になる。

発明の開示 我々は、動物およびヒトの体液、さらに詳しくは血漿と尿にドナー（供与体）の 体が癌で苦しんでいる場合に、８０Ｍ試験において癌に関係した抽出物および／ または癌組織に対するリンパ球の反応と同一のＳＣＭに反応するリンパ球におけ る反応を与える癌認識因子を発見した。本願明細書において記載するように、そ れらの因子は単数形であって、「一般的な癌〜関連ＳＣＭ−認識因子Ｊ、「ｓＯ Ｍ−認識因子」又は単にｒｓｃＭ因子ｊと呼ぶ。

８０Ｍ因子はペプチド又はペプチドに似た物質であって２．３の密接に関係した ペプチドからなると考えられる。８０Ｍ因子は、配列Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｐ ｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｒｓ　−Ｍｅｔ−Ｒ４−Ｒ４−Ｒ４−Ｒｔ　　 （但しＲ１はＡｓｎとＧｉｎからなる群から選び、Ｒ２おＲ１およびＲ番はそれ ぞれ独立にＶａ　ｌ、　Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選び、Ｒ６とＲ７ はそれぞれ独立にＡｓｎとＧｉｎからなる群から選ぶ〕を有する１３個のアミノ 酸フラグメント（断片）を含むと考えられる。

この配列は８０Ｍ因子のアミノ酸末端を含まない。

一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子は１本質的に公称１０００ダルトンの分子量 カットオフのフィルターを通過し公称５００ダルトンの分子量カットオフのフィ ルターで保持される低分子量のペプチドがらなジ、そして該ペプチドは標準の８ ０Ｍ試験においてリンパ球を刺激するために使用したとき癌患者から単離された ＳＯＭ−反応リンパ球の細胞間螢光偏光作用において少なくとも１０％の減少を 与える。

以下の記載するその方法によって精製された因子はほぼ次のアミノ酸組戊を有す る：　（Ａｓｘ１．Ｇｌｘｘ。

８ｅｒ、Ｈｉｓ、ＧｌｙｓｓＴｈｒｓＡｒｇ、Ａｌａｍ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａ ｌｘ。

Ｐｈｅｍ　、　ＩＩ　ｅ、Ｌｅｕａ　＊　Ｌｙｓｍ　）。

８０Ｍ因子のトリプシン断片のアミノ酸配列に基づいて、該因子の１つの調製品 内の１６個のアミノ酸セグメントは、アミノ酸配列Ｐｈ　ｅ　−Ａｓ　ｎ　−Ｌ ｙ　ｓ　−Ｐｒ。

−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ 　−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｌｙｓを有する。そしてそのセグメントは因子のアミノ酸 末端を含まない。

また、８０Ｍ因子の別の標品内の１４個のアミノ酸セグメントは、アミノ酸配列 Ｐｈｅ　Ａｓｎ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅ ｔ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ　−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　’に有する。そして そのセグメントも因子のアミノ酸末端を含まない。

これら２つのトリプシン断片は共に８０Ｍ試験において完全に活性である。２つ の継片に共通である最初の１３個のアミノ酸はＳＯＭ−活性の生起に最も重要で ある。従って１本発明の重要な別の面は定義された配列のペプチドのみからなる ８０Ｍ因子であり、それらのペプチドは８０Ｍ活性を有するものとして直接水さ れているか又はかかる活性を有すると考えられる。最も広範囲には、かかる因子 は本質的に次の配列を含む少なくとも１３個のアミノ酸残基全有するペプチドの みからなる：　Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｒ４−Ｌ　ｙ　ｓ　−Ｐｒ　ｏ−Ｐｈｅ　−Ｒｑ 　−Ｐｈｅ　−ＦＬｓ　−Ｍｅ　ｔ　−Ｒ４−Ｒ４−Ｒ４−Ｒ−ｒ　　（但し％ Ｒ１はＡａｎとＧｌｎからなる群から選び、Ｒ８、Ｒ，およびＲ番はそれぞれ独 立にｖａ’　＊　Ｌｅｕ　ｍおよびＩｌｅからなる群から選び、ＲＩＩはＡｓｐ とＧｌｕからなる群から選び、Ｒ６およびＲ，Ｆはそれぞれ独立にＡｓｎとＧｌ ｎからなる群から選ぶ〕。この因子は本質的に１つのペプチドを含むことが望ま しい。

２つのトリプシン断片からの完全配列情報を利用するとき、それは各々が上記定 義の１３個のアミノ酸断片を含む２つの異なる平行なりラスの８０Ｍ因子のもと である。

第１のクラスは最も広くは１本質的にＰｈｅ−Ｒｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　 −Ｒ４−Ｐｈｅ−Ｒａ　−Ｍｅ　ｔ−Ｒ４−Ｒｓ　−ＦＬｓ　−ＲｎＲ，Ｂ−Ｌ ｙｓの配列〔但し、Ｒ１〜Ｒ？は前に定義したもの、ＲａはＳｅｒ　とＴｈｒか らなる群から選ぶ〕を少なくとも１５個のアミノ酸残基を有するペプチドのみか らなる。この因子は本質的に１つのペプチドのみからなることが望ましい。

このクラスの中でさらに狭く定義された因子は、本質的にＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙ ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ　−ＬｅｕＭｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ− Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓの配列を含むペプチドのみからなる。これらの ペプチドは特定配列のいずれかの側にさらにフランキング配列を含みうる。この 因子は本質的に１つのペプチドのみを含むことが望ましい。

このクラスの中で最も狭く定義された因子は、本質的にＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓからなる本質的に純粋なペプチドからなる。

第２のクラスは１本質的に最も広範囲にはＰｈｅ　−Ｒｓ　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｍｅ　ｔ−Ｌ　−Ｒ４−Ｒ４−ｋ　−Ｐｈｅ−Ｒ ｓ　−Ｌｙｓ　Ｃ但し、Ｒｔ〜Ｒ，ｌは前に定義したもの、Ｒ８はＳｅｒとＴｈ ｒからなる群から選ぶ〕の配列を含む少なくとも１６個のアミノ酸残基含有する ペプチドのみからなる。この因子は本質的に１つのペプチドのみを含むことが望 ましい。

このクラスの中でさらに狭く定義された因子は本質的Ｋ　Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙ ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ　 Ｇｉｎ−Ａｉｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓの配列を含むペプチドのみからなる。

こねらのペプチドは特定配列のいすね５かの側ＩＣさらにフランキング配列を含 みうる。この因子は本質的に１つのペプチドのみからなることが望ましい。

このクラスの中で最も狭く定義された因子は本質的Ｋ　Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　ｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇ ｉｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　のアミノ酸からなる本質的に純粋なペ プチドからなる。このペプチドは、癌で苦しんでいるドナーからのＳＯＭ−反応 リンパ球を刺激するために使用したときペプチドの５×１０　フェムトグラム（ ｆＰ）が少なくとも３０チの偏光値の減少を与えるような８０Ｍ試験における活 性を有することか望ましい。

８０Ｍ因子は、１０００ダルトン以下の見掛は分子量を有する分子からなる＄２ の両分から１０００ダルトン以上の見掛は分子量を有する分子からなる体液の第 １の画分を分離するために癌で苦しんでいるドナーからの体液を限外ｆ遇するこ とによって生成することができる。その体液は末梢血液、尿および血漿からなる 群から選ぶ。限外濾過後、その因子は各段階がさらに高精製された因子をもたら す数段階からなる精製工程をさらに受ける。

この精製工程の第１段階は、θ〜約７００ダルトンの分画範囲を有し限外濾過体 から塩類を分離することができるゲル濾過カラムからの溶離からなる、因子はク ロマトグラフ床全容積の約０．３〜０．５倍で溶離する。

第２の段Ｉｖは約１５００〜３０，０００り／’トンノ分画範囲を有するゲル濾 過カラムがらの溶離がらなジ、因子はクロマトグラフ床全容積の約０．４〜０． ６で該カラムから溶離する。

この精製プロセスの次の段階は、約０．２８　Ｍ〜０、３１　Ｍの重炭酸アンモ ニウムでジメチルアミンエチル・セルロースの陰イオン交換カラムからの溶離か らなる。

最終段階は、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって因子を実質的に均一に精 製することからなる。

８０Ｍ試験においては因子のさらに高精製調製品を使用することが望ましいけれ ども、初限外Ｐ液を含む精製の全ての段階からの因子を試験に使用することがで きる。

８０Ｍ因子は、８０Ｍ因子を単離するドナーに存在する癌の種類に関係なく１種 々の異なるタイプの悪性腫瘍を有するドナーから得た潜在的にＳＣＭに反応する リンパ球に陽性反応を与える。従って用語「一般的」が付く。因子は悪性腫瘍を 含まないドナーから誘導さね、たりンバ球に８ＣＭ反応を少ししか又は全く反応 しない。一般の癌関連抗原として作用する能力は因子を悪性腫瘍の存在に対して 血液試料の一般的スクリーニングに有用にさせる。

その因子は他の興味ある性質も有する。これらの性質の１つは、悪性腫瘍のない ドナーから得たリンパ球と因子が接触したときにＳＣＭに反応するリンパ球のＳ ＣＭ反応を改良する性質であって、それによってリンパ球は８０Ｍ試験において 癌に関係した抗原に反応するが、接触後マイトジェン（分裂促進因子）に反応し ない。第２の性質は、潜在的にＳＯＭよって測定した際ヒトの骨髄細胞の線に５ ６２方向へ少なくとも９０チ下げる性質である。

本発明の別の面は、一般的な癌に関係した８０Ｍ因子を８０Ｍ試験に用いる方法 に関する。最も一般的に、この方法は、（１）哺乳類のドナーのリンパ球と一般 的な癌に関係したＳＯＭ−認識因子とを接触させ：そして（２）リンパ球の懸濁 液を接触させる工程から得たリンパ球の細胞形質マトリックスの組織化度の減少 を決定することによって哺乳類ドナーからのリンパ球を試験して悪性腫瘍の存在 又は非存在を決定することからなる。

組織化度の減少を定量する望ましい方法はｉｌ）　一般的な癌関連ＳＯＭ−認識 因子と接触されたリンパ球の一定分量について螢光偏光Ｐｓを測定する工程：（ ２）接触されなかった対照リンパ球の一定分量について螢光偏光Ｐｃを測定する 工程：および（３１Ｐ　ｓ／　ＰｃＯ比を決定する工程からなる。約０．９以下 のＰｓ／Ｐｃ比は８０Ｍ因子に対する陽性反応およびリンパ球のドナーに悪性腫 瘍が存在することを示す。

さらに望ましい方法は、Ｐｓと、マイトジェンと接触されたリンパ球の別の一定 分量の螢光偏光ＰＭとを比較してＳＯＭ反応比ＲＲ３ＣＭ　ｋ決定することであ る：　ＲＲｓｃＭ＝Ｐ　Ｓ／ＰＭ 約０．９以下の几Ｒはリンパ球のドナーに悪性鷹ＣＭ 瘍が存在することを示す。

これとは別に、８０Ｍ試験において３０Ｍ因子を用いる方法は、（１）血液試料 から潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球を分離する工程：（２）分離されたリン パ球に一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子を接触させることによりリンパ球を刺 激させる工程：（３）刺激されたリンパ球に、螢光発生化合物に対して細胞内加 水分解性の非螢光発生化合物として定義される螢光発生剤前駆物質を接触させて 、リンパ球を細胞内酵素加水分解のために螢光発生化合物に浸透させることによ って刺激さね、た螢光含有リンパ球を生成する工程：（４）刺激された螢光含有 リンパ球を偏光で励起さすことによってそれらに螢光を発生させる工程；（５） 螢光を発生するリンパ球からの偏光された螢光発光を鉛直方向および水平方向に 測定して螢光を発生するリンパ球の偏光値を決定する工程：および（６）刺激さ れた螢光を含有するリンパ球の決定された偏光値と、同一ドナー分量の対照リン パ球の偏光値とを比較することによって、リンパ球のドナーの体に癌が存在する か否かを示す工程からなる。工程（３）と（４）は同時に行うことができる。

リンパ球は鉛直方向に偏光した光で励起することができる。鉛直偏光を用いると きの偏光値は次の関係に従って螢光分光光度計で測定される：但し、Ｊｖおよび ＩＨはそれぞれ鉛直面および水平面における偏光された螢光の強さである：Ｇは 分光光度計の光学系を通る偏光の水平および鉛直成分の不等透過に対する補正係 数である。

本発明は癌で苦しんでいる被験者を同定する診断法を提供するのみならず、該被 験者の治療法も包含する。これらの方法は、一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子 が癌細胞へのリンパ球の試験内自発毒性を低下させる性質を有するという観察に 基づいている。

かかる観察に基づいて、ＳＯＭ−認識因子の生体内活性の低下は癌細胞に対する リンパ球による免疫学で監視の効率を高める筈である。

最も一般的に、この治療は体液の少なくとも１つが一般的な癌−関連ＳＯＭ−認 識因子を含む患者に対してである。その治療は、　（１）　ｓ　ＯＭ−認識因子 を含有する体液を処理してそれを選択的に不活性化することにより因子の生体内 作用を低下させる工程：（２）その体液を患者に戻して癌に対する患者の抵抗を 高める工程からなる。

この一般的な寸法の一つの用途におりで１体液は末梢血液であり１体液を処理す る工程は、その末梢血液を透析して１０００ダルトン以下の見掛は分子量のペプ チドを除去し、それによってＳＣＭ−認識因子を選択的に不活性させることから なる。

この一般的な方法の別の用途における体液処理工種は１体液中のＳＣＭ−認識因 子を因子に特有の抗体又は該抗体のＦａｂフラグメントで中和することかなる。

そのＦａｂフラグメントはＳＣＭ−認識因子と一価の結合をすることができる。

さらに１本発明は癌細胞をイメージング（画像診断）する方法も包含する。この 方法は（１）一般的な癌関連ＳＯＭ−認識因子に対する抗体をイメージング物質 で標識化する工程：および（２）その標識化抗体を利用して癌細胞を画像診断す る工程からなる。

本発明はさらに、（１）一般的な癌関連ＳＯＭ−認識因子に対する抗体を抗癌物 質で標識化することによって抗癌物質を癌細胞に向け：（２）標準化抗体が患者 の癌細胞に結合できるように標識化抗体を癌患者に投与することからなる。抗癌 物質を癌細胞に向ける方法を包含する。

さらに本発明は、免疫検定法において一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子に対す る抗体を使用して体液中の一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子の水準を決定する 方法を包含する。免疫検定法は放射線免疫検定法、螢光免疫検定法、酵素−結合 免疫吸着検定法、又は比濁分析検定法のような沈殿免疫検定法にすることができ る。

本発明のこれらおよび他の特徴１面および利点は以下の説明および請求の範囲か らさらに良く理解できるであろう。

次の議論、実施例および請求の範囲において反復使用されている多数の用語の定 義を便宜上収集する。

「一般的な」とは１本発明の３０Ｍ因子が精製される体液のドナー、または８０ Ｍ試験において８０Ｍ因子と共に使用されるリンパ球のドナーを苦しめている癌 の特定のタイプに関して非特定的であるということを意味する。

り上げられて加水分解によって細胞内で螢光発生化合物に転化される非螢光発生 化合物を意味し１本明細書で使用されている例は二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ ）である。

「標準８０Ｍ試験Ｊ　：６Ｘ１０細胞／−で１．０１のリンパ球懸濁液と、０． １−のマイトジェン又は抗原と、螢光発生剤前駆物質としてのＦＤＡ″に使用し 。

螢光偏光測定用に４７０ｎｍの励起波長および５１０ｎｍの発光波長を使用する ８０Ｍ試験。

これらの用語は共に、大きさに従った限外ｒ過による分子の分離が８０Ｍ因子の 大きさの範囲における分子に近似し、立体配座並びに大きさに依存するこ見掛は 分子量をもった分子から分離することができる。

８０Ｍ活性を示し、かつ全てのタンパク質および大きなペプチドを含む特異の生 物学的活性をもった圧倒的多数の他の分子が存在していないような純粋な状態の 物質。

リシン又はアルギニン残基の後のペプチド連鎖を切断するタンパク質加水分解酵 素の作用によって大きなペプチドから切断されたペプチド。

発明全実施するための最良の形態 本発明は、一般的な癌−関連ｓｃＭ−認識因子であるペプチドの発見および該ペ プチドを実質的均一に精製することに関する。該因子は１０００ダルトンの公称 分子量カットオフをもったフィルターを通過するが、５００ダルトンの公称分子 量カットオフをもったフィルターによって保持される。該因子は。

（Ａｓｘ１．Ｇｉｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙｇ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ。

Ａｌａｓ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＶａｌＢ％Ｐｈｅｓ　、Ｉｌｅ％Ｌｅｕ＠。

ＬｙｓＩ）の近似的なアミノ酸組成を有する。２つの活性トリプシン断片は因子 の別の標品がら単離されている。これら断片は初因子分子のアミノ酸末端を含ま ない。これら断片の第１はＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　 Ｉ　−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　−Ｍｅ　ｔ−Ｉ　１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈ ｒ−Ｌｙｓの配列をもった１５個のアミノ酸を有する。こね、ら断片の第２はＰ ｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ− １１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ　−Ｐｈｅ−８ｅ　ｒ−Ｌｙｓの配列をもった １６個のアミノ酸を有する。

因子の性質は、悪性腫瘍をもたないドナーのリンパ球のＳＣＭ反応全修飾し、該 リンパ球の悪性腫瘍細胞への試験管内細胞毒性を減少させる能力、並びにドナー から単離した因子の多くの異なるタイプの癌との交差反応を含むものが以下に記 載される。

８０Ｍ因子の性質 乳癌の患者の血漿から精製した一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子のアミノ酸組 成を決定した。それらの結果を第１表に示す。ＲＰ−）ＩＰＬＣによって精製し た因子の凍結乾燥試料を窒素雰囲気下密閉ガラス・アンプル中で６ＮのＨＯ４中 ２％グリコール酸で１１０℃において２４時間加水分解させた。

加水分解後、試料を凍結乾燥した。残留分は０．０４Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝 液中２％のドデシル硫酸ナトリウムで溶解させた。アミノ酸は１次の刊行物に記 載されているＨＰＬＯによって分離後それらの螢光によりＯ−フタルジアルデヒ ド誘導体として決定した：　Ｂ、Ｎ、Ｊｏｎｅｓ、　Ｓ、Ｐａａｂｏ　ａｎｄ　 Ｓ、５ｌｅｉｎ、”Ａｍ１ｎ。

Ａｃ１ｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ　Ｐｅｐｔｊｄｅｓ　ｂｙ　ａｎ　Ｉｍｐｒ ｏｖｅｄ　５４−ＰｈａｔｈａｌｄｉａｌｄｅｈｙｄｅＰｒｅｃｏｌｕｍｎ　Ｌ ａｂｅｌｉｎｇ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、　”　Ｊ、Ｌｉｑｕｉｄ　Ｏｈｒｏｍａ ｔ。

Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ”、　Ａｌｔｅｘ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｂ ｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　Ｃ ａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９４７１０゜第１表 Ｓ０Ｍ因子の相対モルのアミノ酸組戊 アミノ酸　　　　　　　　　相対モル組設Ａｓ　ｘ　　　　　　　　　　　　　 　２．１０Ｇｌｘ　　　　　　　　　　　　　　３．２０Ｓｅｔ　　　　　　　 　　　　　　　１．２７Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，６５Ｇｌ）１ 　　　　　　　　　　　　　４．６０Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　１． １１Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．８６Ａｌａ　　　　　　　 　　　　　　　ｚ６０Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，９４Ｍｅｔ　　 　　　　　　　　　　　　１．５８Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　３．２ ２Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　３．０７１１ｅ　　　　　　　　　　　 　　　Ｏ，８６Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　２．８７アミノ酸組成は窒 素雰囲気下密封ガラス・アンプル中で６ＮのＨｏｔ中２％チオグリコール酸で乾 燥したペプチドを加水分解後決定した。加水分解後、試料を１￥結乾燥し、残留 分を０．０４　Ｍのホウ酸ナトリウム中２％のＳＤＳ緩衝液で溶解させた。アミ ノ酸は、前記ベックマン・インスッルメンツ社の仕様ジアルデヒド誘導体として 決定した。アミノ酸のＣｙｓおよびＰｒｏは決定しなかった。

第１表のアミノ酸組成データは活性因子がペプチドであることを示す。そのデー タは近似のアミノ酸部ｇ　（Ａｓｇ、Ｇｌｘｍ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｇ、Ｔｈ ｒ、Ａｒｇ。

ＡＩａｍ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔｌ、Ｖａｌｍ、Ｐｈｅａ、　Ｉｌｅ、Ｌｅｕｍ、Ｌｙ ｓｍ）をもったペプチドと最もよく一致した。

８０Ｍ因子の異なる２つの試料から単離されたセグメントのアミノ酸配列は、オ ンライン１２０ＡＰＴＨ−アミノ酸分析装置と結合したタンパク質配列決定装置 （Ａｐｐ目ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　４７７人型）を使用して自動エドマン分 解法を行なうことによって決定した。２．３の種類の癌１例えば乳癌、肺癌、大 腸癌。

気管支癌又は頚癌の患者から単離したＳＯＭ因子全体をエドマン分解法にかけた とき１反応は起きず。

８０Ｍ因子のアミノ酸末端が遮断されていることがわかった。従って、分子のセ グメントの配列を決めるためには、遊離アミノ酸末端のアミノ酸をもったフラグ メントを得る必要があった。かかるフラグメントは、トリプトシンの消化、続い て以下の実施例で詳述するように逆相高圧液体クロマトグラフィーによるトリプ トシン・フラグメントの精製によって因子の別の精製試料から得た。これらフラ グメントの１つは肺癌患者の血漿からの因子試料から、そして他は乳癌患者の血 漿から得た。

それぞれの場合の特定フラグメント（後で８０Ｍ活性を有することが示された） は、約３０μｔの全体積において相Ａの３０．４体積チ、相Ｂの６９．６体積チ で溶離した。配列決定のために、ＳＣＭ−活性トリプトシンの７ラグメントは配 列決定装置のディスク上に直接点在させ、エドマン分解法、続いて生成したＰＴ Ｈ−アミノ酸を結合されたオンラインのＰＴＨ−アミノ酸分析装蓋において同定 する逐次サイクルによってコンピュータ管理自動配列決定分析を行なった。

配列決定装置の配列呼出しコンピュータプログラムは肺癌患者の血漿から単離し た８０Ｍ因子の７ラグメントの配列として１６個のアミノ酸配列を同定した。そ の配列はＰｈｅ　−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ｆ’ｈｅ−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ　− Ｌｅｕ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−８ｅ　ｒ−Ｌｙｓであ った。同様に、コンピュータプログラムは乳癌患者の血漿から単離した因子のフ ラグメントの配列として１５個のアミノ酸の配列を同定した。その配列はＰｈｅ −Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　−Ｍｅ　ｔ −Ｉ　１　ｅ−Ａｓｐ　−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓであった。

これら２つのトリプトシン・フラグメントにおける最初の１３個のアミノ酸は同 一である。それらのカルボキシ末端は異なるけれども、１つの欠落のアミノ酸Ｐ ｈｅを短い方のフラグメントに挿入すると。

唯一の差はＳｅｔに対するＴｈｒの置換となり、極めて保存性の置換はペプチド の機能に影響を与えないよ精製された８０Ｍ因子は、数種の異なる悪性腫瘍をも った患者から単離したリンパ球に対する刺激剤として使用したとＩＪＳＣＭ試験 において完全に活性である。この活性は因子の精製中食ての点での検定法によっ て示すことができる。その検定法の結果の詳細は以下の実施例に示す。最高の活 性は最終精製工程の逆相高圧液体クロマトグラフィーで得られる。

ペプチド４０μＭのタンパク質含有を有する乙の画分１／１０　ｍは、癌患者か ら単離したＳＯＭ−反応リンパ球の刺激に使用したとき細胞内螢光偏光を４４， ６チ程減少させるが、健康なドナーから単離したリンパ球の同−細画分を刺激し たとき細胞内螢光偏光作用は減少しなかった。

性 乳癌患者の血漿から単離した８０Ｍ因子から切断した１５個のアミノ酸トリプト シン・ヘプチド・フラグメント（乳房フラグメント）と、ｉ癌患者の血漿から単 離した８０Ｍ因子から切断した１６個のアミノ酸トリプトシン・ペプチド・フラ グメント（肺フラグメント）ハ共に８０Ｍ試験において完全（”ｆｆｘわち、５ Ｘ１０　　Ｐ、又は約１６，０００分子）は。

８０Ｍ試験において癌患者のリンパ球に対する刺激剤として使用したとき完全活 性を示した。肺フラグメントは肺癌および乳癌の患者からのリンパ球で等しくよ く反応したが、正常なドナーからのリンパ球の刺激に使用したとき８０Ｍ試験に おいて反応しなかった。

肺フラグメントおよび乳房フラグメントは共に８０Ｍ試験において完全に活性で あってそれらの配列の最初の１３個のアミノ酸のみを共有するから。

この１３個のアミノ酸の共通配列は８０Ｍ活性の発生において最も重要な配列で ある。従って、「コア」と呼ぶこれら１３個のアミノ酸だけの配列、　Ｐｈｅ　 −Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　ｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１ １ｅ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ａｓｎは８０Ｍ活性を有すると考えられる。

この配列は８０Ｍ活性を有すると考えられる１３個のアミノ酸の唯一の配列では ない。あるアミノ酸の置換、「保存性」と呼ぶアミノ酸の置換はペプチドの立体 配座又は機能を変えることなくペプチドにおいてしばしば行われることはタンパ ク質およびぺブチドの化学のよく確立されている原理である。コアの配列におけ るそのようなアミノ酸に影響を与える変化ａ、Ｖａｌ　　に対するＩｌｅとＬｅ ｕおよびその逆。

Ｇｌｕに対するＡｓｐおよびその逆、およびＧｉｎに対するＡｓｎおよびその逆 を含む。従って、前記保存性アミノ酸置換のいずれか又は全てが行われるコア構 造を有する変ったペプチド分子が８０Ｍ活性を示すと考えられ、従って本発明の 一部と考えられる。

肺および乳房フラグメントは共により大きい一般的な癌−関連８０Ｍ−認識分子 の部分として単離される。かかるフラグメントは、よシ大きな分子に組み込″１ ｎたときにそれらの８０Ｍ活性を保持できることは明白である。従って、上記の 保存性アミノ酸置換を有する又は有さない１３個のアミノ酸コア配列を組み込む 大きなペプチドも８０Ｍ活性を示すことが期待さね、る。

コア配列のこれら２つのタイプの修飾の発生は本発明のさらに別の重要な面を与 える。これは定義された配列のペプチドのみからなるＳＣＭ＝活性因子であシ、 それらのペプチドは８０Ｍ活性を有することが直接水されているか、又は該活性 を有すると考えられる。かかる因子は最も広くは、実質的にＰｈｅ−Ｒ１−Ｌｙ ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｒ４−Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｍｅｔ−几４−Ｒｓ　−Ｒ６−Ｒ？ 　（但し％ＲＩはＡｓｎとＧｌｎからなる群から選び、Ｒ１，Ｒ，およびＲ４は それぞれ独立にＶａ１％ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選び、ＲうはＡｓｐ 、とＧｌｕからなる群から選び、Ｒ６とＲ？はそれぞれ独立にＡｓｎとＧｌｕか らなる群から選ぶ〕の配列を含む少なくとも１３個のアミノ酸残基を有するペプ チドのみからなる。この因子は実質的に該ペプチド１つのみを含むことが望まし い。

肺および乳房フラグメントからの完全配列情報が利用されるとき、それは２つの 異なる平行なりラスの８０Ｍ因子を生じる。そして各々はコア配列またはコア配 列から保存性置換によって誘導された配列を含む。これらの長いペプチドは、そ れぞれ保存性アミノ酸置換に対してさらに１つの可能性、すなわちＳｅｒの代シ のＴｈｒおよびその逆を有する。これらアミノ酸の等価は、肺フラグメントがＳ ｅｔであるが。

乳房フラグメントがＴｈｒを有することによって示される。これらアミノ酸のそ れぞれの７ラグメントにおける位置は肺フラグメンＦの位置１４のＰｈｅを削除 することによって整列することができる。

こね、ら因子の第１のクラスは乳房フラグメントの配列、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙ ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ− Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓから誘導される。このクラスに最も広くは、実 質的にＰｈｅ　−Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−凡１−Ｐ　ｈ　ｅ　−ＦＬｓ 　−Ｍｅ　ｔ　−Ｒ４−Ｒ１１−Ｒ４−Ｒ，７−Ｒ６−Ｌｙｓの配列を含む少な くとも１５個のアミノ酸残基を有するペプチドのみからなる。この配列に、おい て、Ｒｓ〜Ｒフは前に定義したものそしてコア配列において可能なアミノ酸の置 換をもたらす、Ｒ８はＳｅｒとＴｈｒからなる群から選ぶ。この因子は実質的に １つのペプチドのを含むことが望ましこの第１のクラスの中でさらに明確に限定 された因子は、実質的にＰｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　Ｉ Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓの 配列を含むペプチドのみからなる。これは乳房フラグメントの元の配列である。

これらのペプチドは特定の配列のいずれかの側にさらにフランキング配列を含む ことができる。そしてこれらのフランキング配列は中空の長さのものにできる。

この因子も実質的に１つだけのペプチドを含むことが望ましい。

この第１のクラス内で最も狭く限定された因子は。

本質的にＰＲｅ−Ａａｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ　− Ｌｅｕ−Ｍｅ　ｔ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓのア ミノ酸配列からなる実質的に純粋なペプチドからなる。これはフランキング配列 をもたない乳房フラグメントの正確な配列である。

これら因子の第２のクラスは、肺フラグメントの配列、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　ｌ−Ｐｈｅ−ＬｅｕＭｅ　ｔ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｓｐ− Ｇｌ　ｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−８ｅ　ｒ−Ｌｙｓから誘導される。このクラスは最 も広は実質的に、　Ｐｈｅ　−Ｒ４−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｐｈｅ− Ｒｓ　−Ｍｅ　ｔ　Ｒ４−Ｒｓ　−Ｒｓ−Ｒｔｒ　−Ｐｈｅ−Ｒｇ　−Ｌｙ　ｓ の配列を含む少なくとも１６個のアミノ酸残基を有するペプチドのみからなる。

この配列において、Ｒｓ〜Ｒ−ｒは前に定義したもの、そしてコア配列における 可能なアミノ酸置換をもたらす、Ｒ８はＳｅｒとＴｈｒからなる群から選ぶ。こ の因子は実質的［１つだけのペプチドを含むことが望ましい。

この第２のクラスの中でさらに明確に限定された因子は、実質的にＰｈｅ−Ａｓ ｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ− Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｌｙ　ｓの配列を含むペプチドのみ からなる。これらのペプチドは特定の配列のいずれかの側にさらに７ランキング 配列を含むことができる。そしてこれらのフランキング配列は中間の長さのもの にできる。

この因子も実質的ＩＣ１つだけのペプチドを含むことが望ましい。

この第２のクラス内で最も狭く限定された因子は。

本質的にＰｈｅ−Ａｓｒ＋−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　１−Ｐｈｅ　− Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｌｙｓの アミノ酸配列からなる実質的に純粋なペプチドからなる。これはフランキング配 列をもたない肺フラグメントの正確な配列である。

これらの因子は全＜８０Ｍ活性を有することが期待され、る、そして本発明の範 囲内にある。

５、８　ＣＭ因子の交差反応性 全ての種類の癌をもったドナーからそれぞれ単離されたリンパ球が８０Ｍ試験に おいて因子に反応するので、その因子は一般的な癌−関連８０Ｍ因子と定義され る。リンパ球のドナーを侵す癌の種類は。

８０Ｍ因子が精製される体液のドナーを侵す癌の種類と同一である必要はない。

以下に検討するように。

異なる１９種類の癌患者から得た血漿からの因子の精製は常に逆相高圧液体クロ マトグラフィーにおける同じ位置で溶離する因子をもたらした。これは同−分子 又は橿めて似た分子がこれら患者の全てから単離されたことを示唆する。実際に 、肺癌および乳癌の患者の血漿から単離した８０Ｍ因子からのトリプシン・フラ グメントのアミノ酸配列はフラグメントの最初の１３個のアミノ酸か同一である ことを示している。２つの配列の唯一の相違は、肺フラグメントの位置１４にあ るフェルアラニン残基の欠失および次の位置におけるセリンに対するスレオニン の保存性置換である。８０Ｍ因子の交差反応性の立証についての詳細は以下の「 実施例」に示す。

６、一般的な癌−関連８０Ｍ因子によるＳＣＭ反応の修飾 −ｆｆ的な癌−関連８０Ｍ因子は、癌のないドナーから得た潜在的にＳＣＭに反 応するリンパ球をその因子と接触させるとそれらリンパ球の反応を修飾できる性 質を有する。接触の前に、それらのリンパ球は８０Ｍ試験においてマイトジェン のみに反応して、癌に関連した抗原に反応しない。しかしながら。

８０Ｍ因子との長期間の接触後、細胞のＳＣＭ反応は修飾されて癌に関連した抗 原のみに反応し、マイトゲンに反応しない。換言すると、８０Ｍ因子とかかるリ ンパ球による接触は、８０Ｍ試験におけるそれらの反応を悪性腫瘍のないドナー からのリンパ球の正常な反応から癌に侵されたドナーからのリンパ球で見られる 反応に変える。癌のないドナーからのリンパ球のＳＣＭ反応の修飾の立証は以下 の「実施例」で詳述する。

８０Ｍ因子は、潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球の試験管内の自然細胞毒性を 著しく下げる性質がつる。この性質に基づいて、一般的な癌−関連ＳｃＭ認識因 子分子はキラーリンパ球の攻撃に対して癌細胞の防御に参加して、癌細胞の無制 限成長を助けると考えられる。癌細胞の成長抑制における免疫系の正常な機能の 重要性は、免疫抑制を受けている患者に癌の異常な形がしばしば発生することに よって示される。この重要な例は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に苦しむ 患者において普通はむしろゆつくシ広がる癌であるカボシ（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ） 肉腫の攻撃的形態の発生である。

一般的な癌−関連８０Ｍ因子は健康なドナーからのリンパ球のＳＯＭ反応を修飾 して、骨髄細胞へのキラーリンパ球の自然細胞毒性を下げるから、因子を選択的 に不活性にさせ、続いてＳＯＭ−認識因子を含有する体液を患者に戻すことによ って、ＳＣＭ−認識因子を含有する体液を処理してその因子の生体内作用を低下 させることは、病気に対する自然抵抗を増すために癌の管理に使用できると考え られる。

体液力；末梢血液の場合、体液の処理工程は末梢血液を透析して１０００ダルト ン以下の見掛は分子量のペプチドを除去することからなる。これとは別に。

体液の処理工程は因子をそれに特定の抗体、又は該抗体のフラグメント、例えば Ｆａｂ　（抗体結合性）フラグメントで中和することからなる。該Ｆａｂフラグ メントは、各フラグメント分子が因子の１つの分子だけを結合するように一価の 結合ができる。これは。

大きな因子−抗体複合体の形成が望ましくない場合には、用途によって完全な抗 体の使用が望ましい。

この一般的な癌−関連ＳＯＭ癌認識因子の使用は以下に詳述する。

８０Ｍ因子の精製における第１の工程は癌に侵されたドナーの体液から限外ｆ液 を得ることである。

体液は末梢血液、血漿又は尿にすることができる、その体液が末梢血液の場合、 その血液は遠心分離によって血漿から赤血球を分離しなければならない。

８０Ｍ因子の単離に使用される体液のドナーは８０Ｍ試験に使用されるリンパ球 に関して同−又は異種にすることができる。

限外−過去は、１０００ダルトン以上の見掛は分子量を有する分子からなる体液 の第１の画分を１０００ダルトン以下の見掛は分子量を有する分子からなる第２ の画分から分離する。本発明の一般的な癌−関連８０Ｍ因子は限外Ｐ液の第２の 画分に見られる。

用語「見掛は分子量」および「公称分子量カットオフ」は、限外濾過がこの分子 量の範囲で分子量に従って分子を分離する方法としては若干不正確な方法であり 、１０００ダルトンの公称分子量カットオフのフィルターによって除去される正 確な分子量は分子の立体配座に若干依存するので１本願明細書において用いてい る。実際の分子量において１０００ダルトンより大きい分子は１例えば分子が比 較的長くて狭い場合には１０００ダルトンの公称分子量カットオフのフィルター を通過することができる。

第１の画分から第２の画分の分離は公称１０００ダルトンの分子量カットオフの 限外フィルターを介して体液を濾過することによって行うことが望ましい。

限外ｆ液段階又はそれ以後における該因子の調製品の純度はその比活性によって 記載することができる。本願明細書における用語「比活性」は、特定の画分を８ ０Ｍ試験におけるＳＯＭに反応するリンパ球の刺激に使用するとき細胞内の螢光 偏光値を特定の減少度１例えば２０％を与えるのに必要なタンパク質の量の逆数 として定義される。８０Ｍ因子の精製目的は粗Ｐ液に見られる比活性以上に８０ Ｍ因子の比活性を高めることである。従って、精製プロセスは精製された画分の 比活性の決定工程が後に続く。

ここに報告された実施例におけるタンパク質の濃度は望ましくは２２０ｎｍの波 長において紫外線吸光度によって近似的に決定されるだけであシ、かつ因子の線 量−反応曲線は末だ決まっていないから、比活性に関してここに記載された８０ Ｍ因子の各種精製工程のキャラクタリゼーションは近似的のみである。しかしな がら、タンパク質濃度は因子が種々の精製工程を通して移動すると著しく減少す るが。

活性は比較的影響されず、それによって８０Ｍ因子の比活性の増大をもたらすこ とは明白である。にもかかわらず、１ｏｏｏダルトンの公称分子量カットオフの 膜を介した限外濾過が生物流体から全てのタンパク質および大きなペプチドを含 む特定の生物活性をもった分子の圧倒的多数を除去する限り、そのｆ液は実質的 に純粋の一般的な癌関連ＳＯＭ−認識因子から本質的になると記載することがで きる。

一般的な癌−関連８０Ｍ因子の精製における次の段階は、脱塩工程であって限外 濾過から得られた第２の画分が塩類を分離できるクロマトグラフのカラムに負荷 される。カラムに負荷された物質は次に蒸留水でカラムから溶離される。そして クロマトグラフの床体積の約０．３〜０．５倍の間の溶離体積で溶離する部分（ ８０Ｍ因子を含む）を収集する。この工程に使用するカラムは、Ｏ〜約７００ダ ルトンの分画範囲をもったゲル濾過カラム、例えば商品名５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ −１０である。

精製工程の次の段階は大きさに従って再び分離する別のゲイ過工程である。脱塩 工程から得られたＳＯＭ−含有状料は、約１５００〜３０．０００ダルトンの分 画範囲をもった別のゲル濾過カラム、例えば商品名５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０ に負荷される。そのカラムに負荷された物質は次にアンモニウム塩の弱い水溶液 で溶離される。アンモニウム塩は重炭酸アンそニウム、好適には５０ｍＭの重炭 酸アンモニウムが望ましい。クロマトグラフの全床体積の約０．４〜０．６倍の 範囲内の溶離体積で溶離する部分が８０Ｍ因子を含み、収集される。

精製の次の段階は、電荷によって分離する陰イオン−交換クロマトグラフィ一工 程である。前のゲル濾過工程からの８０Ｍ因子含有材料を陰イオン交換カラム（ 望ましくは、ジエチルアミンエチル・セルロース（ＤＥＡＲセルロース））上に 負荷ｆる。カラムに負荷さね、た物質は次にアンモニウム塩の濃度を増してカラ ムから溶離される。そのアンモニウム塩は重炭酸アンモニウムが望ましく、アン モニウム塩の増加濃度は１０ｍＭ〜１．０　Ｍの重炭酸アンモニウムである。約 ０．２８〜０．３１　Ｍの重炭酸アンモニウムでカラムから溶離する画分は８０ Ｍ因子を含み、収集される。

精製の最終段階は逆相高圧液体クロマトグラフ（ＦＬＰ−ＨＰＬＯ）であって、 それは電荷および／または疎水性によって分離する。典型的に、　ＤＥＡＥ−セ ルロースカラム溶出液からの８０Ｍ因子含有材料は寸法が２２０　ｍ　Ｘ　Ｚ　 １０１のＲＰ−ＨＰＬＣ！カラム（商品名Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ−３００）　 　に負荷される。次に溶離は２つの溶媒を組み合せで行い、最初に７０チ水性ア セトニトリル中０．１体積チの水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９０体積チと０ ．０９体積チのＴＦＡＩＯ体積チで体積−てそのアセトニトリルを含有する溶液 の高濃度勾配をつけて行う。全ての出発材料からの８０Ｍ因子は、水性７０％ア セトニトリル中０．１体積チの水性ＴＦＡの２６体積チおよび０．０９体積チの 水性ＴＦＡの７４体積チの溶媒組成において均一ピークとして溶離する、これと は別に、ＦＬＰ−ＨＰＬＯはペックマンの商名名Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　ＯＤ Ｓなる逆相高圧液体クロマトグラフィー・カラムで行うことができる。このカラ ムの場合、溶離は若干具なる溶媒の組合せで行われ、最初に水性７０％アセトニ トリル中０．１体積チの水性トリフルオロ酢酸の７０体積チと０．１体積チ水性 トリフルオロ酢酸の３０体積チ、続いてそのアセトニトリルを含有する溶媒の高 濃度勾配によって行う。８０Ｍ因子はこのカラムおよびこの溶構系を用いる場合 常に、水性７０％アセトニトリル中０．１％水性トリフルオロ酢酸の４３．７体 積チおよび０．１水性トリフルオロ酢酸の５６．３体積チの溶媒組成において均 一ピークとして溶離する。

８０Ｍ因子の使用 ８０Ｍ因子の活性は１次の刊行物に記載さねている一般的な試験方法に従って可 変の潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球に及ぼすその影響によって確認される： 　Ｌ、０ｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｂ、０ｅｒｃｅｋ、　　”Ａｐｐ目ｃａｔｉｏｎ　 ｏｆｔｈｅ　Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｏｆ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ ｔｒｎｃｔｕｒｅｄｎｅｓｓｏｆ　Ｏｙｌｏｐｌａｓｍｉｃ　（ＳＯＭ）　ｉｎ 　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆＭａｌｉｇｎａｎｔ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ：ａ　Ｒｅｖｉｅｗ、”　Ｅｕｒｏｐ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ１３、９０３−９１ ５（１９７７）。　本発明の一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子は、癌患者ドナ ーからの潜在的に反応するリンパ球を上記刊行物に記載されているようＫＳＣ！ Ｍ試験において該リンパ球の刺激に使用すると該リンパ球の細胞内螢光側光値を 著しく下げる。

該刺激されたリンパ球の細胞内螢光偏光値の低下度は、該リンパ球の刺激にＰ液 を使用したときでも実質的に少なくとも２０％、そして最も精製さねたＨＰＬｃ 画分を使用すると５０チ以上である。

これに報告した８０Ｍ試験の適切な実施に既に確立されている２つの方法が重要 である。これらの方法は潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球の単離と、螢光備光 値自身の測定法およびそれらの８０Ｍ試験に意味のある数に変換することである 。これらの方法は次の論議に要約されている。

（１）　　潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球の単離潜在的にＳＯＭに反応する リンパ球の単離は、ａｌｓｏ　ｉｎ　ａ　ｐｒｉｏｒ　ｐａｔｅｎｔ　ａｐｐｌ ｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｂ、　０ｅｒｃｅｋ＆　Ｌ、０ｅｒｃｅｋ、　５ｅｒｉ ａｌ　Ｎｏ、　８３８，２６４．　　ｆｉｌｅｄ　Ｍａｒｃｈ　１０゜１９８６ 、　ｅｎｔｉｔｌｅｄ″Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｂｕｏｙ ａｎｔＤｅｎｓｉｔｙ　５ｐｅｃｉｆｉｏ　Ｃｅ１Ｉｓ　ｆｒｏｍ　Ｄｅｎｓｉ ｔｙ　Ｇｒａｄｊｅｎｔｓ″〇一般的なリンパ球集団からのこれらリンパ球の分 離は、比較的小比率（約２０〜２５％）のリンパ球のみが８０Ｍ試験に反応する ので、８０Ｍ試験の適切な実施に重要である。従って、非分画リンパ球について 試験を行なうことは、８０Ｍ試験において実際に反応できるリンパ球が完全に反 応したときでも。

細胞内偏光値の減少は極小さく観察されることになる。

潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球を単離するために、ドナーから末梢血液試料 を採取してヘパリン添加チューブに収集する。収集後、その末梢血液は鉄粉又は カルボニル鉄粉で処理し、血液と鉄粉の混合体を含有するチューブを磁石の上に 置いて血液試料から鉄粉と共に食細胞を分離する。次にその血液試料の一部を密 度勾配溶液（商品名フィコール−トリオシル（Ｆｉｃｅｌ　１−Ｔｒｉｏｓ口） ）に移して遠心分離によって密度差に基づいた潜在的にＳＣＭに反応するリンパ 球の分離をする。この分離方法は２５℃で１．０８１ｔ／ｃｄの密度と０．３２ ００ｓｒ＋ｙｔ１　の浸透圧を有する密度勾配溶液を使用する遠心分離は２５℃ の温度において５５０Ｘ＃で２０分間行なう。潜在的にＳＯＭに反応するリンパ 球はパスツール・ピペットを使用し密度勾配材料の上に分離された細胞層を除去 することによって回収される。この材料は、試験結果を妨害する種々のより重い 血漿および細胞広分を含むので、密度勾配材料の除去をできる限り避けるように 注意しなければならない。より軽い血漿材料の除去も汚染物質やＳＯＭに反応し ない細胞の試験試料への導入を排除するためにできる限り回避すべきである。

分離の次に潜在的に８ＣＭに反応するリンパ球は。

２．３の洗浄工程、最初は保存剤を含まない０．９％塩化す）　ＩＪウム溶液中 で、次にＤｕｌｂｅｃｃｏの完全リン酸塩緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し て。

８０Ｍ試験法における次の使用のために３７℃に保持する。

球の螢光偏光値の測定方法は次の刊行物に記載されｂｙ　Ｂ、０ｅｒｃｅｋ　＆ 　Ｌ、Ｃｅｒｃｅｋ、　５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　８６７．０７９゜ｆｉｌｅｄ　 Ｍａｙ　２７．１９８６．　ｅｎｔｉｔｌｅｄ″Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒｍｅａｓ ｕｒｉｎｇ　Ｐａ１ａｒｉｚｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｅｍｉｓｓｉｏ ｎｓ”　。

これらの文献に記載されているように、被検者の末梢血液から予め分離さねたＳ ＣＭに反応するリンパ球は３７℃の無菌ガラス管内で既知濃度のマイトジェン、 例えばフィトヘマグルチニン又は本発明の主題である一般的な癌−関連ＳＣＭ− 認識因子のような癌に関係した抗原と共に温度する。コンカナバリンＡおよびア メリカヤマゴボウの根茎マイトジェンのようなフィトヘマグルチニン（Ｐ）ＩＡ ）以外のマイトジェンが使用されてきたが、８０Ｍ試験にはＰＨＡが望ましｂｏ この温＃は、６ｘｌＯ細胞／ａの細胞懸濁液１−に適当に希釈したマイトジェン 又は抗原０．１ｄを添加することによって開始される。

その装置は３０〜６０分間行なう。

温冒されたリンパ球は次に懸濁液中で螢光発生化合物に細胞内で加水分解できる 適当な非螢光化合物（以下螢光発生剤前駆物質と呼ぶ）１例えばフルオレセイ／ ・ジアセテー）（ＦＤＡ）と混和される。

そのフルオロセイン・ジアセアートは、ｐＨ７，４および浸透圧０．３３０ｏｓ 即勾の完全ＰＢＳ中０．２５ｍＭの最終濃度で使用されるそしてアセトン又は氷 酢酸中で調製さねた濃縮貯蔵溶液から希釈される。

対照又は刺激されたリンパ球懸濁液０．２１１１７のアリコートを注射器でＦＤ Ａ基質溶液３１を含有するビーカーにゆっくり注入する。

細胞はＦＤＡに十分な時間（約５分）さらして。

ＰＤＡ基質溶液をリンパ球内に浸透させる。それらの細胞内で、非螢光発生のフ ルオレセイン・ジアセテート分子は酵素加水分解によってフルオレセイン分子に 転化される。

螢光を含有するリンパ球は、励起光の偏光作用に対する発光した螢光の偏光作用 はリンパ球を励起するために使用した面備光の方向に依存しないから、偏光に対 するそれらの反応は等方性である。しかしながら、こねらの測定に使用される従 来の螢光偏光作用測定装置はリンパ球を励起するために鉛直方向に偏光された励 起光を使用しているので、その測定法は鉛直方向に偏光された励起光に関して記 載されている。

鉛直方向に偏光された光の形で励起エネルギーにさらされると、フルオレセイン 分子は螢光を発光する。鉛直方向に偏光された発光と水平方向に偏光された発光 間の関係を測定する。これは、鉛直および水平面における偏光された螢光の強さ を測定し１次の関係に従って偏光値（Ｐ値）を決定することによって行なうこと ができる： 但し、工　およびＸＨはそれぞれ鉛直面と水平面に■ おける偏光された螢光の強さである。セしてＧは使用する特定装置の光学系を通 過する偏光の水平および鉛直成分の不等透過に対する補正係数である。Ｇの値は 、水平方向に偏光された光の強さを８０Ｍ測定用に使用する波長と同一波長の水 平方向に偏光された光で励起されたＰＢＳにおけるフルオレセインの１０　　Ｍ 溶液から放射された鉛直方向の強さで割ることによって決定される。ここで報告 される測定のＧ値は０．４２である。

刺激されたリンパ球、すなわち本発明の一般的なＳＯＭ−関連癌認識因子にさら されたリンパ球のＰ値は同一ドナーからの刺激されないリンパ球の対照懸濁液の Ｐ値と比較される。そして対照リンパ球のＰ値と比較した刺激されたリンパ球の Ｐ値の減少率が癌抗原に対するＳＣＭ−反応の表示である。

ＳＯＭ反応は励起および発光波長のある範囲に渡って観察できるけれども、螢光 発生剤前駆物質としてＦＤＡを使用するときには４７０ｎｍの励起波長と５１０ ｎｍの発光波長を使用することが極めて望ましい。しかしながら、良好な結果は ４４２ｎｍの励起波長と５２７ｎｍの発光波長を使用しても得られ念。

ＳＯＭの螢光測定に利用する分光光度計は高感度で高安定性でなけねばならない 、そして偏光された螢光発光の強さが時間の関数として記録されると共に８０Ｍ 測定におけるフルオレセインの沖合（バルク）濃度がＩＯＭ〜１０　　Ｍの桁の みであるから励起光の強さの変動を補償できなければならない。また、広帯域フ ィルター装置は、ＳＯＭ反応は狭い波長領域内のみで検出されるからＳＣＭの測 定用には適さない。励起モノクロメータ−を４７０ｎｍにそして発光モノクロメ ータ−を５１０ｎｍにセットするとき、励起モノクロメータ−の最大光学的スリ ット幅は２０ｎｍに、そして発光モノクロメータ−の最大光学的スリット幅は１ ０ｎｍにする必要がある。

分光光度計は、偏光された螢光発光が極めて温度依存性であるので熱的に安定に 制御されたキュベツト・ホールダも備えるべきである。さらに分光光度計は螢光 発光の水平および鉛直偏光成分を測定する手段も備える必要がある。

以後示す実施例において我々は熱安定的に制御されたキュベツト・ホールダを備 えたパーキン−ニルマーＭＰＦ−４分光光度計を使用した。測定は全て２７℃で 行なった。光源はキセノン・ランプであった。

螢光偏光作用の測定において、鉛直励起光ビームに対して平行および垂直の発光 強度が自動側光子変換器で交互に約６分間、又は鉛直方向に励起する光ビームに 垂直の発光強度が記録計の全スケール振れの８０〜９０％になる１で記録される 。

細胞からのフルオレセインの漏れおよび基質溶液におけるフルオレセインのパッ クグラウンドに対してこれらの読み値を補正する必要がある。この補正を行なう ために、細胞は適当なフィルター・ヘッドに取り付けた穴径０．２２μｍのニト ロセルロース・フィルター上で溶液からｒ過される。同一の螢光偏光作用測定装 置を使用して、励起光に平行および垂直な螢光が得られる。次に細胞の補正フル オレセイン強度はｆ過のハーフタイムに外挿した全螢光強度からＦ液より得られ た値を差引くことによって得らねる。この外挿は、細胞からのフルオレセインの 漏出およびＦＤＡの自然加水分解のため温度中にパックグラウンドが高くなるの で必要である。

これとは別に、　０ｅｒｃｅｋｓの先細特許出願（ＳｅｒｉａｌＮｏ、８６７． ０７９．　ｆｉｌｅｄ　Ｍａｙ　２７．１９８６．　ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｍｅｔ ｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｐｏ１ａｒｉｚｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃ ｅｎｃｅＥｍｉｓｓｉｏｎｓ″）に記載されているバッググラウンドの螢光補償 方法を用いることができる。要約すると。

この方法は５１つ以上の波長で水平および鉛直方向に偏光された螢光発光を測定 しそれらから細胞内の螢光発光を計算することによって各試例をｆ過する必要を なくしている。

前記のプロトコールに従って、６Ｘ１０　　細胞／Ｎのリンパ球懸濁液１．０　 ｍとマイトジエ／又は抗原０、１　ｒＬｌ、螢光発生剤先駆物質としてＦＤＡを 使用し。

４７０ｎｍの励起波長と５１０ｎｍの発行波長を使用して行った８０Ｍ試験をこ こで「標準８０Ｍ試験」一般的な癌−関連５０Ｍ因子（その精製法をここで記載 する）は、癌の検出のために８０Ｍ試験において有効な刺激剤として使用される 。従って、癌に侵すｆｌでいないドナーからの細胞は、８０Ｍ試験において刺激 剤として使用する癌抗原によって刺激されたときＳＣＭ反応に著しい変化を示さ ないが。

癌に侵されているドナーの細胞はＳＣＭ反応に著しい変化を示す。この変化は、 癌に侵されているドナーの細胞が癌−関連抗原で刺激されるときにＰ値の減少と して見られる。説明したように、８０Ｍ因子は検出さね、る癌の種類に関して特 定的でな（，８０Ｍ試験において８０Ｍ因子で刺激さｆ１＊！ｊンパ球は。

８０Ｍ因子がくる体液のドナーと同種の癌をもったドナーからくる必要はない。

８０Ｍ試験に刺激剤として使用したとき、　ＳＣ！Ｍ因子はＰ値を少なくとも１ ０チ、場合によっては４４．６％も減少させる。Ｐｓが刺激されたリンパ球のア リコートのＰ値であＦ）、Ｐｃが８０Ｍ因子で刺激されなかったリンパ球の了り フートのＰ値であるとすると、約０．９以上のＰ　ｓ　／　Ｐ　ｃの比は刺激さ れたリンパ球のドナーの体に悪性腫瘍が存在することを示す。

８０Ｍ試験において刺激剤として８０Ｍ因子を使用する望ましい方法は、Ｐｓと マイトジェンと接触されたリンパ球のもう１つのアリコートの螢光偏光（作用） 値ＰＭとを比較してＳＯＭ反応比、　ＲＲ８ｏＭを決定することからなる。ここ で ”　Ｒ８０Ｍ　＝　Ｐｓ　７２Ｍ 約０．９以上のＦＬＲはリンパ球のドナーに悪性腫ＣＭ が存在していることを示す。

２癌の管理における使用 一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子はキラー・リンパ球の生体内枚重に対して癌 細胞の防御に参加すると考えらね、るから、当然の帰結として８０Ｍ因子の生体 内活性を選択的に下げる手段は癌細胞のキラー・リンパ球による枚重を受は易さ を増すことによって癌の管理に有用にすることができる。「生体内活性ｊとは、 ｓｃＭ−認識因子の悪性腫瘍へのキラー・リンパ球の細胞毒性を下げる能力を意 味する。

かかる方法の第１の工程として、一旦既知又は疑のある癌患者のリンパ球が８０ Ｍ試験において刺激剤として一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子で陽性反応があ ることが示されたら、体液の試料を患者から採取し、１０００ダルトンの公称分 子量カットオフのフィルターに通し、フィルターを通過する画分を収集し、８０ Ｍ試験における同一の患者からのリンパ球の刺激に使用してその画分に癌−関連 ＳＯＭ−認識因子の存在を確認する。特に、他の臨床表示装置が癌の存在を示す 場合には、この試験を常に行なう必要はない。

癌患者の体液に８０Ｍ因子の存在が一旦示される又は推断されたら、その体液は 因子の生体内作用を下げる方法により因子を選択的に不活性にさすことによって 処理することができる、そして次にその体液は患者に戻すことによって患者の癌 に対する抵抗を高めることができる。一般的な癌−関連８０Ｍ因子は患者を苦し める癌の種類に関係なく８０Ｍ試験での反応を与走るから、当然の帰結として８ ０Ｍ因子の生体内作用は最初に診断された特定タイプの癌のみならず、後で発生 する恐れのある別のタイプの癌に対しても患者の抵抗を高めることができる。こ れは、免疫抑制作用のある薬剤で患者を治療したとき、又はエイズのような状態 のために既に弱体化した免疫系をもった患者を治療するときに意義がある。

体液が末梢血液の場合、８０Ｍ因子の生体内活性を下げる１つの方法は、末梢血 液を透析して１０００ダルトン以下の見掛は分子量をもったペプチドを除去する （因子ｌｌ：ｃ１０００ダルトンの公称分子量カットオフする限外フィルターを 通過できるから）ことによってそれを物理的に除去する方法である。

体液における８０Ｍ因子の生体内活性を下げるもう１つの方法はそれをその因子 に特定の抗体によって中和又は不活性にする方法である。８０Ｍ因子はポリリシ ンおよび複合体に調製される抗体のようなより大きな担体分子に共有結合させる ことができる。

かかる抗体が一旦調裂されたら、従来の方法を用いて抗体形成細胞を単離しハイ ブリドーマとの細胞融合によってモロクローナル抗体を生成する。ポリクローナ ル又はモノクローナルの抗体が一旦形成されたら、それを８０Ｍ因子の中和に使 用することができる。

これとは別に、一旦抗体が形成されたら、それをタンパク質加水分解酵素パパイ ンで一価のＦａｂフラグメントに切断することができる。かかる切断によって生 成された各フラグメント分子は、因子の異なる２つの分子を結合する部位を有す る処女抗体と対照的に因子の１つの分子だけを結合することができる。大きな因 子−抗体複合体の形成が望ましくない場合には、フラグメントρ使用は用途によ って処女抗体を使用することが望ましい。末梢血液にかかる大きな抗原−抗体複 合体の存在は血清の病気および他のアレルギー反応をもたらす可能性がある。

３、８　ＣＭ因子に対する抗体のさらに別の使用癌の管理において生成した抗体 をＳＣＭに使用するさらに別の方法は、抗癌物質を癌の部位へ向けることに癌の 部位における抗癌物質の有効濃度を高めるために、抗癌活性をもった物質を抗体 に付加することである。この方法は、抗癌物質が大量投与時に副作用を起すもの であるときに特に有利である。

抗−８℃Ｍ抗体は、放射線免疫検定法、螢光免疫検定法又は酵素−結合免疫吸収 検定法のような方法。

又は比濁分析法のような沈殿検定法（８０Ｍ因子が一価の抗原でないと仮定した 場合）によって末梢血液又は他の体液中の８０Ｍ因子の水準の決定にも使用でき る。８０Ｍ因子がなんらかの方法で癌細胞と物理的に会合すると仮定すると、螢 光染料や放射性同位元素のような画像診断物質で標識化した抗体は。

癌細胞が生検において検出できるように癌細胞の画像診断に使用することもでき る。また、螢光標識化抗体は流動細胞計測法によって癌細胞の自動検出用に使用 できる。

実　　　施　　　例 次の実施例は８０Ｍ因子、その単離および精製。

並びにその使用方法を説明する。しかしながら１次の実施例は説明のためだけで あって限定のためでないことを理解されたい。

製 活性癌、倒置ば乳房、肺、結腸、卵巣、頚、子宮。

喉頭又は皮膚（基底細胞癌および悪性黒色腫）の癌を有すると陽性診断された患 者の血液試料をベパリンを添加したガラスびん（例えば、商品名Ｖａｃｕｔａｉ ｎｎｅｒ）に収集した。そえらの血液試料の２０１１Ｊずつを約１ｚｏｏｘｐで 約４０分間遠心分離した。沈降した血球の上の血漿を収集して、１００００ダル トンの分子量カットオフの多孔質膜フイルタ−（例えば。

商品名Ａｍ１ｃｏ　Ｕ　Ｍ　２又はＹＭ２フィルター）に圧力を加えてｆ過した 。これらのＰ液は、さらに精製するまで凍結乾燥又は４℃で貯蔵した。

実施例２　：　初精製ＳＣＭ因子の試験実施例１の各試料からの限外Ｆ液のアリ コートは、同一ドナーから得た潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球および前記８ ０Ｍ試験に従ってそれらのＳＣＭ反応を検査したリンパ球と共に装置した。いず れの場合においても、限外ｆ液はＳＯＭに反応するリンパ球に特徴的に反応して Ｐ値を減少させた（第２表参照） 第　　　２　　　表 実施例１の限外ｆ液の８０Ｍ活性 悪性黒色腫　　　悪性黒色腫　　　　７５７悪性黒色腫　　基底細胞癌　　　　 ＳＺＯ喉　　頭　喉頭癌　　６２−９ 乳　　　　　癌　　　乳　　　　癌　　　　　７６．０第２表のデータは、粗限 外ｆ液に存在するときでも、８０Ｍ因子は癌患者からのＳＣＭに反応するリンパ 球のＰ値の減少をリンパ球が癌にかかった組織の粗抽出物又はその組織自身によ って刺激されるときに見られるＰ値の減少に少なくとも等しくさせた。

限外ｆ液による刺激でのＰ値の減少は少なくとも１０チ（それは該ＳＯＭ陽性反 応の特徴である）であつた。しかしながら、８０Ｍ因子は公称５００ダルトンの 分子量をカットオフするフィルター（商品名Ａｍ１ｃｏｎ　ＵＭＯ５）　　を通 過しなかった。これらのデータは、活性が単一のアミノ酸のような小分子よシ大 きいことを示しながら、因子の小サイズを立証している。

実施例１の試料からの凍結乾燥粉末を注入すために無菌の保存剤を含まない水２ ｄに溶解させた。この段階で、調製品の８０Ｍ活性を確認した。そして同一タイ プおよび部位の癌をもったドナーからの活性試料をプールした。プールした試料 は０〜７００ダルトンの分画範囲を有する商品名５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０な る０、９ｘ１８ｃｒｎカラム上で脱塩した。カラムのクロマトグラフ実験毎の試 料体積はカラム容積の２５チを越えなかった。溶離は２重蒸留水で８〜９ｃｒＩ Ｖ′ｈｒの直線溶離速度で実施した。脱塩は室温（２１〜２３℃）で行なった。

クロマトグラフ床の全容積の０．３〜０．５倍の間で溶離する１ｄの画分を集め て１画分の光学密度を決定した。８０Ｍ活性は最初の溶離ピーク内に含まれた。

そのピークに８０Ｍ活性が存在することは８０Ｍ試験によって確認された。乳癌 患者の血漿から最初に得た限外Ｐ溶から調製された最初の溶離ピークのアリコー トは、乳癌患者からのすンパ球のＰ値を８０Ｍ試験における対服値の８６．３チ に減少させた。これは８０Ｍ活性の存在を示す。

こねらの画分は収集して凍結乾燥した。

その溶離液はさらに商品名５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０なるゲルｆ過方ラム（こ れは１５００〜３０，０００ダルトンの分画範囲を有する）で分画することによ ってさらに精製した。凍結乾燥し脱塩した試料は５０ｍＭのＮ　Ｈ４ＨＣＯｓに 溶解させ、０．９ｘ１８ｃｒｎの５ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム上でカラム容 積の５％以下に負荷させ。

３　ｃｍ　／　ｈｒ　　の溶離直線速度であった。溶離は室温で行った。そして クロマトグラフの床容積の０．４〜０６倍でカラムから溶離する１１の画分を収 集した。これらの画分け８０Ｍ活性を試験した。こわらの試験結果は実施例４に 示す。ＳＣＭ−活性の画分け。

８０Ｍ試験における画分の試験後に１−の画分の光学密度によって決定した最初 の溶離ピーク内に含まれた。

一旦それら画分の８０Ｍ活性を試験したら、同一の癌からの活性画分はプールし て凍結乾燥した。

さらに精製するために、凍結乾燥した試料は１０ｍ　Ｍ　　Ｎ　Ｈ４ＨＣＯｓに 溶解させて商品名ワットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ　）　ＤＥ−５２なる微粒ＤＥ ＡＥ−セルロースの０．８ｘ２６ｃｒｎカラムにカラム容積の４％以下に負荷さ れた。そのカラムは１０ｍＭの水性Ｎ　）１４　ＨＣ０ｘ１Ｑｉｕで、１０ｍＭ からＩＭのＮ　Ｈ４）（００ｍまで０１０８チ／分濃度を上げて洗浄した。１ｄ の画分を収集して、各画分について２２０ｎｍの波長における光学吸収を決定し た。その光学吸収に基づいて、全クロマトグラフ床容積の４．５〜４．７倍でカ ラムから溶離する活性画分を試験およびさらに精製するためにプールして凍結乾 燥した。

第３表は、最初に種々のタイプの癌をもったドナーから実施例３の５ｅｐｈａｄ ｅｘ　Ｇ−５０画分のアリコートを８０Ｍ試験において使用してドナーからのり ンノ々球の刺激をしたときの結果を示す。潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球は それらが前に特徴付けられた癌−関連抗原したと同じ特徴的な反応をＧ−５０画 分に示すことがわかる。この脱塩した部分的精製のタンパク質を含む材料は、結 果を第２表に示した粗限外ｆ液と比較して一般に高いＳＣＭ反応を示す。

この高いＳＯＭ反応は減少したＰ値によって示される。

第　　　３　　　表 実施例３の５ｅｐｈａｄｅｘ　（）−５０画分のＳＣＭ活性肺　　　　癌　　　 乳　　　　癌　　　　　　　　７３．０肺　　　　癌　　　頚　　　　癌　　　 　　　　　６９．６肺　　　癌　　気管支径　　　　　７３．６喉頭癌　気管癌 　　　７７．６ 乳　癌　気管癌　　　８０．２ 結　腸　癌　　　乳　　　　癌　　　　　　　　６３．５喉頭癌　乳　癌　　６ ３．０ 悪性黒色腫　　悪性黒色腫　　　　　　７４．９健康なドナー　　　悪性黒色腫 ９９゜３健康なドナー　　　結　腸　癌　　　　　　　９８．０結腸炎　　結ｈ ＠！ｉ９８．９ ｇ４表Ｕ、ＤＥＡＥ−セルロースを介して精製後に種々のタイプの悪性腫瘍をも ったドナーから得た８０Ｍ因子を使用して種々のタイプの悪性腫瘍のドナー又は ８０Ｍ試験において悪性腫瘍のないドナーから単離され九すンノく球を刺激した ときの結果を示す。予想されるように、癌患者からの１ノンノ（球はＤＥＡＥ− セルロース・カラムから精製されたｓｃＮ＋因子に反応してＰ値がかなり減少す るが、悪性腫瘍のないドナーのリンパ球はそのようなＰ値の減少を示さなかった 。

、第　　４　　表 実施例３のＤＥＡＥ−セルロース画分のＳＣＭ活性乳　　　　　癌　　　乳　　 　　　癌　　　　　　　６Ｌ２乳　　癌　気管支炎　　　６９．５ 乳　　　　　癌　　　頚　　　　　癌　　　　　　６９．０基底細胞皮膚癌　　 　基底細胞皮膚癌　　　　　　ＳＺＯ健康なドナー　　結　腸　癌　　　　　９ ８．６胆の　う　炎　　悪性黒色腫　　　１００．０尿　　道　　炎　　　頚　 　　　　癌　　　　　　９９．８虫　　垂　　炎　　　結　　腸　　癌　　　　 　　９８０良性乳房戊長　　　乳　　　　癌　　　　　９７．０良性下垂体腺腫 　　　脳　　　　癌　　　　　１’　８０．０実施例４のＤＥ−５２一般的帰一 関連ＳＣＭ−活性画分は次に再構成し、Ｚ　１　ｍ　ｘ　２２　ｃｒｎＨＰＬｃ カラムを使用して逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＯ）　によっ て均一に精製した。そのカラムは商品名Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ−３００（７ミ クロン）を充てんした。ＲＰ−ＨＰＬＣの精製に使用された移動相は次の通りで あった： 相Ａ：０．１体積チの水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。

相Ｂ：水性７０チアセトニトリル中０．０９体積チの水性ＴＦＡ。

凍結乾燥したＤＢ−５２のＳＣＭ−活性画分は注入のために無菌水（保存剤を含 まず）で再構成し竜２５０μｔのアリコートをＲＰ−ＨＰＬＯカラムに注入した 。移動相の流量は５０μｔ／分であったそしてその組成プロフィールは相Ａの９ ０体積チ、相Ｂの１０体積チの１０分１次に３体積チ／分の速度で相Ｂの直線的 増加３０分であった。２２０ｎｍの波長における光学吸収によって検出された光 学密度ピークは、「ナノボア（ｎａｎｏｂｏｒｅ）Ｊテフロン・チューブを介し て１．５コの円すい形のプラスチックエペンドルフ遠心分離チューブの中に手で 収集された。そして溶媒は真空遠心分離機内で蒸発させた。全ての場合に、一般 的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子は相Ｂの７４体積チでカラムから溶離した。

実施例６　　：　　８０Ｍ因子の別のａｐ−ＨｐＬｃ精製別に、８０Ｍ因子は、 ベックマン・インスツルメンツ社販売の商品名Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　ＯＤＳ 　（５ミクロン）を充テｉ’ｖ　Ｌ　ｆＣ４，６ｗａ　ｘ　２５　Ｃｒｎ　ＨＰ ＬＯカラムと実施例４のＤＥＡＥ−５２８ＯＭ−活性画分を使用してＨＰＬＯを 行なうことによって精製することができる。このカラムで使用された移動相は次 の通シであった：相Ａ：０．１体積チの水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。

相Ｂ：水性７０％アセトニトリル中０．１体積％ＴＦＡ。

アクアボア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）　　カラムに関して移動相の流量がｘ、ｏｏｍ ／／分であったこと、およびその組成プロフィールが相Ａの７０体積％、相Ｂの ３０体積チの５分、続いて３．５体積％／分の流量で相Ｂの直線的増加の２０分 であったことを除いて、このカラムで同一の一般法に従った。光学密度ピークは ２２０ｎｍで検出し、ケイ素化ガラス試験管の中に手で収集し、その溶媒は真空 遠心分離機内で蒸発させた。このＨＰＬＣ系を使用したとき全ての場合に、頚の 鱗状細胞癌、乳腺癌、気管支線癌、および悪性黒色腫を含む１９種の癌からの一 般的癌一関連ＳＯＭ認識因子の精製は常に活性の単一光学密度ピークを生じ。

相Ｂの５６．３体積チで溶離した。

実施例６においてＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅカラムでＦＬＰ−ＨＰＬＯによって単 離されたペプチドの８０Ｍ活性試験のために、ペプチドは注入のため保存剤を使 用することなく無菌水で再構成した。これらの試料で製置後。

ＳＯＭ−反応リンパ球の８０Ｍ活性を第５表に示す。

この画分け、癌患者からのリンパ球の刺激に使用したとき偏光作用値に最大の減 少を示す。８０Ｍ因子の３つの調製品の２つが他の画分で値よシ著しく低い４０ チ以上もの偏光作用値の減少を示した。精製された因子は予想の通シ使用したリ ンパ球のドナーを苦しめる癌のタイプに関して非特定的であった。

また、精製された因子は健康なドナーからのリンパ球の刺激に使用したとき反応 を示さなかった。

実施例６０ＲＰ−ＨＰＬＯ画分のＳＣＭ活性乳　　　　癌　　　　乳　　　癌　 　　　　　　　　５８．９乳　　　　癌　　　　肺　　　癌　　　　　　　　　 ５７．３結腸癌　乳　癌　　　５５．４ 乳　　癌　　気管支癌　　　　　　６８．０健康なドナー　　　　乳　　　癌　 　　　　　　　　９９．８健康なドナー　　　　肺　　　＠　　　　　　　　　 １０１．０実施例８　　　：　　　８０Ｍ因子からのＳＣＭ−活性トリプシン・ １６個のアミノ酸長いトリプシン（ｔｒｙｔｉｃ）　　フラグメントは実施例５ の精ｆｆｓＣＭ因子から単離した。

このフラグメントはより大きいペプチドの全８０Ｍ活性を有することを示し、自 動式エドマン分解法によって配列を決定した。精製された８０Ｍ因子のトリプシ ンでの切断および活性フラグメントの精製は次の方法によって行った： 凍結乾燥中のペプチドの吸収損失を防ぐために。

８０Ｍ因子をＨＰＬＣ溶出液の存在下でトリプシンで消化させた。トリプシンの 消化は１０重量％のトリプシンを使用して３７℃において２４時間０．１　Ｍの トリス−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ＝８．３）中で行った。

消化物は０．１体積チの水性トリフルオロ酢酸で４倍に希釈した、そしてミクロ フローＨＰＬＯ分離装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　　に注入 した。トリプシン・フラグメントはアクアボアＲＰ−３００コラム（２０００ｘ 　２．　Ｉ　Ｎ罵）を使用して分離した。それらフラグメントの溶離のために、 移動相の溶媒は次の通シであった： 相Ａ　：　０．１体積チの水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）相Ｂ：水性７０％ア セトニトリル中０．０９体積チのＴＦＡその移動相の流量は５０μｔ／分、そし てその組成プロフィールは１０分の９６体積チの相Ａ、４体積チの相Ｂ、続いて ３体積チ／分の割合で相Ｂの３０分の直線的増加からなる直線的溶離勾配であっ た。

ＳＣＭ−活性トリプシン・ペプチド・フラグメントは相Ｂの６９．６体積チおよ び相人の３０．４体積チ（全体積は約３０μｔ）で溶離した。

第６表は、８０Ｍ試験における刺激剤として実施例１，３および６から種々の精 製段階における一般的な癌−関連ＳＯＭ−認識因子の調製品を使用することによ って得られた結果を要約する。多くの異なる悪性腫瘍に苦しむドナーのリンパ球 を８０Ｍ試験において本発明の因子と共に使用したとき、全ての場合に著しい反 応が見られた。この反応を第６表にその因子と製置しなかった同一のリンパ球に ついてｓ　ｃ　ｂｉ測測定行なうことによって得られた対照偏光値のチとして示 す。その値が小さくなる程、８０Ｍ試験における因子に対する反応は大きくなる 。試験した因子の最も粗い調製品でも、限外Ｆ液は１８．０チ〜３７．ｌチの偏 光値の減少を示し、ＦＬＰ−ＨＰＬＯで精製した最も高精製画分は４４．６％と 偏光値の大きな減少を示した。本発明の因子は特異であって。

癌患者のリンパ球を刺激するために使用したときのみ偏光値の減少をもたらす。

Ｒ，Ｐ−ＨＰＬＣ精製画分でも健康なドナーのリンパ球の刺激に使用したとき偏 光値の減少をもたらさなかった。

第６表 種々の糖果段階における８０Ｍ活性の例（実施例９）Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５ ０画分　　　　　　　１９．８−３７．０ＤＥ−５，２七にロース画分　　　　 　　　　１８．０−３１．０ＲＰ−ＨＰＬＯ画分　　　　　　　　　　３１０− ４４．６健康なドナー又は悪性腫瘍でない病気のドナーからのリンパ球に試験し たとき、いずれの画分も活性を示さなかった。

その精製を実施例８に記載したトリプシン・ペプチドは標準８０Ｍ試験において 完全活性である。約５Ｘ１０ｆＰのこのフラグメント（すなわち、５×１０　？ 、又は１６．　ＯＯ０分子のフラグメント）は試験において完全活性を示した。

そのフラグメントを肺癌患者から単離したとき、それは８０Ｍ試験において小さ な細胞肺癌患者のリンパ球に試験したとき活性を立証し、第７図に示すように乳 腺癌患者のリンパ球と完全に交差反応した。しかしながら健康なドナーのリンパ 球を使用したとき反応は見られな肺癌の実施例８におけるトリプシン・フラグメ ントの８０Ｍ活性小細胞肺癌　　　　　　　　　７０．０　　：　　６８．０乳 腺癌　　　　６７．５　：　６８．０健康なドナー　　　　　　　　　　１０１ ０：　　１０４．０次の実施例は、異なるタイプの癌患者から得たリンパ球の刺 激に使用したとき８０Ｍ試験における８０Ｍ因子の反応能力を示す。この交差反 応性を示すために、癌患者からの多数の血液試料の各々から２　ｍｌの細胞を含 まない血漿を得た。その血液試料はに収集された。それらの試料は１０００ダル トンの公称分子量カットオフのフィルター（商品名（ＡｎｉｃｏｎＵＭ２又はＹ Ｍ２）を通して少なくとも１２時間限外ｆ過し、４℃で無菌状態下に貯蔵した。

癌患者、健康なドナーおよび非悪性腫瘍患者のヘパリン添加血液試料から潜在的 にＳＯＭに反応するリンパ球を単離した。限外ｆ液を含有する一般的な癌−関連 ＳＣＭ−認識因子の活性および癌特異性を試験する念めに、潜在的ＶＣ８ＣＭに 反応するリンパ球（５ｘｌｏ細胞／ＭｌｉｎＰＢＳ）の０．７５ｊ！／７リコー トをその限外Ｐ液と共に３７℃において４０分間温装置た。０．０７５１７の限 外ｆ液はそれぞれの検定法に使用した。ＳＣＭの測定は次の刊行物に既に記載し たように行った：　Ｌ、０ｅｒｃｅｋ　ａｎｄ　Ｂ、０ｅｒｃｅｋ。

“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｏｆ　Ｃｉ ｈａｎｇｅｓ　１ｎｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｄｎｅｓｓ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｐ ｌａｓｍｉｃ　Ｍａｔｒｊｘ（ＳＣＭ）ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏ ｆ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　：　ａＲｅｖｉｅｗ、　”Ｅｕ ｒｏｐ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１３．９０３−９１５（１９７７）ａｎｄ　ｉ ｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｏｒ　ｐａｔｅｎｔ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｂ。

０ｅｒｃｅｋ　ａｎｄ　Ｌ、Ｃｅｒｃｅｋ、　５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、８６７．０ ７９．　ｆｉｌｅｄＭａｙ　２７．１９８６．　ａｎｄ　ｅｎｔｉｔｌｅｄ″Ｍ ｅｔｈｏｄ　ｆｏｒＭｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｐｏ１ａｒｉｚｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｃｅ　Ｅｍｉｓｓｉｏｎｓ、”８０Ｍ検定において、細胞内螢光偏光作用 値（Ｐ値）の少なくとも１０％の減少は、刺激用限外ｆ液の陽性反応とした。

第８表のデータが示すように、８つの異なる癌タイプの患者からの潜在的にＳＣ Ｍに反応するリンパ球は９つの異なる癌タイプからの一般的な癌−関連ＳＯＭ− 認識因子を含有する限外Ｐ液に反応する。

これと対照的に、健康なドナーおよび癌でない病気のドナーからの限外Ｆ液は陽 性のＳＣＭ反応を示さなかった。また、健康なドナーからの潜在的にＳＣＭに反 応するリンパ球も非悪性状態のリンパ球も８０Ｍ試験においていずれの限外Ｐ波 に反応しなかった。

飾 ８０Ｍ因子との温度によって悪性腫瘍を含まないリンパ球のＳＯＭ反応を修飾す るためにｓ　ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　ａｒｔｉ ｃｌｅ、　５ｕｐｒａ、および１９８６年３月１０日付は出願第８３８．２６４ 号（Ｂ、　０ｅｒｃｅｋ）に記載されているように、潜在的にＳＣＭに反応する リンパ球を健康なドナーの血液試料から単離して、ダルベツコの完全リン酸塩緩 衝化塩類溶液（ＰＢＳ）に５×ｌＯ細胞／　ｊｊｌで懸濁させた。これら細胞の アリコートは次の（ａｌ〜（ｈ）の３ゴ中に温度した＝（ａ）癌患者からの細胞 を含まない血漿：（ｂ）１０００ダルトンの分子量カットオフのＡｍ１ｃｏｎ　 　Ｕ　Ｍ　２フイルターを通して１２時間限外濾過した癌患者からの血漿＝（ｃ １５００ダルトンの公称分子量カットオフのＡｍ１ｃｏｎ　０Ｍ５　　フィルタ ーを通して１２時間限外濾過した癌患者からの血漿：（ｄ）脱塩又は５ｅｐｈａ ｄｅｘ　ＣＴ−１０カラム・ステージを介して精製された一般的な癌−関連８０ Ｍ因子：　（ｅ）Ｓｅｐｈｄｅｘ　Ｇ−５０カラム−ステージを介して精製され た因子：　（ｆｌ　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロース・カラム工程を介して精製され た因子：　（ｇｌ　ＲＰ−ＨＰＬＯ工程を介して最終的に精製した因子：および （ｈ）　１００００ダルトンの公称分子量カットオフのＡｍ１ｃｏｎ　０Ｍ２　 フィルターを介して限外濾過された健康なドナーからの血漿。これらの温度け２ ５時間行った。

健康なドナーからのリンパ球のＳＣＭ反応を修飾する８０Ｍ因子の能力は、前記 の画分の各々との温度の前後にリンパ球のＳＣＭ反応比（ＦＬＲ８０Ｍ）を決定 することによって示した。ＲＲの決定をする８０Ｍ ためにマイトジェン又は８０Ｍ因子と接触させる前に、装置した細胞を十分に洗 浄した。修飾の存在又は不在は、植物凝集素（ＰＨＡ）との短接触期間後のリン パ球懸濁液の偏光作用値と８０Ｍ因子を含有する基質との短接触期間後のリンパ 球懸濁液の偏光作用値との比によって決定された。８０Ｍ試験法に従って、１． ０以下のＲＲはドナーに悪性腫瘍が８０Ｍ 存在する陽性表示であり、一方１．１以上のＲＲ８ＣＭは悪性腫瘍の存在しない ことを示す。

第９表 健康なドナーからのリンパ球のＳＯＭ反応の８０Ｍ因子による調節（実施例１２ ） 細胞を含まない癌血漿　　　　　　　　　　　　　１．３Ｂ　　　　０．８０Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０（ＳＯＭ−活性）　　　　　　　　　　１．４０　　 　０．８０Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（ＳＣＭ−活性）　　　　　　　　　　 １．３８　　　０．７３ＤＥＡＥ−セルロース（ＳＣＭ−活性）　　　　　　　 　　　　　１．３９　　　０．７０ＲＰ　−ＨＰ　ＬＣ（ＳＯＭ−活性）　　　 　　　　　　　　　　　１．４０　　　０．６５第９表は、　ＲＲに反映される ように、ＳＯＭＣＭ 因子又は植物凝集素に対するリンパ球の反応に及ぼすＳＯＭ因子含有画分との温 度の影響を示す。前温度しなかったリンパ球、又は公称１０００ダルトンの分子 量カットオフのフィルターを通して濾過された健康なドナーからの限外ｆ液と前 温度されたリンパ球、又は公称５００ダルトンの分子量カットオフのフィルター を通して沢過された癌をもったドナーからの限外Ｆ液と前装置されたリンパ球は 予想通り１．３５以上のＲＲを示した。一方、ＳＯＭ因子ＯＭ を含有する画分と前装置されたリンパ球は全て、ＲＲ８Ｃ！Ｍの値を悪性腫瘍の 患者から最初に単離されたリンパ球の特徴である０、６５〜Ｏ，Ｓ　ＯＯ値に減 少悪性腫瘍細胞への潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球の自然細胞毒性に及ぼす ８０Ｍ因子の影響を示すために健康なドナーから得られたかかるリンパ球を癌患 者の血液試料から前に記載したように単離した８０Ｍ因子を含有する血漿と共に ３７℃で２５時間温装置た。また、これらのリンパ球のアリコートは対照品とし て保持して温室しなかった。さらに。

潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球は癌をもったドナーから得て、同様に（ある アリコートは８０Ｍ因子を含有する血漿と共に温室し、別のアリコートは対照品 として保持して温室しなかった）処理した。

製置後、リンパ球の細胞毒性は刊行物（Ｍ、　Ｒ。

Ｐｏｔｔｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｍｏｏｒｅ＋　”Ｎａｔｕｒａｌ　Ｃｙｔｏｘｉ ｃ　Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　５ｕｂｐ ｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ、　’　Ｉｍｙ＋ｕｎｏｌｏｇｙ３７、１８７−１９４（ １９７９））に記載された方法に従って試験した。この公開された方法に従って 、検定のための標的細胞として　Ｏｒ　　で標識化したに５６２のヒトの骨髄細 胞系を使用した。エフェクター細胞として潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球を 使用した。

標的細胞／エフェクター細胞の比は１／２０であった。　Ｃｒ　　の放出は、エ フェクター細胞が標的細胞に有毒であることを示す。細胞毒性のチは次のように 決定される： 但し、上式のＲ８は試料における　Ｏｒ　　の放出チ、Ｒｏは対照品における　 ｃｒの放出チ、そしてＲＴは洗浄剤（商品名Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−Ｚｏｏ　　）の 存在下での５１Ｃｒ　の放出チである。それらの結果を第１Ｏ表に示す。これら の結果は、健康なドナーからの潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球の公称１００ ０ダルトンの分子量カットオフのフィルターを通してＦ遇された限外ｆ液との温 室はそれらの細胞毒性を９０％以上壕で低下させたことを示す。そのｍ置を癌患 者からの潜在的ＫＳ　ＣＭに反応するリンパ球と行ったとき、細胞毒性の低下は ４０〜９０％と少なかった。

しかしながら、かかる癌患者のリンパ球は製置前の細胞毒性はよシ低かった、そ して限外Ｐ液との温室後に残る細胞毒性の残留水準は健康なドナーのリンパ球の 温室後に残る値に四速した。癌患者の細胞に存在する細胞毒性の低い水準（１１ 本発明の一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子のような因子に生体内でさらすこと によってもたらされた細胞毒性の低下と一致した。

第　　１０　　表 に５６２のヒトの骨髄細胞系に対する自然リンパ球に以上、望ましい実施態様に 関して本発明の詳細な説明したが、他の実施態様も可能である。従って請求の範 囲の意図および範囲はここに記載した望ましい実施態様の記載に限定されるもの ではない。

国際調査報告 国際調査報告 ＰＣＴ／υ５　ｇ９１００９６１

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. １．公称１０００ダルトンの分子量をカットオフするフィルターを通過し公称５ ００ダルトンの分子量をカットオフするフィルターによって保持される低分子量 のペプチドから本質的になり、標準ＳＣＭ試験により測定した場合に癌に苦しめ られているドナーからのＳＣＭに反応するリンパ球の細胞内の螢光偏光作用値を 少なくとも１０％減少させることを特徴とする、実質的に純粋な一般的な癌−関 連ＳＣＭ−認識因子。
2. ２．実質的に均一に精製された請求の範囲第１項記載の因子。
3. ３．実質的に、Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｒ２−Ｐｈｅ−Ｒ３− Ｍｅｔ−Ｒ４−Ｒ６−Ｒ６−Ｒ７〔但し、Ｒ１はＡｓｎとＧｌｎからなる群から 選び、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立にＶａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅか らなる群から選び、Ｒ５はＡｓｐとＧｌｎからなる群から選び、そしてＲ６とＲ ７はそれぞれ独立にＡｓｎとＧｌｎからなる群から選ぶ）の配列を含む少なくと も１３個のアミノ酸残基を有するペプチドのみからなることを特徴とする一般的 な癌−関連ＳＣＭ−認識因子。
4. ４．前記因子が悪性腫瘍を含まないドナーから得たＳＣＭに反応するリンパ球と 接触されたときに、リンパ球がＳＣＭ試験において癌−関連抗原に反応するがマ イトジエンには反応しないところのＳＣＭに反応するリンパ球のＳＣＭ反応を修 飾する性質を有する請求の範囲第３項記載の因子。
5. ５．ヒトの骨髄細胞系Ｋ５６２ヘの潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球の自然試 験管内毒性を５１Ｃｒの放出で測定した場合少なくとも９０％低下させる性質を 有する請求の範囲第３項記載の因子。
6. ６．（Ａｓｘ２、Ｇｌｘ３、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ５、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌ ａ３、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ３、Ｐｈｅ２、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３、Ｌｙｓ８）の 近似的アミノ酸組成を有する請求の範囲第３項記載の因子。
7. ７．因子内の１６個のアミノ酸セグメントが、アミノ酸配列Ｐｈｅ、Ａｓｎ−Ｌ ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇ ｉｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓを有し、因子のアミノ末端を含まない請 求の範囲第３項記載の因子。
8. ８．因子内の１５個のアミノ酸セグメントが、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌ ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓを有し、因子のアミノ末端を含まない請求の範囲 第３項記載の因子。
9. ９．実質的に１つのペプチドのみを含有する請求の範囲第３項記載の因子。
10. １０．実質的に、Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｒ２−Ｐｈｅ−Ｒ３ −Ｍｅｔ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｌｙｓ〔但し、Ｒ８はＳｅｒとＴｈ ｒからなる群から選ぶ〕の配列を含有する少なくとも１５個のアミノ酸残基を有 するペプチドのみからなる請求の範囲第３項記載の因子。
11. １１．実質的に１つのペプチドのみを含有する請求の範囲第１０項記載の因子。
12. １２．実質的に、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓの配列を含有するペ プチドのみからなる請求の範囲第１０項記載の因子。
13. １３．実質的に１つのペプチドのみを含有する請求の範囲第２項記載の因子。
14. １４．実質的に、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ− Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓの配列を含 有するペプチドのみからなる請求の範囲第１３項記載の因子。
15. １５．実質的に、Ｐｈｅ−Ｒ２−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｒ３−Ｐｈｅ−Ｒ３ −Ｍｅｔ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｌｙｓ〔但し、Ｒ８はＳｅｒとＴｈ ｒからなる群から選ぶ〕の配列を含有する少なくとも１６個のアミノ酸残基を有 するペプチドのみからなる請求の範囲第３項記載の因子。
16. １６．実質的に１つのペプチドのみを含有する請求の範囲第１５項記載の因子。
17. １７．実質的に、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ− Ｌｒｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓの配列を含 有するペプチドのみからなる請求の範囲第１５項記載の因子。
18. １８．実質的に１つのペプチドのみを含有する請求の範囲第１７項記載の因子。
19. １９．本質的に、アミノ酸Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ− Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ− Ｌｙｓからなる実質的に純粋なペプチドからなる請求の範囲第１８項記載の因子 。
20. ２０．５×１０−２フエトグラムのペプチドが、ＳＣＭ試験において癌に苦しん でいるドナーからのＳＣＭ−関連リンパ球の刺激に使用されたとき少なくとも３ ０％の偏光作用値を減少させる請求の範囲第１９項記載のペプチド。
21. ２１．（ａ）哺乳類ドナーから得たリンパ球の懸濁液を請求の範囲第１項又は第 ３項の一般的な癌−関連ＳＣＭの認識因子と接触させる工程；および （ｂ）該リンパ球の懸濁液を接触させる工程から得られるリンパ球の細胞形質マ トリックスの組織化度の減少を決定する工程、からなることを特徴とする哺乳類 ドナーから得たリンパ球からドナーに悪性腫瘍が存在するか否かを試験する方法 。
22. ２２．因子が、実質的に、Ｐｈｅ−Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｒ２−Ｐｈ ｅ−Ｒ３−Ｍｅｔ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７〔但し、Ｒ１はＡｓｎとＧｌｎから なる群から選び、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立にＶａｌ、Ｌｅｕおよび Ｉｌｅからなる群から選び、Ｒ５はＡｓｐとＧｌｎからなる群から選び、そして Ｒ６とＲ７はそれぞれ独立にＡｓｎとＧｌｎからなる群から選ぶ〕の配列を含む 少なくとも１３個のアミノ酸残基を有するペプチドのみからなる請求の範囲第２ １項記載の方法。
23. ２３．因子が本質的に、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ −Ｌｙｓからなる実質的に純粋なペプチドからなる請求の範囲第２２項記載の方 法。
24. ２４．因子が、本質的に、アミノ酸Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ− Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ− Ｓｅｒ−Ｌｙｓからなる実質的に純粋なペプチドからなる請求の範囲第２２項記 載の方法。
25. ２５．因子内の１６個のアミノ酸セグメントが、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ａｓｎ− Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ− Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓを有し、因子のアミノ末端を含まない 請求の範囲第２１項記載の方法。
26. ２６．因子内の１５個のアミノ酸セグメントが、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ａｓｎ− Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ− Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓを有し、因子のアミノ末端を含まない請求の範 囲第２１項記載の方法。
27. ２７．細胞形質マトリックスの組織化度の減少を決定する工程が、 （ａ）既に因子に接触されているリンパ球のアリコートの螢光偏光作用Ｐｓを測 定する工程：（ｂ）末だ因子に接触されていないリンパ球の第２のアリコートの 螢光偏光作用Ｐｃを測定する工程；および （ｃ）約０．９以下のＰｓ／Ｐｃの比がリンパ球の提供者に悪性腫瘍が存在する ことを示すところのＰｓ／Ｐｃの比を決定する工程、からなる請求の範囲第２１ 項記載の方法。
28. ２８．細胞形質マトリックスの組織化度の減少を決定する工程が、 （ａ）既に因子と接触されているリンパ球のアリコートの螢光偏光作用Ｐｓを測 定する工程：（ｂ）フイトヘマグルニチン、コンカナバリンＡおよびアメリカヤ マゴボウのマイトジエンからなる群から選んだマイトジエンと接触されたリンパ 球の第２のアリコートの螢光偏光作用ＰＭを測定する工程：および （ｃ）約０．９以下のＲＲＳＣＭがリンパ球のドナーに悪性腫瘍が存在すること を示すＰＳ／ＰＭの比として、ＳＣＭの反応比ＲＲＳＣＭを決定する工程、から なる請求の範囲第２１項記載の方法。
29. ２９．（ａ）血液試料から潜在的にＳＣＭに反応するリンパ球を分離する工程： （ｂ）分離したリンパ球を請求の範囲第１項又は第３項の因子と接触させること によってリンパ球を刺激する工程： （ｃ）刺激したリンパ球を螢光発生剤前駆物質と該前駆物質がリンパ球に浸透し て細胞内酵素加水分解により螢光発生化合物に加水分解させるのに十分な時間接 触させることによって、刺激された螢光を含有するリンパ球を生成させる工程： （ｃ）刺激された螢光を含有するリンパ球を偏光で励起させることによってリン パ球に螢光を発生させる工程： （ｅ）螢光を発生するリンパ球から鉛直方向に偏光された、および水平方向に偏 光された螢光発光を測定して螢光を発光するリンパ球の偏光作用値を決定する工 程：および （ｆ）刺激された螢光を含有するリンパ球の決定された偏光作用値と、工程（ｂ ）を除いた工程（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の操作を受けた同一ドナー からのリンパ球の対照アリコートの偏光作用値と比較し、それによってリンパ球 ドナーの体に癌の存在又は不在を示す工程からなることを特徴とする、血液試料 のドナーの体に悪性腫瘍の存否を示す血液試料のスクリーニング方法。
30. ３０．リンパ球が鉛直方向に偏光された光で励起され、偏光作用値が次の関係式 に従って螢光分光光度計で測定される請求の範囲第２９項記載の方法：Ｐ＝（Ｉ Ｖ−ＧＩＨ）／（ＩＶ＋ＧＩＨ）但し、上式のＩＶとＩＨはそれぞれ鉛直面と水 平面における偏光された螢光の強さ、そしてＧは分光光度計の光学系を通る偏光 の水平および鉛直成分の不等透過に対する補正係数である。
31. ３１．工程（ｂ）と工程（ｃ）が同時に生じる請求の範囲第２９項記載の方法。
32. ３２．（ａ）ＳＣＭ−認識因子を含有する体液を処理して選択的に不活性にさせ ることによって該因子の生体内作用を低下させる工程：および （ｂ）前記処理された体液を患者に戻すことによって癌に対する患者の抵抗を高 める工程からなることを特徴とする、患者の体液の少なくとも１つが一般的な癌 −関連ＳＣＭ−認識因子を含む癌患者を治癒する方法。
33. ３３．体液が末梢血液であり、体液を処理する工程が１０００ダルトン以下の見 掛け分子量のペプチドを除去する末梢血液の透析からなり、その血液からの除去 によってＳＣＭ−認識因子を選択的に不活性する請求の範囲第３２項記載の方法 。
34. ３４．体液を処理する工程が、体液中のＳＣＭ−認識因子を該因子に特有の抗体 で中和することからなる請求の範囲第３２項記載の方法。
35. ３５．体液を処理する工程が、体液中のＳＣＭ−認識因子をＳＣＭ−認識因子と 一価の結合することができるＳＣＭ−認識因子に特有の抗体のＦａｂフラグメン トで中和することからなる請求の範囲第３２項記載の方法。
36. ３６．（ａ）請求の範囲第１項又は第３項の一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子 に対する抗体をイメージング物質で標識化する工程：および （ｂ）標識化した抗体を利用して癌細胞を画像診断する工程からなることを特徴 とする、癌細胞の画像診断方法。
37. ３７．（ａ）請求の範囲第１項又は第３項の一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子 に対する抗体に標識を付けて、抗癌物質を癌細胞に向ける工程：および（ｂ）標 識を付けた抗体が患者の癌細胞に結合できるように標識を付けた抗体を癌患者に 投与する工程からなることを特徴とする、抗癌物質を癌細胞に向ける方法。
38. ３８．免疫検定において請求の範囲第１項又は第３項の一般的な癌一関連ＳＣＭ −認識因子を使用して体液中の一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子の水準を決定 する方法。
39. ３９．免疫検定が放射線免疫検定である請求の範囲第３８項記載の方法。
40. ４０．免疫検定が螢光免疫検定である請求の範囲第３８項記載の方法。
41. ４１．免疫検定が酵素結合免疫吸収検定である請求の範囲第３８項記載の方法。
42. ４２．免疫検定が沈殿免疫検定である請求の範囲第３８項記載の方法。
43. ４３．沈殿免疫検定が比濁分析検定である請求の範囲第４２項記載の方法。
44. ４４．沈殿免疫検定が濁り測定検定である請求の範囲第４２項記載の方法。
45. ４５．（ａ）癌で苦しんでいるドナーの体液を得る工程：（ｂ）１０００ダルト ンより大きい見掛け分子量を有する分子からなる体液の第１の面分を１０００ダ ルトン以下の見掛け分子量を有する分子からなる第２の面分から分離する工程： および （ｃ）第２の画分を精製して実質的に純粋な一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子 を得る工程からなることを特徴とする一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子を製造 する方法。
46. ４６．体液は末梢血液、尿および血漿からなる群から選ぶ請求の範囲第４５項記 載の方法。
47. ４７．第１の面分から第２の面分の分離が、公称１０００ダルトンの分子量カッ トオフの限外フィルターを通して体液のろ過によって行なう請求の範囲第４５項 記載の方法。
48. ４８．さらに、０〜７００ダルトンの分画範囲を有し塩類を分離できるゲルろ過 カラムに第２の画分を負荷し、負荷された材料を蒸留水で溶離し、クロマトグラ フィーの全床容積の約０．３〜約０．５の間の溶離体積で溶離する部分を収集す ることによって第２の画分を脱塩する工程からなり、それによって請求の範囲第 ４５項の第２の画分における比活性に対する収集した脱塩部分における一般的に 癌−関連ＳＣＭ−認識因子の比活性を増す請求の範囲第４５項記載の方法。
49. ４９．さらに、 （ａ）約１５００〜約３０，０００ダルトンの分画範囲を有する濾過カラムに収 集した脱塩部を負荷する工程： （ｂ）．工程（ａ）でカラムに負荷された材料をアンモニウム塩の弱い水溶液で カラムから溶離する工程：および （ｃ）クロマトグラフの全床容積の約０．４〜約０．６倍の間の溶離体積で溶離 する部分を収集する工程からなり、それによって請求の範囲第４８項の収集され た脱塩部における比活性に対して収集された溶離液における一般的な癌−関連Ｓ ＣＭ−認識因子の比活性を高める請求の範囲第４８項記載の方法。
50. ５０．さらに、 （ａ）収集された溶離液をジエチルアミノエチル・セルロース陰イオン交換カラ ムに負荷する工程：（ｂ）工程（ａ）でカラムに負荷された材料を高濃度のアン モニウム塩でカラムから溶離する工程：および （ｃ）約０．２８Ｍ〜約０．３１Ｍのアンモニウム塩でカラムから溶離する部分 を収集する工程からなり、それによって請求の範囲第４９項の収集された溶離液 における比活性に対して収集された溶離液における一般的な癌−関連ＳＣＭ−認 識因子の比活性を高める請求の範囲第４９項記載の方法。
51. ５１．さらに、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって、請求の範囲第５０項 の収集された溶離液からの一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子を実質的に均一に 精製する工程からなる請求の範囲第５０項記載の方法。
52. ５２．請求の範囲第４５項、第４８項、第４９項、第５０項又は第５１項の方法 によって製造された実質的に純粋で一般的な癌−関連ＳＣＭ−認識因子。