JPH03503847A - Ｂ型肝炎ワクチンの製造及び精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）感染は、世界的規模の公衆衛生上の重要な問題で ある。ＨＢＶは、不治のそして時には死に至る肝臓疾肇を引き起し、米国だけで も推定で毎年２０．０００人もの新たな犠牲者を出している程である。極東、ア フリカ及び西欧に於いては、人口の約１０％が慢性のＨＢＶキャリアであり、そ の結果、慢性の活性肝炎及び肝硬変が主要な死亡原因となっている。更に、ＨＢ Ｖのキャリアは肝ガンにかかりやす＜、ＨＢＶはヒＩ−のガンに関与することが 知られているいくつかのウィルスのうちの一つであることを強く証明する証拠が ある。

よって、ＨＢＶ感染から防御するための安全で経済的に実現可能なワクチンの生 産が緊急に求められている。このようなワクチンを生産するために様々な方法が 試みられている。

上記文献に記載されているように、これまで生産されている全てのワクチンの基 本成分はＢ型肝炎表面抗原（ｉ（ＢｓＡｇ）である。これはそもそも、ＨＢ■感 染の慢性患者のプラズマから単離されたものであって、ＨＢＶ感染に有効なワク チンとして使用されている。

ＨＢＶ感染キャリアのプラズマ中にあるＨＩ３ｓＡｇは、４２ｎｍのＨＢＶ感染 ウィルス粒子（ゾーン粒子）並びにＩＩＢＶ−ＤＮＡ及びその他のＨＢＶ構造タ ンパクが欠失している非感染の２２ｎＩＮ粒子の両方の形態をとって存在してい る。この２２ｎｍ粒子は、ＨＢＶ慢性のヒトキャリア及びＨＢ　Ｖ血症（マｉ＋ ｔｍ日）患者の両者に於いて過剰に生産されている。この２２ｎｍ粒子はＨＢ　 Ｖ形質転換へパトーマセルラインにより分泌されるものである。

免疫原性の高い２２ｎｍ　ＨＢ＋Ａｇ粒子は６つの関連タンパクから構成されて いる。即ち、（り主要タンパクＰ−２４ｏ　これは２４．０００ダルトン（２４ Ｋ）の分子量を有する非グリコジル化形態である。

そして、ＧＰ　−２７があり、これはＰ−２４のグリコジル化された形態のもの であって、分子量２７．０００ダルトンのものである。これらはＨＢＶゲノムの Ｓ領域にコードされており、２２６個のアミノ酸を有している。（ｂ）少量（マ イナー）タンパクであって、分子量３３．０００ダルトン（３３に＋の単一グリ コジル化形態をとるＧＰ−３３、及び分子量３６．０００ダルトンｆ３６Ｋ）の 二重グリコノル化形態をとるＣＰ−３６゜これらは、ＨＢＶゲノム？ｅ−３２及 びＳ領域にコードされており、２８１個のアミノ酸を有する（Ｓ領域に２２６個 、Ｐｒ！−Ｓ２領域に５５個のアミノ酸）。（ｃ）夫々、分子量が３９、０００ 及び４２．０００ダルトン（３９に、　４２Ｋ）を有する少量タンパクである非 グリコジル化形態のＰ−３９及びグリコジル化形態のＧＰ−４２゜これらは、Ｈ ＢＶゲノムのＰｒｅ−３１，Ｐｒ＋−３２及びＳ領域にコードされており夫々　 ３８９個及び４００個のアミノ酸を有している（Ｓ領域に２２６個、Ｐｉｅ−３ ２領域に５５個及びＰｒｅ−３ｌ領域に（１０Ｂ　〜＋１９）個）。このように 、ＨｔＡｇ　２２ｎＩ１１粒子の全タンパクはＨＢＶゲノムＤＮＡの連続した（ ｏｎｉｎｆｅ＋＋ｎｐｌｅｄ）同一の配列ニコードされており、それらの最終形 態は、遺伝子発現（転写及び翻訳）が開始される位置、並びに翻訳後グリコジル 化の有無及びその程度によって決められるものである。

２２＋＋ｍ　）ｌＢｔＡｇＢ＋Ａｇ粒子１ｌ−５２及びＰ＋＋−３１生産物とは 独立して無関係に、Ｐ　−２４／ＧＰ−２７（Ｓ領域）から集合して形成され得 る。

最近、Ｐｒｅ−３２特異的タンパクであるＧＰ−３３及びＧＰ−３６，並びにＰ ＋＋−３ｌ特異的タンパクであるＧＰ−３９及びＧＰ−４２はＰ−２４とは独立 して抗原決定基を有しており、ＨＢ＋Ａｇ　２２ｎｍ粒子中に存在すると免疫原 性を高めることが示された。

更に、Ｐｒｅ−Ｎ２及びＰＴｅ−３１タンパクが存在すると、２２ｎｍ　ＨＢ＋ Ａｇ粒子はポリマー化されたヒト血清アルブミンに結合することができ、これは 、ＨＢＶウィルス粒子がＨＢＶ感染に際して、標的細胞に結合することができる 能力と直接に相関関係を有するものである。

即ち、Ｐｒｅ−Ｓ及びＳ領域タンパク抗原決定基の両者を有するＨＢｓＡｇ粒子 はウィルス粒子を中和し、この粒子が標的細胞に感染するのを防ぐような応答を 生起させることのできるワクチンとして用いることができるのである。こうして 、このワクチンはＨＢＶ感染に対して長期間に亘る有効な防御を可能にするもの である。例えば、Ｐｅｒ＋ｉｎｇ　ｅｌ　１１．、ＰＩＯＣ，Ｎ１１１．＾ｃｘ ｄ、　Ｓｃｉ。

υＳ＾８２：３４４［１−３４４４（１９８５）；　Ｎ！ｕ＋ａｔｈ　ｔｌ　ａ ｌ、、　Ｎ！ｉｏ＋ｅ　３１５＋　１５４−１５６（１９８５）；　Ｎｅｎｚｌ ｈ　ｅｌ　＋ｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４６：　４２９−４３６（１９８６）；ｒｅｆ ｉｔｅｌ　ａｌ、、　　Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：　５１ｉ５２３（１９ ８６１；及びＭｉｌｉｅｈ　ｃｌ　＋１．。

一般に、免疫プログラムに採用し使用することが認められている本来のＨＢｓＡ ｇワクチンはＨＢＶの慢性キャリアのプラズマから得られたものである。

以下に、プラズマ由来のワクチ：／の製造方法の具体例を示す。

（１）　　メルク（Ｍｅ＋ｃｋ）　、ンヤープ（Ｓｈｓ＋ｐ）及びドータｆＤｏ ｂｍｅ）によって製造されたＨｅｐｌｓｙｔｘ　Ｂ　（登録商標）　。）ｌｉｌ ｌｔｎｍ＊ｎ（ｂ）　　パスツール研究所により製造されたＨｓｖ＆ｅ　Ｂ　（ 登録商標）＾＋ｆｍｏｖｉｅ＋　ｅｌ　＊１．、　　Ｖｘ＋ｃｉｎｔ　　２＋　 ２０９−２１４（１９８４）；及びＵＳ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４．３３５．２１４　　°発行６月１５日（１９８２）を 参照のこと。

上記のいずれの方法とも、非常に精製度の高く感染性の不純物を含まないためヒ トのワクチンとして使用するのに安全なプラズマ由来のＨＢ＋Ａｇ　２２ｎｍ粒 子を製造することができるとされている。

しかしながら、これらの方法において重要なステップは時間がかかるとともに経 済的に高価なものである。何故ならば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は 硫酸アンモニウム分画、及びそれに続くンタ糖及び塩化セシウム勾配による超遠 心を含むからである。プラズマ由来のＨＢｓＡｇワクチンを製造するための他の より迅速かつ安価な方法も記載されてはいるが、いずれもポリエチレングリコー ル（Ｐ　Ｅ　Ｇ）又は硫酸アンモニウム分画、超遠心による等密度（口ｏｐＹｃ ｎｉｃ）分離及び種々のクロマトグラフィ用樹脂によるクロマトグラフ分離のス テップを共通して含むものである。

これらの方法は全て高価でかつ時間がかかるものであるため、ヒトのプラズマ由 来のワクチンの価格が高いものとなる。「Ｂ型肝炎」、Ｍｓｎｐａ＋及びＧｕｅ ＩＢ　Ｅｄｓ、　（１９８１）　Ｅ！＋５ｙｉｅ＋／ｌｉｏ＋ｔｈＨｏｌｌｘｎ ｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅ！ｓ、＾ｍｓ＋ｅ＋ｄ＋ｍ、　　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｌｋ、　　０ｘｆｏｒｄ参照のこと。最終的には、プラズマ由来のＨＢｓＡｇ 　２２ｎｍ粒子を含むワクチンの主要な欠点は、それが健康に障害を与える可能 性があるということである。これらの方法はＡＩＤＳウィルスをも含めた同時精 製の不純物を不活性化する物質を採用するものの、ワクチンが望ましくない副作 用を生じさせるというような危険性が依然存在する（Ｗｔｌｇｇｌ（Ｎｔｔｏ＋ ｅ−υ１４：　　２９Ｈ＋９８３１）　、従って、ヒトプラズマ由来の不純物と いう潜在的危険性がないＨＢｓＡｇ粒子を得るための効率的で安全な方法を提供 することのできる、組換えＤＮＡ技術がワクチン用の２２ｎｅ　ＨＢ＋Ａｇ粒子 の製造に応用されている。

組換えベクター及びＨＢｓＡｇ発現用プラスミドの構築並びに原核細胞系からの ＨＢｓＡｇ精製方法についてはこれまでにすでに記述されている（例えば、Ｇｌ ｌ目ｂｅ＋Ｉ　ｃｌ　ｓｌ、、［１，Ｓ、Ｐａ１ｅｎ＋　ｔｌｏ、　４．４２ｇ 、　９４１．　１９８４年１月３１日発行、及びＴ＊ｋｃｄ＊　ＣｈＣｍ、Ｉｎ ｄａｒａｉｅｓ　ｐＸｌｅｎｉ　ａｐｐｌｉｃｔｌｉｏｎ＋　ＥＰＯ０６８７１ ９＾２．１９１１３年１月５日公開、及び１０　Ｎ１００６４Ｇ、　１９８６年 １月３０日公開を参照のこと。）。

形質転換細胞系からのＨＢｓＡｇ製造方法はこれまでのプラズマ由来ＨＢ　ｓ　 Ａ　ｇについて記載された方法に基づいている。

しかしながら、この原核細胞系は生産されたＨＢｓＡｇを分泌することが出来な いので、形質転換細胞を溶解するステップが更に必要となる。この結果、有害な 性質を有する細菌性エンドトキンンを一緒に精製してしまう可能性がある。更に 、原核細胞系ではＨＢｓＡｇ生産物をグリコジル化することも、又それらを２２ ｎ１１粒子に集合させることも出来ない。よって、このような方法で製造された ワクチンはプラズマ由来の生産物と比較しく１９８０１参照）。

従って、組換えＨＢｓＡｇ製造用の真核細胞発現系が開発された。この系によれ ば、グリコジル化され且つ２２ｎｍ粒子に集合したＨＢｓＡｇを製造することが 可能である。

酵母細胞を用いた真核細胞培養により製造されたＨＢｓＡｇワクチンには、市販 されているものとしてＲｅｃｏｍｂｉｗ＊！）１Ｂ　　（登録商標）ワクチン（ Ｍｅ＋ｃｋ、　５ｂｓｒｐ及びＤｏｂｍｅ　：ＭＳＤ、　Ｅａｉ　ｌ　ｉ他、ｊ 。

Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　１３：　３−９　Ｓａ’ｐｐｌｅｍｔｌ　Ａ　（１９８６ ）　）及び５ａｉｌｂｋｌ　ｉｎｃＢｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｒｐ、　　により製造 されている組換えＨＢｓＡｇワクチン（米国特許４．６４９．１９２　　（１９ １１７年１月ｌＯ日発行）及びＥＰＯ出願１９９６９８Ａ　（１９８６年１０月 ２９日公開））がある。

しかしながら、これらの方法で製造されるＨＢｓＡｇ粒子は、形質転換プラスミ ドがＳ領域配列しか含んでいないために、Ｐ＋ｅ−３ｌ又はＰ＋ｅ−３２抗原決 定基を有していないＳ領域のみの産物である。従って、これらの粒子は、「天然 」プラスミド由来粒子と同程度の免疫原性を有しているものではない。酵母細胞 はまたＨＢｓＡｇ粒子を分泌することはできない。酵母細胞はＨＢｓＡｇタンパ クをグリコジル化することはできる力く、このグリコジル化は哺乳細胞のものと 同じではない。酵母内でも２；）ｖ粒子の集合は起こるが、この粒子は安定した もので（よなｔ玉。この製造方法ではプラズマ由来ＨＢｓＡｇに類似した最終生 産物を得るために化学的処理が必要となり、ヒトに使用すること力（できるだけ 安全なものにするためにはホルマ’Ｊン処理も必要とされている。これらの方法 並びに洗浄剤及び尿素を用し）る精製ステップによってＨＢｓＡｇ分子の構造が 変化し、その結果、抗原性が失われ、また製造コストが増加すると（１つた事態 を招くことになる。

ごく最近になって、Ｓ領域の抗原決定基に加えてＰｒｅ−３２抗原決定基を含む ＩＩＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を製造するため（こ酵母系が用し１られた（例えば、１ ９８６年２月１９日公開のＥＰＯ！７１９０８人３　（武田イヒ学工業（日本） ）及び１９８６年３月２６日公開のＥＰＯ１７５２６１＾２（カイロン社）があ る）。これらのワクチンはＰｒｅ−３２領域の抗原決定基を含んではいるが、依 然としてＰＴＩ−３ｌ領域の抗原決定基は含んでいないものである。更に、これ らの方法（よ酵母系を用いるため上記したような問題をかかえるものである。

よって、最も有利なＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子ワクチン製造方法（よ哺乳細胞の培養 による方法である。

４）ワクチン及びその哺乳動物細胞培養系における製造方法哺乳動物細胞培養系 においては、ＨＢｓＡｇ粒子のグリコジル化はヒトキャリアからの「天然Ｊ　Ｈ ＢＶ粒子のものと同一である。生産されたＨＢｓＡｇ粒子もまた同様に「天然」 の仕方で集合するため、更に化学的操作を加える必要がない。最後に、２２ｎｍ 　ＨＢｓＡｇ粒子は該細胞から培地中に分泌され、細胞を溶解されることなく、 この培地から容易に精製することができる。

しかしながら、哺乳動物組織培養による組換えＨＢｓＡｇワクチンの合成におけ る主要な問題の一つは、真正な２２ｎｍ　）ｌＢｉＡｇ粒子内に集合したＨＢｓ Ａｇタンパクの完全なスペクトラムの合成である。ＰＴＩ−３ｔ含有タンパク（ Ｐ−３９及びＧＰ−４２）は２２ｎｅＨＢ＋Ａｇ粒子の分泌を阻害するものと思 われる。例えば、Ｏｕ及びＲｏｔｔｅ＋、　］、　Ｖｉ＋ｏ１．６１ニア８２− ７８６　（１９８７）　：Ｐｅ＋ｓｉｎｇ他、Ｉ、　Ｖｉ＋ｏ１．６１：１６７ ２−１６７７　［１９８７）を参照のこと。

哺乳動物細胞系により製造された幾つかの有効なＩ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇワクチンは 、ＨＢｓＡｇの発現を指示するために外来性の発ガン性ウィルス発現ベクター（ 例えば、５ｖ４０、アデノウィルス）を用いていた。これらの方法では、Ｐｉｅ −３ｌ抗原決定基を含有せずに、Ｐｉｅ−３２及びＳ領域のみが発現されたＨＢ ｓＡｇ粒子力（製造される。ＨＢｓＡｇ粒子を発現させるために外来性の調節要 素を用いるために集合が不充分であり、収率の低下を招くこととなる。収率が低 いこと及びＰｒｅ−３ｌ領域の欠失のため１こ、このワクチンは免疫原性の点で 劣るものである。最後に、この系（こ記載された精製方法は時間がかかりすぎか つ高価なものである。

即ち、通常ＰＥＧ又は硫酸アンモニウム分画を含み、その後精製ＨＢｓＡｇを得 るために超遠心を行なうものである（例え（ｆ１１９８１年１０月２Ｂ日公開の ＥＰＯ０３１１９７６５＾１．１９８５年　６月１９日公開のＥＰｏ　１４５５ ８９＾３．１９１１６年１１月１２日公開のＥＰＯ２０１４１６＾１、及び１９ ８６年６月２５日公開のＥＰｏ　１８５５７３＾１があり、これらは全て／ぐス ツール研究所名義の出願である。）。

組換え哺乳動物細胞培養からＨＢｓＡｇ粒子を製造する他の方法も記載されてい る（例えば、１９８６年１月１５日に公開されたジェネンテインク社名義のＥＰ ｏ　１６８２３４＾２出願）。しかじな力（らこのシステムでは精製された生産 物を得るために、硫酸アンモニウム又はＰＥＧ分画及び遠心分離という時間及び コストのかかるステップを含むものである。このシステムにおけるＨＢｓＡｇ粒 子の最終生産物はＳ領域タンノ々りのみを含むものである。

最近になって、免疫原性の抗原決定基の全て、即ちＰＴＩ−Ｓｔ、Ｐｒｃ−３２ 及びＳを有するタンパクを含むＨＢｓＡｇ粒子を哺乳動物細胞培養システムを用 いて製造することに成功したということが言われた。しかし、このシステムは重 金属イオン及び／又はステロイドホルモンの存在下で細胞培養を行なわなければ ないないような遺伝子発現用の外来性調節配列（マウスメタロチオネインプロモ ーター）をも使用するものである。これらの物質は、最終生産物から除去されな い場合には、毒性を示す可能性のあるものである。更に、この記載された製造方 法も、精製生産物を得るためにコスト及び時間のかかるＰＥＧ分画とそれに続く 遠心分離を含むものである。また、発現系において外来性遺伝子調節配列を使用 するために、？ｅ−Ｓｌ、Ｐｒｅ−３２及びＳ抗原決定基の化学量論的量は高度 な免疫原性を有するＨＢｓＡｇ生産物を得るためには理想的なものではない。エ ンドトロニクス社名義のＥＰＯ１９８４７４＾１　　（１９８６年ｌθ月２２日 公開）を参照のこと。

５）哺乳動物細胞培養も見上−彷ｊ−リスユ久二Ｚ専Ａ辺Ｊ組換え哺乳動物細胞 ワクチン製造にみられた上記の欠点に鑑みて、本出願人は、高度な免疫原性を有 しており、そして「天然」生産物に非常に類似している純炭の高いＨＢｓＡｇ粒 子を大量に製造するための新規かつ経済的な方法を開発した。この粒子は、非常 に効果的かつ安価なワクチンの基本成分を提供するものである。加えて、この新 規な粒子は全ての抗原決定基、即ち、Ｐｒｔ−３ｌ、？＋−３２及びＳ領域を含 むものである。これらの抗原決定基は「天然Ｊ　ＨＢＶ遺伝子調節配列を用いる 発現系によって製造されるため、粒子が化学量論的に「天然」のプラズマ由来粒 子と類似していることになるのである。

発明の概略 本発明は、精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子の新規な製造方法であって、 （ａ）培地中で該粒子を産生ずる哺乳類細胞を培養することにより培地中へヒト Ｂ型肝炎表面抗原粒子を分泌させ、該培地は分子量が約３×１０５ダルトンより 大きい分子を含まない血清が添加されており、 （ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原粒子を含む得られた培地から全細胞、細胞砕片及び粒子 凝集体を除去し、 （Ｃ）得られた培地を処理して存在するＢ型肝炎表面抗原粒子を濃縮及び精製し 、さらに （ｄ）こうして得られた濃縮し精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子を回収する ことを含む該製造方法を提供する。

本発明の特に好適な方法によれば、精製され濃縮されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒 子は、 （ａ）培地中で該粒子を産生ずる哺乳類細胞を培養することにより培地中へヒト Ｂ型肝炎表面抗原粒子を分泌させ、該培地は分子量が約３×１０５ダルトンより 大きい分子を含まない血清が添加されており、 （ｂ）ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を含む得られた培地から全細胞、細胞砕片及び 粒子凝集体を除去し、（Ｃ）得られた培地を処理して濃縮されたヒトＢ型肝炎表 面抗原粒子を含む溶液を得、 （ｄ）濃縮された抗原粒子を含む得られた溶液を処理して溶液中のＤＮＡ含量を 減少させ、 （ｅ）そのようにして得られた濃縮して精製された表面抗原粒子を含む溶液のｐ Ｈを所望により約３．０−約７０になるべく調整し、 （ｆ）得られた溶液中に存在する濃縮された表面抗原粒子を精製し、さらに （ｇ）精製された濃縮ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を回収することにより得ること ができる。

より特異的には、本発明はＢ型肝炎表面抗原粒子、特異的には高度に免疫原性の ある２２ｎｍ　ＨＢｉＡｇ粒子を精製する新規な方法に関するものである。これ らの粒子は、ＨＢＶウィルスの標的細胞に対する感染を中和する免疫応答を惹起 する抗原としで使用される。より特定すると、精製方法は、新規なプレ分画ステ ップ、即ち、超遠心を用いて、Ｂ型肝炎表面抗原粒子が分泌された培地から約３ ×１０５ダルトンより大きい分子量を有する分子を除去することを特徴とするも のである。

本発明の精製方法は種々のステップを含む。第１ステツプにおいて、ＨＢ　ｓ　 Ａ　ｇ粒子を産生じ及び培養血清添加の培地中へ分泌させた。培養培地はまず分 画され、高分子量、即ち、約３００Ｋを有する細胞不純物を除去した。添加培養 培地のプレ分画は重要なステップであって、これにより、精製ステップを最小陽 にして高い精製度が可能になるものである。約３×１０５ダルトンより大きい分 子量を有する分子とは、培地中で使用された牛胎児血清に由来する高分子量タン パク複合体不純物を含むものであり、それらを事前に除去することにより以下の 利点がある。

（１）細胞を高レベルのＦｅ２を含有する培地中で増殖させることができる。

（２）高分子量複合体は細胞増殖に阻害作用を有する可能性があることを考える と、細胞増殖が促進される。

（３）これらの高分子量タンパク複合体は精製プロセスで除去される主要な不純 物であるため、ＨＢｓＡｇの精製が簡単なものになる。

続いて行なう精製ステップでは、低分子量分子、即ち、タンパク不純物から高分 子量ＨＢｓＡｇ粒子を主に分離することを必要とする。第一に、Ｂ型肝炎表面抗 原粒子を含む得られた培地から全細胞、細胞砕片及び粒子凝集体を除去し、得ら れた培地を処理して存在するＢ型肝炎表面抗原粒子を濃縮及び精製し、さらに、 こうして得られた濃縮し精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子を除去する。

これらのステップは以下の実施例、特に実施例５において、詳細に述べるもので ある。

特に好適な本発明の具体例によれば、精製された濃縮ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子 が製造される。この方法は、実施例５に記載の精製プロセスの最初の３ステツプ 、即ち、培地のプレ分画、全細胞、細胞砕片及び粒子凝集体のＨＢｓＡｇ粒子を 含む回収された培地からの分離、並びに濃縮ヒｌ−ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を含む 溶液を得るための得られた培地の処理、に続いて、すでに述べた種々の精製プロ セスを含むものである。濃縮された抗原粒子を含む溶液を処理して溶液中のＤＮ Ａ含量を減少させ、溶液のｐＨを所望により約３０−約７．０になるべく調整す る。本発明の一好適具体例に於いては、溶液を酸で処理することにより、１（を 調節するために濁りが生じる。この濁りはタンパク不純物を含むものであり、Ｂ 型肝炎表面抗原粒子から分離することができる。精製された濃縮ヒトＢ型肝炎表 面抗原粒子はその後回収される。実施例５と比較しての差異及びこの差異による 利点は実施例１１に詳細に記載しである。

本発明方法により、ＦＣ３含有培地中の細胞増殖レベルの増大が達成され、簡単 な方法により純度の高い分泌ＨＢｓＡｇ粒子を得ることができる。この方法は、 ＰＥＧ又は硫酸アンモニウムによる分画又は遠心分ＶｔＳ＜超遠心も含めて）な いしアフィニティクロマトグラフイによる分離も用いないものである。この方法 は迅速でかつ効率よく純度の高い生成物を高収率で生産することができる。とい うのも、該方法は、リサイクル可能な成分に基づいているため、従って、大変安 価であるからである。

よって、本出願人は非常に低いコストで高純度の生産物を製造することができる 。また、現在市販されている非常に高価なワクチンをこれまで使用することので きなかった潜在的患者（利用者）のより広いスペクトラムを有する効果的なＨＢ Ｖワクチンを提供することが可能になるものである。

最後に、本発明は、「天然」の化学量論的量に類似した量で天然の抗原決定基（ Ｐ！ｅ−Ｓｌ、Ｐｉｅ−５２及びＳ）の全てを含む、哺乳動物細胞系により産生 されたＨＢｓＡｇ粒子を提供するものである。この生産物は、全ての使用予定者 に対して免疫原性を有しており、Ｐｒｅ−３ｌ抗原決定基をも有することにより 、Ｓ領域又はＰｒｅ−３２領域の抗原決定基に対する非応答性という問題を克服 できるものである。（例えば、２ｏｅｋ＋＋ＩｎＩｎ、　］、　Ｉｎｆｅｃｔｉ ｏｎ　ｊ３　：６１−６７　（Ｓｕｐｐｌｅｍｓｎｌ＾）　（１９８６）を参照 のこと）。

′　　　の　　　−ｔ−ｆ　　日 第１図。ｐｓＰＨＢＶ８−１構築を図示、　ｐ７．５ＡＬ２６　（１１，８００ ｂｐ）をＰｓｔｌで消化し、３８００　ｂｐ　フラグメントを分離した。

ＨＢＶ配列を含み、ヒトＡｌｅｘａｎｄｅｒ　ＤＮＡに接したフラグメントをＴ 、ＤＮＡ　リガーゼによってｐｓＰ８４　のＰｓｔＩサイトにす第２図。ｐＳＰ ）ｌＢＶＢ８構築を図示。ｐＳＰＨＢＶ８−１　をＥｃｏＲＩ　とＸｂａｌで十 分に消化し、次いでＨＢＶ−ＡＬ２６プロモーター及びＰｒｅ−８ｌのコード配 列を含む５００　ｂｐフラグメントを分離した。別の反応で、ｐｓＰＨＢＶ８− １　をＥｃｏＲ［とＰｓｔｌで消化し、Ｐｒｅ−３２及びＳをコードする配列、 並びにＨＢＶ−ＡＬ２６　ｘンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む２ ４００　ｂｐ　フラグメントを分離した。これらの７ラグメントを、Ｘｂａｌと Ｐｓｊｌで切ったｐＳＰ６５に、トリプルリゲーション方法で縦につないでサブ クローンした。

第３図。ｐｓＰＨＢＶＡ１３　＆びｐＳＰ）ＩＲＶＢ８１３構築を図示。５Ｖ４ ０Ｐｌ！　およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに接したｄｈｆｒ遺伝子をｐ ＳνＥ１００−ｄｈｆｒからＥｃｏＲ１／ｌｉｌ化により分離し、末端をＫｌｅ ｎｏｗフラグメントで満たし、さらに５Ｉｌａｌで消化した。

１３００　ｂｐ　プラントエンドフラグメントをｐＳＰＨＢＶ８−１　及びｐＳ ＰＨＢＶＢ８　（コレらハｄｈｆｒと同様ニＨＢｓＡｇ　Ｏ）配列を含むプラス ミド１）ＳＰＨＢＶＡ１３及びｐＳＰ）ＩＢＶＢ１３を生成すル）ノＰｖｕｌｌ 　サイトにサブクローンした。

第４図。第４図はＨＢｓＡｇ粒子の製造及び精製の好ましい方法へを説明するフ ロー図である。

第５図。！（ＢｓＡｇ　（精製したＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子）のスクロース結合 。粒子をスクロース勾配５０〜５％スクロースに与え、ＢｅｃｋＩｌｔｎ　＠　 Ｓｌ＃　２７　ローターで２７００Ｏｒｐｍ、１６〜２１℃で１８時間超遠心に かけた。底からプールした１、８１　フラクションをＨＢｓＡｇ存在及びスクロ ース濃度に関して分析した（屈折計）。

第６図。ＨＢｓＡｇの固相ラジオイムノアンセイ。固相ラジオイムノアッセイギ ット（Ｔｒａｎｅｎｏｌ）を使用した。

ｔａｌ　　既知標準（Ａｂｂｏｔｔ）を本出願人の組み換えＨＢｓＡｇ（ＣＨＯ ）の検量線と比較した。

ｆｂｌ　　ＣＨＯ細胞で生産される組み換えＨＢｓＡｇワクチンの検量線。本出 願人のワクチン（ＣＨＯ）を血漿由来（）ｌＢｓＡｉｒ）　　ワクチン（Ｉ（ｅ ｐｔａｖａｘ　Ｂ　＠　＞　及び酵母組み換えワクチン（Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ 　ＨＢ　＠　）の検量線と比較した。

第７図。セロコンバージョンによるＨＢｓＡｇ効果アッセイ。本出願人のワクチ ン（Ｃ）１０）を血漿由来ワクチン（Ｈｅｐａｔａｖａｘ　Ｂ　＠　）及び酵母 組み換えワクチン（Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ　ＨＢ　＠　）　　と比較した。

Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを１１　ワクチンで腹腔内感染させた（各ワクチン濃度に対 してマウス１０匹を使用した）。注射１゜日後、マウスを瀉血し、血清を標準血 清（ｉｌＨＯ）に対して検量した＾ｕｓａｂ　ＥＩＡ　”’キット（Ａｂｂｏｔ ｔ　　■）により抗ＨＢｓＡｇ抗体の存在に関して試験した。

第８図。これは）ＩＢＳＡｒ粒子の製造及び精製の特に好ましい方法を説明する フロー図である（好ましい方法Ｂ）。

第９図。これはＨＢｓＡｇ粒子の製造及び精製の特に好ましい方法Ｃを説明する フロー図である。

第１０図。酵母組み換えワクチン（Ｒｐｃｏｍｂｉｖａｘ　ＨＢ　＠　）　と比 較しまた本出願人のワクチンを注射した非応答マウスにおける抗Ｓ抗体の検出及 び定量。

Ｂの　ｔ−日 本発明は以下のステップを含む精製したＢ型肝炎表面抗原粒子を製造するための 新規な方法を提供する。

ｔａ＋　　培地で粒子を生産する哺乳類細胞を培養して、細胞にＢ型肝炎表面抗 原粒子を培地中に分泌させる。培地は約３　ＸＩＯ３ドルトンより大きい分子量 を有する分子を含まない血清を補充されている。

（ｂｌ　　全ての細胞、細胞の残骸、粒子集合体を得られたＢ型肝炎表面抗原粒 子を含む培地から除去する。

ｆｃ）　　得られた培地を処理して、そこに存在するＢ型肝炎表面抗原粒子を濃 縮および精製する。

（ｄｉ　　得られた濃縮、精製Ｂ型肝炎表面抗原粒子を回収する。

上記方法によって製造された粒子はヒトＢ型肝炎表面抗原粒子であり得る。

本発明はさらに、精製）ＩＢｓＡｇ粒子を回収する方法を提供する。該方法はさ らにステップｔｃ＋で得られたＨＢｓＡｇをさらに精製して、粒子を含む溶液を クロマトグラフィーカラムに通して、これらの粒子を回収することにより低分子 量不純物を除くことを含む。ステップｆｃｌの濃度は、非バッチ精製システムに おける粒子をさらに精製させるための適当な条件下で処理する。

肝炎粒子を分泌する哺乳類細胞く例えばウシ胎児血清）を含む培地に加えられる 血清が、培地に細胞を置く前に、高分子量不純物タンパク（即ち約３００．００ ０　　ドルトンより大きい分子量を宵するタンパク）を含まないことは本発明の 重要な要素である。このようなタンパクは、例えば血清を予備分画化することに より（すなわち限外ろ過を通す）、血清から除去される。

約３００により大きい分子量を有する汚染タンパクの血清からの除去の不足は、 続く精製ステップにおける汚染タンパクが高レベルになり、収量を下げ、純度を 下げる。

限外ろ過ステップを使用することにより、本発明において予備分画化が行われる が、培地に加えられた血清か高分子量汚染タンパクを減らす任意の方法が同じ結 果を与えることは当業者にはわかるはずである。

全ての細胞、細胞の残骸、粒子集合体からのＢ型肝炎表面抗原粒子の分離は、当 業者に知られている任意方法によって行ってもよいが、限外ろ過ステ・ノブが好 まし０゜限外ろ過ステップから得られたＨＢｓＡｇ粒子を含むろ過物を次いでさ らなる精製用に回収する。

分離ステップ（ｂｌで使用するパッチ容量がクロマトグラフィーカラム上の好ま しい連続精製ステ・ツブ（例えばゲルクロマトグラフィーステップ）に適用する には大きすぎるので、ＨＢｓＡｇ粒子はさらに濃縮し、さらに精製され得る。精 製は好ましくは分離ステップ（ｂｌの後に得られたろ過物に対して、分子量約３ ００に未満を有する汚染分子を除去する限外ろ過ステ・ツブまで実施される。所 望ＨＢＳＡｆ粒子を含む残留物は次いでさらに精製してもよ（１゜好ましい本発 明の具体例において、さらなる精製は透析番こよって行われ、透析は好ましくは さらに濃縮するための他の限外ろ過ステップに続く。

濃縮し、精製したＨＢｓＡｇ粒子は次いでクロマトグラフィー使用により（好ま しくはゲルろ過カラム）、さら番こ精製して、さらに汚染低分子量粒子を除去し てもよ０゜ゲルろ過ステップはさらに精製するために好ましく（よ２回繰り返す 。ゲルろ過クロマトグラフィーは好ましく番よ、Ｎ、　Ｎ’−メチレンビスアク リルアミドと共有架橋結合したアリルデキストランのカラム上で行う。ゲルろ過 カラムは分子量約Ｉ　　ＸＩＯ’　　ドルトンより大きい分子を排除する。

方法は、以下の実施例、特に実施例５でより詳しく記載している。

本発明のとりわけ好ましい方法において、精製し、濃縮したヒトＢ型肝炎表面抗 原粒子が以下のステップにより得られ得る。

（ａｌ　　培地で粒子を生産する哺乳類細胞を培養して、細胞にＢ型肝炎表面抗 原粒子を培地中に分泌させる。培地は約３　ＸＩＯ’　　トルトンより大きい分 子量を有する分子を含まない血清を補充されている。

ｔｂ＋　　全ての細胞、細胞の残骸、粒子集合体を得られたＢ型肝炎表面抗原粒 子を含む培地から除去する。

＋Ｃ１得られた培地を処理して、濃縮したヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を含む溶液 を得る。

ｔｄｌ　　ｍ縮した抗原粒子を含む得られた溶液を処理して、溶液中のＤＮＡ含 有量を減らす。

ｔｅｌ　　濃縮し、精製した表面抗原粒子を含む得られた溶液のｐＨを調節し、 必要によりｐＨ約３．０〜約７．０を得る。

げ）　得られた溶液内に存在する濃縮した表面抗原粒子を精製する。

（ｇ　精製し、濃縮したヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を回収する。

この特に好ましい例は実施例＋１に記載する。この特に好ましい方法によると、 ステップ＋Ｃ１から回収した濃縮抗原粒子を含む溶液はさらに精製した後、回収 する。特に好ましい方法のステップａ、ｂ、ｃは実施例５に記載されている方法 におけるのと同じであり、上記の実施例５の方法も実施例１１の方法に適用する 。追加の方法は実施例１３に記載されている。

培地を処理して濃ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を含む溶液を得た後、得られた溶液 を処理して溶液のＤ）ＩＡ含有量を減らす。一方の好ましい方法（実施例１１参 照）において、ＤＮＡ含有量を減らすための処理はＤＮａｓｅを溶液に添加する ことから成る。もう一つの好ましい方法〈実施例１３参照）において、ＤＮＡ含 有量を減らすための処理は、溶液をアニオン交換クロマトグラフィー（好ましく はジエチルアミンエチル官能基を有する架橋されたアゴ０−スのカラム上で）に かけることから成る。このアニオン交換クロマトグラフィーステップはＤＮａｓ ｅ溶液処理に続いてもよい。

濃縮し、精製した表面抗原粒子を含む得られた溶液のｐＨを、必要によりｐＨ約 ３．０〜約７．０を得るように調節する。本発明の一方の好ましい具体例におい て、得られた溶液を酸で処理することによりｐＨが調節され、濁りが現れる。濁 りはタンパク不純物を含むか、ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子から好ましくは遠心分 離によって分離可能である。このステップは酸処理された抗原粒子のさらなる精 製である。

あるいは、ＤＮＡ及びタンパク不純物は、−Ｆ記抗原粒子の溶液からイオンク０ マドグラフィー（好ましくはアニオンクロマトグラフィー）使用によって除去し てもよく、これにより溶出容量を伴うＨＢｓＡｇ粒子溶出物並びにＤＮＡ及びタ ンパク不純物がカラムに結合あるいは流出か遅延する。アニオン交換カラムは好 ましくはＤＥＡＥアニオン交換カラムである。本発明の特に好ましい具体例にお いて、ＤＮＡ及び他の不純物を除去するために使用するカラムは、ＤＥＡＥ官能 基と架橋したアガロースカラムである。このようなカラムの一例としてＤＥＡＥ −５ｅｐｈａｒｏｓｅがある。この方法は実施例１３により詳しく記載されてい る。

もう一つの代案は、上記二つの方法と組み合わせることである。即ちＯＮλｓｅ 処理によるＤＮＡ含有量を減らし、次いで酸性化し、ＤＥＡＥカラム上でＤＮＡ を連続的に除去する。

一方、ＤＮＡ除去の後、任意の精製方法がさらなる精製に使用され得ることが当 業者には明らかである。例えばカチオンもしくはアニオン交換クロマトグラフィ ー、強カチオン交換りロマトフラフィーが好ましい（例えばスホン酸官能基を有 するカラムを使用）。本発明の特に好ま（、い具体例において、さらなる精製に 使用するカチオン交換カラムはスルホン酸官能基として以下の式を有するＮ−ア クリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールで ある。

−Ｃ０Ｎ）ｌ　−Ｃ（ＣＨ３）２−　ＣＨ２−５Ｏ３Ｈこのようなカラムの一例 としては５Ｐ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　＠　ＬＳがあ高度に精製、濃縮した抗原粒 子はさらにホルムアルデヒドで処理して、あらゆる生存する生物及び存在するウ ィルスを不活性化した後、さらに濃縮（好ましくは限外ろ過によって）してよい 。得られたさらに濃縮した粒子を次いでクロマトグラフィ−（好ましくはゲルろ 過クロマトグラフィー）によって精製する。得られたさらに濃縮した粒子は次い でクロマトグラフィー（好ましくはゲルろ過クロマトグラフィー）により精製す る。好ましいゲルろ過カラムはＮ、　）ｌ’−メチレンビスアクリルアミドと共 育架橋結合したアリルデキストランから成る。

実施例１０に記載のように、本発明の好ましいステップに代わるステップを使用 した場合、いろいろな問題が起こる。例えば、分離に関して限外ろ過に代わり遠 心分離を使用すると、多くの細胞不純物（例えば細胞膜及び脂質複合体）が除去 されず、全体の収量を下げ、ＨＢｓＡｇ粒子純度を下げる。遠心分離はコストも 時間もがかる。

０．２２ミクロン膜滅菌ンステムを使用すると、実施例に記載した異なる問題が 生じる。

同様に、濃縮に限外ろ過の代わりにＰＥＧを使用した場合、ＨＢｓＡｇ粒子の７ ５％回収率しか得られなかった。さらに、純度はより低く、プロセスはより時間 がかかった。

従って、代わりの方法（例えば実施例ＩＯに記載されている方法及び当業者によ ってわかる方法）を使用してもよいが、好ましい方法ステップは実施例５で議論 した。

さらに、上で議論したように、とりわけ本発明のとりわけ好ましい具体例は実施 例１１で説明する。

Ｂ型肝炎表面抗原をコードするｃＤＮＡを発現可能な任意の哺乳類細胞を使用し てよい。好ましい細胞はチャイニーズハムスター卵＃（ＣＨＯ）細胞　、特にＣ ＨＯ−ＨＢ２００細胞である。

Ｂ型肝炎表面抗原は哺乳類細胞（例えばＣＨＯ−ＨＢ２００）を培養することに よって得られる。培養条件は当業者に知られている。培養は回転瓶内またはマイ クロキャリアーを使用する醗酵槽内で行ってよい。

精製したＢ型肝炎表面抗原粒子はプロセスから回収する。上記のように、これら の精製粒子はＢ型肝炎表面抗原のプレーＳｌ　、プレー８２及びＳ抗原ポリペプ チドを含み、得られた純度は９５から９８−９９％に達し得る（９５％から９８ −９９％タンパク不純物なし）。精製したＢ型肝炎表面抗原粒子はさらに血漿由 来粒子に近い化学量論的量でプレー８１　、プレーＳ２及びＳ抗原ポリペプチド を含む。

より詳細には、精製したＢ型肝炎表面抗原粒子は表面抗原ポリペプチドを含有し 得、その場合Ｓ表面抗原ポリペプチドは７５〜８０％の粒子を含み、プレー８２ 表面抗原ポリペプチドは１０〜１５％の粒子を含み、プレー５１　表面抗原ポリ ペプチドは５〜ｌＯ％の粒子を含む。本発明の特定具体例において、Ｓ表面抗原 ポリペプチドは７８％の粒子を含み、プレー８２表面抗原ポリペプチドは１４％ の粒子を含み、プレーＳｌ　表面抗原ポリペプチドは８ｘの粒子を含む。

本発明のより特定的具体例において、本発明は精製したＢ型肝炎表面抗原粒子を 含み、その場合、表面抗原ポリペプチドは以下の量で存在しえる。

３　　　２４ｋＤ　　非グリコジル化　６２．４％３　　　２７ｋＤ　　グリコ ジル化　　６２．４％プレーＳ２３３ｋＤ　　−グリコジル化　１０８％プレー Ｓ２３６ｋＤ　　ニグリコシル化　　３．２％プレーＳ１２９ｋＤ　　非グリコ ジル化　　６．１％上に論じた量が回収された生成物の純度によって変化し得る ことが当業者にはわかる。

本発明はさらに、上記方法で生産したＢ型肝炎表面抗原粒子の効果的免疫化量及 び適当なキャリアーを含むＢ盟肝炎表面抗原ワクチンを提供する。

実　　　施　　　例 次の実施例は、本発明の理解を助けるために示すものであって、これによって本 発明の範囲を限定する意図は全くないし、限定的に解釈されるべきでもない。こ れらの実施例は、ベクターの産生、ペプチドをコードする遺伝子のベクター中へ の挿入、または生じたプラスミドのホストへの導入に利用される慣用的な方法に ついては詳細には説明していない。また、実施例はこのようなホストベクター系 によって産生されるポリペプチドを分析するために使用される慣用的手法の詳細 も示していない。

更に、実施例は、哺乳動物の組織培養についての、また、組繊培養細胞の組換え ＤＮＡの形質転換についての、更には、形質転換された組織培養細胞によって生 産されたペプチドの限外が過やゲル１濾過による精製についての慣用的方法の詳 細を示していない。

このような方法は、当業者にとって周知であり、多くの文献に開示されている。

例えば、次のような文献である。

一般的分子生物学的方法 Ｍａｎ口１０等、モレキコラークローニング　ラポラトリーマニコアル、コール ド　スプリング　／’ｔ−バード　ラボラトリ−、ニューヨーク（１９Ｂ２）　 　；　Ｄ１ｙ口等ベーシック　メソッド　インモレキュラー　バイオロジー、エ ルセヴイア、ニューヨーク、アムステルダム（１９８６） 哺乳動物組織培養法 １１＋ｌ＋ｏｂとＣｈａ＋ｉｎ、　Ｐｒ０Ｃ，Ｎ１１１．　Ａｃｘｄ、　Ｓｅｉ 、　７７　：　４２１６−４２２０　（１９８０）　；ヘパタイ！・ティス　ア ンド　リヴアー　デイジイーズ、ｖｙｘＩ等（＋ｄ＋）、　４７７−４８５．　 Ｇ＋ｏｎｅとＳｌ＋１ｔｌｏｎ　Ｉｎｃ、　　オルランド、フロリダ（１９８４ ）　；　Ｍｉｃｂｅｌ等、バイオ／テクノロンイー　３：　　５６１〜５６６フ ィーンヤー　イン　“ゲル　フィルトレージョン　りロマトグラフィ”、エルセ ビイア、アムステルダム（１９８０）哺乳動物細胞系 本出願人は、ウエイズマン　インステイテユート／イエダリサーチ　アンド　デ ベロップメント　カンパニーによって開２ＨＭ＋　　　　　　　　　　　　　　 　　　５０１ｂ発されたＣＨＯｐ７．５ＡＬ２６とＣＨＯｐ７．５ＡＬ２６によ って示される細胞系を用い、それぞれ寄託番号Ｎｏ、　ｌ−５７１とＮｏ、　ｌ −５７５の下、パスツール研究所に寄託した。これらプラスミドの構造は、出願 中の欧州特許出願に開示されている。選択可能な形質導入用プラスミドにＨＢｓ Ａｇ遺伝子領域を同じように含んでいる他の哺乳動物細胞系を、本発明の実施に 際して倒木発明のため開発され且つ使用された細胞系とプラスミドＭ＋２００ 本出願人は、ＣＨＯ細胞系ＣＨＯｐ７．５　ＡＬ２６　（第１図）　を用いＨＢ ｓＡｇ粒子を産生・精製した。しかし、本出願人はこの細胞系がマイコブプラズ マで汚染されていることを知見した。それで、使用前浄化（キユアリング）を必 要とした。

この細胞系は、ＣＨＯｄｈｌ＋細胞をプラスミドｐ７．５ＡＬ２６からのＤＮＡ とｄｈｌｔ遺伝子を含むプラスミドからのＤＮＡで、トランスフェクトすること によって、形成された。ｐ７．５ＡＬ２６ＤＮＡ対ｄｂｌ＋遺伝子を含むプラス ミドのＤＮＡの比は、１０対１であった。

プラスミドｐ７．５人Ｌ２６は、ｐＢＲ３２２のＥｅｏＲ１部位に、“ＴＡＴ人 ”プロモーターと“ＳＶ　４Ｏ−１ｉｋｅ”プロモーターとによって示されるＨ 　Ｂ　Ｖプロモーターと共ニｐｉｅ−ＳＢ：　ｐｒｔ−８２領域を含む全ＨＢＶ 表面抗原遺伝子を含有する７、５ｋｂのＥｃｏＲｌ　フラグメントを挿入するこ とによって、形成した。

更に、そのプラスミドはＨＢＶエンノ＼ンサー因子と、３′末端下流に２〜３個 のポリアデニル化位とを含む。そのＤＮＡを、５ｈｅａｆ等、］、Ｖｉ＋ｏ１． ５１：　　７７６〜７８７（１９８４１の手法によってアレキサンダー細胞から 単離したところ、ＨＢＶ　ＤＮＡの５′と３′の末端に（アレキサンダー細胞か らの）側鎖状ホスト配列を含んでし）た。その後、形質導入された細胞をメソト レキサイト（２０Ｏｎ１ｍｌで処理し、次いで耐性細胞を選んだ。

他の細胞系を、側鎖状ホスト細胞（アレキサングー）ＤＮＡ配列の大半または全 てを除くために処理された同様なＨＢＶ　ＤＮＡで形質転換した。このように、 例えば、ｐ７．５＾Ｌ２６からの３．１ｌｋｂのＰ！ｌ　ＤＮＡフラグメントが ｐＳＰ６４に導入された。生じたプラスミド、つまりｐｓＩ’ＨＢＶ８−Ｉ　Ｉ ｔ、ＨＢＶプｏ−Ｔ−−９−ＴＡＴＡボックスの上流にヒトＤＮＡの１００ｂｐ と、前記遺伝子の３″末端下流域のＰ　域にわたってヒトＤＮＡの６ＧＯｂｐと を含んでいた。

Ａ、細胞系ＣＨＯ２００Ｍ″ ｐ７．５ＡＬ２６へ吏共 マイコプラズマで汚染された細胞系Ｃ）１０２００Ｍ’　９７．５ＡＬ２６を抗 生物質キット、即ちＢＭ−ＣＹＣＬＩＮＥＴＭ（ボーリンガ−、マンハイム）を 用いて浄化した。その浄化は、そのキットに適合したプロトコール（ボーリンガ −・マンハイムカタログＮｏ、　７９９０５０参照）に従って、正確に実施した 。この浄化によって、我々がＣＨＯ−ＨＢ２００と表示する細胞系の産生が成功 した。それはマイコプラズマを含んでおらず、しかも多量のＨＢｓＡｇ粒子を産 生ずる。

この細胞系によるイムノ反応性のＨＢｓＡｇの形成・発現（量）を、群生培養物 の培地の分析によって定量した。ＨＢｓＡｇ検出のためのトラベノール（登録商 標）固相ラジオイムノγソセイキットを用いて、ＣＨＯ−ＨＢ２００培養物の培 地は３〜５ｆＩｇ／Ｉ−イノム反応性ＨＢｓＡｇを含むことが測定された。

選び出したクーロンＣＨＯ−ＨＢ　２００は少なくとも６ケ月ＨＢｓＡｇを安定 に産生じた。

Ｄ　新規ＨＢｓＡｇ発現プラスミドの開発プラスミドｐｓＰＩＩＢＶＢ−１（第 １図）を、更に処理し、残存している上流アレキサンダー細胞ＤＮＡ配列を除去 した。これは、ｐｓＰ）ＩＢＶＢ−１のＸｂａｌ−ＥｅｏＲＩフラグメント５０ ０ｂｐ　とＥｃｏＲｌ−？ｔ１７ラグメント２４０ＱｂｐとをｐｓＰ６５にサブ クローニングすることによって行った。こうして、ｐｓＰＲＢＶＢ８　　（第２ 図）が産生された。

ｄｈｆ＋遺伝子を、ＳＶ４０初期プロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化位置の 制御下、ｐｓＰＨＢＹｌｌ−１とｐｓＰｌ（ＢＶＢ８とにサブクローニングして 、それぞれｐｓＰＨＢＶＡＬ３とｐｓＰＨＢＶＢｌ１１３を［１生した（３３図 ）。これは、全ての正規配列をもったｄｂＩｒ遺伝子を含む、ｐｓＶＥｌｏｏ− ｄｈ＋＋のフィルドイン（ｆｉｌｌｃｄ−ｉｎ）　　ＥｃｏＲＩ−３ｎ暑ｌフラ グメント１３００１Ｂを適切なＨＢＶプラスミドの　Ｐｖｏ■位にサブクローニ ングすることによって、行なわれた。

通常のプロモーターの制御を受けるＨＢｓＡｇ遺伝子を含む短化構造物を、ＳＶ ４０初期プロモーターの制御下のｄｈｆ＋遺伝子と共に、ｄｈｌｒ　ＣＨＯ細胞 にトランスフェクトした。

本発明で出願人が使用した次の方法は、一般に、哺乳動物細胞の組繊培養に用い られる標準手法である。これらの方法の変形例は、既に開示されており、同様な 目的のために使用し得る（我々の方法等を含む種々の方法の例は、次の文献を参 照されラル　ヘブタイティス　アンド　リヴアー　ディジイーズ°。

ｖｙ＆を等　（ｃｄ＋１４７７−４８５．　　Ｇ＋ｕｎｅと５ｌｉｔ口ｏｎ　Ｉ ｎｃ　　オルランド、フロリダ（１９８４）　；そして、Ｍｉｃｈｃｌ等、バイ オ−テクノロジー３：５６１〜５６６　（１９８５） ＡＩ　　トリプシン処理 群生培養物を二次培養または冷凍保存の前に、トリプシン処理した。培養培地、 即ちダルベツコの変形ミニマルイーグルズ（Ｄｎｌｂｅｃｃｏ’＋　Ｍｏｄｉｌ ｉｓｄ　ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅａｇｌｅ’ｉ：ＤＭＥＭ−）を、培養容器から捨て 、次いで冷却トリプシン溶液（０，２５％、１，３に希釈）のＰＢＳ希釈液を添 加した（添加されたトリプシンの容量は、当初の成長用培地の容量の約１／１０ であった。固定された（　１ｎｃｂｏ＋ｔｄ）細胞をすばやく洗浄し、余分なト リプシンを除去した。５〜１０分後３７℃で、残留トリプシンが細胞に接触して いる間、５〜１０％のウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）が補填された成長用培地（ＤＭ ＥＭ）を培養容器に添加し、トリプシン処理を止めた。

おだやかな振盪の後、固定されている細胞を壁から除去し、培地中に懸濁させた 。これらの細胞は二次培養するか、長期の凍結保存に供した。

０．２５％トリプシン溶液の調整（ストック）トリプシン溶液は、次の成分を含 む。

８０ｇ　　ＮａＣＮ、　　　　　４ｇ　　ＫＣｊ！ｌｆ１ｇデキストラーゼ、３ ．５　ｇ　　ＮｌＨＣＯ３２５ｇトリプシン（１，３００１ＣＮ）上記全成分を ＩＨの水に溶かし、そしてｐ　Ｈを８．５に調整した。その後、上記溶液を０． ２２ミクロンのフィルターによって枦遇し、次いで（−２０℃）冷却した。これ で、数年保存が可能でストックした上記溶液を、トリプシンを含まない以外は上 のストック溶液と同じ配合物を含む溶液で１：３に希釈した。

細胞の長期保存が必要なときはいつでも、次の操作を実施した。群生培養物を、 セフシランで記したようにトリプシン処理した。懸濁された細胞を１０９６のＦ ｅ２が補填されたＤＭＥＭ培地中で１．２度洗浄した。洗浄後、その細胞を２０ ％Ｆ　ＣＳ　＋　１０９６　Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏを含む培地中に再び懸濁すると、最 終細胞濃度は３〜４Ｘ１０６細胞数／　ｍｌに達した。使用されている容器の温 度を１時間で室温にまで」二げ、その後−２０℃のフリーザーに移した。次の朝 、２４時間かけて凍った容器を一７０℃とした。最終的に、容器を長期間液体窒 素中に置いた。約１週間後、１〜３個の容器を細胞生存能力分析のために解凍し た。

こうして、マスター細胞及びワーキング用細胞・バンクが設貯蔵された凍結細胞 を含む容器を液体窒素貯蔵タンクからすばやく取り出し、３７℃の水浴に入れた 。細胞をすばやく溶かし、１０％ＦＣ３の補填された２５〜５０ｍ１のＤＭＥＭ を含むＴ型フラスコ（７５〜１５０　Ｃｌ１ｌ）に移した。数時間後、細胞の大 半は、底に付着していることがわかった。培地を、細胞の解凍後４時間、補充し た。約５〜８日後、培養物は、群生した。

実施例　３ 全てのＣＨＯ細胞系を１０ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｅｏ）　、２０１１Ｍのへ ラプス［Ｈｅｐｅ＋］　（Ｒｔｎｇｈｌ　Ｌｔｄ、）、３０ＩＩＭのＮａＨＣＯ ２（メルク）、１５０〜／　ｍｌのプロリン［Ｐ＋ｏｌｉｎｅｌ　（Ｓｉｇｍａ ）及び４０１１９　／　ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｐｓ）を含むＤＭＥＭ中で 成長させた。培養物の要求に沿うように、培地は２〜ｌＯ％のウシ胎児血清（Ｆ ｅ２）　（Ｂｏｃｋｎｅｋ）で補填された。培地の最適作用ｐＨは７．１５〜７ ２５の範囲であ８５０ａ＋＋　　又は４９０ａ１１３のプラスチック製の回転瓶 （コーニング）を、細胞成長とＨＢｓＡｇ産生のために用いた。群生培養物をト リプシン処理し、次いで細胞を１０％のＦｅ２が補填されたＤＭＥＭ培地中に懸 濁し、再培養のために用いた。各回転瓶を、＋ａｏｉのＦｅ２が補填され且つ少 なくとも　５Ｘ　１０６個の細胞を含む５０〜１００ｍ１の培地を用いて、接種 （植え継ぎ）した。接種材料の大きさによって、再群生するために培養物に必要 とされる時間が決定される（それは２〜１０日であり得る）。接種後、数時間で 、細胞の大半は、結合し、広がり始めた。２４時間後、細胞分裂が観察された。

培養物が群生するまで１０％ＦＣ３で補填された培地を用いることを勧める。そ の後ＦＣ３量を２〜５％に減する。Ｆｅ２の減量は長期の細胞維持及び産生に最 適である。このような培養物は、Ｉ−ｆ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ産生能力を失うことな く、６ケ月もの間維持可能である。

群生培養物中の細胞は、回転瓶１個につき２．１０８〜１０９であった。

ＣＨＯ細胞の激しい典型的な代謝は、高い細胞密度と共に、培地の速かな　ｐＨ 減を生ずる。たぶん、これは一方では培地の消耗によって、他方では望まない毒 性代謝物の放散よって起きると思われる。可能性のある細胞損傷を防ぐために、 群生培養物中の培地を毎日充当することを勧める。

ＣＨＯ−Ｆ（３２００（実施例１）によるＨＢｓＡｇの形成・産生を、長期間の 連続的なＨＢｓＡｇ産生のために利用した。毎日１つの培地を補充することによ って、群生培養物中のＨＢ　ｓＡｇ産生は少なくとも６ケ月間安定であった。産 生速度は４〜５■／　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ／　Ｌ／２４ｈであった。それは連続培 養の６ケ月間不変であった。

多量のＨＢｓＡｇが回転瓶培養系中で産生じ得るけれども、この方法は、限られ た商業生産のためにふされしいだけである。

主な制限は関与する労働量と効率の悪い操作とによる。

故に、回転瓶系は、マイクロキャリアを用いたスピナと発酵器のような大量生産 系を接種するために用いられる細胞についての成長に推薦できる。

実施例の標題に示したように、以下の実施例に述べる方法は一つの好ましい方法 にすぎない。より好ましい方法を実施例１１として記載する。その方法は本発明 の特に好ましい方法である。図４及び図８は各々、この二つの方法についてのフ ローダＨＢｓＡｇの製造にあたって、（実施例３，４で述べたような）ローラー ボトルンステムを用いた。使用した培地は、高分子量の不純物タンパク質を除去 するために分画分子量３００．０００の膜を備えたベリコン（Ｐｅｌｌｉ＋ｏ３ 　登録商標）システム（ペリコンタンゼンシャル（丁ｔｎｇｅｎｌｉ＋ｌ）フロ ー限外が過、ミリポア）を用いた限外濾過により予め分画した２〜ｌＯ％ＦＣ３ ，好ましくは２％ＦＣ８を含有する（工程１）。

培養基ｆｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｅｄ口）は毎日採取し、プールした（）＼−ベスト ）。ハーベストしたＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を含む培地を、細胞と大きい細胞片 を除去するために０２２ミクロン膜を備えたベリコンタンゼンシャルフロー限９ １．　？？過（ミリポア）により清澄化した（工程２）。最後に、清澄化した粗 培地を濃縮し、分画分子量３００．０００の膜を備えたベリコンタンゼンンヤル ７０−限外１濾過（ミリポア）により（ＰＢＳで）透析した（工程３）。濃縮物 をさらに２回連続してセファクリル（Ｓｅｐｈ＊ｃＢｌｌ　Ｓ−４００（登録商 標）カラム（２，６ＣＩＩ　Ｘ　１９Ｇ　ｃｍ）　（ファルマシア）上でゲルが 過クロマトグラフィーにより精製した。各々の操作の後、ＨＢｓＡｇ粒子を含む ピーク画分を、分画分子量３００．　ＯＨの膜を備えたミニタン（１ｎｉｌ＋ｎ 、登録商標）タンゼンシャルフロー限外濾過システム（ミリポア）を用いて濃縮 した。図４に精製方法をまとめて示す。ＨＢｓＡｇ粒子を精製するこの新規な方 法を用いた結果を実施例６に示す。この実施例は、高度に精製されたＨＢｓＡｇ 粒子１００ｍｇのバッチ製造に関するものである。

ベリコン及びミニタンタンゼンシャルフロー限外１濾過工程において使用した方 法は、製造者（ミリボア社）提供のプロトコールに記載のとおりである。１リツ トルのベット容積を有するセファクリルＳ−４００カラムを用いるゲルが適法は 製造者（ファルマシアファインケミカルス）の記載のとおりである。精製プロセ スを通して、出願人は、限外が過、透析、およびゲル清適クロマトグラフィー（ 装填及び溶出）におけるバッファーとしてリン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を使用 した。また、カルシウム）＋ （Ｃｇ　　）及びマグネシウム（ｆｉｇ＋＋）を含有しないＰＢＳバッフ十＋ 以下の方法により、ＣＩ　　及び匂＋１を含有しないＰＢＳバッファー（×１） を調製する。

０・２　ｇ　　　ＫＨ２ＰＯ４ 上記の成分を１リツトルの水（発熱物質を含まない二回蒸留したもの）に溶解す る。溶液のｐＨを７２５に調製する。

Ｃ６新規なＨＢｓＡｇ製造−精製プロセスの詳細な説明工程１：細胞培地（培養 物）の予備分画ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を産生じ培地中に分泌するＣ　ＨＯ−ＨＢ 　２ＧＧ細胞（実施例１に記載）をローラーボトル培養システム（実施例３及び ４に記載）中で生育させた。典型的には、２０個のこのようなローラーボトル中 で細胞を生育した。

培地は以下のようにＦｅ２で補った。すなわち、ローラーボトルに接種するには 、１０％ＦＣ３で補った培地を用いた。日毎に（−日経った古い培地を新しい培 地で交換することにより）細胞培養培地を補給するには、２〜５％ＦＣ３，好ま しくは２９６　Ｆ　ＣＳで補った培地を用いた。これら二つの場合、Ｆｅ２て補 った培地はまず、分画分子量３００．０００の膜を備えたベリコンタンゼンシャ ルフロー限外清適システムを用いて予め分画を行った。供給側及び留出側のゲー ジ圧力は典型的にはＯｐ！１付近であった。屏液（分子量３０Ｇ、　ＮＯ以下の ＦＣ３補充培地成分）のみを細胞に加える。

ローラーボトルに接種するには、少なくとも５Ｘ１０６のＣＨＯ−ＨＢ２００細 胞を含む予め分画された１０％ＦＣ３補充培地１００ｍ１を各々のローラーボト ルに注いだ。細胞はこの培地中で互いに接するようになるまで（２〜１０日間） 生育した。

細胞が互いに接するようになったとき、すなわちローラーボトルあたり２×１０ 〜１×１０９細胞に達したとき、細胞により産生されたＨＢｓＡｇ粒子の精製を 開始した。１０％ＦＣ８を補った接種培地を細胞培養液から除いて捨て、これを 予め分画した２％ＦＣ３補充培地で置換した。細胞をこの培地中で少なくとも６ ケ月間、培地を毎日交換しながら生育した。集密的細胞は１日１リツトル（１０ 個のローラーボトル）あたり４〜５■のＴ（ＢｓＡｇ粒子を産生ずる。培地をロ ーラーボトルから毎日（１日あたり２０Ｘ　１００　ｍｌ−２リツトル）取り除 くが、培地は分泌されたＨＢｓＡｇ粒子を含有する。これらの収集した培地をプ ールし、４℃で貯蔵する。毎日収集しプールした集密的培地が２５リツトル貯っ たとき（８０〜１００■ＨＢｓＡｇ、１３日培養）、工程２で示すように、この プールした培地からＨＢｓＡｇをバッチ式に精製することを開始する。

上述のユニークなＦｅ２−補充培地の予備分画工程により、ＨＢｓＡｇ粒子の精 製を最少の工程数で高純度にまで行なうことが可能となる。この理由を以下に概 括する。

分泌されたＨＢｓＡｇ粒子を含む培地中の主な不純物はＦｅ２に由来するタンパ ク質である。最良の培養条件を実現するにはＦｅ２は必要であり、従って細胞培 養液から除外することはできない。分泌されたＨＢｓＡｇ粒子は高分子量を有す るので、精製の際ＨＢｓＡｇ画分に混入するタンパク質は高分子量のものであろ う。上述の分画分子量３００．０００の膜での予備分画を行なうと、培地から高 分子量のタンパク質混入物の大部分が除去される。事実上、分子量３００．００ ０以下のＦＣ３補充培地成分のみが培養液に加えられる。従って、細胞培！Ｉ液 から抗体複合体やポリアルブミン凝集体のような高分子量のタンパク複合体が排 除される。実際に、予め分画した培地中で生育した細胞の生育及びＨｒ３　ｓ　 Ａ　ｇ産生特性を予め分画しなかった相当する培地中で生育した場合と比較する と、前者の培地は両方の観点について優れていた。つまり、予備分画した培地は ２つの主要な利点、すなわちより良好な細胞生長及びＨＢ　ｓ　Ａ　ｇの精製に おけるより少ない不純物レベルという利点を提供する。

最後に、以下の精製工程においては、主として低分子量タンパク質混入物から高 分子量のＨＢｓＡｇ粒子を分離することが必要となる。これらの混入物は、主な 両分として、分子量が約９７、　ＮｏダルトンのＦＣＳ由来のアルブミンを含有 している。

工程２　：　［（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を含む収集した培地（ｃｌ′１ｌｔｕｒｅ 　ｍｅｄｉｘ）の清澄化 この工程は実際にはＨＢｓＡｇ精製プロセスの第１段階であり、（ＨＢｓＡｇを 含む）収集した培地中に存在する遊離した全細胞及び細胞片が培地から除去され る。この工程は通常粗培地の清澄化と呼ばれている。出願人は０．２２ミクロン フィルターを備えたタンゼンシャルフロー限外が過システムを用いてＨＢｓＡｇ 含有培地を清澄化した。典型的には、−回の操作（Ｔ　Ｏｎ）毎に２５リツトル のバッチ（８０〜１００■のＨＢｓＡｇ粒子）をこのシステムで濾過する。供給 側と留出側ゲージの圧力読取値はＱｐ＋ｉに保持する。１時間あたり数百リット ルの培地をン濾過可能なので、このシステムではより大量のあるいはより多数の バッチを処理しうる。各々のバッチを１濾過したのち、システムは５〜１０リツ トルのＰＢＳで洗浄される。従って、これは極めて迅速なプロセスでありかつ工 業的に適用可能である。

全細胞及び大きい細胞片（＞２２０ｎｍ）凝集体（例えば膜及び膜種合体、大き な細胞オルガネラ）のみが０．２２ミクロンのフィルター（２２Ｇｎｍｌ　によ って捕集される。この清澄化の限９１１濾過工程の濾液（２２ｎｍのＨＢｓＡｇ 粒子を含む）のみが集められ、さらに工程３〜工程５に従って精製される。濾液 の量は最初の量と同じ、すなわちバッチあたり２５リツトルである。この清？登 化の限外が過工程によるＨＢｓＡｇ粒子又は全培地タンパク質の損失はない（１ ００％の回収）。

工程３：清澄化培地からＨＢｓＡｇ粒子の濃縮及び精製清澄化した粗培地（工程 ２）の量は、清澄化する前と同量であって、バッチあたり２５リツトルである。

この培地からＨＢ　ｓへｇ粒子を特異的に精製するには、第一に濃縮工程が必要 である。出願人のもののような多いバッチ量では、直接に精製プロセスの最終工 程（工程４．５）で用いるゲル濾過カラムでの精製に適用することはできない。

従って、濃縮工程が必要であり、残余の培地成分からＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を特 異的に精製するような濃縮工程が望ましい。このような工程は、清澄化した粗培 養物を分画分子量３００．　ＮＯの膜を備えたベリコンタンゼンジャルフロー限 外濾過システム中で濃縮することにより実現された。

このシステムはまた、密間隔Ｍ　９濾過システム内で、分画分子量３００、００ ０の膜により保持されたＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を透析することをも可能とする 。

出願人は２５リツトルの清澄化粗培養基をペリコン３００．０ＯＯＭＷフィルタ ーシステム（上記）に加え、濾液（分子量３００．０００以下のアルブミンを含 む分子）を捨てる。フィルター上に保持された物　（ｔｅｌ＋ｎ１ｉｌｅ）　（ 分子量約３００．０００以上のＨＢｓＡｇ粒子を含む分子）を１０Ｌ（リットル ）のＰ　Ｂ　Ｓ　（ＩＯＸ　ＩＬ）に対して透析する。透析後、保持された物の 量は６６０ｍ１であり、これは約４０倍の濃縮を意味する。

次いでこの６００ｍ１の濃縮物（あるいは保持された物）を集め、さらに分画分 子量３００．０００の膜を備えたミニタンタンゼンシャルフロー限外が過システ ム中で濃縮する。このミニタンシステムは、ペリコンシステムに比べてより少量 （１リツトルまで）の処理に適している。ミニタン限外が過の濾液を捨て、保持 された物のみを集める。典型的には、約６６０ｍ１のペリコン濃縮物（あるいは 保持された物）を装填した場合、ミニタンシステムから約１５０ｍ１の保持され た物（あるいは濃縮物）が回収される。

これは、さらに約４５倍濃縮されたことを意味する。従って、ペリコン及びミニ タンシステムを直列に用いて、全体としての濃縮は、清澄化粗培地の約１８０倍 の濃縮が得られている。各々のバッチ操作ののち、ペリコン及びミニタンシステ ムは５＝　ＩＱ■、のＰＢＳで洗浄される。

上記のシステムは清澄化した培養物（基）　（ｃｏｌｌａｔｅ　ｍｅｄｉａ）を 単に濃縮するのみならず、該培養物成分からＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子を特異的に精 製する。分画分子量３００．　ＯＨの膜を備えた上記システムで濃縮したのちに 、清澄化培養基の全タンパク質の　２５％のみが回収される。しかしながら、培 養基中の全ＨＢｓＡｇ粒子の９５％が回収される。このことは、培養基由来の混 入物からＨＢ　ｇ　Ａ　２粒子が特異的に精製されること（約３５倍）を示す。

元のＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子の９５％が回収されるが、これは回収された元の全タ ンパク質の　２５％の一部を構成するにすぎない。すなわち、全体と１５で　６ ３６■のタンパク質のうちの９５■がＨＢｓＡｇである（約１５％）。従って、 上記の　１００ｍｌの濃縮物（ミニタンでの保持された物）は、最終的なＨＢ　 ｓ　Ａ　２粒子の精・製を達成するために、さらにゲル７濾過により精製される 。

工程４　濃縮した清澄化培養基からＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子のゲルｌ濾過精製 ＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子をさらに精製するために、出願人はその化学的−物理的性 質、すなわち１〜２Ｘ１０６ダルトンの範囲にあるその有効分子量を利用した。

この理由で、１×１０６ダルトンより大きい分子量の分子を排除するセファクリ ルＳ−４００（ファルマシア）ゲル屏過カラムを使用する。セファクリルＳ−４ ００は、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドで共有結合により架橋されたア リルデキストランのゲルが過カラムである。

従って、ＨＢｓＡｇ粒子のような大きな分子は排除され、また迅速に溶出（留出 ）される。アルブミンや他のタンパク質のようなより小さい混入分子はカラムの 樹脂に入りそしてゆっくりと溶出される。この結果、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　粒子と 低分子量混入物との間での効率的な分離がなされる。出願人が使用したセファク リルＳ−４００カラムは２．６ｃｍ　Ｘ　１９０　ａａの寸法のものであり、有 効カラムベッド容積は１リツトルである。より大量の濃縮物もしくは濃縮物中の より多量のタンパク質に対しては、より容量の大きいセファクリルＳ−４００（ 登録商標）を使用しうる。

典型的なバッチにおける濃縮した培養物は容積で約１５０ｍ１（工程３）であり 、約６４０■の全タンパク質のうち約９５雌のＨＢｓＡｇ粒子を含む。濃縮の開 の透析工程の結果（工程３）として、濃縮物は従ってＨＢｓＡｇ粒子と混入タン パク質を含有するＰＢＳ溶液（つまり、１５０ｍ１のＰＢＳ中９５■のＨＢ　ｓ へｇ）である。濃縮物の各バッチについて、１本のみのセファクリルＳ　−４０ ０カラムを使用する。ただし、精製速度を上げるためにより多くを用いることも できる。カラムによるゲル濾過１回あたり、濃縮物の　Ｉ／３（５０ｍｌのＰＢ Ｓ中の約３２■の）（ＢｓＡｇ）をロード（装填）する。これはカラムベッド容 積の約５％（容積で）を意味する。流速は最良の分離となるように１時間あたり 約１０ｃに調節し、これは水柱で約２５〜３０口の低い操作圧をもたらす。

カラムからのＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子の溶出はＰＢＳを１べ・・Ｉド容積（１リツ トル）まで使用することにより行なわれる。溶出後、同じカラムを再使用する前 に、カラムを２〜３ベツド容積（２〜３リツトル）のＰＢＳで洗浄する。

Σ（ＢｓＡｇ粒子のサイズが大きいため、粒子はガラムベッド樹脂には入らず、 従ってカラムから迅速に溶出される。ＨＢｓＡｇ粒子のピークは数両分で回収さ れ、これはボイド容積のすぐあとの両分である。溶出画分は通常１つの両分が１ ０ｍ１である。

ＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子は１４〜＋５画分（１４０−１５０ｍｌ　）にわたって存 在する。

セファクリルＳ　−４００カラムからのＨＢｓＡｇ粒子の回収率は極めて高く、 精製の度合もかなりの程度である。５０ｍ１のＰＢＳ中のロードされた約３２■ のＨＢｓＡｇから　１４０　ｍｌの溶出液中に３０■のＨＢｓＡｇ粒子が回収さ れ、回収率は９２％であった。

ＨＢｓＡｇ粒子の精製度はカラム１回の操作で４〜５倍であった。全タンパク中 のＨＢｓＡｇ−特異的成分は溶出したＨＢｓＡｇピークの両分に対して６０〜７ ０％である（プレカラム濃縮物における全体の１５％のみという比率から増加） 。ＨＢｓＡｇ粒子をさらに純度９５％以上に精製するために、工程５に記載のよ うに同じセファクリルＳ−４００カラムを通しての第二のゲル濾過を行なう。

工程５：第一のゲルが過カラムの溶出ピークからのＨＢｓＡｇ粒子の第二のゲル が過精製 第−のゲル濾過操作（工程４）に使用したと同一のセファクリルＳ　−４００カ ラムを第二のゲル濾過操作に使用する。第一のゲルが過操作ののち、カラムを３ 〜５ベツド容積（３〜５Ｌ）のＰＢＳで洗浄して全ての結合している分子を除去 する。典型的な濃縮し清澄化した培養物の各バッチは、第一のカラムによる３〜 ４回の操作を要し、各操作は１／３の量の濃縮物について行なわれる。第二のゲ ルが過操作においては、２つの第一ゲル１濾過操作のピーク画分を合せた（各々 　１４０〜１５０ｍ１）。従って、典型的には、合せた溶出ＨＢｓＡｇ粒子ピー ク　２８０〜３００ｍ１をまず濃縮し、次いで第二のゲル１濾過操作としてセフ ァクリルＳ−４００カラムにロードする。（３番目の第一ゲル屏過で溶出したＨ ＢｓＡｇピークは次のバッチのものと合せて第二のゲルト１濾過操作に供される 。そこで、ＨＢｓＡｇ粒子を含有する濃縮培養物の２つのバッチ毎に、第一・の ゲルが過操作が６回、第二のゲルを濾過操作が３回必要となる。） 第二のゲル１濾過カラムにロードする前に合せた溶出ピークを濃縮するために、 分画分子量３００．０００の膜を備えたミニタンタンゼンンヤルフロー限外が過 システム（工程３で述べたよう（こ）を使用した。これにより、量は　２８０〜 ３００ｍ１から約６０ｍ１（こ減少した（約５倍の濃縮）。この６０　ｍｌは約 ５７〜６０ｔ＋ｇのＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子を含有し、第二のゲル清適操作として セファクリルしＳ−４００カラム上にロードされる。

第二のゲル７濾過操作から（ＰＢＳで）溶出したＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　２粒子のピー クは　１４０ｍ１のＰＢＳ中に約４８５■のＨＢｓＡｇ泣子を含有する。これは 、ＨＢ　ｓ　Ａ　２粒子として８５％の回収率を意味する。さらに、この第二の ゲルが過のピークは９５％以上（約９８〜９９％）の純度のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ− 特異的タンパク質を含んでいる。

このように、全体として、濃縮した清澄化粗培養物（培地）からＨＢｓＡｇ粒子 を精製するために２つの連続したゲル濾過カラムを使用して、出願人は高収率（ ７８％）及び極めて高純度（９５％以上）を達成した。

精製プロセス全体を通して、各々の段階での回収率、収率及びＨＢｓＡｇ粒子の 純度は実施例７．８及び９に記載の分析方法を用いて決定した。

精製スキームを図４に概括して示し、ＨＢｓＡｇ粒子の典型的なバッチの製造及 び精製を実施例６に示す。

本明細書中に記載の精製プロセスにおいて、工程１〜５はワクチンに使用される ＨＢｓＡｇ粒子の工業的な製造のためにスケールアップすることが可能である。

これは、（１）多数のローラーボトル又はミグ０キヤリヤーアダプター付の発酵 槽中での培養、 （２）ベリコン（登録商標）及びミニタン（登録商標）又は工業的スケールの量 に適したこれらの相当システム（ミリポア社）を用いる限外か過、並びに （３）大きなベッド容積のセファクリルＳ　−４００カラム又は直列に接続した 多数の上述カラム（工程４．５）を用（するゲノしン濾過精製、 により達成される。

最後に、本願の製造及び精製プロセスの新規な特徴の−べつかを以下に概括する 。

培養基の予備分画は、やっかいな高分子量タンｌ々り質混入物を除去し、極めて 簡便な方法でＨＢｓＡｇ粒子を精製することを可能とする。精製に先立つ濃縮工 程は大変効果的であり、力Ａなりの予備精製を達成する。精製工程は再使用可能 なシステム中で迅速に行なわれる。

清澄化、濃縮及び精製工程（工程２〜５）を含む全工程要素は物理的に（管で） 互いに連結することができ、クローズドシステムを形成する。全ての要素は滅菌 しうるので、本願の精製プロセスはクローズドシステム内で全体を通して滅菌条 件下で行なわれる。

従って、組換えＤＮＡにより製造される大量の高度（こ精製されたＨ　Ｂ　ｓ　 Ａ　２粒子を極めて効率的かつ低コストで製造することができる。

実施例　６ 以下のＨＢｓＡｇ粒子の製造及び精製についての方法は、実施例５により詳細に 記載されている。

ＨＢｓＡｇの製造のために２０個のローラーボトルを使用した。

用いた培地は、分画分子量３００．０００の膜を備えたペリコン限外が過により 予備分画したＦｅ２−補充培養基の濾液を含んで０た。

表１は第一バッチから得られた結果を示す。

表　１　＝　第一バッチの精製１１１ 章　粗培地中のＨＢ’　ｓ　Ａ　ｇの濃度は４０■／２であった。

粗培地とは、毎日集められ、２５！までプールした細胞培養基を意味し、そこま で蓄積された時点で精製が行なオ）れる。

この培地は０２２ミクロンの膜でのベリコン限列ン濾過により清澄化され、これ が清澄化粗培地である。

ネ傘清澄化粗培地をＩＯＬのＰ　Ｂ　Ｓ　（ＩＯＸ　ＩＬ）に対して分画分子量 ３００．０００の膜を備えたペリコン上で濃縮及び透析した。

フィルター上に保持された物、６６０　ｍｌをさらにミニタン（分画分子量３０ ０．０００の膜）で濃縮し、　１４８ｍ１の最終濃縮物を得た。ＨＢｓＡｇ粒子 の特異的な精製が濃縮工程により達成されることに留意されたい。

零本本１００■の第二バッチを同じように濃縮して同様の結果を得た。

濃縮物をさらにセファクリルＳ−４００カラム（２，５ｘ　１９０　ｍ）上でゲ ル屏過して精製した。カラムに３２５■ＨＢｓＡｇ（濃縮物の　１，７３量）を ロードした。３００■のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇが　ｌ　４　（ｌ　ｍｌの溶出液中に 回収された（回収率９２９ｆｉ）。２−っのカラムの溶出液を合せ、ミニタン（ 分画分子量３００．０００の膜）により５８ｍ１まで濃縮し、さらに同じセファ クリルＳ−４００カラム上で第二の同一のゲルメ濾過操作にかけた。第二のカラ ムにロードした。５７■のＨＢｓＡｇから４８５■が回収された（８５％）。Ｈ ＢｓＡｇ粒子は第一カラム上で３〜４倍に（全タンパク質の１５％から約６０％ へ）精製され、第二カラム上でさらに　１５倍に（全タンパク質の６０％から約 ９５％以上へ）精製される。

精製したＨＢｓＡｇ粒子は５ＩＩＳ−ＰＡＧＥ　（１５％）により分析した。

ＨＢｓＡｇ−一特異的タンパク質のバンドは、実施例７に記載したようにウサギ 抗体を用いて、銀染色及びウェスタンプロットにより可視化した。

Ａ、　精製方法（実施例５及び６参照）の各ステップの後のＨＢ　ｓ　Ａ　２粒 子の純度を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（Ｓ　Ｄ　Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動） （１５％ゲル）及び該ゲルの銀染色法により評価した。ゲルにより第２のゲルが 過ステップ（実施例５及び６）後のＨＢｓＡｇ粒子は約９８〜９９％の純度であ ることが示された。

透明化した粗培養培地、透明化した粗培地の濃縮物、第１の５ｅｐｈ８ｃＢＩ　 Ｓ−１００■ゲル屏過からの溶出液濃縮物、第２のＳｓ由ｃＢＩ　　Ｓ−４００ ’ゲルが過からの溶出液濃縮物、及びスクロースでバンド化した培地濃縮物のピ ークフラクション（実施例１１参＠）の試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色法に より比較した。標準的方法により測定した同じ量のタンパク質を各試料について ゲルにかけた。粗培地中では、主要なバンドは不純物タンパク質（アルブミン） に対応し、ＨＢｓＡｇ−特異タンパクのバンドは弱いバンドでしかなかった。濃 縮した粗培地においては、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ−特異タンパクのバンドは強化され （全体で１５％）、不純物のバンドは有意に弱まる。第１の　５ｅｐｈａｃＢＩ 　Ｓ−４００■カラムの後では、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ−特異バンドはタンパク質バ ンドの約６０９６を示し、この段階においては不純物のバンドは小さいバンドで ある。第２の　５ｅｐｈｘｃＢＩ　Ｓ−４００■カラムの後では、全てのＨＢｓ Ａｇ−特異バンド、２４に、　２７に、　３３に、　３６に、　３９Ｋ及び４２ Ｋがはっきりと観察される１、これらは全タンパク質バンドの９５％以上を示す 。主要なＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ−特異バンドは２４に、　２７に、３３Ｋ及び３６に であり、３９Ｋ及び４２には小さなものであるが有意なバンドである。スフロー ・スでバンド化した試料は第１のＳ＋ｐｈｘｃＢＩ　Ｓ−４００■カラム溶出物 と非常によく似たプロフィールを示し、スクロースによるバンド化では、６０％ のＨＢｓＡｇ粒−ｒ純度しか得られないことがわかる。

Ｂ、　精製方法（実施例５及び６）の各ス子・・戸プの後、精製ＨＢ　ｓ　Ａ　 ２粒子を、血景由来のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　粉子に対して生成されたウサギ抗体を 使用したウェスタンプロットによりさらに分析した。プロットはＨＢｓＡｇ粒子 に特異的な下記の分子量、２４に、　２７に、　３３に、　３６に、　３９に、 　４２にの６つの主要なタンパク質バンドの存在を示した。

ＨＢｓＡｇ粒子−特異性抗体を使用したウェスタンプロット法により、ＨＢｓＡ ｇ粒子バンドの特異的同定が可能である。

各試料につき同じタンパク質量を使用した。使用した抗体は抗アルブミン特異性 をも有していた。これは精製プロセス全体を通じて主要なタンパク質不純物であ るアルブミンの特異的減少を測定するのに有用である。

粗培地試料はアルブミンバンドのみをはっきりと示し、、ＨＢｓＡｇ粒子−特異 バンドはこの方法を用いて検出できるレベルを下回っていた。タンパク質バンド の抗体−特異的検出については、バンド当りのタンパク質の量及び測定条件下で の抗原性が検出レベルを決定する。出願人は、粗培地は非常に低い量のＨＢ　ｓ 　Ａ　２粒子−特異バンドを含み（八において検出レベルが約５０ｎｇ／バンド である銀染色法により観察されたように）、これ等のバンドは我々の測定条件に おいては高い抗原性を有しないと結論する。培地濃隋物試料は低いアルブミンレ ベルを示し、２４Ｋ及び３３にのＴ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ−特異バンドが主要なバン ドであり、２７Ｋ及び３６にの弱いバンドを宵していた。第１のＳ＋ｐｈａ＋Ｂ ＩＳ−４００■カラム溶出物においては、アルブミンは弱いバンドでしかなく、 主要な２４Ｋ及び３３にのＨＢｓＡｇ−特異バンドと、２７に、　２６に、　３ ９Ｋ及び４２にの弱いＨＢｓＡｇ−特異バンドを有している。スクロースにより バンド化した試料は第１の５ｅｐｈ１ｃＢＩ　Ｓ−４００■カラム溶出物に非常 によく似たプロフィルを有している。第２の５ｅｐｈａ＋ＢＩ　Ｓ−４００■カ ラム溶出物は観察できるアルブミンのバンドを殆ど示さず、２４Ｋ　、　２７Ｋ 　、　３３にの主要なＨＢｓＡｇ−特異バンドと３６に、　３９に、　４２にの 弱いが有意なＨＢｓＡｇ−特異バンドを示す。従ってこの試料においては、バン ドは殆ど全てがＨＢｓＡｇ粒子−特異的なものであり、その高い純度を示してい る。即ちこれは、上記へにおいてゲルの銀染色法を用いて観察された結果を裏付 けるものである。

ウェスタンプロットのバンド弾質（特に第１及び第２のＳ＋山ｃＢＩ　Ｓ−４０ ０■カラム溶出物に対応する試料について）をさらに評価したところによれば、 生成され、、Ｎ７出願人の方法により精製されたＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ−粒子の化 学量論が示されている。即ち、２４に、　２７Ｋ及び３３にの主要なバンドと、 ３６に、　３９Ｋ及び４２にの弱いバンドである。

コレ等ノ知見ハ、Ｌｃ＋１＋＋ｎ　ｔｌ　Ｉｌ、、　　Ｉ、Ｖｉ＋ｏ１．５２： 　３９６−４０２（１９８４）のデータと完全に一致する。この文献には、血液 血漿由来ＨＢＶ粒子とＨＢｓＡｇのみを含む大きなフィラメント中の下記のタン パク質が記載されている（彼等が記載したより小さい２（ｌｎｍ　ＨＢｓ＾ｇ粒 子は３９Ｋ及び４２Ｋを含んでいない）。

２４に一非グリコシル化（Ｓ） ２７に一グリコジル化（Ｓ） ３３に一単一グリコンル化（Ｐｒ＋−３２）３６に一二重グリコシル化（Ｐｉｅ −３２）３９に一非グリコシル化（ＰＩ＋−３ｌ）４２に一グリコジル化（Ｐｉ ｅ−３ｌ）出願人の行った銀染色ゲルとウサギ抗体を使用したウェスタンプロッ トの比較においては、ＨＢｓＡｇ粒子のＰｉｅ−Ｓ２３３にタンパク質のより高 い免疫原性が観察された。銀染色ゲル上においては、３３にのバンドは２４Ｋ及 び２７にの主要なバンドと比較して弱いものであった。ウェスタン免疫プロット においては３３にのバンドは２４Ｋ及び２７にの主要なバンドと同様に主要なバ ンドであった。これは、「発明の背景」において言及した、例えばＭｉｌｉｃｈ 　ｃｌ　１１．、　１．ｌｎｍｎｎｏｌ、ユ旦　３１５−３２２　（１９８６） 　にお１するＰｉｅ−Ｓ２領域抗原決定基に関連するより高い免疫原性の知見と 一致する。

Ｃ１さらにＰｒｅ−３ｌｆｌｌｉ域に対する特異的モノクローナル抗体を使用し 、ウェスタンプロット法によりＰ＋＋−Ｓｌタンパク質（３９Ｋ。

４２Ｋ）の存在が示された。プロットは、４２にのグリコジル化形態と比較して 少なくとも２倍の多い量の３９に非グリコジル化Ｐｒｅ−５ｌを示す（これによ りモノクローナル抗体がグリコジル化タンパク質と非グリコジル化タンパク質と に等しく反応すると考えられる）。

Ｄ、　さらにＦＣＳ及びＣＨＯ細胞に由来する不純物の存在についで精製ＨＢ　 ｓ　Ａ　ｇを評価した。ＦＣＳ及びＣＨＯ細胞細胞タンパクモれぞれに対する２ 種のウサギ抗体によるウェスタンプロット法を使用することにより、陽性対照と 比較した場合、精製ＨＢｓＡｇ中の不純物レベルはいずれの場合も検出レベルよ り低いことを示すことができた。ここで検出レベルとはバンド当りのタンパク質 の量及び測定条件下におけるその抗原性の両方をいう。

実施例　８ ＨＢｓＡｇ粒子免疫原性決定のため、Ｔ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ検出用固相ラジオイム ノアッセイキット（Ｔ＋ａｖｅｉｏｌ■）を使用した。出願人が測定した）ＩＢ ｓＡｇ粒子は、濃縮された第２のゲルが過溶出物のものであった（実施例５、ス テップ５または第４図、ステップ５）。キットは既知の標準試薬（Ａｂｂｏｌｔ ■）についてカリプレートした。出願人の組換えＤＮＡ生産ＨＢｓＡｇ（ＣＨＯ ）のカリブレーション曲線をＡｂｂｏｌｌ■のカリブレーション曲線と比較した 。＾ｂｂｏｌｌ■の標準試薬と比較して、本出願人の■１ＢｓＡｇ（ＣＨＯ）は Ｔ＋…ｎｏｌ■キットからのチンパンジー抗体に対するより高い親和性を有して いるようである（第６Ａ図）。

下記の実施例９に記載した方法により、高度に精製されたＨＢｓＡｇ粒子（実施 例５のステップ５から得た濃縮ＨＢｓＡｇ粒子）を明ばんアジュバント調製物と 結合させてＨＢ　ｓ　Ａ　ｇワクチンを製造した。

本出願人のＦ（ＢｓＡｇワク千ンを血漿由来（ＨＢｓＡｇ）ワ■ クチンーＨｅｐｌｉｖｇｔ　Ｂ　　と酵母組換えワクチン−Ｒ＋＋ｏｉｂｉｖｉ ｘ　ＨＢ。

の両方のカリブレーンラノ曲線と比較した。結果はやはり、市販のワクチン（） ｌｅｐｔｓｖｍｘ　　、　Ｒｒｃｏｍｂｉｖｘｘ■）と比較して、出願■ 人のワクチン（ＣＨＯ）が丁目ｖｅｎａｌ■キットからのチンパンジー抗体に対 する最も高い親和性を有していることを示している。

組換え酵母ワクチン　し、。ｍｂｉｆｘｘ　）ＩＢ■は、おそら＜　　Ｔ＋ｉｖ □、。ＩＲ１＾■キットの抗体に対する非常に低い親和性のために、アッセイ中 に反応しないようである。

Ｃ１（Ｏ−１（Ｂ２００細胞により精製されたＢ型肝炎表面抗原（Ｉ（Ｂ　ｓ　 Ａ　ｇ）　　（実施例３及び４）を高度に（約９８％）精製した（実施例５及び ６）。ｔ（ＢｓＡｇｆｉ度はＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ検出用固相ラジオイｌ、ノアッセ イキノト（丁＋＋ｖ＋ｎｏｌ’）を使用しタンパク質測定（実施例７及び８）に より決定した。Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇを明ばんアジュバントと結合させ、組換 えＨＢｓＡｇワクチンを構成した。明ばん調製物は、１．５ｍｌの明ばん（硫酸 カリウムアルミニウム・１８Ｈ２０）を過剰の１Ｍリン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｈ ＰＯ４）（約１ｍ１）で滴定することにより得た。得られた懸濁液をＨ２Ｏで１ ０倍に希釈し、遠心分離した。明ばん沈殿物を１０ｍ１のＰＢＳ中に再懸濁して Ａｌ２（ＯＨ３）の約２．５■／ｍｌの溶液を得た。この溶液の１　ｍｌに、５ ０ｔ１９（マイクログラム）の出願人の組換えＣＨＯＨＢ＋Ａｇを加え、ＰＢＳ で容量を５　ｍｌに調整した。

出願人の組換えワクチン（ＣＨＯ）を血漿由来ワクチン−Ｈｅｐｌｘｖ＋ｘ■（ Ｍｅ＋ｃｋ、Ｓｂ＋ｒｐ　ｘｎｄ　ＤｏｂＩＩｅ　）及び酵母組換えワクチン− Ｐ、ｅｃｏｍｂｉｖｍｘ　Ｈ［ｌ■（Ｍｅ＋ｅｋ、５ｈｘＨ＊ｎ＋ｌ　Ｄｏｌｌ ｉｔ　）下記の量、Ｇ、Ｑｌｐ９．０．０３Ｉ１９．００９醇、０２７埒、０． ８１埒、２４Ｎをそれぞれ含む１ｍｌのワクチン試料をＢｔｌｂ／ｃマウスに腹 腔内注射した（各群につきマウス１０匹）。注射の３０日後にマウス■ を放血させ、Ａｏ＋ｘｂ　Ｅｌ＾　キット（Ａｂｂｏｔｌ■）により抗−ＨＢｓ Ａｇ抗体の存在について血清を試験し、オランダ中央血液銀行から受は取った対 照血清（Ｗ　ＨＯ）に対してカリブレーションした。

結果は第７図にまとめた。市場で入手可能な前記２種の市販ワクチンと比較して 、本出願人の組換え（ＣＨＯ）ワクチンは少くとも１０倍高い強度を有している と推論できる。

実施例１１に詳細に記載した特に好ましい方法により製造した本出願人の絹換え （ＣＨＯ）ワクチンの調製物を使用してより大きなスケールで上記の実験を繰返 した。上記に記載したのと同様の結果が得られた。

前記マウス血清変換試験において３種の抗体が誘発された、（ａ　）　　１ｌｅ ｐ＋ａｖｘｘ　Ｂｏ　（血漿）に対する抗体（ｂ　）　　Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｒ 　　ＨＢ■（酵母）に対する抗体（Ｃ）　　本出願人のワクチン（ＣＨＯ）に対 する抗体３樗の抗体についてその性質と特異性に関し、同じ力価で分析した。本 出願人の高度に精製したＨＢｓＡｇ（ＣＨＯ）粒子（実施例５、ステップ５）を ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によりフラクション化し、ニトロセ ルロースフィルターに移した。ウェスタンプロット法を使用し、フィルターを前 記３種の抗体に露した。

Ｌｐｌｓｖｔｔ　Ｂ■（血漿）及びＲｅｃｏ＠ｈｉｗｔｔ　Ｉ（Ｂ■（酵母）に 対するマウス抗体は、ＨＢｓＡｇ粒子中に存在するＳタンパク質（２４Ｋ　）の みを認識したが、本出願人のワクチン（ＣＨＯ）に対するマウス抗体はＳ及びＰ ｒｅ−３２（２４Ｋ　、　３３Ｋ　）の両方のタンパク質を認識した。

これ等の知見はやはり、前記ワクチンは市販のワクチンと比較して抗体のより高 い力価を誘発したことを示している。さらに本出願人のワクチンに対して誘発さ れた抗体の性質及び特異性はこ異っており、Ｓ　（２４Ｋ）タンパク質に加えて 、ウィルスの感染性に重要だと考えられるＰｒｅ−３２（３３Ｋ）タンパク質を も認同種　［ｅｏｎｇｅｎｉｃ）　ＢｌＯ＋系マウス（Ｈｘ＋ｌｘｎ　０ｌａｃ 　１．ｌｄ、、ＢｉｃｅＫｌｓｒ。

Ｕ、により入手した。）を使用して実験を行った。これ等はＳタンパク質に対す る非応答槽であることが知られており、即ちこれ等はＰｒｔ　−Ｓタンパク質を 含まないＨＢｓＡｇワクチンには応答しない（Ｍｉｌｉｅｈ　ｒｔ　ａｌ、、Ｓ ｃｉ！ｎｃｅ　　２２ｇ：１１９５−１１９８（１９８５））。

これ等のマウスを１グループ当り２６マウスの２つのグループに分けた。１つの グループのマウスには、Ｐｒｅ−８ｌまたはＰｒｅ−３２抗原決定基を含まない 酵母由来のＲ＋ｅｏｍｂｉｖｔｔ　ＨＢ’ワクチン（「発明の背景」に記載した 。）の１埒を腹腔内注射し、他のグループのマウスには実施例１１に記載したよ うに製造した本出願人のＨＢｓＡｇワクチンの１埒を腹腔内注射した（これ等は マウスに対する通常の投与量の約５０倍である。）。最初の免疫化から３０日後 、各グループの半数のマウスを放血させ、以下に記載するようにして血清中の抗 体力価を測定した。残りのマウスは再度免疫化しく追加免疫）、第２の免疫化か ら２週間後に放血させ、以下に記載するようにして血清中の抗体力価を測定した 。

市販の抗ＨＢｓＡｇ抗体試験用の人出ｂ　ＲＩＡ■（人ｂｂｏｌｌ■）を使用し て血清を分析した。この試験は抗−８抗体を検出し、定量するものである。第１ ０図に示したように、結果は第１の免疫化後には両方のグループのマウスにおい て抗体力価はわずかじか発生しないことを示している。しかし、第２の免疫化後 におい工は、本出願人のワクチアはＲｅｃｏｍｂｉｗｔｔ■が誘発するものより も約１０倍高い抗体力価を誘発した。これは統計上有意な差異である（　ｐ　（ ０，００１）。これ等の結果は、本出願人のワクチンが既存のワクチンに存在す る非応答性の問題を克服するに違いないことを示している。

Ｄ、血清変換試験において誘発された抗体の性質の追加の試験さらに実験を行い 、酵母由来Ｒ＋＋ｏｍｂｉｙ＊ｘ　ＲＢ■と本出願人のＨＢｓＡｇワクチンによ る第２の免疫化後に集めた上記非応答種マウスの血清を、抗−Ｐｒｅ　−３ｌ抗 体の存在について固相ＥＬＩＳＡにより試験した。この試験においては、ＨＢｓ ＡｇのＰｉｅ−５１領域に対応する合成２１量体ペプチドを、ポリスチレン９６ −ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｎｎｃ、Ｃｏマ易１ｉｎｋ　ｐｌｘｌｅ ｓ、カタログ＃　４７１１０４２）上に０５埒／ウエルで被覆した。次に陰性対 照としての正常マウスの血清を含む種々の血清の１．５の希釈物でウェルに二重 の層を形成した。そして第２抗体としてのビオチニル化抗−マウスアフィニティ ー精製１ｇＧ及びエクストラビジンペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｍｔｋｏ＋染色 キット、カタログ＃７８０１−１）と共に連続的にインキュベートした。結果（ 下記表■に示した。）は本出願人のＨＢｓＡｇワクチンにより免疫化された非応 答種マウスの血清中には抗−？ｅ　−３ｌ抗体が存在しているが、酵母由来のＲ １ｃｏｍｂｉｖｇｘ■ワクチンでワクチン化したマウスの血清中にはそのような 抗体は存在していないことを示している。

表　　　■ 非応答種マウスにおける抗−？ｅ　−５ｌ抗体についての固相ＥＬＩＳＡの結果 血清源　　　　実験１　　　実験２ 本出願人のワクチンの後　０．７Ｇ７　；　０．８１１　　０．６０８　；　Ｇ 、　５７５Ｒｅｅｏｍｂｉｙｘｘ■の後　　　　０．４２２　、０．３９９　　 　［１，３６３；　０．３５２正常マウス血清　　０．３９７　：　０．３９９ 　０．３８９　：　０．３８にれ等の結果は、本出願人のワクチンは抗−Ｐｉｅ 　−Ｓｔ抗体の生成を誘発するが、前記酵母由来のワクチンはそのような抗体の 生成を誘発しないことを示している。これ等の知見の新規性及び有意性について は実施例１２の最後で論する。

実施例　１０ 哺乳動物細胞培養物によって分泌されたＨＢｓＡｇ粒子の代替１１，１ゆ、１． １い、工、工１．１９７．１ヤ、ヤ、１い１２．１−一浦開Ｈ−−−−鹸響Ｉ鳴 訃榊−慢−−曙一一１励■酬曙−一精製法 第４図に示されるように、ｒＨＢｓＡｇ粒子の精製スキーム」は５つの重要な工 程からなる。各工程では、実施例５に詳述された方法以外の代替法が使用され得 る。

さらに、代替法を様々に組み合わせて精製ＨＢｓＡｇ粒子を得ることも可能であ る。

これらの代替法と（実施例５及び第４図に記載の）本出願人の好適な精製法との 比較を、この実施例の末尾の第■表に要約以下に、精製スキームの各輯の可能な 代替法を詳述する。

Ａ、工程１に対する代替法（培養培地の前分画）（実施例３及び４に記載の）Ｈ ＢｓＡｇ粒子を産生ずるＣＨＯ細胞を、以下の培地内で択一的に成長させ得る。

１）２〜１０％の牛胎児血清（Ｆｅ２）、好ましくは２％ＦＣ８を有する実施例 ３（１）に記載の成長培地、但し、成長培地の前分画を行わない（成長培地の前 分画は実施例５に記載されている）。

しかしながら、この代替法は更なる精製の問題を生起した。

培養培地を前分画しなかったときには、その後の精製工程において混在するタン パク質のレベルは非常に高く、最終収量を減少させ、また最終生成物の純度を低 下させた。ＰＥＧ分画、アフィニティクロ？トゲラフイー（Ａ目ｉｇｔｌ　Ｂｌ ｕｅ■、　　Ｂｌｏｅ−Ｓｅｐｂ＊＋ｏｓｅ■、　ＰｈｅＢｌ−３ｅｐｈｘｒｏ ｓｅ■）、イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｅｐｓｒｉｎ−３ｅｐｈｘ＋■■ 、　ＤＥＡＥ−３ｅｐｂ＋ｃｅｌ■）及びゲルが過（Ｓｅｐｈｘｃｕｌ　　Ｓ− ４００ｏ）の使用を含む、以下の段階に記載の代替精製工程は全て、培養培地を 前分画しない第一工程と組み合わせて用いられた。ゲルろ過（Ｓｅｐｈ＊ｅＢＩ 　　Ｓ−４０００）代替工程のみが、前両分された培養培地により産生されたＨ ＢｓＡｇ粒子上で、即ち好適方法人（実施例５）で実施された。

２）２〜１０％、好ましくは２％ＦＣ３を有する、実施例３及実施例５に記載の 成長培地、但し、該成長培地は、分画分子量３１１０、０００の分画膜に代えて １０．００ｆ１ＭＷ又は１０Ｇ、　ＯＯＯＭＷの分画膜を■ 用いて、Ｉ’ｅｌｌ＋ｃｏｎ　　限外屏過により前分画された（実施例５）。

しかしながら、この代替法は細胞培養物成長の問題を生起した。

培養培地の？１ｌｉｃｏｎ■限外滑過前分画に、！０．　ＯＯＯＭＷ又は１００ 、　ｆｌｏｏＭＷの分画膜を使用したときには、細胞成長を有意に阻害［７、Ｈ Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ収量の低下を引き起こした。

従って、工程１に対する本出願人の好適方法は、第４図及び実施例５に記載の方 法である。

その培地中に分泌されるＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を産生ずるＣＨＯ細胞の培養培 地を、可能な代替工程を用いて清澄化することができる。

１　）　　　Ｓ６Ｉマ１１■遠心分離機（ＲＣ−３Ｂ型、スイング式パケットロ タ−付き）を用いる、ＩＦパケット中の採集培地の遠心分離を、４．０００＋ｐ ｍで１５〜２０分間行った。次に、（細胞及び細胞砕片の一部を清澄化した）上 清を、第４図に示す精製法の工程３〜５に従って処理する。

しかしながら、これらの代替法の使用は次の問題を生起させた。

採集培地の遠心分離は、その培地から全ての細胞を除去し、また上清中に残留す る細胞膜や脂質複合体の如き他の主要な夾雑物を除去したにすぎなかった。これ はこの後のゲル濾過精製工程（工程４，５）を妨げ、ＨＢｓＡｇ粒子の総収量を 減少させかつＨＢｓＡｇ粒子の純度を低下させた。さらに、遠心分離工程は時間 のかかる方法であり、大容量の場合効率的に使用することが不可能である（遠心 分離工程たり約１２ｐ／時でのみ処理可能である）。

２）　滅菌用に通常使用される０２２μフイルター系（Ｍｉ１１ｉｐｏｒｅ■） を用いるろ過（これは、０．２２μ膜を用いるＰｅ１ｌｉｃｏｎ■系を持つクロ スフロー限外が過−実施例５とは異なる）。

しかしながら、この代替法を用いると次の問題が生した。

（０２２μ分画膜を持つクロスフロー限外濾過Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ■系に対抗する ものとしての）０２２μ膜滅菌系を用いるろ過は、培地を効果的に清澄化し、全 ての細胞、細胞膜及び脂質複合体を除去したが、次のような欠点があった。即ち 、０．２２μ滅菌型膜が急速に目詰まりを起こし、頻繁に交換する必要があるた め、大容量を、二の系で処理することは不可能である。これは生成物の収量損失 を招き、また時間がかかる。

従って、本出願人の好適な系は第４図及び実施例５の工程２に記載の系であり、 本出願人は、この系で、０．２２μ分画膜を持つクロスフローＰＣｌｌｉｃｏｎ ■限外濾過系を使用する。これは工業的規模の系であり、大容量の培地を処理す ることが可能であり、培地の処理は迅速である（数百ｆ！／時）。この系は目詰 まりを起しにくく、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を１００％回収する。

Ｃ，Ｉ稈３に対する代替法（清澄化培養培地の濃縮工程）］、　）　　ＨＢ　ｓ 　Ａ　ｇ粒子を含む高分子量タンパク質複合体を沈澱させるための、１０％Ｐ　 Ｅ　Ｇ　（Ｐ　Ｅ　Ｇ６０００、Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ）を用いるポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）分画。濃厚形態（２５％〜３０％）でＰＢＳに溶解したＰＥＧを 、ＰＥＧの終濃度が１０９６Ｗ／Ｖとなるように清澄化培養培地（工程２）に加 える。ＰＥＧ沈澱物を、遠心分離（アングル式ローターを装着した　Ｓｏ＋ｖａ ｌｌ■ＲＣ−３８遠心分離機内、５０ｄ遠心チコーブ中、ＧＯＯＯ〜？０００＋ ｐｍで２０分間）によって、又は（第４図の工程３及び実施例５に記載のように ）　３００．ＯＯＧＭＷの分画膜を持ッＰｅ１ｌｉｃｏｎ■りａスフａ−限外ン 濾過系を用いるが過によって採集することができる。この溶液を良く混合し、４ ℃に少なくとも３０分間放置する。このＰＥＧ分画工程は培地中に生じたＨＢｓ Ａｇ粒子に関してのみ行い、但し、該粒子は工程１で前分画されなかったことに 注目すべきである。

この代替濃縮法を用いて、以下のような結果が得られた。

小容量（１！まで）の清澄化培養培地を使用した場合のみ、清澄化培養培地のＩ Ｏ％ＰＥＧ分画が有効であった。さらに、重要な点として、ＰＥＧ分画のみが■ ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を７５％回収した。ｌＯ％ＰＥＧ分画により、（全ＨＢ 　ｓ　Ａ　ｇ粒子を２５％含む）総タンパク質の約８０％が損失し、この１０％ ＰＥＧ分画後のＨＢｓＡｇ粒子の純度は０５〜１％にすぎない。最終的に、ＰＥ Ｇ分画後、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ含有沈殿物をＰＦ３５に再懸濁し、ＰＥＧを除くた めに透析しなければならない。次に、この工程の後に別の濃縮工程が続き、さら にその後に最終の精製工程（工程４゜５）が続く必要がある。従って、ＰＥＧ分 画は、時間がかかり、ＨＢｓＡｇ粒子の重大な損失を生じさせ、その後に濃縮工 程を必要とする且つこの工程を組み込んだいわゆる前濃縮工程であり、ＰＥＧ分 画は不経済な工程であると考えられる。ＰＥＧ濃縮は、以下の工程のいくつかと 代替法とを組合せて（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アブイニテイク ロマトグラフィー及びゲル濾過と共に）実施されたことに注目すべきである。

２）　　１０．ＯＯＯＭＷ、　ｌｏＯ，ＯＯＯＭＷ又は３Ｇ０．　ＯＯＯＭＷの いずれかの分画■ 膜を用いるクロスフロー限外７濾過（Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｔｔ製のＭｉｎ＋ｌ ｉｎ系、　Ｐｅ１１ｉ＋ｏｎ■系）。Ｍｉｎ山ｎ■又はＰｅ１ｌｉｃｏｎ■系を 用いるこれらの方法は、限外が過工程の間の保持物質（即ち、膜を通過しない物 質）の透析を許容する。この系の典型的な適用を次に示す。

ａ）　ｌＯ，ＧＯＯＭＷ分画膜をもツＭｉｎｉｌｔｎ■系。

６．４１の清澄化培養培地（工程２）が限外所通され、そして２２のリン酸緩衝 塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）　（４Ｘ５００　ｍＩ　Ｐ　Ｂ　Ｓ）で透析された。これに より、２６０ｍ１の最終濃縮物（約２５倍濃縮）が得られた。

ｂ　）　１０Ｇ、　＋１０［ＩＭＷ分画膜をもつＰｅ１ｌｉｃｏｎ■系。

３４Ｉｌの清澄化培養培地（工程２）が限外か過され、そして８ｐのＰＢＳ　（ ８ＸＩＲＰＢＳ）で透析された。これ番こより、６６０ｍ１の最終濃縮物（約５ ０倍濃縮）力（を尋られた。

Ｃ）　３０Ｇ、　ＯＯＯＭＷ分画膜をもツ？１ｌｉｃｏｎ■系。

３４２の清澄化培養培地（工程２）力（限外濾過され、そして１０ｇのｐ　Ｂ　 Ｓ　（１０ｘ　１ｆｌ　ＰＢＳ　）で透析された。これ（こより、５００ｍ１の 最終濃縮物（約７０倍濃縮）が得られた。

代替濃縮法を用いて、以下のような結果が（尋られた。

ａ　）　　１０．　ＯＯＯＭＷ分画膜を用（＼るＭｉｎｉｌｓｎ■での限外濾過 及び透析は遅かった。従って、この系を、ＨＢｓＡｇ粒子の工業的規模の生産に 適用することはできな０゜ＨＢｓＡｇ粒子の回収率は非常に高い（９６％以上） が、総タン、（り質の回収率もまた非常に高かった（９５９６以上）。従って、 この系ζよ、生成物を損失させずに出発物質を濃縮するうえで極めて有効である が、出発物質からＨＢｓＡｇ粒子を精製すること（ま不可能であり、ＨＢｓＡｇ 粒子対総タン／ぐり質の地番よ変わらず同じである（ＨＢｓＡｇ粒子の純度は僅 か番こ約０．４％である）。

清澄化培地の容量を増加したときには、膜上に保持されたタンパク質の量は、流 速が実質的に低下するまで増加した。

ｂ　）１００．　ＯＯＯＭＷ分画膜を用いるＰｅ１ｌｉＣｏ＋■系での限外濾過 及び透析は、１００．　ＯＯＯＭＷ分画膜をもつＭｉｎ目■■系を用いる上記（ ａ）よりも効果的である。より大容量を処理することができたし、またその流速 はより大きい。膜上に保持されたタンパク質はほとんどな（、従って、大量のタ ンパク質を含む大容量の培地を処理する場合でも流速は厳しく制限されることは ない。

しかしながら、培養培地の濃縮は極めて有効であるけれども、この系は、ＨＢｓ Ａｇ粒子を特異的に精製することができない。即ち、ＨＢｓＡｇ粒子の回収率は 、　１００％であるが、総タンパク質の回収率は９５％以上であった。従って、 ＨＢｓＡｇ粒子対総タンパク質の比は出発物質中での比と同じままである（　Ｈ Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子の純度は僅かに約０４％である）。

ｃ　）　　３００．　ＯＯＯＭＷ分画膜を用いるＰｅ１ｌｉｃｏｎ■系での限外 濾過及び透析は好適な方法であり、この方法は上記２つの方法（ａ。

ｂ）よりも有効である。ここで、この系はＨＢｓＡｇ粒子の濃縮および特異的精 製を達成した。即ち、９８％のＨＢｓＡｇ粒子が回収され、一方、最初の総タン パク質はその１０％が回収されたにすぎなかった。これはファクター９までＨＢ 　ｓ　Ａｇ対総タンパク質の比を増大させた（ＨＢｓＡｇ粒子の純度は３〜４％ である）。

ｄ）　この濃縮工程でさらにＨＢｓＡｇの精製を達成するために、本出願人は、 別の必要に応じての代替工程を追加した。

この工程は、３００．０００ｉｌＷ分画膜をもつ上記Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ’系を用 いる限外濾過及び透析の後に行われる。この付加的工程はｌＯ％ＰＥＧを用いる ＰＥＧ分画である（この方法はこの章の第１部に記載したような方法であるが、 ここでのＰＥＧは限外屏過後に使用され、限外が過の代りに使用されるものでな いために、異なる）。

しかしながら、この方法は結果的に、総タンパク質を（１０％から）２５％の所 望のレベルへ減少させることを達成したが、ＨＢｓＡｇ粒子の回収を（９８％か ら７０％回収へと）２８％減少させた（ＨＢｓＡｇ粒子の純度は約７〜１０％で ある）。

限外濾過後のこの代替ＰＥＧ分画工程は、限外が過後の総タンパク質含量が（９ ８％以上と）非常に高いために、上記ａ及びｂに記載の代替系では、試みられな かった。

要約すれば、濃縮工程はこの精製法において重要な工程である。ゲル１濾過を用 いる最終精製（実施例５．第４図）を実施し得る前に、清澄化培養培地を濃縮す ることが不可欠である。上記代替濃縮法の全てを、細胞培養時に前分画されなか った清澄化培養培地に適用したことに注目すべきである。

記述の系（工程１．第４図、実施例５）を用いる前記培養培地の前分画を、濃縮 工程（工程３）及び最終精製工程（工程４．５）で生じた問題点を克服するため に、比類ない工程として開発した。前記前分画は、分子量が約３００．０００の （細胞培養前の）培養培地夾雑物を除去する。

最初に前分画された清澄用培地に対して濃縮を行った場合には、３００．　ＯＯ ＯＭＷ分画膜をもつＰｅ１ｌｉｅｏｎ■系を用いる本出願人の好適濃縮方法（実 施例５．第４図）は次の結果を与えた。

即ち、２ｉの培地から、　１４８ｍ１の濃縮物が得られた（限外済過濃縮の間に １０２のＰＢＳで透析した）。これは　１７０倍の濃縮であり、またＨ　Ｂ　ｓ 　Ａ　ｇの回収率は約９６９６であり、一方、総タンパク質回収率は所望レベル の僅か２５％である（この段階でのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子の純度は約１５９６− 策Ｉｌも参照せよ）。それ故、これは上記の全ての代替工程（１，２ａ、２ｂ、 ２ｃ、２ｄ）よりもかなり優れている。本出願人の好適方法は、従って、ＨＢｓ Ａｇ粒子を過大に損失させずに、１工程でＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを高レベルに濃縮及 び精製を共に達成する１）　疎水性カラムを使用するアフィニティクロマトグラ フイー３種類のアフィニテイカラム、即ち、Ｂｌｎｅ−３＋山ｒＯ纂ｅ■（Ｐｈ ａ＋ｍｘｃｉｔ）　、入山ｇｅｔ　Ｂ…■（Ｂｉｏ＋ｘｄ）及びＰｂｅｎ７１− ３ｅｐｈｇ＋ｏｓｅ。

（ＰｈｘｔＩｌｘｃ目）を使用した（これらのカラムの使用は、Ｐｈｘ＋Ｉｃ１ ａ及びＢｉｏ＋ｉｄによる使用説明書に従−った）。

Ａｌｌｉｇｅｌ　ＢＩＩｌｔ■及びＢｌｕｅ−３ｅｐｈａ＋ｏ＋ｅ■カラムを、 以下の精製方法において（本出願人の好適方法に種々の代替工程を組合せて）使 用した。

ＨＢｓＡｇ粒子を培養物から誘導し、培地を前分画せずに、これをｌＯ％ＰＥＧ を用いて濃縮した（上記の章Ｃ１，濃縮工程の代替法を参照せよ）。ＰＥＧ沈殿 物を最少容量のＰＢＳに溶解しくＰＢ３１ｍｌ当り　２５０ｕｇタンパク質）、 ＾目ｉｇｅｌ　Ｂｌｕｅ■カラム又、より１゜ｅ−Ｓｅ山＋ｏ＋ｅ■ヵ５ユ。い ずれか、ユ装置した。本出願人は３５ｍ１の充填カラムを使用し、カラム当たり ＰＢＳ中のＨＢｓＡｇ溶液５ｍ１（カラム当たり１２５■のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒 子）を載せた。このカラムを２容（７０ｍｌ）　Ｐ　Ｂ　Ｓで洗い、チオシアン 化ナトリウム（ＮａＳＣＮ）で溶出し、次いでＰＢＳ中の４０９６ＰＥＧ溶液で 溶出した。溶出は、最初に１容（３５ｍｌ）のＯ，１ＭＮａ５ＣＮ　ｌｌｌ液液 洗浄し、次いで０．２５Ｍ　Ｎａ５ＣＮ　（３５ｍ１）で第二の洗浄をすること により実施された。これは、カラムからＨＢｓＡ４を除かずにアルブミンのよう なタンパク質を除去する際に有効であった。ＨＢｓＡｇ粒子は、ＩＭ　ＮａＣｌ を含宵するＰＢＳ中の４０”６ＰＥＧ溶液でカラムから溶出された。この方法に よって、１０〜２０％のＩ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子が回収されたにすぎず、＾［Ｉ ｉｇｅｌ　ＢＩＩｌｅｏカラムとＢｌｕｅ−３ｅｐｈ■＋ｅ■カラムの間で見掛 は上の差はなかった。ＨＢｓＡｇの純度は、アルブミンと共溶出したため、低か った（５％〜７％）。次の精製方法においては、Ｐｈｅｎ７１−３ｅｐｈａｒａ Ｉｅ■カラム（ベント容積２７ｍ１のミニカラム）を使用した。ＬＴ　Ｂ　ｓ　 Ａ　ｇ粒子を細胞培養物から誘導し、培地を前分画■ せずに、濃縮し、そしてＰｅ１ｌ＋ｃｏｎ　　３Ｇ０．０（ＩＯＭＷ分画膜上Ｐ ＢＳ中の１００ｆｉＰＥＧを用いて濃縮し、ＰＥＧ沈殿物を最少容量のＰＢＳに 溶解した（最終容量１．Ｌｎｌ、ＨＢｓＡｇ粒子約０５■）。

次に、この溶液を、１９ｎ＋Ｉ（７容）のＰＢＳで洗浄したカラム上に載せた。

溶出はＨ，５ｍ１（５容）の水で行われ、ＨＢｓＡｇの僅かに２２％が溶出され たにすぎなかった。その純度は、ＨＢｓＡｇ画分と一緒にアルブミンが共溶出し たため、低かった（７％）。

従って、これらの方法は本出願人の好適方法（実施例５．第４図）よりも劣る。

２）イオン交換クロマトグラフィー ２種類のイオン交換カラム、即ち、ベッド容積３ｍｌのＨＣｐａｒｉｎ−８ｅｐ ｈａ＋ｏｔｅ■カラム（Ｐｈａ＋ｍ、ｃｉｇ）及びベッド容積２．５ｍｌのＤＥ ＾Ｅ−３ｅｐｈｘ＋ｏ＋＋■カラム（Ｐｈｘ＋ｍｇｃｉｉ）を使用した（カラム は製造元であるＰｈａ＋１ｃ口の使用説明書に従って用いられた）。

両力ラムに載せるＨＢｓＡｇ粒子サンプルを次のようにして調製した。

培地が前分画されない培養物から、ＨＢｓＡｇ粒子を誘導した。採集した培養培 地を、Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ■３００．　ＯＯＯＭＷ分画膜上で濃縮及び透析し、さ らにＰＢＳ中の１０％ＰＥＧで濃縮した。このＰＥＧ濃縮物（ＨＢ’ｓＡｇサン プル）を希釈Ｐ　Ｂ　Ｓ　（０，３ｘ　ＰＢＳ）に溶解し、次のようにして前記 カラム上に載せた。

１１ｅｐｒ＋１ｎ−５＋ｐｈｘ＋ｏ＋ｅ■カラムとに６ｍｌのＨＢｓＡｇサンプ ル（約１．５■）を載せ、またＤＥＡＥ−５すｈｘｃｔｌ■カラム上にＩ　ｌ　 ｍｌの該サンプル（約２．７５■）を載せた。カラムからのＨＢｓＡｇ粒子の溶 出は以下のようにして行った。

Ｈ！ｐｔ＋１ｎ−３！ｐｈｔ＋ｏ＋＋Ｏカラムヲ４容（１２ｍｌ）　＋７）　０ ．３ＸＰＢＳ　テ洗い、Ｑ、　３ｘ　ＰＢＳと　２ＸＰＢＳとの間のＰＢＳ濃度 勾配溶液で溶出した（３０＋＊１＝ＩＯ容）。このカラムから、僅かに１０％〜 ２０％のＨＢｓＡｇが回収され、それは低純度（５％〜７％）のものであった。

ＤＥＡＥ−３ｓｐｈｘｃｅｌ■カラムからは段階的ＰＢＳ濃度勾配溶液によって 溶出された。即ち、各１容ｉ２．５ｍ１）のｇ、２ｘｐＢｓ１ＧＪＸＰＢＳ　、 　　０．５ＸＰＢＳ　、　０．７５ＸＰＢＳ　、　　ＩＸＰＢｓ　、　　１．５ ＸＰＢｓ　。

２ＸＰＢＳを用いてカラムを洗浄した。これはＨＢｓＡｇ粒子の放出を可能にし 、回収率は７０％であるが、多くの両分に分散した（不純）。さらに、全ＨＢｓ Ａｇ画分中に夾雑物が存在するため、その純度は低かった（約５〜１０％）。

従って、これらの方法を用いるＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　２粒子の精製は有効ではなかっ た。

後述のいくつかの他のイオン交換カラムがテストされたことにも注意されたい（ 実施例１１参照）。５Ｐ−Ｔ＋ｉ■Ｂｌ■）の使゛用は意外にも良好な結果を与 え、このカラムを好適な方法Ｂに組み入れた（実施例１１）。

３）ゲルン濾過クロマトグラフィー ａ）　好適な　Ｓ＋ｐｈｘｅＢＩ　Ｓ−４００’ゲルが過に対する代替として、 ５ｅｐｈｉ＋ｏ＋ｅ　ＣＬ−６Ｂ■（Ｐｈｘｒｍｘｃ口）を使用した（ベッド容 積５００ｍ１のカラムを製造元の使用説明書に従って使用した）。

５ｅｐｂｘ＋ｏ＋ｃＣＬ−６Ｂ　’カラムを用いるゲル濾過を、次のようにして ５ｅｐｈ■マｌ　Ｓ−４００■カラムと直接比較した（この方法でのベッド容積 のタイプ５００ｍ１）。

培地が前分画されない培養物から、ＨＢｓＡｇ粒子を誘導した。採集したＨＢｓ Ａｇ含有培養培地を初めにＰｅ１ｌｉｃｏｎ■３００、　ＯＯＯＭＷ分画膜又は ＾Ｉｃｏｎ　１Ｍ３ＱＯ■即ち分画分子量３００．０ＯＯの分画膜（六ｍ１ｃｏ ｎ　Ｃｏｒｐ、）上で濃縮し、次いで１０％ＰＥＧで分画した（Ｐｅ１ｌｉｃｏ ｎ■３００．０［１０１１Ｗ分画膜上で予め濃縮せずにＰＥＧで分画した場合と 比較して、この場合にはＨＢｓＡ■ ２粒子の損失が減少した）　。Ｐｒ１ｌ＋ｃｏｎ　　及び＾ｍ１ｃｏｎ　Ｘｔ４ ３００■は同じ結果を与えた。ＰＥＧ沈殿物（ＨＢｓＡｇ粒子含有サンプル）を 好ましくはＩＸＰＢＳに溶解するか又は高塩濃度のＴｒｉｓ−ＮｔＣ１緩衝液（ ５０ｍｌＪ　Ｔ＋ｉ＋−Ｔ＋ｉ＋＋ｕ塩基、　５１ｇｎ５　；　３　ＭＮｓＣｌ −分析用、Ｍｅ＋ｃｋ　）に溶解した。５ｃｐｂｔｒｏ＋ｅ■カラム又は５ｓｐ ｈ＊ｃＢｌ■カラム上に８１ｍ１のＨＢｓＡｇサンプル（約２■）を載せた。と もに、ＰＢＳ緩衝液中に載置されたサンプルは、Ｔ＋ローＮ５Ｃｌ緩衝液中のサ ンプルよりも良好（２倍）に分離、精製された。ＨＢｓＡｇ粒子を精製する際の これらのカラムの間の相違を、以下のように要約することができる。

ＨＢｓＡｇ粒子は、１容（５００ｍｌ）のＰＢＳでカラムを洗うことにより溶出 された（両力ラムはベッド容積５００ｍ１のタイプのカラムであった）。溶出画 分をｌ　Ｄ　ｍｌのサンプルとして集め、そのアリコートをＨＢｓＡｇ−特異性 についてテストした（実施例８及び９に記載のＴ■ｅｎｏｌ■キット及び実施例 ７に記載のタンパク定量）。ＨＢｓＡｇ粒子の回収率（収量）は、５ｅｐｈ！ｃ ＋７１　Ｓ−４０００カラムから９０％以上であり、また変は、サンプルをＰＢ Ｓ中で載置したときには、５ｅｐｈａｃＢｌ■カラムからの場合４５％であり（ Ｔ＋ローＮａＣ１緩衝液を用いて載置したときには２０％であった）、一方、サ ンプルをＰＢＳ中で載置したときには、Ｓ！ｐｈｔ＋ｏｓｔ■カラムを用いた場 合の純度は僅かに２０〜３０％であった（サンプルをＴｔローＮｉＣｌ緩衝液中 で載置したときには純度は１０〜１５％であった）。

Ｓ！ｐｈｘｔ＋７１■カラム又はＳｅ山＋ｏ＋ｅ■カラムを用いてＨＢｓＡｇ粒 子の純度をより向上させるために、第二のゲル濾過を行った。第一のゲルが過か らの溶出ピーク画分をＰＢＳ中のｌＯ％ＰＥＧで濃縮し、ＰＥＧ沈澱物をＰＢＳ に再溶解した。

第二カラム上へのサンプルの載置は上記の第一カラムの場合と同様に行ったが、 この場合には、載置用緩衝液としてＰＢＳのみが用いられた。次のことが観察さ れた。

第一カラムが５ｅｐｈｘｃＢＩ　Ｓ−４００■であって、第二カラムが５ｅｐｈ ｘｃＢＩ　Ｓ−４００■であるときには、約９５％のＨＢｓＡｇ粒子が純度６０ 〜７０％で回収された。

第一カラムが５ｅｐｈｉｃＢＩ　Ｓ−４００’であって、第二カラムが５ｅｐｈ ａ＋ｏｓｔ　ＣＬ−６Ｂ■であるときには、約６θ〜７０％のＨＢｓＡｇ粒子が 僅かに約５０％の純度で回収されたにすぎなかった。

第一カラムが５ｅｐｈｘ＋ｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ■であって、第二カラムがＳｅｐ ｈｇ＋ｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ■であるときには、７０％のＨＢｓＡｇ粒子が非常に 幅広いピーク（不純ピーク）で回収されたにすぎなかった。

培地が前分画されない培養物中に産生されたＨＢｓＡｇ粒子に対してこれらの上 記精製方法が実、施されたことに、再度注目すべきである。前分画工程は、本出 願人が、いがなる段階でもＰＥＧ分画／′濃縮を必要とゼずに、一方実施例５及 び第４図に記載の工程のみを用いてＨＢｓＡｇ粒子を極めて高いＬノベルに精製 することを可能にする。

この実施例の童Ｃ１（コニ程３に対する代替法）に記載のように、ＰＥＧ分画／ 濃縮は組み合わせ工程として透析と遠心分離及び／又は限外ｌ濾過とを必要とす る。従って、これは時間がかかると共に製造コストも高くなる。

最後に、上述したように、ゲルが過によって精製すべきＨＢ　ｓ　Ａ　ｇサンプ ルの調製には、３００．　ＯＯＯＭＷ分画膜をもっ■ Ｐｅ１１１ｃｏｎ　　またはＡｍ１ｃｏｎ　ＸＡ３００■系による濃縮工程を使 用し■ た。両者ともに同じ結果となったが、使用したＡｍ１ｃｏｎ　　系は５［１ｆｒ ＩＩｌのサンプルを処理し得たにすぎず、また操作圧力５０ｐ日■ を必要とした。一方、Ｐｅ１１１＋ｏｎ　　系ははるかに大容量を処理可能であ り、またＱｐｉｉの圧力で操作し得る。この系は工業的応用にとってもまた低コ スト生産にとっても望ましい。

従って、培地が前分画される細胞培養物から誘導されたＨＢｓＡｇ調製物のため の好適な方法はＳ＋ｐｈａｃＢＩ　Ｓ−４００■を用いる２つの連続的カラム稼 動である。この方法により、その結果として、第二の穆動後に９５％を超すＴＴ ＢｓＡｇｌＱ子の最終純度を達成する（実施例５及び第４図）。この工程はまた 、２つの連続的稼動に同じカラムを使用するため、より経済的でもある。

４）　第二のゲノー濾過工程（第４図及び実施例５の工程５）に対する別の代替 工程として、第一のＳ＋ｐｂ＋ｃｒ７１　Ｓ−４００■カラム（工程４）から溶 出されたＨＢｓＡｇ粒子をシーｒｔｌＮ勾配上に次のようにして載置した。

培地が前分画される培養物から、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を誘導した。

ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ含有培地を、実施例５に記載のようにして、工程４の終りまで （即ち、工程１〜４を包含する。）処理した。（第一の　Ｓ＋ｐｈａｃｒｙｌ　 Ｓ−４００■カラム上でのゲル清適後の）精製ＨＢｓＡｇ粒子を、Ｂ＋ｅｋｎ＋ ｎ　ＳＷ　２７超遠心チユーブ中の（ＰＢＳで調製された）５０〜５％ンヨ糖勾 配上に載せた。このショ糖勾配を１６〜２１℃で、２７．　ＯＯＯ＋ｐｍで１８ 時間超遠心分離した。遠心分離後、チューブの底から　１．８ｄの両分を採集し 、それらのンヨ糖濃度（屈折計使用）及びＨＢｓＡｇ−特異性（実施例７の方法 使用）を測定した。ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子の特異的なピークは、鋭いピークとし て両分６〜７中に位置していた。ショ糖勾配中のこの様なＨＢ　ｓ　Ａ　ｇのバ ンドパターンは、（第５図に示した）本出願人の方法によって製造されたＨＢｓ Ａｇ粒子の高い均質性を示している。

さらに、ショ糖バンド化後のＨＢｓＡｇ純度の（実施例７に詳述される）評価に より、（５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎブｏ　ノド分析後の実施例７に記 載の）この方法によって調製されたＨ　Ｂ　ｓＡｇ粒子の純度（６０〜７０％） は全く改善されないことが実証された。さらに、収量もまた、ゲル７濾過を用い て達成された収量よりも少なく、約７０９６の回収率に過ぎない。また、ショ糖 法は非常に時間がかかり、高価な装置を使用する。

５）　第二のゲルン濾過工程（第４図及び実施例５の工程５）に対する、Ｉ−（ Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子の高純度化を達成するための別の可能な代替工程と１．て、 第一の５ｅｐｈｘ日ＴＩ　Ｓ−４０００カラムから溶出されたＨ　Ｂｓ　Ａ　ｇ 粒子を、ＣｓＣ１勾配上に載せ、超遠心分離によって分離した（ＣｓＣ１勾配超 遠心法の詳細は、Ｈｉｌｌｅｍａｎら、］、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　７　：　Ｓ ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｉ　、３−８（１９８３１及びＡｄａｍｏｖｉｃ＋ら、１ ’＋ｃｃｉｎｅ　、２　：　２０９−２１４（１９８４１に記載されている）。

ＣｓＣ１勾配分離（等密度バンド化）を用いて得られた〆結果は、窩ら回収率は 低かった（約４０〜５０％）ということである。

この回収率の減少は、ＣｓＣｌ勾配から回収されたＨＢｓＡｇ粒子の、必要な透 析によるものであり、このとき透析は透析バッグの中で行われ、ＨＢｓＡｇ粒子 はバッグに付着する。さらに、ＣｓＣ１勾配超遠心は非常に高価であり、時間も かかるため、工業的に適用し得ない。好適な方法は、従って、実施例５及び第４ 図に記載の方法である。

第■表は本出願人の好適な新規ＨＢｓＡｇ粒子精製方法と、ＨＢｓＡｇ粒子精製 に使用した代替法とを比較している。包含されている方法は、本出願人が系の開 発の間に使用した可能な代替法である。実施例５及び第４図に、好適な方法Ａの 詳細を示している。代替法の詳細は上記実施例１０に記載されている。

特に好適な方法（好適方法Ｂ）の詳細は、実施例１１及び第８図に与えられてい る。

実施例　１１ この方法を示すフローダイヤグラムを図８に示す。

全てのステップで、ピロゲンを含まない水及び容器を使用する。

ステップ１〜３： これらのステップは好ましい方法Ａ（実施例５）のステップ１〜３に記載されて いる通りである。

ステップ４　濃縮清澄化した培地からのＨＢｓＡｇ粒子のＤＮａ　ｓ　ｅ処理 ステップ３のＭｉｎｉｌｗｎ　　（登録商標）システムから回収した保留物（又 は濃縮物）　　１５０＋ｎｌを、１１．７０１１単位のプロテアーゼ非含有Ｄ　 Ｎ　ａ　ｓ　ｅ　（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｌｉｌｅ＋　ｔｌｉｏｃｈｅｍｉｃｘｌ　 Ｃｏｒｐｏ＋ｇ口ｏｎ）ｌバイアルで処理する。室温で２時間インキュベートす る。この処理により、ＤＮＡ含量が２０ｎｇ／μｇ−ＨＢｓＡｇから　２Ｐｇ／ μｇ−ＨＢｓＡｇに減少する。

ＤＮａ　ｓ　ｅ処理の終りに、たんばく質溶液を、２０ｍ　ＭのＮａＡｃ、ｐＩ −（＝４．５で１：５希釈する。（所要により）　ｐｔｌを　４５に調整する。

希釈は、ＨＢ　Ｓ　Ａ　ｇの吸着を防止するためにシリコン処理したびんの中で 行なう。

希釈し、酸性化すると、濁りがみられる。これを、Ｓｏ＋ｖ＊ｌｌ（登録商標） 遠心機を用いて１２．０００＋ｐＩｌｌで３０分間遠心して除去する。上清（約 ８５０ｍ１）はＨＢｓＡｇを含む。

希釈及び酸性化工程は、ステップ５のＴｒｉｓ１ｃ＋）ｌ　（登録商標）カラム に適した溶液を作成すべく行なわれる。前記カラムに添加する溶液は低塩で低ｐ Ｈでなければならない。驚くべきことに、これらの条件で生成する濁りにはアル ブミンや他の汚染物質が含まれるが、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇは含まれない。従って、 この濁りを遠心により除去しても、＋（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇが損失することなく精製 さね得る。

ステップ５：ＤＮａｓｅ処理後のＨＢｓＡｇ粒子のイオン交換精製 このステップでは、前ステップの遠心処理後の上溝を、カチオン交換カラムの５ Ｐ−Ｔ＋ｉ＋ａ＋Ｂｌ　（登録商標）ＬＳ（ＴＢＦ、　　フランス）に導入する 。ＨＢｓＡｇ精製のために多くのイオン交換樹脂が試された（下記のセクショク Ｃ＃照）。予期せぬことに、５Ｐ−Ｔ＋ｉ＋ｘｃ＋７１　（登録商標）カチオン 交換カラムが、大容量を有し且つ高収率と高精度を達成する唯一のカラムであっ た。５Ｐ−Ｔｒ１１ＣＴＴ＋　（登録商標）　ＬＳは、官能性スルホン酸基とし て下記の基− −ＣＯＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）　２−ＣＨ２−３ｏ３Ｈを有するＮ−アクリロールイ ル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールのコポリマ ーである。使用したカラムは５ｃｍｘ　２１．５ｃ１ｍのカラム（Ｐｂ＋ｒｍｇ ｃｉｉ　　（登８商８））であり、３６の最大線速度（７２０ｍｌ　／ｈ＋）で ５Ｐ−Ｔ＋ｉ＋ｇｃｒ７１　（登録商標）ＬＳを４３０ｍ１充填する。

カラムを、２０ｍ　ＭのＮａＡｃ、ｐＨ＝　　４．５を５ベツド容量用いて上記 した流速で平衡化する。充填後、カラムを２０ｍ　ＭのＮａＡｃ、ｐＨ＝　４． ５中５０ｍ　ＭのＮａＣ１を３ベツド容量用いて洗浄する。

充填及び洗浄ステップ後からの溶出ｇ！！、（Ｔ）ＮＡ及びＩ）ＮＡ分解生成物 を含む）を捨てる。ＨＢｓＡｇの溶出は、２０ｍ　ＭのＮａＡｃ、ｐＨ＝　　４ ．５中４ｆｌ〜１２［１ｍＭのＮａＣ１にバッフ　７−を変化させて開始する。

溶出ステップの線流速は６．３　（１２６０１／ｈ）である。溶出液の吸光度を ２８０ｎｍで測定することによって、ランの進行を絶えずモニターする。２つの ピークがみられる。

第１のピークは純粋なＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを含み、第２のピークは少量のアルブミ ン汚染物質を含み、その量は使用したＮａＣｌ濃度に依存する。このステップで 、１ベツド容量でカラムから約８０％のＴ（ＢｓＡｇが排除される。次ステツプ のために、非常に純粋なＨＢｓＡｇを含む第１のピークを集める。

ステップ５Ａ。

５Ｐ−Ｔ＋１ｓｘｃＢｌ　（登録商標）カラムからのＨＢｓＡｇ溶出液を、３７ ？６ホルムアルデヒド（ＵＳＰグレード）の　Ｉ：１０００希釈物を用いて３０ ℃で４８時間インキュベートする。この処理により、たんばく質溶液中に存在し 得るウィルスが不活化する。この処理は予防手段としてのみ実施される。

ステップ６：濃縮及び精製 前ステップからのＨＢｓＡｇ含有溶液を、　１００．０００Ｍ　Ｗカットオフ膜 を備えたＭｉｎｉｌａｎ　　（登録商標）又はＰｅ１ｌｉｃｏｎ　（登録商標） 限外濾過システムで濃縮する。透過速度は　ＩＩ／ｈ＋である。

ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇは膜を通過せず、保留（「Ｃ（亡＋＋＋ｌ１ｅ）溶液中に集め られる。保留溶液を元の容量の約５０％に濃縮する。

濃縮した保留溶液を、好ましい方法Ａのステップ４と同様に処理する。溶液を、 ２つの連結した５ｃｅＸ　１（ｌｌｌｅ＋ｅ　５ｅｐｈｓｃｒｙｌ−４００（登 録商標）スーパーファインゲル濾過カラムに導入する。

前記カラムには総容量で４Ｌの樹脂が１４０ωｌ／ｈ＋の流速で充填されている 。（あるいは、より大きなカラムを１つ用いてもよい。） カラムを、ＰＢＳバッファ（実施例５）を少なくとも　２ベツド容量用いて上記 した流速で平衡化する。

ボイド容量後ＨＢｓＡｇが溶出する。これは高い（９９％を越える）純度を有し ている。ホルムアルデヒドがカラム上に保持され、約１ベツド容量後溶出する。

本出願人は、顕著な精製ロスを呈することなくこの　Ｓ＋ｐｈ為＋Ｂ１−４００ 　（登録商標）でのクロマトグラフィーステップを省略することも可能であり、 この場合ホルムアルデヒドはＭｉｎｉｌｇｏ　　（登録商標）又はＰｅ１ｌｉｃ ｏｎ　（登録商標）限外濾過システムを用いて透析濾過することにより除去され ると考えている。。

５ｃｐｌ＋＋ｃＢｌ−４０＋１　　（登録商標）カラムからのＨＢｓＡｇ含有溶 出液を、Ｇｅ１ｆｆｌｔｎ　ＡＣＲＯ５Ｇ＾（０，２μ）フィルターを介してガ ラスびんに濾過することにより滅菌してもよい。

この新規な方法によれば、従来方法により製造されるものよりも高純度の非常に 有効な製品が得られる。（たんばく質に関する）純度は９８％を超え、ＤＮＡ汚 染度はＨＢｓＡｇｌ＋ｃｇ当りＱＪｌ１ｇ以下である。従って、製品は臨床グレ ードを有するものである。この新規で特に好ましい方法は、５〜６ステツプしか 含まずに単純であり、迅速かつ非常に効率的である。こうして高純度の製品が非 常に低コストで製造される。

Ｃ，ステップ５で使用した５Ｐ−Ｔ＋１ｓａｅＢｌ　（登録商標）ＬＳカラムの 他のイオン交換カラムに比較した利点他種類のカラムについて、ステップ１〜３ の初期の精製工程後ＨＢｓＡｇ粒子を更に精製する能力をテストし、比較した。

５Ｐ−Ｔｔｉｔａｔ＋１１　（登録商標）が、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇに対して十分な 容量を有しかつ高い収率と純度が得られる唯一のイオン交換樹脂であることが判 明した。

ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子を精製すべく使用される５Ｐ−Ｔｔ目ｉｃ＋丁ｌ（登録商 標）カラムの予期せぬ有効性を立証するために、テストしたすべてのカラムにつ いて以下検証する。これらの結果から明らかなように、５Ｐ−Ｔ＋ｉ■ｃＢｌ　 （登録商標）カラムはテストしたすべての他のカラムに比べて驚くべき利点を有 している。

問題点：（１）低回収率−粒子に対する高い親和性（２）粒子とのＤＮＡ結合及 び溶出 （ｂｌ　デキストランザルフェート 問題点：（１）非常に低容量 （２）バッファ条件で回収率が異なる （ｃ）　ＨＡ　ｔｌｌｔｒａｇｅ１ 問題点＝（１）非常に低容量 （２）低回収率 （ｄ）　ＨＴＰ　Ｂｉｏｇｅｌ 問題点：（Ｉ）回収率が５０％にすぎない−ＨＢｓＡｇのＩＩＴＰ−Ｂｉｏｇｅ ｌ　（登録商標）に対する高い親和性（りＤε＾Ｅ　５ｅｐｈｘ＋ｏ＋ｅ　（登 録商標）問題点：低容量−回収率測定できず （１）　５Ｐ−Ｔ＋ｉ＋ｅｃＢｌ　（登録商標）利点：高容量と高回収率（収率 ） 実施例　１２ （実施例１１のように製造した）出願人の組換ＨＢｓＡｇワクチンを成人ボラン ティアに注射し、ワクチンに対して高力価の抗体が誘発することを、抗−ＨＲｓ 　Ａ　ｇ抗体に対する公知のアッセイ法の＾ｏ＋ａｂ　ＥＩＡ　　（登録商標） 又はＡ＋１１１ｂＲＩＡ（登録商標）（アボット）を用いて証明した。

更に、非応答者、すなわち酵母由来の組換ＨＢｓＡｇに応答しなかったヒト被検 者を同定した。出願人の組換ＨＢｓＡｇワクチンを注射すると、ＨＢ　ｓ　Ａ　 ｇに対する抗体の産生が誘発された。このことは、出願人の組換ＨＢ　ｓ　Ａ　 ｇワクチンが従来市販のワクチンよりも多くの被検者に免疫を与えることを示す 。

ヒトにおいて誘発された抗体の質の更なる評価ヒ１−血清を出願人のＨＢ　ｓ　 Ａ　ｇワクチンで免疫化したヒトから集め、Ｒｅｃｏｍｂｉｖｉｘ　（登録商標 ）ワクチンで免疫化したヒト及びＢ型肝炎４！イから集めたヒト血清と比較した 。抗−ＰＩ！　−３ｌ抗体の存在について、血清を、第２抗体としてビオチニル 化抗ヒト親和性精製１　ｇＧ　（Ｓｉｇｍａ　、　カタログ番号Ｂ−９０１５） を用いて（実施例９のセクシヨンＢに記載したような）固相ＥＬＩＳ＾により分 析した。結果を下記の表１ｖに示す。

表　　　　　　　　　＋Ｖ ヒｌ−血清中の抗−Ｐｒｅ　−８ｌ抗体に対する同相Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａの結果 ０、　　Ｄ、　　（４０５ｎｍにおける）血　　清　　源　　　　　　　　実　 　験　　１　　　　　　　実　　験　　２出願人のワクチン　　　０．５５６　 、０．５７２　　　０．８４０　；　０．８４３虫　　者　　　　　　　　　　 　　０．５３０　：　　０．５３８　　　　　　　　　−Ｒｅｃｏｍｂｉｖｘｘ 後０．３６５．０．３７７−−正常のヒト血清　　　　０．３６２　、０．３６ ７　　　０．３８９　；　０．３８６表ＩＶから、出願人のワクチンで免疫化し たヒトの血液中に抗−Ｐｒｅ−３ｌ抗体が存在すること、これらの抗体のレベル がＢ型肝炎虫者の血液中に存在する抗体と類似していることが明らかである。し かしながら、酵母由来のＲｅｃｏｍｂｉｖｉｘ（登録商標）で免疫化したヒトの 血液は抗−Ｐｒｅ　−Ｓｌ抗体を含んでいない。

本出願人は、組換ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇワクチンが抗−Ｐｒｅ　−３ｌ抗体の産生を 誘発することは今回初めて知見されたことと確信している。こうした知見から、 出願人のワクチンは、？ｅ　−３ｌ決定基を有することによりＳ領域又はｐｒｔ 　−３２領域決定基に対する非応答性の問題を解消し得る点で現存するワクチン よりも育効であることが示される（例えば、２ｕｃｋｅｕ＋ａｎ、　　１．　、 　　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　１３゜６ｌ−６７（１９８６１（補遺Ａ）参照された い）。

実施例　１３ ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇの製造及び精製のための好ましい方法にの方法を示すフローダ イヤグラムを図９に示す。

ステップ１−〜３ これらのステップは、好ましい方法Ａ（実施例５）及び好ましい方法Ｂ（実施例 １１）のステップ１〜３に記載されている通りである。

ステップ７ｉ　：　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子のＤＥＡＥアニオン交換カラムによる 精製 ステップ３のＭｉｎｉｌｘｎ　　（登録商標）又はＰｅ１ｌｉｅｏｎ　（登録商 標）システムから回収した保留物（又は濃縮物）１００〜１００　ｍｌを、１ｘ 　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐ　ｔ（７ｊ５±００５）に懸濁しかつ平衡化したＤＥＡＥＦ ａｔｌ　Ｆｌｏｗ樹脂を４００〜９００　ｍｌ含有するアニオン交換カラムに導 入する。

流出分を集める。次いで、カラムを　ｌｘ　Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄しく充填物の０５ 容量）、溶出液を集め、流出分に加えた（総容量＝充填物の　１５容量）。

ＤＥＡＥカラム後、たんばく質溶液をｌｏｍＭのＮａＡｃ　（ｐＨ＝４．５）で 　１・３希釈し、ｐＨ＝４．５に酸性化した。（この希釈後、目に見える濁りは みられなかった。この点は好ましい方法Ｂのステップ４の終りのときと異なる。

これは、殆どすべてのアルブミンがＤＥＡＥカラムから除去されたためである。

その結果、この方法では濁りを取り除（遠心ステップを省略することができる。

） 任意に、ＤＥＡＥクロマトグラフィーステップの前に、（好ましい方法Ｂのステ ップ４に記載したように）ステップ３の濃縮物をＤＮａｓｅで処理してもよい。

ステップ５・ＨＢｓＡｇ粒子のイオン交換精製このステップでは、前ステップの 希釈した酸性化流出溶液を、好ましい方法Ｂ（実施例１１）のステップ５に記載 し７たようにカチオン交換カラムの５Ｐ−Ｔ＋ｉ＋ａｃ＋７１　（登録商標）Ｌ Ｓに導入する。

ステップ５Ａ：ホルムアルデヒド処理 ＳＰ−丁＋ロ暑ｃ＋７１　（登録商標）カラムから溶出したＨＢｓＡｇを、好ま しい方法Ｂ（実施例１１）のステップ５Ａに記載したようにホルムアルデヒドで 処理する。

ステップ６°ホルムアルデヒドの除去及び滅菌前ステップのホルムアルデヒド処 理したＨＢｓＡｇ溶液からホルムアルデヒドを透析により除去する。透析は、３ ０．０００又は１０Ｇ、　０００Ｍ　Ｗカットオフ膜を備えたＭｉｎｉｌｇｎ　 　（登録商標）［又はＰｅ１ｌｉ＋ｏｎ　（登録商標）］限外／濾過システムを 用いて実施する。

透析は　ＩＸ　Ｐ　Ｂ　Ｓに対して実施し、透析開始前に保留物を約５０ｍ１に 濃縮する。濃縮及び透析サイクルを３〜４回繰り返し、保留物が約５０１に濃縮 されたとき透析を完了する。限外濾過システムを　ｌｘ　Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄し、 これを保留物に添加して保留物の最終容量１（１（ｌＩｌｔとする。このＨＢｓ Ａｇ溶液を０２μのフィルターによりｌ濾過して滅菌し、　４℃で保存する。

この新規な方法によれば、前記した方法（好ましい方法Ｂ）とほぼ同程度の純度 を有する生成物が得られる。生成物の収率も、好ましい方法Ｂで達成される収率 とほぼ同程度である。また、方法Ｃにより製造されたＨＢｓＡｇ粒子を分析した ところ、方法Ｂにより製造された生成物と同一であった。この新規な方法の利点 は非常に簡便であることであり、よって非常に高純度の生成物が非常に低コスト で製造される。この方法が簡便な理由は次の通りである。

（１）好ましい方法ＢのＤＮａ　ｓ　ｅステップをＤＥＡＥカラムに変更するこ とにより、面倒な遠心ステップが省略される。ＤＮａｓｅのコストが除外される ので、方法の全コストも削減できる。

（ｂ）ホルムアルデヒドステップ前の遠心ステップが省略される。

後続のゲル清適ステップが省略される。

（ｃ）　５ｅｐｈｘｃＢｌ　　（登録商標）カラムの平衡化、流出（ｒｅｎｎｉ ｎ）及び再生という時間のかかるステップが省略される。

（ｄｌ　５ｔｐｈＩｃ＋１１　　（登録商標ンカラムクロマトグラフイ−（ゲル 済過）ステップ後の濃縮ステップが省略される。

Ｃ，ＤＥＡＥ　５ｔｐｈｚｒｏｓｔカラムの利点このイオン交換ステップは、Ｈ ＢｓＡｇ粒子の精製において新規なステップであると考えられる。このステップ は、ＨＢｓＡｇ粒子がカラムに結合も妨害もされず、カラムを通過するだけの点 で新規である。汚染物質がカラムに結合も妨害もされないため、精製が行なわれ る。ＤＮＡはカラムに結合しくよって、方法ＢのＤＮａｓｅステップが省略され る）、主たるたんばく質汚染物質のアルブミンはカラムによって妨害され、ＨＢ ｓＡｇ粒子の後に溶出する。同様に、他のアニオン性汚染物質、例えばたんばく 質、帯電脂質、ポリサッカライド及び膜断片はＨＢｓＡｇ粒子から分離される。

更に、セル培養物からのｐＨ指示薬（染料）もカラムに結合し、よってＨＢｓＡ ｇ粒子から分離される。この簡単に実施されるステップ後のＨＢｓＡｇ粒子の純 度は９０％を超える。

ここで使用したＤＥＡＥカラムは大容量を有している。粒子がカラムを通過し得 るように条件（ｐＨ，イオン強度）が選択される。（これは、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ 粒子を［１ＥＡＥカラムに結合させることによりＨＢｓＡｇ粒子の精製を試みた 実施例１１のセクションＣ（ｅ）　　に記載したＤＥＡＥカラムの使用とは異な る。）Ｆｉｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇｕｒ拳　２ 旦１ｊ　　″　の　　　　　　スキームス土ユ１土　Ｐｅ１１ｉｃｏｎ”３００ ．０００　ＭＷカットオフ膜上で予備分画化した、ＦＣ３補充培地を使用する組 織培養ノステムにおけるｌｌＢｓＡｇ粒子の製造。ろ過物（タンパク質＜３００ ．０００　ＭＷ）のみを細胞培養に加える。膜上の残留物（タンパク質＞３００ ．０００　ＭＷ）は除く。

ン膜−ｈＨＢｓＡｇ粒子を含む相培地を一次透明化することにより精製する。ろ 過物のみをさらに精製する。膜上の残留物（細胞及び細胞の残骸）は除く。

工Ｘ７’≧ムブ」　透明化相培地（ステップ２のろ過物）由来のＨＢｓＡｇ粒子 の＊＊、及びＰｅ目１ｃｏｎ”’３００．０００　ＭＷカットオフ膜上でＰＢＳ に対しで透析。残留物のみをさらに精製する（タンパク質３００．０００　ＭＷ より大）。ろ過物を除く（タンパク質３００．０００榊Ｗ未満）。残留物を１Ｊ ｉｎｉｔａｎ　Ｔ′３００．０００　ＭＷカットオフ膜上でさらに濃縮する。

五テノ−１−４ステップ３の残留物を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４０（１”’カ ラム上でのゲルろ過Ｉによって精製する。次いで帽ｎ１ｔａｎ　Ｔ′（３００， ０００ＭＷ力Ｉトオフ膜）１−で溶出したＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ　ピークフラクシ ョンを濃縮する。

↓ Ｘ　ｆ　−ｙ　’１７’　５　　ステップ４のｄｌＨＢｓ＾ｇ溶出物を５ｅｐｈ ａｃｒｙｌ　Ｓ−４００”’カラム上でゲルろＡｌ１によりさらに精製し、次い で帽ｎ１ｔａｎ　”（３００，０００ＭＷカプトオフ１！！り上で溶出したＨＢ ｓＡｇ　ピークフラクションを濃縮する。

第４図 □　　ＨＥｓＡｇ　（μ幻 一−−針−−スゲロース　　　　（％）ＣＰＭ　Ｘ　１Ｇ’ ＨＢｓＡｇ　抹Ｍ　　　（μｇ／ｚ＋’＞ｘ　’ＩＦＩＧＵＲＥ７ 第８図 Ｂ　　　　　　　　の　　　　　　　　　　の−に“　　　い　　　　　　しい 　　Ｂ）スｊ−≦（Ｌ二ｌ　第４図と同様。

■ 、入ｊ２Ｌプ」ユ　濃縮した透明化培地由来ＨＢｓ八ｇへ子のＤＮａｓｅ処理す る。

希釈及び２０ｍｋｌ　ＮａＡｃ　ｐＨ４，５による酸性化。現れる濁りを遠心分 離によって除去する。

ｘ　ｆ　ｙヱ立　ステップ４の浮遊物を５Ｐ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ”ＬＳカラム 上で精製する。

■ １匹」巳！−プ５ａ　　ステップ５の濃ＨＢｓＡｇ溶出物をホルムアルデヒドで 処理する。

スミニブ１　ステップ５由来ＨＢｓＡｇ含有溶液を１旧ｔａｎ　”またはＰｅ１ ｌｏｃｏｎ””　（１００，０００ＭＶＩカプトオフ膜）上で濃縮する。濃縮し た残留物を５ｅｐｈａｃｒｙｌ−４００上で精製する。５ｅｐｈａｃｒｙｌ−４ ００からの溶出物を０．２　ミクロンフィルターで滅菌ろ過する。

第９図 八　　　　　〇　　　　　　　　　　の　　　　　い　　　　　　、Ｑスー　プ １〜３　第４図と同様。

スヱエブ土　ステップ３の残留物をＤｌｉ＾ε高速カラ高速カラ脚上る。

溶出フラクションを回収し、ｌ：３に希釈し、ｐＨ４，５に酸性化する。

ステュ１エ　ステップ４の酸性化し、希釈した溶出物を５Ｐ−Ｔｒｉｓａｃｒｙ ｌｅ　ＬＳカラム上で精製する。

スヱユ２５エ　ステップ５の溶出物をホルムアルデヒドで処理する。

ス土工ｊ工　透析して帽ｎ１ｔａｎ＠またはＰｅ１ｌｏｃｏｎ＠　（３０Ｋ又は １００１０Ｏｘカツトオフ膜）上でホルムアルデヒドを除く。濃残留物を０．２ ミクロンフィルターで滅菌ろ過する。

ＦＩＧＵＲＥ　１０ ？＋’７２１＝Ｆ＋ｊ”ｉｉ　＃　　ＨＢ、　　ｑイ’　　　　（Ｂ１０．ｓ） 珀−１ｖｌ（ａ、） 国際調査報告

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子の製造方法であって、（ａ）培地中で該粒 子を産生する哺乳類細胞を培養することにより培地中へＢ型肝炎表面抗原粒子を 分泌させ、該培地は分子量が約３×１０５ダルトンより大きい分子を含まない血 清が添加されており、 （ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原粒子を含む得られた培地から全細胞、細胞砕片及び粒子 凝集体を除去し、 （ｃ）得られた培地を処理して存在するＢ型肝炎表面抗原粒子を濃縮及び精製し 、さらに （ｄ）こうして得られた濃縮し精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子を回収する ことを含む該製造方法。
2. ２．Ｂ型肝炎表面抗原粒子がヒト表面抗原粒子である請求項１に記載の方法。
3. ３．ステップ（ａ）の血清がウシ胎児血清であることを特徴とする請求項１に記 載の方法。
4. ４．全細胞、細胞砕片及び粒子凝集体を限外ろ過により除去することを特徴とす る請求項１に記載の方法。
5. ５．Ｂ型肝炎表面抗原粒子を濃縮し精製するステップ（ｃ）の処理が限外■過を 含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. ６．濃縮し精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子の回収がクロマトグラフィーを含む ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ７．クロマトグラフィーがゲル■過クロマトグラフィーを含むことを特徴とする 請求項６に記載の方法。
8. ８．ゲル■過クロマトグラフィーがＮ，Ｎ′メチレンビスアクリルアミドと共有 架橋結合したアリルデキストランのカラムによるクロマトグラフィーを含むこと を特徴とする請求項７に記載の方法。
9. ９．ゲル■過クロマトグラフィーが分子量約１×１０６ダルトンより大きい分子 を排除するカラムによるクロマトグラフィーを含むことを特徴とする請求項７に 記載の方法。
10. １０．得られた濃縮精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子をさらに限外■過により濃 縮することを特徴とする請求項７に記載の方法。
11. １１．得られた濃縮精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子をさらにゲル■過クロマト グラフィーにより精製することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. １２．Ｂ型肝炎表面抗原粒子を濃縮し精製するステップ（ｃ）の処理が透析を含 むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. １３．得られた濃縮精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子をさらに限外■過により濃 縮することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. １４．哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むことを 特徴とする請求項１に記載の方法。
15. １５．ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−ＨＢ２００細胞であることを特徴とする請求項１４ に記載の方法。
16. １６．精製された濃縮ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子の製造方法であって、 （ａ）培地中で該粒子を産生する哺乳類細胞を培養することにより培地中へヒト Ｂ型肝炎表面抗原粒子を分泌させ、該培地は分子量が約３×１０５ダルトンより 大きい分子を含まない血清が添加されており、 （ｂ）ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を含む得られた培地から全細胞、細胞砕片及び 粒子凝集体を除去し、（ｃ）得られた培地を処理して濃縮されたヒトＢ型肝炎表 面抗原粒子を含む溶液を得、 （ｄ）濃縮された抗原粒子を含む得られた溶液を処理して溶液中のＤＮＡ含量を 減少させ、 （ｅ）そのようにして得られた濃縮して精製された表面抗原粒子を含む溶液のｐ Ｈを所望により約３．０−約７．０になるべく調整し、 （ｆ）得られた溶液中に存在する濃縮された表面抗原粒子を精製し、さらに （ｇ）精製された濃縮ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を回収することを含む該製造方 法。
17. １７．ＤＮＡ含量を減少させるステップ（ｄ）の処理が溶液にＤＮアーゼを加え ることを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. １８．得た溶液をさらに陰イオン交換クロマトグラフィーにかけることを特徴と する請求項１７に記載の方法。
19. １９．ＤＮＡ含量を減少させるステップ（ｄ）の処理が溶液を陰イオン交換クロ マトグラフィーにかけることを含む請求項１６に記載の方法。
20. ２０．陰イオン交換クロマトグラフィーが、カラム上に存在するジエチルアミノ エチル官能基をその上に有する架橋アガロースのカラムによるクロマトグラフィ ーを含むことを特徴とする請求項１８または１９に記載の方法。
21. ２１．ステップ（ａ）の血清がウシ胎児血清であることを特徴とする請求項１６ に記載の方法。
22. ２２．全細胞、細胞砕片及び粒子凝集体を限外■過により除去することを特徴と する請求項１６に記載の方法。
23. ２３．ステップ（ｃ）のヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を濃縮する処理が限外■過を 含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
24. ２４．精製され濃縮されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子の回収がクロマトグラフィ ーを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
25. ２５．クロマトグラフィーがゲル■過クロマトグラフィーを含むことを特徴とす る請求項２４に記載の方法。
26. ２６．ゲル■過クロマトグラフィーがＮ，Ｎ′メチレンビスアクリルアミドと共 有架橋結合したアリルデキストランのカラムによるクロマトグラフィーを含むこ とを特徴とする請求項２５に記載の方法。
27. ２７．ゲル■過クロマトグラフィーが分子量約１×１０６ダルトンより大きい分 子を排除するカラムによるクロマトグラフィーを含むことを特徴とする請求項２ ５に記載の方法。
28. ２８．得られた濃縮ヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を限外■過によりさらに濃縮する ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
29. ２９．得られた濃縮されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子をゲル■過クロマトグラフ ィーにより精製することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. ３０．ステップ（ｃ）のヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を濃縮する処理が透析を含む ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
31. ３１．得られた濃縮されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を限外■過によりさらに濃 縮することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
32. ３２．このようにして得られた溶液のｐＨ調整が溶液を遠心分離にかけることを 特徴とする請求項１６に記載の方法。
33. ３３．精製され濃縮されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子を陽イオン交換クロマトグ ラフィーによりさらに精製することを含むことを特徴とする請求項１６に記載の 方法。
34. ３４．陽イオン交換クロマトグラフィーが強陽イオン交換クロマトグラフィーを 含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. ３５．強陽イオン交換クロマトグラフィーがスルホン酸官能基がその上に存在す るカラムによるクロマトグラフィーを含むことを特徴とする請求項３４に記載の 方法。
36. ３６．強陽イオン交換クロマトグラフィーが−ＣＯＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ ２−ＳＯ３Ｈ官能基をその上にもつＮ−アクリルオリル−２−アミノ−２−ヒド ロキシメチル−１．３プロパン−ジオールの共重合体のカラムによるクロマトグ ラフィーを含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
37. ３７．得られた更に精製及び濃縮された抗原粒子をホルムアルデヒドを用いて存 在するすべての生存有機体および生存ウィルスを不活性化することにより処理す ることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
38. ３８．得られた更に精製及び濃縮された抗原粒子をさらに限外ろ過により濃縮す ることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
39. ３９．得られた更に精製し濃縮された粒子をクロマトグラフィーで精製すること を特徴とする請求項３８に記載の方法。
40. ４０．クロマトグラフィーがゲル■過クロマトグラフィーを含むことを特徴とす る請求項３９に記載の方法。
41. ４１．ゲル■過クロマトグラフィーがＮ，Ｎ′メチレンビスアクリルアミドと共 有架橋結合したアリルデキストランのカラムによるクロマトグラフィーを含むこ とを特徴とする請求項４０に記載の方法。
42. ４２．哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むことを 特徴とする請求項１６に記載の方法。
43. ４３．ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−ＨＢ２００細胞であることを特徴とする請求項４２ に記載の方法。
44. ４４．請求項１に記載の方法により製造された精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子 。
45. ４５．Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２及びＳ表面抗原ポリペプチドを含む請求項４ ４に記載の精製されたＢ型肝炎表面抗原粒子。
46. ４６．タンパク質不純物に対して９５％以上の純度を有するＰｒｅ−Ｓ１、Ｐｒ ｅ−Ｓ２及びＳ表面抗原ポリペプチドを含む精製された非血漿由来ヒトＢ型肝炎 表面抗原粒子。
47. ４７．タンパク質不純物に対して９８％以上の純度を有する請求項４６に記載の 精製されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子。
48. ４８．表面抗原ポリペプチドを Ｓ表面抗原ポリペプチド７５−８０％ Ｐｒｅ−Ｓ２表面抗原ポリペプチド１０−１５％Ｐｒｅ−Ｓ１表面抗原ポリペプ チド５−１０％の量で含有する請求項４６に記載の精製されたヒトＢ型肝炎表面 抗原粒子。
49. ４９．表面抗原ポリペプチドが Ｓ表面抗原ポリペプチド７８％ Ｐｒｅ−Ｓ２表面抗原ポリペプチド１４％Ｐｒｅ−Ｓ１表面抗原ポリペプチド８ ％の量で存在する請求項４８に記載の精製されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子。
50. ５０．表面ポリペプチドが Ｓ２４ｋＤ非グリコシル化６２．４％ Ｓ２７ｋＤグリコシル化１５．６％ Ｐｒｅ−Ｓ２３３ｋＤ単一グリコシル化１０．８％Ｐｒｅ−Ｓ２３６ｈＤ二重グ リコシル化３．２％Ｐｒｅ−Ｓ１３９ｋＤ非グリコシル化６．１％Ｐｒｅ−Ｓ１ ４１ｋＤグリコシル化１．９％の量で存在する請求項４９に記載の精製されたヒ トＢ型肝炎表面抗原粒子。
51. ５１．請求項１６に記載の方法により製造した精製されたヒトＢ型肝炎表面抗原 粒子。
52. ５２．Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２及びＳ表面抗原ポリペプチドを含む請求項５ １に記載の精製されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子。
53. ５３．Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２及びＳ表面抗原ポリペプチドを血漿由来粒子 のポリペプチドの量とほぼ同量の化学的量論量で含む請求項４４、４５、４６、 ４７、５１または５２に記載の精製されたヒトＢ型肝炎表面抗原粒子。
54. ５４．請求項４４、４５、４６、４７、４８、５１または５２に記載の有効免疫 量のＢ型肝炎表面抗原粒子と適当な担体とを含むＢ型肝炎表面抗原ワクチン。