JPH03504162A - 測定法、用途及び構成部品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

測定法、用途及び構成部品 この発明は、ハプテン類の測定法、その方法の用途及びその方法に資用なキット を含む構成部品に関する。 現在では、多数の市販のハブテン測定法がある。しかし、このような方法は、し ばしばハブテン濃度が減少するにつれて、増大する信号を発する欠点に悩まされ ることが多い。これは往々にして不便であり、バラツキ、ノイズまたはエラーの 原因となりうる。多数の市販のハブテン類測定法の他の障害は、用いた試薬単に 対して鋭敏過ぎるときがあることである。本願の発明台は、ハブテン濃度が増加 するにつれて、増加する応答を測定４−ろ方法で（よく用いられる逆比例関係と は逆の関係）、ハブテンを測定４る方法を提供することが好ましいと考えるもの である。この方法は抗体、特に標識された抗体のような試薬を過剰引用いること ができる場合は、使用するこれら試薬の爪が少々変化しても、精度に不利な影響 はしないという追加の（す点がある。 欧州特許出願第８５９０１４９５．３号、同８５９０３０１９．９号及び同第８ ７３０８８２９．８号に記載のノステムにより上記のような多くの利点が提供さ れ、すなわち、これらのノステＪ２ては、抗体は小分子とその抗体との複合体と 結合するが、小分子単独またはその抗体単独とは結合しないことが記載されてい る。これらの特許出願に開示の抗体の製造法はあいにく所望のレベルの特異性を 有する抗体を得るにはかなりくり返すので面倒なことが多い。特異性が製造の容 易さの犠牲になる場合は、バックグラウンドは高くなると考えられる。英国特許 出願第８７００４６１号には、小分子とその抗体との複合体と結合゛４°るごと がてき、小分子に対する抗体と結合しうるが、小分子単独とは結合できない別の 種類の抗体類が開示されている。これら抗体類は、測定法に用いることができ、 容易に産生することができる。あいにくなことにこれらの抗体類は、限定された 方法、例えば競合分析法で標識ハブテンを用いる方法のような限定された方法以 外の方法ではハブテンを測定できなかったといわれている。 木馳発明名は、比較的容易に産生されるが、しかも」二連のような利点を有し、 種々の方法に用いることができ抗体類を使用するハブテン測定法を提供すること が好ましいと考えるものである。このような方法が発現されたのである。 この発明は、 （１）ハブテンをハブテンの結合パートナ−に接触させ、それによりハブテンは いくらかの結合パートナ−と結合し、（ｉｉ）非結合の結合パートナ−を第２の 結合パートナ−に接触さ０、 （…）結合パートナ−を、ハブテンと結合した結合パートナ−とは結合するが、 第２の結合バー１へサーと結合した結合パートナ−とは結合しない抗体に接触さ せ、次いて（１ｖ）結合パートナ−と結合した抗体用を測定４゛ることからなる ハブテン測定法をＪＪＪ　ＩＪ（４°る。 上記の（ｉｉｉ　）及び（１ｖ）で述べた抗体は、以後、「選択抗体」と呼ぶこ とが多い。選択抗体はボリン

【１−ナル抗体であってらよいが、好ましくはモノ クローナルの選択抗体を用いるのが好ましい。 本朝て“抗体”という用語が用いられる場合は、その抗体は、（Ｆａｂ、Ｆ（ａ ｂ’）、、Ｆｖのような）結合部位を有する全免疫グロブリンまたはフラグメン トであると理解すべきである。 その抗体はまた凝集体たまはハイブリッドであってもよいが、通常は余りつｆま しくない。ハブテンの結合パートナ−として、（Ｆａｂフラグメノトのような） フラグメントを用いることが特に有用である。 ここで用いられる用語“ハブテン”とは、それ自身免疫原性てない小分子という 通常の意味をもっている。当業者は、この発明によ−て測定される小分子のよう な低分子量物質は、通常非免疫原性であるが、これらのハプテン類に対する抗体 類は、非免疫原性分子（または、非常によく似た類似体）と免疫原性物質（ウノ １１１【清アルブミンまたはごれと同等のらの）との結合体で動物を免疫するこ とにより得られるということを認知している。 ハプテン類が小分子であることは理解されるであろう。このようなハプテン類は 、分子用が例えば１００〜＋５００のらのが適切であり、より適切ならのは１２ ０〜＋　２００．好ましくは２００〜１０００である。分子量が１０００以下の ハプテン類は、この発明にとって、特に重要である。ヨーロッパ特許出願第８５ ９０１４９５．３号、同第８５９０３０１９．９号及び英国特許出願第８７００ ４６１号は、この発明の測定法に最適なハプテン類のタイプについて参考にする ことができる。ヨーロッパ特許出願第８７：（０８１１２９，８号ら同様に参考 にしてもよい。 測定に特に重要なハプテン類は、医薬品、乱用薬品、代謝産物、」Ｊ薬品（例え ば汚染物質及び農薬）、毒物等の群から選択されてもよい。 結合パートナ−に結合した選択抗体量の測定を容易にするために、選択抗体また は結合パートナ−のいずれかを固定化するのが適切である。結合パートナ−と選 択抗体との複合体を沈殿さ０ることも考°えられるが、この方法は選択抗体また は結合パートナ−のどららか一方を固定化するよりも劣ると考えられる。 用いられろ固定化法は、い４゛れの適切な方法でしよいが、一般に、固体表面、 例えば、プレート、デユープ、浸漬棒、毛細管、紙、ゲル状物等の表面に付着さ せる方法である。 ハプテン結合パートナ−用の第２結合パートナーは、ハブテン結合パートナ−と 結合し、一旦結合すると、抗体との有意な結合をｔｉｌｌ　ｔＬする。一般的に 第２結合パートナーは、ハブテンの誘導体または類似体である。最ら適切には、 第２結合パートナーは、立体効果により、抗体との結合を阻止するのに十分な大 きさの分子である。発明者の考えでは、第２結合パートナーの特に好まし、いク ラスは、大きな結合パートナ−であり、好ましくはハブテンの大きな誘導体、例 えばハプテンと大分子との結合体またはハブテンの近似類似体と大分子との結合 体である。 このような大分子は、最も適切には分子ｆｆ１５０００以上であり、好ましくは 、高分子、例えば蛋白質である。一般的には、これら高分子は分子量がｔｏｏｏ ｏ以上であり、より適切には２００００以上、好ましくは４Ｇ（１００以上であ る。本頓発明者は、アルブミン（例えばウソ血清アルブミン）のような高分子が ハプテンとの結合に適当であると考えられる。 ハブテン（または近似類似体）と大分子との結合体が、結合パートナ−を生成さ せるのに用いられる場合、その結合体は特に適切な第２結合パートナーとなるこ とが多い。このように用いられる結合体、即し第２結合パートナーは、水に易溶 性である（しかし、これら結合体の難溶性のものを用いることもできる）。当業 者は、このような結合体が容易に人手でき、かつ多数の通常の結合方法によりえ られることを知っている。 第２の結合パートナ−は、ハプテンの結合パートナ−に対する抗体、例えばハプ テンの結合部位に対する抗体、例えば抗イデイオタイプ抗体であるのが利点であ る。 」１記の抗イデイオタイプ抗体のフラグメントを用いることは特にｆり点となり 得る。 当業者は、結合パートナ−としては、通常得られる程度の高い親和性で結合゛４ ゛るものが選択されるが、第２結合パートナー複合体に対する選択抗体の親和性 は通常得られる程度の低親和性であるべきであることを知っている。 測定は所望なら標識を用いてらよい。そうであれば、その標識は、選択成体の結 合パートナ一対の固定化材」二にはない。 この発明のある観点において、標識は必要でない。例えば、ハブテン、第１パー トナ−及び選択抗体の会合は、例えば電気的、光学的などの方法、例えば回折格 子等のような表面の改質（それにより堆積物の反射特性が変化する）によって直 接測定たは抗体のような適切な結合物質であるが、ハプテンの結合パートナ−と してモノクローナル抗体を用いる時、最良の結果が得られると考′えられる。 −に記のことから、特に好ましい観点において、この発明は、（１）ハブテンを 標識モノクローナル抗体と接触さｌ、その結果ハプテンは、いくらかの標識モノ クローナル抗体と結合し、（１１）非結合標識モノクローナル抗体を、大きな結 合パートナ−と接触さＵ、 （ｉｉｉ）標識モノクローナル抗体Ｃ体を、ハプテンと結合した標識モノクＩ′ １−ナルＩＪＣ体と結合するが大きな結合パートナ−と結合したけ識モノクロー ナル抗体とは結合しない固定化抗体と接触さけ、次いて （１ｖ）標識モノクローナル抗体と結合した抗体量を測定することからなるハブ テン測定法を提Ｏ（するものである。この測定法は、標識モノクローナル抗体上 の標識を用いて行われる。通常、このようにして固定化された標識は、液相を分 離し、固形物を洗浄後分針される。 」、記のことから、特に好ましい観点において、この発明は、（ｉ）ハブテンを 固定化されたモノクローナル抗体と接触させ、その結果ハブテンはいくつかのモ ノクローナル抗体と結合し、（１１）非結合固定化モノクローナル抗体を大きな 結合パートナ−と接触さＵ、 （山）固定化モノクローナル抗体を、ハプテンと結合した固定化モノク【１−ナ ル抗体とは結合するが、大きな結合パートナ−と結合した固定化モノクローナル 抗体とは結合しない標識抗体と接触さＵ、次いで （ｉ、＝）固定化上ツク【Ｉ−ナル抗体と結合した標識抗体の徂を測定４−るご とからなるハプテン測定法を提（１（することは明らかである。この測定は、標 識モノクローナル抗体上の標識を用いて行われ、かつ通常その標識は固形物に結 合される。通常このような固定化された標識は液相を分離し、固形物を洗浄後、 分析される。 使用されるハプテン用の結合パートナ−（一般にモノクローナル抗体）の量は、 通常、ハブテンに曝す際に飽和されない程度の重である。この過剰量は、次のよ うな好結果を有利にもたらす、即しこの分析法は妥当な限界内の過剰量により過 度に影響されない。これは試験される試料の可能性のある量に対して結合パート ナ−の過剰量を用いることにより容易に達成される。 実際に、試料中のハプテンの可能性のある濃度が一般に巾広い限界内で一般によ く知られており（または算定することができ）、必要ならば一連の実験を行うこ とができるので、これは当業者によって余り難しくはない。同様に第２の結合パ ートナ−の過１１ｍらよた通畠田いられ、これは必要なら一連の実験を行うこと ができるが、当業者にとっては困難なく行える。 診断テストのためのハブテン＾λとしては、血液、血清、唾液、尿またはハブテ ンを含有する疑いのある他の起源であってもよい。池の起源としては、食物試料 、工業試料、研究室試料も考えられる。この起源は、所望なら、使用０１１に精 製されまたは濃縮されてらよい。したがって、試験法に導入されるハブテンはＪ Ｉ７！媒体中まノーはその後のｗ体中にあ−てもよい。このような試料処理法は 一般的であり、この発明の一部をなすものではない。 ハブテンと実際に結合したハブテンの結合パートナ−と結合する抗体（オなわも 選択抗体）は、ハブテンと結合しなかったハブテンの結合パートナ−（例えば第 １抗体）に対して種々の親和度を６っている。ハブテンと結合したハブテンの結 合パートサーに２を才ろ抗体の結合性が、ハブテンと結合しなかったハブテンの 結合パートナ−に比較して高い場合は、第２の結合パートナ−と選択抗体を同時 に加えてらよい。この比が低い時、一般的に、第２の結合パートナ−をまず加え て、続いて選択抗体を加えることがｃ１°刊である。 ハブテンに対してフリーの結合パートナ−のいくらかの残留結合性で抗体を作ろ ごとは容易であると名゛えられるので、第２の結合パートナ−を導入した後に選 択抗体を導入する測定法をＩＴＩいろ方が好よしい。 この発明に用いられる培捜期間は−・般的に約１分から２時間、より−・般的に は２分から１００分間、例えば１０分から６０分間である。 ハブテンの結合パートナ−に結合した抗体の量を測定する方法は、使用者に好都 合なように方法を選択してもよい。一般的には抗体と結合パートナ−の一方が、 信号発生手段で標識される。この手段は、この方法を行っている間その場に存在 し、または、例えばそれ自体標識されている他の抗体を用いて、抗体もしくは結 合ベートナーに結合さＵる“サンドイッチ法により後から加えてもよい。しかし ながら、この方法を行う間、抗体または結合パートナ−につけた標識を用いる方 が好ましい。 ハブテンの結合パートナ−と結合した抗体の量を測定する方法は間接でらよいが （例えば、結合してない量を測定し、その差によって結合爪を測定する）、ハブ テンの結合パートナ−に結合した抗体の雫を直接測定するのが好ましい。 この測定法では、選択抗体またはハブテンの結合パートナ−につけである標識を 測定するのが適切である。用いられる標識は、放射能標識（例えばＣ１４または Ｈ’　）または発光標識（例えば、生物発光、蛍光または化学発光の標識）また は酵素標識類（例えば、ホスファターゼ、ベルオキンダーゼ、β−ガラクトノダ ーゼ等または補酵素の標識）のような通常の標識であって生じさ仕ろのに使って らよい。この標識は所望により電流測定の変化を生しさＵるのに使ってもよい。 ヨーロッパ特許出願第８５９０１４９５．３号、同第８５９０３０１９．９号及 び英国特許出願第８７００４６１号には、適切な標識及びその測定法について考 慮されている。 ）り用するのが好ましい固体の表面はマイクロタイターウェルである。最も適切 な標識は、酵素標識であり、そのうち、アルカリフＡスファターゼが好ましい。 これは、便利な方法、例えばｐ−ニド【１フエニルホスフエートの脱リン酸化反 応またはＮＡＤｒ）またはＮＡＤＩ）１１の脱リン酸化による方法で測定され、 ついて増幅ザイクルが始まる。この分析法の選択は幅広く行われ、かつ当業者は 、自身の都合のないような方法を選択できる。 る条件下で行われる。ずなわら、例えば、極端でない温度、例えば４〜４０℃で あり、最ら適切には室温であって、用いられる水溶液は、必要に応じて通常の緩 衝液及び等張調節剤を含んでもよく、その結果、溶液は極端でないｐＨ及び張度 である。 この発明に用いられる特に適切な選択抗体は、利用し易いので、英国特許出願第 ８７００４６１号に記載されているのと同様にして生成さＵることができる。 選択抗体を標識化する便利な方法が用いられているが、Ｖｏｌｌ−ｅｒ法または 石川らの方法（Ｊ、　ｌｌｌ１ｎｕｎｏａｓｓａｙ　１９８３年、４巻、２０９ 〜３２７頁）、特にヘテロ２１ＩＩｌｉ官能基の架橋剤を用いる方法が好ましい 。 ハブテンに対−４゛る抗体（通常モノクローナル抗体）を作る（ｒａｉｓｅ）た めに用いられた物質を第２の結合パートナ−として用いることが０利である（例 えば１３　Ｓ　Ａに結合した／）ブテンは抗ハブテンモノクローナル抗体を生成 させるのに用いられ、かつ第２の結合パートナ−となりうる）。 選択抗体はｎｉＪ述の特許出願及び国際特許出願ＰＣＴ／ＧＩ３８７１００４６ １号の方法によって作ってもよい。いくつかの場合には、特にハブテンが天然に 動物または細胞の中に存在する場合には、ハブテンの結合パートナ−で免疫化す るのに十分であるが、ハブテンとハブテンの結合パートナ−を用いるのが好まし い。所望によりハブテンと結合パートナ−からまず複合体を作ってもよく、その 複合体は必要に応じて共有結合で結合させてもよい。 この発明の方法は、ハブテンと非結合の結合パートナ−からハブテンと結合した 結合パートナ−を除去する工程を必要としないというｆｌ１点を（ｆする。同様 にこの発明は、結合パートナ−と結合した選択抗体の量を測定する前に、ハブテ ンと結合した結合パートナ−を除く必要はない。同様に、この発明は、使い易い しのでなければ特別な専用装置を必要としないという利点をＦＴする。 好ましい観点において、この発明は、 （ａ）ハブテンに対するモノクローナル抗体を固体表面に吸収さ什、 （ｂ）このように固定したモノクローナル抗体にハブテン溶液を接触さＵｏ、そ の結果ハブテンはいくつかのモノクローナル抗体と結合し、ついでハブテンの大 きな誘導体の溶液を接触させて、その結果残りのモノク【１−ナルら結合させ、 （Ｃ）このような結合して固定化したモノクローナル抗体を、ハブテンと結合し たモノクローナル抗体とは結合するｈす１ブテンと結合したモノクローナル抗体 の大きな誘導体とは結合しない標識抗体と接触さけ、 （ｄ）固定化した標識抗体を非固定化の標識抗体から分離し、ついで （ｅ）固定化された標識量を測定する ことからなるハブテン測定法を提供するものである。 またこの発明は、ハブテンに対する結合パートナ−、ハブテンに対４゛る第２の 結合パートナ−及び選択抗体からなるハブテン測定のためのキットら提供するし のである。 最ら適切には結合パートナ−は、固定化したモノクローナル抗体である。最ら適 切には第２の結合パートナ−はハブテンの大分子誘導体である。最も適切には選 択抗体は、標識モノクローナル抗体である。 好ましくはキットは、選択抗体の結合用試剤から構成されてしよい。 選択抗体は、０１ｊ記の方法により抗体を得、ついで所望の活性度を生成４−る 抗体群を選別するこ七により選択することができろ。 選択抗体を得る方法は、試験される抗体と第１の結合パートナ−との結合が起こ ったか否かを測定４る方法に基づく方法である。選択抗体は、ハブテンの存在下 で第１結合パートナーと結合オろか、第１結合パートナーが第２結合パートナ− と結合したならば、第１結合パートナ−とは結合しないことが見られる抗体であ る。いずれか便ｆｌｌな方法が用いられるが、次の方法の１−、Ｊを用いるのが 好ましい。このような方法では、用いられろ第２の結合パートナ−は、第１結合 パートナーを作るのに用いられる結合体のことが多い。 被験抗体は、固体表面に結合される（例えば、該表面上にまたは該表面に既ｒＹ の抗体上に吸収さＵることにより結合される）。このような表面にハブテンかま たは第２結合パートナーに曝された第１結合パートナーを加える。標識抗体と０ ７ｊ記表面との会合の程度が測定される。第２結合パートナーの存在下よりハブ テンの存在下で結合の程度がより強力であるこれら被験抗体が、選択抗体として 選択される。 この結合の程度が強ければ強い程、選択抗体はすぐれたものである。通常１０倍 増加したしのが非常に容易に得られ、１００倍増加したしのが、容易に得られ、 及びそれ以上の倍率も比較的容易に得られる。 別に、第１結合パートナーを固体表面に結合させる。ハブテンまたは第２結合パ ートナーのいずれかを加える。被験抗体を加えて、ついで固体表面に結合した被 験抗体量を測定する。第２結合パートナーの存在下よりもハブテンの存在下の方 が結合の程度がより強力な被験抗体が選択抗体として選択される。結合は別の標 識抗体を用いて測定してらよい。 ハブテンがＣｒ、在しない場合に第１結合パートナーとの結合程度が高いことを 示す選択抗体が、一般的にこの発明の方法で続いて用いられる。結合が余り強力 でなければ同時進行ンステムが用いられるが、これは一般的にそれほど容易には 得られない。 選択抗体が得られた時には、上記の方法は、別の適切な第２結合パートナ−を選 択するのに用いられる。 この発明の方法において抗イデイオタイプ抗体の第２結合パートナーとして用い られる抗体を選択するには、抗イデイオタイプ抗体の証明にＩＩ用できる多くの 方法の１つを用いてらよい。 これらの大多数は、例えば本願に記載の第１結合パートナー及び抗体のような第 ルセブターに対して抗体のハブテンとの競合的結合の証明を含んでいる。抗体が ハブテンに対するモノクｏ　−−３ル抗体に抗イデイオタイプ抗体であることを 証明した例は次の通りである： １　モノクローナル抗体を結合させた表面を試験される抗体にさらケ。 ■、モノクローナル抗体に特異的な標識ノ＼ブテンを、上記の被験抗体にさらし た抗体４１２びに被験抗体にさらさなかったモノク（Ｊ−ナル抗体の複製標品に 加える。 ｉｉｉ　、非結合の標識ハブテンを洗浄して分離する。 ｉｖ、１１験抗体と会合した標識量及び被験抗体と会合してない標識量を測定す る。 ■、肢験抗体を加えた後会合した標識量が大きく減少する時（例えば５０％また はそれ以上の減少が生しる場合）には、この抗体は抗イデイオタイプ抗体である と考えられる。 ついでこの抗体は第２結合パートナーとしての有用性を試験されろ。これによっ て第１結合パートナーとの結合における抗イデイオタイプ抗体が選択抗体とのさ らなる結合を示すかどうかが測定される。この測定を行うにはやはり、多くの段 階がある。 １、モノクローナル抗体（第１結合抗体）と結合した表面を抗イデイオタイプ抗 体にさらケ。 ！１．ついで、標識した選択抗体を、これ（上記ｉの抗イデイオタイプ抗体にさ らした表面）と、抗イデイオタイプ抗体にさらさなかった第１結合パートナーの 複製標品とに加える。 ｉｉｉ　、非結合の標識抗体を洗浄して分離する。 １ｖ、抗イデイオタイプ抗体と会合した標識量及び体イディオタイプ抗体と会合 しない標識量を測定する。 Ｖ　抗イデイオタイプ抗体が第１結合パートナーと会合した標識量を大量に減少 させると、これは本発明の方法における第２の結合パートナ−として有用である と考えられる。測定した標識量の５０％減は、有用な第２結合パートナーである ことを示すが、一般にこの数値は、できる限り大であるべきであり、９０％以上 の減少を目障とすべきであり、９８％以上の減少は、実施例１ マウスのモノクローナル抗体が、β−エストラジオール６−（０−カルボキンメ チル）オキシム（β−ｏｅｓＬｒａｃｌｉｏｌ　６−（０−ｅａｒｂｏｘｙ−ｍ ＣＬｈｙｌ）　ｏｘｉａ＋ｅ）　：　［３ＳΔ（ノグマ　ケミカル　カンパニー 　エルティディ　型録番号Ｅ　５６３０）を免疫原として用いる通常の方法によ りエストラジオールに対して作られる。 ついで標準の方法を用いてモノクローナル抗体が、抗エストラノオールモノクロ ーナル抗体１００μにエストラノオール２００μを混合したロット脱晶に対して 作られる。ハイブリドーマクローン類を、必要な（ＳｅｌＡｂ）モノクローナル 抗体の産生のために次のようにして選別する。 マイクロタイター板（Ｎｕｎｃ　Ｉ＋ｍ＋＊ｕｎｏｐｌａＬｅ　ｌ　ｃｏｄｅ　 ４−３９４５４）を取り、各ウェルを抗マウスＩｇＧ抗体（ノグマ型録番号Ｍ　 ８６４２）Ｉｕ９を含む５０ｇＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）　１ｏｏｕ１２ テ：＋−ティングし、室温で１夜放置する。この溶液を除去し、ウニ、ルを同緩 衝液中０２％カゼインで満たし、室温で１時間放置する。ついでこのウェルを０ ．０２％ツウイーン２０（’ｒＴ）含有の５０１トリス（ｐＨ７，４）で４回洗 浄する。ついで、４組のウェルに同し被験ハイプリドーマ培養液各１００μＱを 入れる。それらを室温で２時間インキュベートし、各ウェルに２ｕ９マウスＩｇ Ｇ溶液１Ｏｕ（ｌを混合し、さらに３０分間インキュベートする。ついで、この ウェルをＴＴで４回洗浄する。 抗エストラジオールモノクローナル抗体の結合体は、Ｖｏｌｌ−ｅｒ　Ａ、　Ｃ ，Ｂｉｄｗｅｌｌ及びＡｎｎ　１３ａｒｌｅＬＬの方法ＱＳｕ口、　Ｉｏｒｌｄ 　ｌＩｅａｌＬｈＯｒｇａｎ、、　５３巻、５５頁（１９７６年））によりモノ クローナル抗体１　、５１ｇとアルカリホスファターゼ５Ｊ１１１を用いたアル カリホスファターゼから作られる。これをｌ　：　２００に希釈する。この溶液 ４０ｚＱにβ−エストラジオール６−（０−カルボキンメチル）オキツムとｌ３ ＳＡ　Ｉ　ＯＯμＱを加え（溶液Ｉ）、またこの溶液の別の４０肩Ｃに［３ＳΔ 同量を加える（溶液■）。４組のウェルを取り、２組に溶液１１００μＱを入れ る。残りの２組に溶液■】００μＱを入れる。ついでこのウェルを室温てさらに １時間インキュベートする。ついでこの溶液を捨て、ウェルを４回ＴＴで洗浄す る。ついで各ウェルに、３．３ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ含有の５０ｍＭ重炭酸塩緩衝Ｗ ｉｔ　（ｐＨ１０，３）　中１０ｍＭ　ｐ　−−１−ト０　フェニ／ｌｚ’Ｊ　 ７酸溶１ｆｆｌｌｏｏｕＱを入れる。ついでそのアルカリホスファターゼの活性 を４０５ｎＩ１１で記録する。 ハイブリドーマクローンとしては、上記選別で次の結果、すなわり溶液１の人。 た２組のつＪ、ルはアルカリホスファターゼの活性度が低く、溶液Ｈの入った２ 組のウェルはアルカリホスファターゼの活性度が高い結果を与える培養液を生成 するクローンが選択される。 得られたり（１−ンは、汚染クローンがないように精製され、通常の技術で腹水 をレイズ（ｒａｉｓｅ）するのに用いられる。このようにして得られたモノクロ ーナル抗体は、プロティンＡ分画法により精製される。ついでその抗体は上記（ ５ｅｌＡｂ−Ｃｏｎｉで示される）のようなアルカリホスファターゼと結合され る。この結合体は、次のようにエストラジオールの分析に用いられる。 マイクロタイター板のウェルをそれぞれ抗エストラジオールモノクローナル抗体 １μ９を含む５０ｄ重炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）１００μＱでコーティングする 。それを室温で１夜放置する。ついでウェルを０．２％カゼイン−」二記緩衝液 の溶液１０ｈ１２でおおい、室温でさらに１時間放置する。ついでそのウェルを ＴＴで４回洗浄する。エストラジオール：　ｌ３ＳＡ結合体の（１：２）連続希 釈液をリン酸緩衝溶液で１ｐｇ／峠の濃度から出発して作る。各希釈液１００Ｍ （！を２組の各ウェルに入れ、室温で１時間インキュベートし、２組のウェルに は緩衝液だけを入れる。溶液を捨ててウェルを′ｒＴで４回洗浄する。各ウェル に５ｅｌＡｂ−Ｃｏｎｊｔｆｆｉ品の１　：４００希釈液！００μＱを混合し、 室温でさらに１時間インキュベートする。ついでこの溶液を捨て、ウェルを１゛ Ｔで４回洗浄する。各ウェルにｌｏ＋ａＭｐ−ニド（１フェニルリン酸−５０ｍ １１１重炭酸塩緩衝液（ｐＨｉｏ、３．３．３ｍＭ　ＭｇＣＩｔ含有）の溶液１ ００μＱを加えて、アルカリホスファターゼ活性度は４．２ｎＩ１１で測定する 。ついでホスファターゼ活性度に対するエストラジオール濃度のグラフは、添加 したエストラジオール結合体の第１及び第２抗体の結合を阻害する力を示すもの である。９０％以上の阻害を示す結合体の最低濃度が確認され、次の測定に用い られる。 マイクロタイタープレートを抗エストラジオールモノクローナル抗体でコーティ ングし、上記の方法と同様にうわ薬をかけ洗浄する。エストラジオールの１：２ 連続希釈液を、５０ｍ１Ａトリス溶液（ｐＨ７，４）中Ｉμｇ／ｚＱから作製す る。２組のウェルにこの溶液を１００μσずつ入れ、ウェルを室温で１時間イン キュベートする。ついて上記確認された濃度より１０倍高濃度のエストロゲン結 合体溶液ＩＯμｇを各ウェルに混合する。ウェルを室温でさらに１時間インキュ ベートする。溶液を捨て、ウェルを］１゛て４回洗浄する。ついてＳｅｌＡｂ− Ｃｏｎｊ　　Ｉ　００ｐ（ｌを各ウェルに加え、室温で亀時間インキユヘートす る。次に溶液を捨て、ウェルを’ｌ”ｌ”で４回洗浄′４°る。ついて古つ」、 ルにｌＯｍＭｐ−ニトロフェノールリン酸の５０＋ｍＭｆｆｉ酸塩溶液（１）１ １１０．３．３Ｊｓ＋Ｍ塩化マグネシウム含ｒ＝Ｔ）１００μＱを加え、アルカ リホスファターゼ活性度を４０２ｎｍで測定する。このようにしてホスファター ゼ活性に対するエストラジオール濃度の標準曲線が得られる。 」二記のプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ　）によるエストラジオールの連続希釈 液の代わりに分析試験に未知試料を加えることにより、未知試料が測定される。 未知試料を加えたウェル中に最終的に見出されるホスファターゼ活性度は、標準 曲線について、これら未知試料のエストラジオールの濃度と相関関係がある。 実施例２ 第２　（ＳｅｌＡｂ）モノクローナル抗体を作る免疫化法が、抗エストラジオー ルモノクローナル抗体１００μ９とエストラジオール２００μ？を混合したもの を用いて絆臓内で免疫化する以外は実施例１をくり返す。マイクロタイター板（ こコーティングした第１抗体は抗マウスＩｇＧの代わりに抗マウス１ｇ抗体であ り、ＩｇＧの代わりにマウスＩｇＭ　２　ｕｙを加えて２時間インキュベートし た。 実施例３ 第２抗体が、ウサギの通常の免疫化法によって作られたポリクローナル抗体であ る以外は実施例１をくり返す。抗体は、アルカリホスファターゼと結合する前に プロティンＡで同様に精製される。 実施例４ エストラジオールの代わりにヒドロコルグ・シンを用いて実施例１をくり返す。 抗ヒドロコルチゾン抗体を作るのにヒドロコルデシン３−（０−カルボキンメチ ル）オキツム：　ＢＳＡ結合体が用いられ、次に阻害段階でもこの結合体が用い られる。 大ｍ１ＭＩ旺 ヒドロコルデシンを用いて実施例２をくり返す。 龍靴見 ヒドロコルデシンを用いて実施例３をくり返す。 実施例７ エストラジオールの代わりにブ（１ゲスデ（１ンを用いて実施例１をくり返す。 抗ブロゲステ【ノンモノクローナル抗体を作るのに、ついで阻害段階にしプロゲ ステロン３−（ｏ−カルボキンメチル）オキツム・［３ＳＡ結合体が用いられる 。 実施例８ ブ１１ゲステ【ノンを用いて実施例２をくり返す。 ハ夛Ｉ− マウスのモノタ【Ｊ−ナル抗体がテオフィリンに対して常法により得られる。 ついでマウスの免疫化を、完全なモノクローナル抗体を腹膜内に多数回注射して 行い、その胛臓を取出し、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体がモノクローナル 抗体に対して生成される。 これらを、抗イデイオタイプ活性に対して次のように選別する。 ヌンク（Ｎｕｎｃ）のマイクロタイクー仮に、１ウェル当り５０１重炭酸塩緩衝 液（ｐ１１９．６、抗マウスＩｇＧ抗体１ｕ９含有）１０（］μＱをコーティン グし、室温で１夜インキコベートする。溶液を除いて、ウェルを１ウェル当り０ ２％カゼイン−」二記緩衝液２００ｕ（！ておおい、室温で１時間イノキュベー トする。溶液を除いてウェルを５０ＩａＭトリス溶液（ｐＨ７，４）で４回洗浄 する。 ついて４紹のつ」、ルの各々にトリス（ｐＨ７，４）　Ｉ　００μρ中肢験抗体 １〃９を入れる。室温で２時間インキュベートする。ついでつＪ−ルを０．０２ ％ツウイーン２０含〈ｔの５０＋！１Ｍトリス溶液（ｐＨ１７，４）（１”ｌ’ 　）で４回洗浄する。次に抗テオフィリンモノクローナル抗体のｃｉ合体を、Ｖ ｏｌｌｃｒ　Ａ、、　ＩＥ、　Ｂｉｄｖｅｌｌ及びＡｎｎ　ＢａｒｌｃＬ［（Ｂ ｕｌｌ、　Ｗｏｒｌｄ　１ＩｅａｌＬｈ　Ｏｒｇａｎ、、　５３巻、５５頁（１ ９７６年））の方法により、アルカリホスファターゼから作った。この結合体の １　：５００の希釈液を作った。 」二記得られた液２００μｇを２つ取り、そのうちの１つには５０ｍＭ１・リス 溶液（ｐＨ７，４）中１ｍｇ／峠テオフィリン溶液５０ｕＱを加え、池の１つに は緩衝液（トリス）だけを加える。４組のウェルのうし２組には上記のテオフィ リン含有液１００Ｑを入れ、他の２組にはテオフィリンを含まない上記の溶液を 入れる。この溶液を室温でさらに１時間インキュベートする。ついでウェルを１ ゛′ｒで４回洗浄し、各ウェルにＩＯｍＭｐ−ニトロフェノールリン酸−５０ｍ Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨｌｏ、３）　ｌ　ＯＯｕＱを入れる。そのホスファター ゼ含量は、４０５ｎ霧における吸光度の変化率により算定される。ホスファター ゼ結合体の結合損がテオフィリンの付加により大きく減少することで選別された 抗体は、抗イデイオタイプ抗体と考えられ、次のシステムに用いられる（例えば 、テオフィリンを含まない際の吸光度ｒＰ３位の表示（／ｉが２．０で、テオフ ィリンを含む際の吸光度単位の表示値が０．７の場合）。 マウスの池のグループは、稗臓内に抗テオフィリンモノクローナル抗体１００ｔ ＋９を同型のテオフィリンと混合したらのを含何酊ろ５０ｍＭトリス（ｐｌ＋７ ．４）溶液１００ｕＱを用いて免疫化する。 免疫化後、次の４　ＬＩ間にマウスにテオフィリン１００ｇを腹膜内に３回注射 する。 ４目目にＩＩｑＩ臓を除去し、ハイブリドーマを常法により骨′髄腫細胞系ＮＳ Ｏから作る。得られたハイブリドーマを次のようにして必要な（Ｓｅｌａｂ）抗 体について選別４゛る：マイクロタイター板を取り、ウェルを抗マウスＩｇＭ抗 体１μ？含ａの５（１ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）　ｌ　００ｕＱでコー ティングし、室温で１投放置する。溶液を除去し、ウェルに０．２％カゼイン含 有の上記緩衝液を満たし、室温で１時間放置する。ついでそのウェルを′ｒ　’ ｒで１回洗浄する。４組のウェルに上記波検ハイブリドーマ培養液を各１００　 ｒｌＱずつ加える。それらを室温で２時間イノキュベートし、ついで各ウェルに マウスＩｇＭ　２ｕ９の溶液１００ＩＩｌ！を混合し、さらに３０分間インキュ ベートする。ついでウェルを′ｖ１′で４回洗浄する。 抗テオフィリンモノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ結合体の５０ＩＩ Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，４，０１％仔牛血清アルブミン（ＴｎＳＡ　）含有） のｌ：５００希釈液を２００μσ入れたものを二つ取る。その一方には、テオフ ィリン１００９ｇ含有緩衝液５０μＱを加え、他方には緩衝液だけを加える。溶 液を混合し、室温でｌＯ分間イノキコベートオる。各々のウェルに選択した抗イ デイオタイプ抗体１０μ７含有のＴｎＳＡ液を５０μＣずつ入れる。得られた溶 液を次いて室温でさらに１０分間インキュベートする。 ２組のマイクロタイターウェルの各々に上記溶液１００μσずつ加え、被験抗体 に曝ら４−０さらに室温で３０分間インキュベートする。−）いて溶液を捨てて 、ウェルを′ｒＴで４回洗浄する。 各ウェルにｌｏｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸の５０ｍＭ重炭酸塩緩衝溶液（ｐ ｌ１１０．３．３．３ｍＭ塩化マグネシウＪ−含有）１００ｕ１２を入れる。つ いてアルカリホスファターゼの活性を４０５ｎ＊での吸光度変化により測定され ろ。テオフィリンを加えた２組の吸光度変化が、テオフィリンを加えない２組よ り大きく変化する（４−なわら２．０ＯＤ（吸光度）単位が１．０　０１）単位 に変化）場合には、この被験抗体は選択抗体であると考えられ、それから誘導さ れるハイブリドーマは、汚染り【Ｊ−ンがないように精製され、通常の方法で腹 水を生成するのに用いられる。このようにしてＲ１られたモノクローナル抗体は 、ブａティンへ分画法により精製される。ついでそれは上記のようにしてアルカ リホスファターゼと結合される（“５ａｌＡｈ−Ｃｏｎｊ”を生ずる）。この結 合体は次のようにテオフィリンの分析に用いられる。 マイク【ツタイタ−板のウェルに５０ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐｌ＋９．６．抗テ オフィリンモノクローナル抗体１μ９含有）を１００ｕＱづ−ノ加えて＝Ｉ−テ ィングする。室温で１夜放置する。ついで、つｊ、ルに０２％カゼイン−十記緩 衝液１００ｕｌｌを入れ、室温で１時間放置する。それらをＴＴで４回洗浄する 。 −ノいて抗イデイオタイプ抗体の連続希釈液（１：２）をリン酸緩衝食塩溶液で 、開始濃度１μｇ／ＩＩＩ（！で作る。その缶液１００μＱを２４１１のウェル に加え、室温で１時間インキュベートし、別の２組のつ」、ルには緩衝液だけを 加える。溶液を捨て、つ」゛、ルをｉ”　’Ｉ’で４回洗浄する。各ウェルに５ ｅｌＡｂ−Ｃｏｎｊ標品の１　＋　４００希釈液１００ｕＣを入れて混合し、つ Ｊ−ルを室温でさらに１時間インキュベート４る。ついで溶液を捨て、ウェルを ４回’Ｉ’　Ｔで洗浄する。ＩＯ＋ａＭｐ−ニトロフェニルリン酸の５０ａＭ重 炭酸′塩緩衝液（ｐｌ（１０，３，３，３ｄ塩化マグネンウム含有）１００μＱ を各ウェルに加えてアルカリホスファターゼの活性は４０２ｎｓで測定する。ホ スファターゼ活性に対するテオフィリン濃度のグラフは、加えられた抗イデイオ タイプ抗体が第１抗体と第２抗体間の結合を阻害する能力を示すものである。９ ０％以上の阻害を示ず抗イデイオタイプ抗体の最低濃度が確認され、次の測定に 用いられる。 マイクロタイター板を抗テオフィリンモノクローナル抗体でコーティングし、上 記のようにぬりつけ、洗浄した。テオフィリンの連続希釈液（１：２）を５０＋ ｎＭトリス溶液（ｐｌ−１７，４）、開始濃度１μｙ／ｗＱで作る。この溶液各 ｌ００ｕＱを２組のウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。上記確認 された濃度より１０倍高濃度の抗イデイオタイプ抗体溶液１０μσずつを各ウェ ルに混ぜ入れる。ウェルを室温でさらに１時間インキュベートする。溶液を捨て ウェルをＴＴで４回洗浄する。ついで各ウェルにＳｅｌ＾ｂ−Ｃｏｎｊ　Ｉ　０ ０部ｇを加え、室温でさらに１時間インキュベート４”る。ついで溶液を捨てつ Ｊ、ルをｉ”Ｉ’で４回洗浄した。次に各ウェルにＩＯｍＭｐ−ニドＣ１フェノ ールリン酸の５（１ｍ１４重炭酸塩緩衝液（ｐ１４１０．３．３．３ｄ塩化マグ ネシウム含有）１００μＣを入れアルカリホスフェートの活性度を４０５ｎｍで 測定する。このようにしてホスファターゼ活性に対するテオフィリノ濃度の標準 曲線が得られる。 未知試料は］上記のプロトコルでテオフィリン連続希釈液の代わりに分析物に未 知試料を加えて測定される。未知試料を入れたウェルの最終ホスファターゼ活性 度はこれら未知試料中のテオフィリン濃度に対する標準曲線と相関関係にある。 実施例１０ テオフィリンに対してモノクローナル抗体が得られ、その１部をアルカリホスフ ァターゼで標識する。抗テオフィリンモノク【！−ナル抗体に対してモノク（Ｊ −ナル抗イデイオタイプ抗体を作る。、選択モノクロ−ナル抗体を抗テオフィリ ンモノクローナル抗体テオフィリンの複合体に対して作る。テオフィリンの分析 は、固体表面」−に選択モノクローナル抗体を結合させ、次いでテオフィリンの 樟準標品または被験試料および抗イデイオタイプ抗体のレノンに曝した標識抗テ オフィリン抗体にさらすことによって行われる。特異的に表面と結合したアルカ リホスファターゼの量を測定し、試料中のテオフィリン濃度を算定する。 実施例１１ 実施例１０の方法をテオフィリンの代わりにゲンタマインンテオフィリンに対す るモノクローナル抗体をフラグメント化して、Ｆλ１１フラグメントをアルカリ ホスファターゼで標識をつけ測定に用いることを除いて実施例１０の方法を繰り 返した。 実施例１３ テトラヒドロカンニバル（ＬｅＬｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎｉｂａｌ）に対する選 択抗体の製造と用途 欧州特許第０２６４２１９号に記載の方法と類似の方法により＝（１）テトラヒ ト［１カノニバル（’ｒｌＴＧ）に対するモノクローナル抗体を得る。（２）記 載されているようにして’ｌ’　Ｉ（Ｇ誘導体で親和標識をしてδ−８−Ｔ　Ｉ （Ｃ結合体を生成する。（３）この結合体に対してモノクローナル抗体を作製す る。この抗体は、抗ＴＨＣモノクローナル抗体とＴ　ＨＣの複合体と結合するが 、この抗体自体かなり広い範囲で抗Ｔ　ＩＩ　Ｃ抗体と結合するために、欧州特 許第０２６４２１９号に記載の分析法に用いると、高いパックグラウッドが得ら れる。しかしそれは、本発明の方法によるＴ　ＨＣの測定法に選択抗体として有 効に用いられる。この選択抗体は、本明細書の実施例Ｉで、次のような変化をさ せて用いられる：すなわち被験ハブテノは’ｒｏｃである：第１結合パートナ− は、抗′目ＩＣモノク［７−ナル抗体である；選択抗体は上記と同様に作られる ：第２結合パートナ−はδ−９−ＴＩＩＣの１１−力ルボキノメヂルオキンム誘 導体と常法で作った子牛血清アルブミンの結合体である。 国際調査報告 １″１＠′Ｔ′″ａｓａｌ　Ａ―崗１１”’　ＰＣＴ／ＧＢ　　８Ｂ１０１０３ ３国際調査報告 ＧＢ　８８０１０３３ ＳＡ　　　　２５５１５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）ハプテンにハプテンの結合パートナーを接触させ、その結果、ハブチ ンはいくらかの結合パートナーと結合し、（ｉｉ）非結合パートナーに第２結合 パートナーを接触させ、（ｍ）結合パートナーに、ハプテンと結合した結合パー トナーとは結合するが、第２結合パートナーと結合した結合パートナーとは結合 しない抗体を接触させ、一次いで（ｉｖ）結合パートナーに結合した抗体の量を 測定することからなるハプテンの測定法。 ２．ハプテンの分子量が１００００以下である請求の範囲１項に記載の方法。 ３，抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲１項または２項のいずれかに記 記載の方法。 ４．節２結合パートナーがハプテンの高分子誘導体である請求の範囲３項に記載 の方法。 ５．結合パートナーが抗体である請求の範囲１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６１結合パートナーがモノクローナル抗体である請求の範囲５項に記載の方法。 ７．ハプテン誘導体が結合パートナーを作るのに用いられる請求の範囲５項また は６項のいずれかに記載の方法。 ８．第２結合パートナーが結合パートナーに対する抗体である請求の範囲１項ま たは２項のいずれかに記載の方法。 ９．結合パートナーまたは抗体のいずれかが固定化された請求の範囲１〜８項の いずれかに記載の方法。 １０．結合パートナーまたは抗体のいずれかに標識をつけた請求の範囲１〜８項 のいずれかに記載の方法。 １１．固定化されていない結合パートナーまたは抗体のいずれかに標識をつけた 請求の範囲９項に記載の方法。 １２．（ｉ）ハプテンに標識モノクローナル抗体を接触させ、その結果ハブテン はいくらかの標識モノクローナル抗体と結合し、 （ｉｉ）非結合標識モノクローナル抗体に大きな結合パートナーを接触させ、 （ｉｉｉ）標識モノクローナル抗体に、ハプテンと結合した標識モノクローナル 抗体と結合するが、大きな結合パートナーと結合した標識モノクローナル抗体と は結合しない固定化された抗体を接触、させ、次いで （ｉｖ）標識モノクローナル抗体と結合した抗体の量を測定することからなる請 求の範囲２項に記載の方法。 １３．（ｉ）ハプテンに固定化されたモノクローナル抗体を接触させ、その結果 ハプテンはいくらかのモノクローナル抗体と結合し、 （ｉｉ）非結合の固定化モノクローナル抗体に、大きな結合パートナーを接触さ せ、 （ｉｉｉ）固定化モノクローナル抗体に、ハプテンと結合した固定化モノクロー ナル抗体とは結合するが大きな結合パートナーと結合した固定化モノクローナル 抗体とは結合しない標識抗体を接触させ、次いで （ｉｖ）固定化モノクローナル抗体と結合した標識抗体の量を測定することから なる請求の範囲２項に記載の方法。 １４．ハプテン用結合パートナー、ハプテン用第２結合パートナー及びハプテン と結合した結合パートナーと結合しうるが第２結合パートナーと結合した結合パ ートナーとは結合しない抗体からなる請求の範囲１〜１３項のいずれかの方法に よるハプテンの測定用キット。