JPH03504556A - Ｈｉｖ‐１を中和するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５９、ＨＩ　Ｖ−］の異なる菌株または異なる分離物を中和するモノクローナル 抗体を産生ずる、ハイブリドーマ細胞系。

６０、ＢＡＴＯ８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７およびＢＡＴ５０９から成る 群より選択される抗体を産生ずる、請求の範囲第５９項記載のハイブリドーマ細 胞系。

６１１工程： ａ）個体から血液白血球を取り出し、 ｂ）取り出した白血球をＨＩ　Ｖ−１を中和するモノクローナル抗体と接触させ 、そして Ｃ）白血球を個体に戻す、 からなる、ＨＩ　Ｖ−１感染個体を体外で処置する方法。

６２、白血球を免疫沈澱薬物で刺激することをさらに含む、請求の範囲第６１項 記載の方法。

６３、免疫沈澱薬物はインターリューキン−２、特許請求の範囲第６２項記載の 方法。

６４、モノクローナル抗体はネズミ／ヒトのキメラ抗体である、請求の範囲第６ ２項記載の方法。

６５、モノクローナル抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を特徴 する請求の範囲第６２項北載の方法。

６６、モノクローナル抗体はＢＡＴＯ８５、ＢＡＴ　ｌ　２３、ＢＡＴ２６７お よびＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第６２項記載の方法。

６７、ＨＩ　Ｖ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する抗Ｈ１符表千３ −５０４５５６　（３） ｖ−１抗体により結合されたエビドーズと同一であるか、あるいはそれに類似す るアミノ酸配列を有する免疫原ペプチド。

６８、キャリヤータンパク質と結合した、請求の範囲第６７項記載の免疫原ペプ チド。

６９、アミノ酸配列ＲＰＮＮＮＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫま たはその実際のエピトープ部分を有する、請求の範囲第６７項記載の免疫原ペプ チド。

７０、キャリヤータンパク質と結合した、請求の範囲第６７項記載の免疫原ペプ チド。

７１製剤学的に許容されうるベヒクル中にＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる 分離物を中和する抗ＨＩＶ−１抗体により結合されたエピトープと同一であるか 、あるいはそれに類似するアミノ酸配列を有する免疫原ペプチドを含む、免疫原 組成を投与することからなるＨＩＶ−１に対して免疫化する方法。

７２、ペプチドｌ；１ＲＰＮＮＮＴＲＫｓ　Ｉ　ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ Ｋを有する、請求の範囲第７１”Ｊ記載の方法。

７３、キャリヤータンパク質と結合した、請求の範囲第７２項記載の方法。

７４、ペプチドはＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧを有する、請求の範囲第７１ 項記載の方法。

７５、ペプチドはＳ　Ｉ　ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ　ＧＫを有する、請求の 範囲第７１”Ｊ記載の方法。

７７、非ヒト由来のウィルス特異的抗原結合領域およびヒト由来の領域からから なる、キメラのウィルス中和免疫グロブリン。

７８、ウィルスはヒト免疫欠損ウィルス、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウィルス■ま たはＢ型肝炎ウィルスである、請求の範囲第７７項記載のキメラ免疫グロブリン 。

７９、ウィルスはヒト免疫欠損ウィルスである、請求の範囲第７８項記載のキメ ラ免疫グロブリン。

８０、抗原結合領域は不ズミ由米である、請求の範囲第７７項記載のキメラ免疫 グロブリン。

８Ｌ非ヒト由来のＨＩ　Ｖ−１特異的抗原結合領域およびヒト一定領域からなる 、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。

８２、ＨＩ　Ｖ−１の異なる菌株または異なる分離物を特徴する請求の範囲第５ 項記載のキメラＨＴＶ中和性免疫グロブリン。

８３、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパク質と結合し、ＨＩＶによるＴ細 胞の感染を阻害し、モしてＨＩＶ感染細胞との融合によるＴ細胞の感染を特徴す る請求の範囲第８２項記載のキメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。

８４、構成成分： ａ、ヒト重鎮の一定領域の少なくとも一部分に結合した非ＨＩＶ中和性免疫グロ ブリンの重鎖かも誘導された抗原結合領域からなる、少なくとも１つのキメラ重 鎖、前記キメラ重鎖は次のｂと関連している；ｂ１ヒト軽鎖の一定領域の少なく とも一部分に結合した非ヒト免疫グロブリンの軽鎖から誘導された抗原結合領域 からなる、少なくとも１つのキメラ軽鎖、 からなる、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。

８５、ＨＩ　Ｖ−１の異なる菌株または異なる分離物を特徴する請求の範囲第８ ４項記載のキメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。

８６、抗原結合領域はネズミ由来である、請求の範囲第８４項記載のキメラＨＩ Ｖ中和性免疫グロブリン。

８７、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパク質と結合し、ＨＩＶによるＴ細 胞の感染を阻害し、モしてＨＩＶ感染細胞との融合によるＴ細胞の感染を特徴す る請求の範囲第８４項記載のキメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。

８８、ネズミＨＩＶ中和性免疫グロブリンＢＡＴ１２３から誘導された抗原結合 領域またはＢＡＴ１２３と同一のエピトープを反応性の免疫グロブリンおよびヒ ト一定領域からなるキメラ免疫グロブリン。

８９、キメラ免疫グロブリンＣＡ１２３−Ｇｌ−２６゜９０、構成成分： ａ、非由来のウィルス中和性抗体の免疫グロブリンの可変領域をエンコードする 第１ＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列は次のｂに結合している；および ｂ１ヒト由来の免疫グロブリンの一定領域をエンコードする第２ＤＮＡ配列、 からなる、キメラの軽鎖または重鎮をエンコードする融合した遺伝子。

９１、第１ＤＮＡ配列はＨＴＶ中和性抗体の免疫グロブリンの可変領域をエンコ ードする、請求の範囲第９０項記載の融合した遺伝子。

９２、ＨＩＶ中和性免疫グロブリンはＨＩ　Ｖ−１の異なる菌株または異なる分 離物を特徴する請求の範囲第９１項記載の融合した遺伝子。

９３、ＨＩＶ中和性免疫グロブリンはネズミ免疫グロブリンＢＡＴ　１２３であ る、請求の範囲第９２項記載の融合しｔ；遺伝子。

９４、発現された形態である、請求の範囲第９０項記載の融合した遺伝子。

９５、発現された形態である、請求の範囲第９１項記載の融合した遺伝子。

９６、非ヒト由来のウィルス特異的抗原結合領域およびヒト由来の一定領域から なる、キメラウィルス中和性免疫グロブリンの抗ウイルス量を、個体に投与する ことからなる、ウィルスの感染を治療または予防する方法。

９７、ウィルスはヒト免疫欠損ウィルス、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウィルスまた はＢ型肝炎ウィルスである、請求の範囲第９６項記載の方法。

９８、ウィルスは七ト免疫欠損ウィルス（ＨＩ　Ｖ）である、請求の範囲第９６ 項記載の方法。

９９、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリンの治療量を個体に投与することからな り、前記免疫グロブリンは非ヒト由来のウィルス特異的抗原結合領域およびヒト 由来の一定領域からなる、ＨＩＶキャリヤーまたはエイズまたはエイズ関係複合 体をもつ患者である個体を処置する方法。

１００、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリンはＨＩＶ−１の異なる菌株または異 なる分離物を特徴する請求の範囲第９９項記載の方法。

１０１、キメラＨＩｖ中和性免疫グ０ブ’）”は、ＨＩＶＬ７）ｇｐ１２０エン ベロープタンパク質と結合し、ＨＩＶによるＴ細胞の感染を阻害し、モしてＨＩ Ｖ感染細胞との融合によるＴ細胞の感染を特徴する請求の範囲第９９項記載の方 法。

１０２、キメラ）（ＩＶ中和性免疫グロブリンはネズミＨＩＶ中和性抗体ＢＡＴ １２３から誘導された抗原結合領域およびヒト一定領域からなる、請求の範囲第 ９９項記載の方法。

明細書 ＨＩ　Ｖ−１を中和するモノクローナル抗体発明の背景 後天性免疫欠損症候群ｈａ、一般にその頭文字エイズ（ＡＩＤＳ）で知られてお り、社会において直面する、多分最も重大な健康を脅かすものである。この病気 は痛く、衰弱させる過程を進行し、そして通常その被害者を死亡させる。事実、 診断以降から、エイズの被害者の平均寿命は２年より少ない。

今日まで、約４０．０００のエイズのケースは米国において報告された。はぼ２ ０００の個体はこの病気から死亡した。

エイズは、種々の時中のヒトＴ細胞リンパ栄養性ウィルスｌｌｌ型（ＨＴＬＶ　 　ＩＩＩ）、またはリンパアゾツバシー関連ウィルス（ＬＡＶ）と呼ばれて来て いるウィルスである。このウィルスは現在ヒト免疫欠損ウィルスＩ　（ＨＩＶ− １）として知られている。米国の公共健康サービスの病気抑制センターおよび化 学のナショナルアカデミ−により、米国単独において、約１．５百万の人々が１ ９９１年までに感染することが推定された。長期間の疫学の研究からの結果によ ると、感染した群の２０〜６０％は次の５〜６年以内にエイズを発現するであろ うことが示される。例えば、病気抑制センターは、１９９１年間でに約３００， ０００のエイズのケースが存在するであろうことを推定した。

ＨＩＶ−１は、まｌ；、エイズ関係コンプレックス（ＡＲＣ）とし臨床的に定義 される、多少重大性に劣る免疫欠損症候群を引き起こす。ＡＲＣはしばしばエイ ズの開始より先行する。現在エイズより多くのＡＲＣのケースが存在する。ケー スの数は増加し続けるので、ＡＲＣは、それ自体、極めて経費のかかる、重大な 健康の問題となるであろう。

ＨＩＶ−１による感染は被害者の免疫系を損傷し、そして究極的に破壊するので 、エイズは生ずる。免疫系は、被害者がもはや便宜主義者の感染を受は流すこと ができない点まで減少する。被害者を衰弱させかつ死亡させるのは、しばしば二 次感染である。

エイズの患者は、二次感染に対して感受性であることに加えて、そうでなければ 希な状態を発現する。多数はカポージ肉腫として知られている皮膚癌の希な形態 を発現する。この状態は、また、ウィルスにより生ずる免疫欠損から発生すると 信じられる。

ＨＩ　Ｖ−１は、Ｔヘルパー／インデューサーリンパ球（以後「Ｔ細胞」と呼ぶ ）を感染および欠失することにより免疫系を損傷する。Ｔｍ胞は、Ｂ細胞による 抗体の産生、マクロファージおよび自然キラー細胞の成熟および活性、および、 直接および間接に、免疫系の多数の他の調節およびエフェクター機能を制御する ので、必須である。

Ｔ細胞の感染は、ＨＩＶ−１が有するエピトープとＴｍ胞表面上に位置する受容 体部位との間の相互作用により起こる。この受容体部位は、ＣＤ４抗原として知 られているタンパク質分子である。ＨＩ　Ｖ−１上のエピトープは、エンベロー プ糖タンパク質ｇｐ１２０（分子量１２０゜０００ダルトン）により支持される 。糖タンパク質ｇｐ１２０は、Ｔｍ胞において作られる前駆体の糖タンパク貿ｇ ｐ１６０がｇｐ４１（分子量４１，０００ダルトン）とｇｐ１２０とに分割され るとき、産生ずる。

ｇｐ４１はほとんどの感染した個体において支配的な抗体応答を誘発するエピト ープを有するが、ｇｐ１２０が有するエピトープはＣＤ４抗原に結合し、これに よりウィルスを細胞中に入らせる。

ＨＩ　Ｖ−］はレトロウィルスである。ウィルスは細胞中に入った後、逆転写酵 素と呼ばれるウィルスの酵素は宿主細胞の核内でウィルスのゲノムＲＮＡをＤＮ Ａに転写する。新しく合成されたＤＮＡは鋳型として作用し、そして感染したＴ 細胞は新しいＤＮＡを転写してメツセンジャーＲＮＡおよびゲノムＲＮＡのコピ ーを転写させ始める。ウィルスのゲノムＲＮＡはコアタンパク質を、逆転写酵素 、およびある種の他のタンパク質を詰められる。次いで、それらは細胞膜の一部 分により発現され、そして血流中に新しく合成されたヴイリオンとして出芽する 。これらの新しいヴイリオンは他のＴ細胞中に入り、そして感染することができ る。

ＨＩ　Ｖ−１を感染した個体の体中のＴ細胞に移す、２つの既知の機構が存在す る。第１は、遊離のウィルスがＴ細胞上のＣＤ４抗原に結合するとき起こる。第 ２の機構は、ウィルスの直接の細胞対細胞の透過である。

直接の細胞対細胞の透過は、ウィルスのｇｐ１２０をその表面上で発現する、感 染した細胞が感染しない細胞のＣＤ４抗原と結合するとき、起こる。結局、２つ の細胞は融合し、そしてヴイリオンは感染しない細胞に行くことができる。

直接の細胞対細胞の接触および生ずる融合は、細胞の感染の有意の源であり、そ してＨＩＶ−］感染した個体のＴ細胞の破壊の主要な機構であることができる。

感染した細胞および感染しない細胞はしばしば大きい群であり、これによりシン ジチア（ｓｙｎｃｙｔｉａ）として知られている、多数の核化した凝集体を形成 する。細胞の融合はシンジチアにおいて細胞の死亡を引き起こす。参照、す７ソ ン（Ｌｉｆｓｏｎ）　　ｅｔ　　ａ　１．　　ｒＨＴＬ−１１１／ＬＡＶエンベ ロープ糖タンパク質によりＣＤ４−依存性細胞の融合の誘発（Ｉｎｄｕｃｔｉｏ ｎ　　ｏｆ　　ＣＤ４−Ｄｅｐｅｒ＋＋ｊｅｎｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｆｕｓｉｏｎ 　　ｂｙ　　ｔｈｅ　　ＨＴＬ−ＩＩＩ／ＬＡＶ　　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　　Ｇｌ ｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２３ニア２５　２ ７（１９８６）。

細胞の死亡の大部分はシンジチアにおいて起こると信じられる。この理論は次の 理由で当てはまる。有意の感染は他の源、例えば、血流中の遊離のウィルスから 起こり得ると思われないからである。感染した個体の血流中の遊離ウィルスの濃 度は典型的には低い。また、有意の細胞の感染は感染した個体および感染しない 細胞の明確な融合から起こり得ると思われない。１つの研究において、感染した 個体において感染Ｔ細胞の比率は、通常１０．０００〜１００．０００個の白血 球につき１個のみであることが発見された。それにもかかわらず、ＣＤ４陽性細 胞（すなわち、Ｔ細胞）の数は徐々に減少することが報告された。

ＨＩＶ−１が感染した患者は、有意の量の中和性抗体を発生しない。

それらは、典型的には、血流中に非常に低い力価の中和性抗体を有する。

こうして、ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体は、処置に特に有用であろ う。

モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞により産生される。ハイブリドーマは 、すべて単一の融合した細胞からクローニングされて細胞である。すべてのクロ ーンは親と同一である。したがって、同一クローンのすべてのハイブリドーマは 、同一エピトープに結合する同一の抗体を産生ずる。

モノクローナル抗体をつく方法は、最初に、ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）および ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）により記載された。参照、ミルスティン（Ｍ ｉｌｓｔｅｉｎ）　　　ｅｔ　　ａｌ９、Ａイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６ ：４９５−９７　（１９７５）；ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）　　ｅｔ　　ａｌ 、、ヨーロピアン・ジャーナル・オブｅイムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、）、６：５４１　１９（１９７６）。宿主動物、通常マウスを抗原で免疫 化し、次いで殺す。次いで、Ｂ細胞を含有するリンパ球を、通常牌臓または他の リンパ様組織から取り出す。取り出しｌ；リンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイ ブリドーマを形成する。免疫化系の表示したエピトープに対する抗体を産生ずる ハイブリドーマをクローニングし、そしてスクリーニングする。次いで、これら のハイブリドーマを使用して、所望のモノクローナル抗体をつくる。

感染性およびシンシチウムの形成を感染するモノクローナル抗体は、他の中和性 因子より多くの利点を有するであろう。大量のモノクローナル抗体を産生ずるこ とができる。ハイブリドーマは、骨髄腫細胞との融合のために不死であり、そし てほとんど無限に再生することができる。

モノクローナル抗体の他の利点は、高い特異性および高い親和性を有するモノク ローナル抗体を種々の反応性および親和性を有する多数の抗体からスクリーニン グすることができることである。高い特異性および高い親和性を得ることができ る場合、これは最小量で抗体の治療学的使用を可能とし、この最小量はちょうど 適当なエピトープに結合してウィルスを中和しかつシンジチアの形成を防止する ために十分な量である。

モノクローナル抗体の高い特異性は、他の中和因子のそれと対照的である。１つ の研究において、ｇｐ１２０を包含する。ＨＩＶ−］のエピトープの種々のタン パク質で免疫化したヤギから抗血清を票めた。この抗血清は低い希釈のみでＨＩ Ｖ−］の感染を効果的に遮断した。参照、Ｓ、Ｄ、プトネイ（Ｐｕｔｎｅｙ）　 　　ｅｔ　　ａｌ、、　「ライに７．のエピトープのＥ、ｃｏｌｉ産生断片に対 するＨＴＬＶ−１１１／ＬＡＶ中和性抗体（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ／ＬＡＶ−Ｎ ｅｕ　ｔ　ｒａ　ｌ　ｉ　ｚ　ｉ　ｎｇ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｔｏ　　 ａｎ　　Ｅ、ｃｏｌｉ−Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｖ ｉｒｕｓ　　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ）Ｊ、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）、２３４ 　：１３９２−９５　（１９８６）、同様に、組み換え体ｇｐ１２０で免疫化し ｌ；ウサギおよびモルモットからの抗血清は、低い希釈のみでＨＩ　Ｖ−１の中 和に有効であった。参照、Ｌ、Ａ。

ラスキー（Ｌａｓｋｙ）　　ｅｔ　　ａｌ、、「組み換え体エンベロープ糖タン パク質に対する抗体によるエイズレトロウィルスの中和（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａ ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ＡＩＤＳ　　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　　ｂｙ　 　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｔｏ　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　Ｅｎｖｅｌｏ ｐｅ　　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３ ３＝２０９−２１２　（１９８６）、これらの研究において使用したポリクロー ナル抗体は、非特異的であり、したがって比較的大量に使用しなくてはならなか った。

上の結果が示唆するように、全体のｇｐ　ｌ　２０および長い組み換え体ペプチ ドは、多分「中和性エピトープ」が免疫原性でないので、高い中和抗体を誘発す ることができない。そのうえ、抗体は型特異的であり、そして群特異的ない、す なわち、それらは免疫化性ＨＩ　Ｖ−１菌株のみと反応し、そして遺伝的に有意 に異なる他の菌株を反応しないことが発見された。

エイズにおいて治療および予防の目的でモノクローナル抗体を使用するためには 、それは種々のＨＩＶ−１菌株およフィールド（ｆｉｅｌｄ）のＨＩＶ−１分離 物の大きい数および有意の比率に対して保護活性を示さなくてはならない。

要約すると、エイズまたはＡＲＣをもつ患者を処置する！こめに潜在的価値をも ち、無症候性の健康なＨＩＶ−１感染個体におけるエイズの予防において、ある いは高い危険の群の個体においてＨＩ　Ｖ−１感染の予防において保護的価値を 有するモノクローナル抗体は、遊離のヴイリオンにより攻撃を経るか、あるいは 直接の細胞対細胞の透過（シンシチウムの形成）により、ＨＩ　Ｖ−１の広い菌 株により感受性細胞の感染を阻害するものである。

発明の要約 ＨＩＶ−１のウィルスのｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質に結合するモノク ローナル抗体が分離された。このモノクローナル抗体は、遊離ヴイリオンによる Ｔ細胞の感染を阻害し、そして、また、シンシチウムの形成を阻害する。重要な ことには、モノクローナル抗体は群特異的であり、そしてＨＩ　Ｖ−１の異なる 菌株または異なる分離物を中和することができる。

ＨＩＶ−１中和性抗体は、エイズおよびＡＲＣの処置およびＨＩＶ−１感染に対 する受動免疫化のための使用することができる。これらの手順において、抗体は 全抗体として、または抗体断片として使用することができるか、あるいは細胞障 害性因子または抗ウイルス因子に、か、あるいはこのような因子を含有するマイ クロキャリヤーに接合してこれらの因子を感染した細胞に供給することができる 。治療因子の標的した供給は、また、標的に供給すべき因子に対する第２特異性 を与えた、本発明の抗ＨＩＶ−１抗体から誘導された二特異的（ｂｉｓｐｅｃｉ ｆｉｃ）抗体を使用して達成することができる。中和性抗体のバラトープに対す るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して、ＨＩＶ−１に対す る中和性免疫系を刺激することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、マウスまＩ；は他の動物から完全に誘導された 抗体として生体内で使用することができる。あるいは、ことに治療的使用のｔ； め、ウィルス中和性抗体は動物／ヒトキメラ抗体の形態でつくることができる。

好ましくは、キメラ抗体の一定領域はヒト誘導であり、そして可変領域は動物誘 導である。

本発明のモノクローナル抗体は、連続の、安定な抗体産生細胞系により産生され る。これらの細胞系は、ハイブリドーマ技術により、および遺伝子工学の技術に より産生ずることができる。

本発明は、また、本発明の抗体により認識されるｇｐ１２０のエピトープセグメ ントに相当するペプチドに関する。ペプチドはＨＩ　Ｖ−１に対する交差保護性 、中和性免疫応答を発生するだめのワクチン組成物において使用することができ る。それらは、また、生物学的分野においてＨＩＶ−１に対する中和性抗体を検 出するＩ；めに使用することができる。

図面の簡単な説明 第１図は、Ｈ９細胞のＨＩＶ−１感染の中和における本発明のモノクローナル抗 体の４つの相対的有効性を示すプロットである。感染した細胞の百分率は、感染 の９日後に決定した。

第２図は、Ｈ９細胞のＨＩ　Ｖ−１感染の中和における本発明のモノクローナル 抗体の４つの相対的有効性を示すプロットである。感染した細胞の百分率は、感 染の１３日後に決定した。

第３図は、キメラＨＩＶ−１中和性抗体についての軽鎖および重鎖をエンコード するキメラ遺伝子の構造の概略的描写である。（Ａ）プラスミドｐｓＶ１８４Δ Ｈｎｅｏ、ＢＡＴＩ　２３Ｖ、、Ｃ，はヒトＣ，遺伝子と融合したマウスＶ、ゲ ノムの４．４ｋｂｐＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　！断片から成るキメラ軽鎖遺伝子の構造 を含有する。このプラスミドは、ｎｅｏ選択マーカーを含有する。（Ｂ）プラス ミドｐ　ＳＶ２ＡＨｇ　ｐ　ｔ　ＢＡＴ　ｌ　２３Ｖ、ｈＣ，、は、ヒトＣ９１ ゲノムト融合したマウスｖＨの４．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を含有する。プラ スミドはＥｃｏｇｐ　を選択マーカーを含有する。Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｅ：Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈ：Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉｓ　Ｓ：５ａｌｌ、Ｖ：可変領域の遺伝子、Ｃニ 一定領域。

第４図は、キメラＨＩＶ−１中和性抗体（レーン２）およびネズミモノクローナ ル抗体ＢＡＴ１２３（レーンｌ）の等電点電気泳動のパターンを示す。Ｓはカソ ード（上部）からアノード（下部）へのｐｒ値を使用するｐＨ目盛り定め標準タ ンパク質を表す：８．６５．８．４５．８゜１５．７．３５．６，８５．６．５ ５．５．８５．５．２０．４．５５および３．５０゜ 第５図は、キメラ免疫グロブリンの電気泳動の分析を示す。（Ａ）　ｒ−タンパ ク質Ａ親和クロマトグラフィーにより精製した免疫グロブリンは１０％５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により、ジサルファイド結合を還元するか、 あるいはしないで分析した。レーン１％ＢＡＴ１２３、還元した；レーン２、キ メラ抗体、還元した；レーン３、ＢＡＴ１２３、還元しない；レーン４、キメラ 抗体、還元しない。（Ｂ）抗マウス抗体に対する免疫グロブリンの免疫反応性の ウェスタンプロット分析。精製した免疫グロブリン（２μｇ）を１０％の５ＤＳ −ＰＡＧ中に還元性条件下に溶解し、ニトロセルロース膜のフィルター上に電気 トラスプロットし、モして抗マウス抗体と反応させた。レーン１．ＢＡＴ１２３ 、レーン２、キメラ抗体。ＣＣ）（Ｂ）からの反復実験のトラスプロットした膜 を抗ヒト抗体と反応させた。レーンｌ、ＢＡＴ１２３；レーン２、キメラ抗体。

第６図は、ＥＬＩＳＡにおける抗血清に対するその反応性によりア・ンセイした 、キメラ抗体のＩｇＧサブクラスを示す。使用する抗血清は（・）ＩｇＧｌ、（ ０）抗ヒトＩ　ｇＧ３であった。

第７図は、キメラ抗体の抗原特異性のウェスタンプロ・ノドを示す。

（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に溶解し、そしてニトロセルロース膜のフィルター上 にトラスプロットしたＨＩＶ−１抗原に対する免疫グロブリンの免疫反応性。ス トリップｌ、エイズ患者の置換突然変異体（１：２００希釈）、ストリップ２、 ＢＡＴ１２３　（ｌμｇ／ｍＱ）；ストリップ３、キメラ抗体（１μｇ／ｍＱ） 。（Ｂ）ニトロセルロース膜のフィルター上にプロッティングしたＨＩＶ−ｇｐ １２０の潜在的抗原決定基（エピトープ）を表す合成オリゴペプチドに対する抗 体の反応性。ストリ・ンプ１、ＢＡＴ１２３；ストリップ２、キメラ抗体。

第８図は、ＨＩＶ−１によるＨ９細胞の感染へのキメラ抗体の中和活性を示す。

試験した抗体の不存在下におよび存在下にＨＩＶ−１でＨ９細胞を対抗した後、 細胞不合培養上澄み液を第１４日にＨＩ　Ｖ−１特異的抗原捕捉アツセイのため に集めた。抗体の濃度の各々を３回の反復実験において試験した。ＨＩＶ−１の 感、染の阻害は、抗体を添加しＩ；陰性の対照に対して、抗体の存在下にウィル スで感染した培養物゛の抗原捕捉アッセイにおいて得られＩ；光学密度により計 算゛した。試験した抗体はＢＡＴ１２３（○）、キメラ抗体ｃＡＧ１．　５４　 ４（・）、および非反応性不ズミ抗ｈｃＧ抗体（△）であった。

本発明のモノクローナル抗体はウィルスのエピトープ糖タンパク質ｇｐ１２０に 結合する。感染したＴ細胞におけるＨＩＶ−１特異的エピトープタンパク質の処 理において、ｇｐ４１はトランスメンブレンドメインであり、そして暴露しない 。対照的に、ｇｐ１２０は細胞外である外部エンベロープタンパク質である。こ うして、感染したＴ細胞において、ｇｐ１２０タンパク質は本発明のモノクロー ナル抗体のための結合性エピトープを提供する。

本発明のモノクローナル抗体は、感染の阻害およびシンシチウムの形成の阻害に おいて有効であることが分かった。これが示すように、それらは、細胞の死亡の 大部分がシンシチウムにおいて起こると信じられるので、生体内中和のために非 常に有効であるであろう。重要なことには、抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株また は異なる分離物を中和することができる（すなわち、抗体群特異的である）。抗 体はウィルスの異なる菌株または異なる分離物による細胞の感染を中和する。中 和性抗体は、また、ｇｐ１２０のアミノ酸配列中に実質的な程度の異質性を有す るＨＩＶ−１の種々の菌株によりシンシチウムの形成を阻害する。これらの結果 が示すように、抗体は交差保護性であり、そして集団中のウィルスの種々の菌株 に対して保護することができる。

本発明の中和性抗体は感染の中和において高い効能を有することができる。例え ば、モノクローナル抗体は、９日のアッセイにおいて２０倍のＴＣＩ　Ｄ、、に おいてＨＩＶＩＢによる感受性ヒトＴ細胞系の感染を、１０μｇ／ｍＱより低い ＩＣ，、で、阻害することができる。

抗体の産生の一般手順を下に記載する。

本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの産生において普通に使用され る慣用の手順によってつくった。簡単に述べると、マウスを不活性化したＨ　Ｉ 　Ｖ−１で免疫化した。免疫化したマウスの肺臓から取ったＢ細胞をＭＳ−１骨 髄腫細胞と融合した。カルシウムマグネシウム不合リン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ ）中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と混合したポリエチレングリコールを 、融合試薬として使用した。次いで、融合から発生したハイブリドーマを９６ウ エルのマイクロタイタープレートに移し、そして増殖させた。

ＨＩ　Ｖ−１を中和するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを、１系 列のスクリーニング手順により分離した。第１に、酵素結合免疫吸収アッセイ（ ＥＬＩＳＡ）をすべてのウェルにおけるクローンについて実施した。この試験に おいて、これらのクローンにより産生されたモノクローナル抗体が精製したｇｐ 　１２０に結合するかどうかを決定した。ｇｐ１２０との最高の反応性を示すウ ェルからのクローンを、免疫蛍光アッセイによるそれ以上のスクリーニングのた めに選択した。

免疫蛍光アッセイを実施して、ＥＬＩＳＡ陽性のモノクローナル抗体のどれが完 全な生きている感染したＴ細胞に対して特異的に結合するが、感染しないＴ細胞 に結合するかを決定した。免疫蛍光陽性であることが分かったクローン、すなわ ち、感染した細胞に対して特異的である抗体を産生したものを単一の細胞のクロ ーニングにおいて使用した。

単一の細胞のクローニングにおいて、クローンを希釈して、所定の体積についき 数個の細胞が存在するようにする。次いで、この体積をウェルに添加し、そして 細胞を増殖させる。この目的は、あるウェルにおいて、単一の細胞のコロニー／ ウェルのみを二項分布により不規則に達成することである。細胞のコロニーを顕 微鏡で視的に監視して、それがモノクローナルであるかどうかを決定する。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ陽性のクローンを、また、ウェスタンプロット分析において試験 した。この手順において、ＨＩＶ−１タンパク質のリゼイトをゲル電気泳動によ り分離し、そしてニトロセルロースのストリップ上に移した。次いで、ＥＬＩＳ Ａ陽性ウェルの上澄み液を、ストリップ上でｇｐ１２０タンパク質バンドとの反 応性について試験する。

これらのスクリーニング工程の結論において、ｇｐ１２０および感染した細胞に 対して特異的であるモノクローナル抗体は分離された。

次いで、免疫蛍光陽性のハイブリドーマをマウスの腹腔中に注入して、腹水から 大量のモノクローナル抗体を産生じた。次いで、抗体を中和のアッセイのために 精製した。

上の免疫化、融合、スクリーニング、および抗体産生の方法のある数の変更は可 能である。例えば、マウス以外の動物を免疫化に使用することができる。次いで 、Ｂ細胞は融合のために使用するために免疫化した動物から得ることができる。

さらに、前述のもの以外の試薬を化学的融合に使用することができる。

別の方法はハイブリドーマの形成に化学的融合以外の電気的融合を使用すること である。この技術はよく知られている。融合の代わりに、例えば、ニブスティン パールウィルスまたは遺伝子の形質転換を使用して、不死にすることができる。

［例えば、Ｂ細胞の形質転換法、参照、「前景て決定した特異性の抗体を合成す るヒト細胞系の連続的増殖（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｓ　　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎ ｇ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓ　　　Ｓｙｎｔｅｔｉｚｉｎｇ　　Ａ ｎｔｉｂｏｄｙ　　　ｏｆ　　　Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　　５ｐｅｃｉｆ ｉｃｉｔｙ）Ｊ、ズラヮキ（２ｕｒａｗａｋｉ）、Ｖ、Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、、モ ノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ケンネ ンット（Ｋｅｎｎｅ　ｔ）Ｒ，Ｈ，編、Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓｘニューヨ ーク、１９−３３ページ。］ ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光アッセイ、およびウェスタンプロット分析に関して、すべ ての工程のいつかの変更は可能であることに注意すべきである。スクリーニング の工程の数を増減することができる。あるいは、記載したものの代わりに、他の スクリーニング手順、例えば、ラジオイムノアッセイ、または免疫組織化学的染 色技術を使用することができる。

重要な考察は次のことである。すなわち、ｇｐ１２０に対して特異的でありかつ ＨＩＶ−１感染したＴ細胞の細胞表面に特異的に結合するモノクローナル抗体を 分泌するハイプリドーマについて、この手順は選択スる。

単一の細胞のクローニング手順は、種々の数の細胞をウェルの各々中に配置する ように変更することができる。事実、ウェルの各々にだだ１つのクローンが存在 するかどうかについての試験は、また、ある数の方法により実施することができ る。

モノクローナル抗体を産生ずる方法、すなわち、マウスへのハイプリドーマの注 入は、また、変更することができる。パフユージジンまたは中空繊維の技術を使 用する培養において、大量のモノクローナル抗体を増殖することは可能である。

ｇｐ　ｌ　２０および完全な、生きている感染した細胞に対して特異的なモノク ローナル抗体の前述の方法による分離後、ＨＩＶ−１の中和において抗体の有効 性を試験した。免疫蛍光陽性であったクローンの各々からのモノクローナル抗体 を分離した。モノクローナル抗体の存在または不存在でＨＩ　Ｖ−１により感染 した細胞の数を比較した。抗体の各々の異なる力価を使用して、それらの効能を 比較した。中和アッセイを免疫蛍光技術により監視した。

中和の第２試験はシンシチウムの阻害による。シンシチウム阻害のアッセイにお いて、ＣＤ４遺伝子およびそれらの表面上のＣＤ４抗原で人工的にトランスフェ クションした、トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞を接種したウェルに、感 染しｔ；Ｔ細胞を添加した。細胞表面上のＣＤ４抗原は感染したＴ細胞と融合し て、多数の核化した巨大細胞を形成した。異なる力価の免疫蛍光陽性抗体が巨大 細胞の形成を阻害するかどうかを決定した。

中和アッセイおよびそれらの監視手順の大量の変更は可能である。例えば、シン シチウムの形成のみに関し、そして遊離ヴイリオン粒子による感染に無関係であ る場合、一方のみを試験し、他方は試験することは望ましくないであろう。

抗体をこれらのアッセイにおいて、異なる菌株および分離物の中和について試験 する。

結論において、本発明の産生物の種々の調製および試験の方法は可能であり、そ して本発明の範囲内である。本発明のモノクローナル抗体の利点および使用をこ こで説明する。

Ｂ１利点および使用 前述のように、モノクローナル抗体の１つの利点はそれらの特異性である。この 特異性は治療における本発明のモノクローナル抗体の使用に高度に関係する、な ぜなら、それはより低い投与量を使用することができることを意味するからであ る。

本発明のモノクローナル抗体の治療的使用は、生体内の免疫治療および体外の免 疫治療の両者を包含する。本発明のモノクローナル抗体を使用する直接生体内処 置は、それらを内部に、好ましくは静脈内注射を経て投与することを包含する。

脳内の感染した細胞の処置が必要である場合、血液−脳バリヤーの通過を可能と する因子、例えば、ある種の親油性物質にモノクローナル抗体を結合することが できる。本発明の抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する することができ、こうして、患者の集団において直面するウィルスの異なる菌株 または異なる分離物に対して有効的に保護することができる。

体外の治療において、血液白血球を患者から取り出し、そして中和性抗体で処理 する。次いで、モノクローナル抗体を白血球に添加する。白血球は、また、免疫 沈澱薬物、例えば、インターリューキン−２で刺激することができる。次いで、 白血球を患者に戻す。

本発明のマウス誘導モノクローナル抗体は、直接の生体内および体外の免疫治療 の両者のために使用することができる。しかしながら、マウス誘導モノクローナ ル抗体を治療剤としてヒトにおいて使用するとき、患者はヒト抗マウス抗体を産 生ずることが観察された。こうして、マウス誘導モノクローナル抗体は、少なく ともある場合において、制限された治療的価値を有すると言えた。参照、Ｖ、Ｔ 、オイ（Ｏ４）　　ｅｔａｌ、、　「キメラ抗体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　　Ａｎｔ ｉｂｏｃｌｙ）Ｊ、バイオテクニークス（Ｂｉｏ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、 ４　（３）：２１４−２２１　（１９８６）。しかしながら、発表された遺伝子 工学の技術を使用すると、動物誘導部分およびヒト誘導部分を有する抗体をつる ことができる。キメラ抗体は、動物抗体から誘導された抗原結合（可変）領域お よびヒト抗体から誘導された一定領域からなる。ウィルス中和性抗体の産生を下 に記載する。

モノクローナル抗体の他の別の形態は、二特異的抗体である。二特異的抗体は２ つの異なる抗原結合部分を有し、両者は異なる特異性をもつ。

二特異的モノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体から誘導されＩ； １つの抗原結合部分、および特定の部位に対して標的すべき因子に対して特異的 である第２抗原結合部分を有することができる。例えば、第２特異性はヒトＴ細 胞またはマクロファージ、例えば、ＣＤ４分子の表面エピトープに対することが できる。これらの二特異的抗体はＴ細胞またはマクロファージをＨＩＶ−１感染 した細胞に向けて標的するために使用できる。

二特異的抗体は単一の、雑種抗体または二特異性を有する抗体断片であることが できる［参照、Ｍ、ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、ｒマウスモノクローナルＩ 　ｇＧ、のＦａｂ’断片からの二特異的抗体の調製のための化学的技術（Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　　Ｔｅｃｈｎｅｑｕｅ　　ｆｏｒｔｈｅ　　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ ｎ　　ｏｆ　　Ｂ１５ｐｅｃｉｆｉｃ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｆｒｏｍ　 　Ｆａｂ’　　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｍｏｕｓｅ　　Ｍｏｎｃｌｏｎａ ｌ　　ＩｇＧ＋）Ｊ、バイオテクニークス（Ｂｉｏ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ） 、４　（３）：４２４　２７　（１９８６）］か、あるいはそれらは各々が異な る特異性を有する２つの抗体の異質凝集体であることができる。

免疫治療抗体処置を受ける潜在的に患者の集団は、エイズまたはＡＲＣを有する 患者を包含する。種々の治療は受動免疫化による保護である。

本発明の抗体は、集団における異なる菌株のＨＩＶ−１に対して交差保護性であ ることができるので、受動免疫化にとくに適当である。この手順において、無症 候性である（エイズまたはＡＲＣの症候をまだ示さない）か、あるいは血清陰性 であるが、高い危険の群である患者を処置して感染を阻害することができる。標 的はＨＩＶ−１キヤリヤーの母親の中の胎児またはその子供およびエイズの患者 または血液製品とともに働く専門家、例えば、歯科医および看護婦を包含する。

処置のための因子は、再び、本発明のモノクローナル抗体、キメラの不ズミ／ヒ トモノクローナル抗体、または二特異的モノクローナル抗体であることができる 。

エイズを停止しようとする努力における研究の大部分は、ワクチン組成物の研究 に集中されてきた。提案されたワクチン組成物の１つの型において、免疫化因子 はＨＩＶ−］の一部であり、それは非感染性であるが、それにもかかわらず抗体 の産生を誘発する。ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体はこのワクチン組 成物の研究を助けることができる。

それらは、モノクローナル抗体と結合するＨ　Ｉ　Ｖ−１上の「中和性」エピト ープを探索し、同定し、そして研究することを助けることができる。

これらのエピトープは非感染性であるが、それにもかかわらず分子の免疫原性部 分であるようである。これらのエピトープは、エピトープと同一であるか、ある いはそれと免疫学的に同等である構造をもつ、非病原性免疫原の合成を可能とす る。例えば、免疫原は、ＨＩ　Ｖ−１を中和する抗ＨＩＶ−１抗体により結合さ れたエピトープと同一であるか、あるいはそれに類似する、アミノ酸配列からな るペプチドであることができる。

今回、本発明の中和性抗体の２つは、次のアミノ酸配列を有するｇｐ１２０の領 域に位置するエピトープを認識することが発見された：ＲＰＮＮＮＴＲＫＳ　Ｉ ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫこのセグメントはｇｐ１２０の２５アミノ酸残 基長さのセグメント（残基＃２８４−残基＃３０８）を表す。１つの抗体（ＢＡ Ｔ２６７）は配列ＲＰＮＮＮＴＲＫＳ　Ｉ　ＲＩＱＲＧ　（ペプチドａ）と反応 し、そして他方の抗体（ＢＡＴ　ｌ　２３）はＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ 　（ペプチドｂ）と反応する。

これらの２つの１５アミノ酸残基の長さのペプチドは、ＨＩＶ−ＩＢのｇｐ１２ ０の２つの隣接し、オーバーラツプするセグメントを表す。

ペプチドｒａＪは残基＃２９４−残基＃３０８のセグメントを表し、そしてペプ チドｒｂＪは残基＃３０４−残基＃３１８を表す。ＢＡＴ２６７はペプチドｒａ Ｊと反応し、そして５つのアミノ酸ＲＩＱＲＧを共有するペプチド「ｂ」、また はペプチド「ａ」に隣接するｇｐ１２０のセグメント（残基＃２８４−残基＃２ ９８）を表しかつ５つのＲＰＮＮＮを共有する他の１５アミノ酸長さのペプチド と反応しない。これらの結果が示唆するように、ＢＡＴ２６７はエピトープを認 識し、このエピトープは５アミノ酸残基ＴＲＫＳ　Ｉのすべてまたは一部により 完全に支持されるか、あるいはこれらの５アミノ酸のすべてまたは一部と幾つか のフランキングアミノ酸残基とで形成される。同様な結果に基づいて、ＢＡＴ１ ２３は、ＰＧＲＡＦのすべてまたは一部により支持されるか、あるいはＰＧＲＡ Ｆのすべてまたは一部と幾つかのフランキングアミノ酸残基とにより形成される 。

ＢＡＴＯ８５抗体は、アミノ酸配列ＶＱＫＥＹＡＦＦＹＫＬＤＩ　Ｉ　Ｐを有す るペプチドと反応する。

本発明のペプチドの免疫原は、上に同定したアミノ酸配列またはそれらの免疫化 学的および免疫原的同等体からなる。これらの同等体は、例えば、これらの配列 のいずれかの実際のエピトープ部分、種々のＨＩＶ−１菌株からの対応するペプ チド領域および種々の変化により発生しＩ；ペプチド、例えば、インターフェロ ン、欠失体およびアミノ酸の置換体を包含する。

本発明のペプチドは一緒に結合して、より大きい、多価のオリゴペプチドを形成 することができる。

ペプチドは化学的合成により調製することができる。あるいは、それらは組み換 えＤＮＡ技術により調製することができ、ここでペプチドをエンコードするＤＮ Ａ配列をＨＩＶ−Ｉ　　ＤＮＡから合成し、そして適当な発現系において発現さ せる。

ペプチドは、また、個々にまｔ；は組み合わせで使用して、ＨＩＶ−１に対する 免疫応答を誘発することができる。この目的で、ペプチドを一般に投与のための ワクチン組成物中で、ｌμｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ宿主の濃度で配合することができ る。生理学的に許容されうるベヒクル、例えば、水、生理的塩類溶液、またはリ ン酸塩緩衝液を配合において使用することができる。アジュバント、例えば、ア ルミニウム水酸化物のゲルを、また、使用することができる。投与のルートは筋 肉内、腹腔内、皮下または静脈内であることができる。組成は１回または多数回 で、通常１〜４週の間隔で投与することができる。

ワクチン組成物の好ましい実施態様において、ペプチドを担体タンパク質、例え ば、異質キーホールリンペットのヘモシアニン（ｋｅｙｈ。

ｌｅ　　ｌｉｍｐｅｔ　　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に結合する。これはノ１ブテ ンタンパク質の免疫原性を増大する。

ペプチドはイムノアッセイにおいて使用して、中和性抗体を同定するか、あるい は血清中の中和性抗体の存在をスクリーニングすることができる。

ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体が可能とするワクチンの他の型は、抗 イデイオタイプ抗体である。抗体は、それら自体抗原性であるかつ抗体の産生を 刺激することができる領域、「イディオタイプ」を、それらの抗原認識部位付近 に有する。抗原結合部位に対して特異的である抗体は、パロトーブ（ｐａ　ｒｏ 　ｔ　ｏｐｅ）特異的抗イデイオタイプ抗体と呼ぶ。これらの抗体は、最初に抗 体の産生を刺激した抗原と同一のコンフォメーションを有する。参照、Ｊ、Ｌ、 マルクス（Ｍａｒｘ）、「抗原なしの抗体の産生（Ｍａｋｉｎｇ　　Ｗｉｔｈｏ ｕｔ　　Ａｎｔｉｇｅｎｓ）Ｊ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８８；１６ ２　６５（１９８６）。

こうして、ＨＩＶ−１と同一の構造を部分的にもつ、バロトープ特異的抗イディ オタイプ抗体は、動物をＨＩＶ−１に対するモノクローナル抗体で免疫化するこ とによってつくることができる。これらの抗イデイオタイプ抗体は、ウィルスの 免疫原性部分と同一のある種の構造を有し、免疫応答を引き起こすであろうから 、ワクチンとして使用するために適するであろう。有利には、これらの抗イデイ オタイプ抗体はタンノ（り質から成り、そしてウィルスの核酸もたないので、病 原性にほとんど無関係であろう。可変領域がマウスモノクローナル抗イデイオタ イプ抗体であり、そして一定領域がヒト免疫グロブリンである、キメラマウス／ ヒト抗イデイオタイプ抗体はより好ましい。

本発明のモノクローナル抗体は、例えば、マイクロキャリヤーまたはリポソーム 中に組み込むことによって、細胞障害因子または抗ウイルス因子を供給すること を促進するために使用することができる。細胞障害因子の例は、細胞障害性ステ ロイド、ガラニン、アブリン、リチンおよびホスホリパーゼを包含する。抗ウイ ルス因子はインターフェロン、アジドチミジンおよびリポビリンである。また再 び、キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体、または二特異的モノクローナル抗 体は、まｊ；、薬物の供給の促進に適する。

普通の意味において、モノクローナル抗体を包含する抗体は、体液の免疫性の仲 介因子と呼ばれる。しかしながら、標的細胞上の独特の細胞表面抗原に対して特 異的である抗体は、細胞溶解因子または細胞障害性因子に接合することができる ので、生ずる免疫毒素は実際に細胞の免疫性を仲介することができる。細胞障害 性１９７３球は、抗原特異的細胞免疫性の重要な仲介体であり、ウィルス感染し た細胞を認識しそして溶菌する。こうして、適切な操作を使用すると、感染した 細胞表面上で発現されたウィルスの抗原エピトープは、細胞障害性１９７３球の 主要な機能を達成することができる。

Ｃ，キメラウィルス中和性抗体（免疫グロブリン）の産生本発明のキメラウィル ス中和性免疫グロブリンは、キメラの免疫グロブリンの重鎮および軽鎖から構成 されている。キメラ鎖の各々は、非可変領域およびヒト一定領域を有する、隣接 するポリペプチドである。キメラの重鎖および軽鎖は関連して、機能的な抗原結 合領域をもつ分子を形成する。

キメラ免疫グロブリンは一価、二価または多価であることができる。

−価の免疫グロブリンはキメラの軽鎖（Ｌ）と関連した（ジサルファイド架橋を 通して）キメラの重鎮（Ｈ）から形成された二量体（ＨＬ）である。二価の免疫 グロブリンは２つの関連する二量体から形成されたテトラマー（Ｈ２Ｌ２）であ る。多価の抗体は、例えば、凝集する重鎮の一定領域（例えば、ｍｕ型一定領域 ）を使用することによって産生ずることができる。

キメラ免疫グロブリンは抗原結合断片として産生ずることができる。

断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’　またはＦ（ａｂ’）ｘは適当に切頭した重鎮 一定領域を使用することによって産生ずることができる。

キメラ免疫グロブリンの可変領域は、所望のウィルス特異性およびウィルス中和 性を有する、非ヒト免疫グロブリンから誘導される。好ましい実施態様において 、親杭ウィルス免疫グロブリンはウィルスの異なる菌株または異なる分離物を中 和する。これは、ウィルスの集団において直面する、異なる型、菌株および分離 物のウィルスに対する交差保護性を提供する。

キメラウィルス中和性抗体を産生ずることができる、重要な病原性、ウィルスは 、ＨＩＶ、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウィルスｌ（大人のＴ細胞白血病の病原性因 子）、およびＢ型肝炎ウィルスである。

ＨＩＶ中和性免疫グロブリンは前述した。これらのＨＩＶ中和性抗体は、ＨＩＶ −１の糖タンパク質ｇｐ１２０と特異的に反応する；それらは遊離ヴイリオンに よりＴ細胞の感染を阻害し、モしてＨＩＶ−１感染細胞との融合によりＴ細胞の 感染を阻害する。抗体は、交差中和性であるので、すなわち、ＨＩＶ−１の異な る菌株または異なる分離物を中和するので、好ましい。例えば、抗体ＢＡＴ　ｌ 　２３は、中和抗体接合体および交差菌株反応性をもつので、好ましい。ＢＡＴ 　１２３抗体は、１０ｎｇ／ｍＱより低いＩＣ，。で、９日のアッセイにおいて ＴＣＩ　Ｄ、。の２０倍でＨＴＬＶ−１１１Ｂ菌株による、感受性ヒトＴ細胞系 、Ｈ９の感染を阻害する。抗体は、また、幾つかの他のクローニングしたＨＩＶ −１菌株を阻害し、そして患者からの広い、新しく分離したフィルドＨＩ　Ｖ− １試料の生体外複製を阻害する。

キメラ免疫グロブリンの重鎮一定領域は、５つのアイソタイプのアルファ、デル タ、ニブシロン、ガンマまたはミューから選択することカーできる。種々のサブ クラス（例えば、ＩｇＧサブクラス１〜４）の重鎮を使用することができる。重 鎮の異なるクラスおよびサブクラスは異なるエフェクター機能において含まれ１ ．こうして、重鎮の一定領域の型を選択することによって、所望のエフェクター 機能をもつキメラ抗体を産生ずることができる。本発明のキメラ免疫グロブリン は、遺伝子操作技術により産生される。適当な受容体細胞を、好ましくは所望の キメラ軽鎖または重鎮をエンコードする核酸構成体、例えば、ＤＮＡでトランス フェクションする。一般に、キメラ免疫グロブリンの軽鎖および重鎮の構成体の 各々のｊ；めのＤＮＡ構成体は第１ＤＮＡセグメントおよび第２ＤＮＡセグメン トからなり、前記第１ＤＮＡセグメントは可変領域の少なくとも機能的部分をエ ンコードし、そして第２ＤＮＡセグメントに結合し、そして第２ＤＮＡセグメン トは一定領域の少なくとも一部分をエンコードする。融合した遺伝子を、適当な 受容体細胞のトランスフェクションのための発現ベクターにアセンブリングする か、あるいはその中に挿入する。

好ましい実施態様において、融合した遺伝子構成体は、免疫グロブリン鎖ん一定 領域をエンコードする遺伝子に結合した、ウィルス中和性免疫グロブリンの鎖の 可変領域をエンコードする、機能的に再配置された遺伝子からなる。構成体は、 また、可変領域エンコード遺伝子のための内因性プロモーターおよび工ンノ＼ン サーを包含するであろう。例えば、可変領域エンコード遺伝子は、リーダーペプ チド、軽鎖のためのＶＪ遺伝子（接合する（Ｊ）セグメントをもつ機能的に再配 置された可変（Ｖ）領域）または重鎮のためのＶＤＪ遺伝子、およびこれらの遺 伝子のための内因性プロモーターおよびエン／Ａンサーからなる、ＤＮＡ断片と して得ることができる。これらの可変領域の遺伝子は、標準のＤＮＡクローニン グ手順によりジサルファイドウイルス中和性抗体を産生ずる、抗体産生細胞から 得ることができる。参照、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ＭａｎｕａＬ、Ｔ、Ｍａ ｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、コールド−スプリング・ハーバ−・ラボラト リ−、コールド・ノ１−ノ＜−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）ｅ機能的に再配置された可変領域のためのゲ ノムのライブラリーのスクリーニングは、適当なりＮＡプローブ、例えば、マウ ス生殖系列のＪ領域ＤＮＡ配列および下流の配列を使用して達成することができ る。次（Ｘで、正しいクローンの同定および確証は、クローニングした遺伝子の ＤＮＡ配列決定および完全な長さの適切に切継ぎされたｍ　ＲＮ　Ａの対応する 配列の配列の比較ｌこより達成される。機能的に再配置された可変領域の遺伝子 を含有するＤＮＡ断片を、所望の一定領域（またはその一部分）をエンコードす る遺伝子を含有するＤＮＡ断片に結合する。

抗体の軽鎖および重鎮をエンコードする遺伝子は、一般に、免疫グロブリン産生 リンパ様細胞から得ることができる。所望のウィルスに対する産生を産生ずるハ イブリドーマの細胞系は、標準の手順によりつくるすることができる。参照、コ ブロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）　　ｅｔ　　ａｌ、、米国特許第４，１９ ６，２８５号。一般に、これらは、動物をウィルスまたは精製した部分的に精製 したウィルス抗原で対抗させ、免疫化した動物から取った抗体産生細胞を適合性 の骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成し、生ずるハイブリドーマ細 胞をクローニングし、そしてウィルスに対する抗体を産生ずるクローンを選択す ることを伴う。ハイブリドーマのクローンは、特定のウィルスに対する中和活性 について試験することにより、ウィルス中和性抗体の産生についてスクリーニン グすることができる。例えば、ＨＩＶ中和抗体接合体についての幾つかの生体外 アッセイをここに記載する。

ヒト一定領域は、標準の遺伝子クローニング技術により抗体産生細胞から得るす ることができる。ヒト軽鎖の２つのクラスおよびヒト重鎖の５つのクラスのため の遺伝子をクローニングし、こうして、ヒト白米の一定領域はこれらのクローン から容易に入手可能である。キメラ免疫グロブリンの断片、例えば、−価のＦｖ 、ＦａｂまたはＦａ、ｂ’断片または二価のＦ（ａｂ’）ｚ断片は、切頭した形 態でキメラ重鎖遺伝子を設計することによって調製することができる。例えば、 Ｆ（ａｂ’）ｚ重鎖をエンコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ，ドメインをエンコ ードするＤＮＡ配列および重鎮のヒンジ領域の少なくともスルフヒドリル含有部 分を包含する。

軽鎖または重鎮のいずれかをエンコードする融合しＩ；遺伝子を、受容体細胞中 への組み込みのために、発現ベクターにアセンブリングするか、あるいはその中 に挿入する。キメラ遺伝子構成体のだめの適当なベクターは、型ｐＢＲ３２２、 ｐＥＭＢＬおよびｐｕｃのプラスミドを包含する。プラスミドベクター中への遺 伝子構成体の導入は、標準手順により達成することができる。

好ましい実施態様において、発現ベクターは２つの選択可能な遺伝子のマーカー を含有するように設計し、１つは原核生物（バクテリア）系において選択のため のものであり、そして他方は真核生物系における選択のためのものである。融合 した遺伝子は、バクテリア系において産生じかつ増幅し、引き続いて組み込み、 モして真核生物の細胞において選択することができる。原核生物系のために選択 可能な例は、アンピシリン抵抗性を与える遺伝子およびクロランフェニコール抵 抗性を与える遺伝子である。真核生物んトランスフェクション体の選択のための 遺伝子は好ましい（ｉ）キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラ ーゼ遺伝子（工」上」工と表示する）および（爾）Ｔｎ５からのホスホトランス フェラーゼ遺伝子（二且旦と表示する）。ｇｐ±を使用する選択は、この遺伝子 によりエンコードされた酵素がキサンチンをプリンヌクレオチド合成のための基 質として使用する能力に基づく；類似の内因性酵素はそれが不可能である。キサ ンチンおよびイノシンモノホスフェートのモノホスフェートへの転化を遮断する ミコフェノール酸を含有する媒質において、ｇＰＬ遺伝子を発現する細胞のみは 生存することができる。二二二の産生物は、抗生物質Ｇ４１８およびそのクラス の他の抗生物質により引き起こされる真核生物の細胞における、タンパク質の合 成を遮断する。

キメラの軽鎖および重鎖は、受容体細胞を同時転移するために使できる、２つの 異なる発現ベクター中に配置することができる。この場合において、ベクターの 各々は真核生物のトランスフェクション体のための異なる選択可能な遺伝子を有 するように設計する。これにより、受容体細胞を同時トランスフェクションする ことができ、そして同時トランスフェクションした細胞（すなわち、両者のベク ターを受は取った細胞）を選択することができる。同時トランスフェクションし た細胞の選択は、両者の選択可能なマーカーについて選択することによって達成 され、これは同時にあるいは順次に実施することができる。

受容体細胞系は一般にリンパ様細胞である。好ましい受容体細胞は骨髄腫である 。骨髄腫は、トランスフェクションした遺伝子によりエンコードされる免疫グロ ブリンを合成、組み立ておよび分泌することができる。とくに好ましい受容体細 胞は骨髄腫Ｓ　ｐ　／　Ｏであり、これは通常内因性免疫グロブリンを産生じな σ（。トランスフェクションしたとき、細胞はトランスフェクションした遺伝子 構成体によりエンコードされる免疫グロブリンのみを産生ずるであろう。トラン スフェクションした骨髄腫は培養物中であるいはマウスの腹膜中で増殖すること ができ、腹膜において分泌された免疫グロブリンは腹水から回収することができ る。他のリンパ様細胞、例えば、８１７３球または）１イブリドーマは受容体細 胞として使用することができる。

リンパ様細胞をキメラ重鎖およびＨ鎖の遺伝子を含有するベクターでトランスフ ェクションする方法は、いくつか存在する。リンパ株細胞中ヘペクターを導入す る好ましい方法は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびバフ−デル（ｖａｎ　　ｄ ｅｒ）Ｅｂ、（１９７３）ウィルス学（Ｖｉｒｏｌ、Ｌ　５２：４５６に記載さ れているリン酸カルシウム沈澱手順である。他の方法はエレクトロポレイション （ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ）である。この手順において、受容体細胞中 に組み込むべきＤＮＡの存在下に電気パルスを細胞にかける。参照、ボッター（ Ｐｏｔｔｅｒ）　　ｅｔ　　ａｌ、（１９８４）ＰＮＡＳ　　８１ニア１６１゜ ＤＮＡの導入の他の方法は、原形質体の融合による。リゾチーブを使用して、キ メラ鎖遺伝子をもつ組み換えベクターを含有するバクテリアから細胞壁を消化し て、スフェロプラストを産生ずる。スフェロプラストをリンパ様細胞と融合する 。原形質体の融合後、トランスフェクション体を選択し、そして分離する。（Ｏ ｉ、ｅ　ｔ　　ａ　１．（１９８３）ＰＮＡＳ８０：８２５）、最後に、プリン （Ｃｕｌｌｅｎ）　　ｅｔ　　ａｌ、（１９８４）ネイチＪｌ−−（Ｎａｔｕｒ ｅ）、３０７　：　２４　］に記載されているＤＮＡ−デキストラン手順を、ま た、使用することができる。

本発明のキメラウィルス中和性免疫グロブリンは、抗ウィルスの治療および予防 のために有用である。本発明のキメラ免疫グロブリンを使用する直接の治療は、 それらを内部に、製剤学的に許容されうるベヒクル、好ましくは、例えば、無菌 の生理的塩類溶液中で静脈内注射により投与することからなる。抗体は他の抗ウ ィルス因子綿み合わせて投与することができる。

免疫治療の変法は受動免疫化による保護である。このモードにおいて、抗体は病 原性ウィルスの感染の危険がある人に投与して感染に対して保護する。

キメラＨＩＶ中和免疫グロブリンを使用して、エイズの患者またはＨＩＶキャリ ヤーである人を処置することができる。前述のように、キメラ免疫グロブリン（ 例えば、ＨＩＶ中和性免疫グロブリン、例えば、ＢＡＴ　ｌ　２３から形成した 本発明の）は、ＨＩＶ−１の異なる菌株まＩ；は異なる分離物を中和することが できる。さらに、これらの免疫グロブリンはシンチア形成によるウィルスの透過 を阻害することができる。キメ気のそれ以上の進行を遅延するために投与するこ とができる。免疫グロブリンは他の抗エイズ因子、例えば、ＡｚＴと組み合わせ て投与することができる。さらに、いくつかの異なるキメラ）（ＩＶ中和免疫グ ロブリンを一緒に投与することができる。

ある種の患者の集団において、キメラＨＩＶ中和免疫グロブリンを使用する受動 免疫化は適当であることがある。この手順において、無症候性である（なおエイ ズまたはＡＲＣの症候を示さない）か、あるいは血清陰性であるが、高い危険の 群にある患者を処置して感染を阻害する。

標的はＨＩ　Ｖ−１キヤリヤーの缶内の胎児またはその子供、エイズの患者、ま たは血液製品とともに作業する健康な専門ぼ、例えば、歯科医および看護婦を包 含する。

本発明を下記の実施例によりさらに説明する。

不活性化されたＨＩＶ−］の供給を維持するために、下記の如くしてウィルス株 を製造した。ＨＴ細胞線（Ｍ、ロバートーグロッ７す（Ｒｏｂｅｒ−Ｇｕｒｏｆ ｆ）他、前記のネーチａｒ−（Ｎａｔｕｒｅ）、１上６：７２−７４により記さ れている）のＨ９クローンを培養体中に保った。これらのＨ９クローンに、メリ ーランド州ロックヴイルのバイオチク・リサーチ・ラボラトリイのＲ，チン（Ｔ ｉｎｇ）博士から寄贈されたＨ　Ｉ　Ｖ−ＩＣＨＴＬＶ　ＩＩｌ、）を感染させ た。感染させたＨ９細胞を培養体中に保つと、細胞が生殖しそして連続的にＨＩ 　Ｖ−１供給体を合成した。Ｈ９細胞を５ｍＭのＬ−グルタミ７９．５ｍＭ（７ ）ＨＥＰＥＳ、ｓｏ単位／ｌ１１１２ノヘニシリンオヨヒ５０ｍｇ／ｍ（２のス トレプトマイシンが補充されている２０％ＦＢＳ　（熱で不活性化された）ＲＰ ＭＩ１６４０の成長媒体中で培養した。

最初に細胞培養体を１０００ｇで１０分間にわたり遠心して細胞および残屑を除 去することにより、精製されたＨＩＶ−１が得られた。上澄み液を次に９０．０ ００ｇで１時間にわたり遠心した。ウィルス粒子を最少量の燐酸塩で緩衝されて いるｐＨ７，４の食塩水中に再懸濁させ、そしてあらかじめ形成されているスク ロース勾配（２０％−６０％）で遠心管上ｌ＝充填した。試料を次に１００．０ ００ｇで１６時間にわたり遠心した。ウィルスを３８％勾配のところで集めた。

ウィルスを次に部分標本としそして蛋白質含有量を測定した後に一８０℃で凍結 した。

ｂ）免疫法の工程 雄のバルブ／Ｃハツカネズミを免疫法用に使用した。各ハッカネズミに１００μ ｇの不活性化されたＨ　Ｉ　Ｖ−１を与えた。ウィルスの不活性化はＦＤＡの認 可した工程成績表に従い紫外線照射および洗剤であるノニデットＰ−４０（０， １％）の添加により行われた。１匹のハッカネズミ当たり１００μｇのウィルス を含有する量の懸濁液を２００μｇの燐酸塩で緩衝されている食塩水（ＰＢＳ） 中に懸濁させ、そして等量の完全７０インド補助液を用いて乳化させＩ；。

各ハッカネズミに１１００ｐのウィルスを皮下注射して免疫を与えた。

ハツカネズミの数箇所の部位、例えば肢および胴の交差点の下側、に高濃度のリ ンパ腺腫を注射しＩ；。−ケ月後に、ハッカネズミの同じ部位に同量のウィルス の次子増強注射をした。増強注射は不完全７０インド補助液を用いて製造されＩ ；こと以外は、この増強注射は最初の注射と本質的には同じ方法で製造された。

一１月後に、各ハツカネズミにＰＢＳ中に懸濁されている１００μｇのウィルス を皮下注射して再び免疫を与えた。各ハッカネズミはそれぞれの肢と胴の交差点 で皮下に、モしてＭ腔内に注射された。最後の注射から３日後に、ハッカネズミ を殺しそしてそれらの肺臓を取り出した。

肺臓細胞に次に下記の工程により骨髄腫細胞を融合させた。

Ｃ）融合 ５対１比の肺臓細胞対骨髄腫細胞を含有している懸濁液を製造した。

選択された骨髄腫はＮ５−１であっＩ；。ＭＳ−１細胞を調整して約１７時間の 倍加時間とした。それらを対数期になった時に使用した。ＭＳ−１細胞を、細菌 学用平板（１００ｍｍ）中で、６ＸＩＯ’細胞／ｙ＋Ｑの濃度において、５％の 牛の胎児血ｆｆ（ＦＥＳ）、１００単位／舷のペニシリンおよび１００マイクロ グラム／πｇのストレプトマイシンを含有している１０ｉＱのダルベツコ改質イ ーグル媒体（ＤＭＥＭ）中で継代培養した。媒体を３日毎に交換した。他方では 、細胞を１．５４ＸＩＯ’細胞／ｍＱにおいて１０蛯の同じ媒体中で継代培養し そして媒体は２日毎に交換した。

肺臓を細菌学用平板（１００ｍｍ）の上に置きそして２０ｍ（ｌのカルシウムと マグネシウムを含まないＰＢＳ（ＣＭＦ−ＰＢＳ）を肺臓の両端に注射して肺臓 細胞を潅流させることにより、肺臓細胞を製造した。潅流された肺臓細胞を次に ５Ｑｍｆｆの遠心管に移した。

肺臓細胞を４００ｇで５分間遠心し、そして次に５１１１ａの０．８３％ＮＨ， ＣＱ（０，１５５Ｍ）中に室温で１０分間にわたり懸濁させて、赤血球を溶解さ せた。５ｉ＋１２のＧＭＦ−ＰＢＳを管に加えて溶解を停止させた。

細胞を次に粒子状ｊこし、そして１０π０のＧＭＦ−ＰＢＳ中に再懸濁させｌこ 。

４０マイクロリツトルの細胞懸濁液を１ｏｓｕ１２の食塩水に３滴のザツプーオ グロビン丁０と一緒に加えることにより、赤血球の濃度を測定した。

赤血球数は血球計算盤を用いて計数され、そしてこの値から細胞濃度が測定され た。この濃度に次に２５０の希釈係数をかけて、懸濁液中の実際の細胞濃度を与 えた。

ＭＳ−１細胞を５個の細菌学用平板（１００ｍｍ）から５０ｒｔｒＱの遠心管に 移した。ＭＢ胞濃度を上記の係数技術を用いて測定した。５Ｘ１０’のＭＳ−１ 細胞を次にｌｏｍ（２のＧＭＦ−ＰＢＳ中に懸濁させ、そして５０ｗＱの遠心管 中で２．５ＸｌＯ”個の肺臓細胞と混合しｔ；。

細胞を回転させそして１Ｑｓ１２のＧＭＦ−ＰＢＳで洗浄しｔ；。上澄み液をガ ラス製のバスチュールピペットを用いてできるだけ多く吸引した。

管を静かに開けて、細胞粒子を取り出した。

細胞を製造する前に、融合混合物を下記の如くして製造したａ５ｇのポリエチレ ングリコール１４５０　（コダックから販＊）を５ｍＱのＧＭＦ−ＦＢＳ８よび ０．５ばのＤＭＳＯと混合した。混合物を次に５６°Ｃに暖めてそれを融解させ 、滴定して７．０の最終的ｐＨとし、そしてそれを殺薩するＩ；めに０．２２ミ クロンのミリポールフィルターを通して濾過した。１．Ｏｉの部分標本をクリオ チューブに加え、そしてこれらを−７０℃！：おいて貯蔵した。

使用する融合混合物を製造するため、凍結管中の部分標本を３７℃に加熱するこ とｊこより融解させた。別個に、１ＩｌｌＱのＤＭＥＭ　（血清なし）を含有し ている管を３７℃に加熱した。

１．０ｒＩＱのポリエチレングリフール融合混合物の部分標本を細胞懸濁液に加 え、そして懸濁液をよく混合した。ポリエチレングリコール融合混合物を加えて から４５分後に、２．０ｍρの予備加熱されたＤＭＥＭ　（Ｊｍ清なし）を混合 しなから滴々添加した。残りの８ｒｎＱの予備加熱されたＤＭＥＭ　（血清なし ）を次に加えＩ；。細胞を室温で１０分間放置した。

２．０蛯のＦＢＳを懸濁液に加えそして懸濁液をよく混合した。ＦＢＳおよびＧ ＭＦ　−Ｐ　Ｂ　Ｓの混合物が、細胞の試験管壁に対する付着防止を助けた。懸 濁液を４００ｇで４分間にわたり遠心した。

回転させた後に、５％のＦＢＳ、ＩＱ［ｌ単位／πｇのペニシリン、１００マイ クログラム／ｍΩのストレプトマイシン、およびリフドルフィールドのヒポキサ ンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡ　Ｔ）が補充されているｌ１６＋ ＋ｕ２の改質された媒体中に細胞を懸濁させた。

細胞懸濁液の濃度を２００マイクロリツトルの懸濁液出たり３．３×１０５個の 肺臓細胞に調節しｆ−，２００マイクロリツトルの懸濁液の部分標本を次に９６ ウ工ル微量滴定の各ウェルに分配した。１７個のそのような板を製造した後に、 板を培！Ｉ器に移しそして５％ｃｏ、中で３７℃に保った。

細胞を板の中で７日間保ち、次に成長媒体を除去し、そして新しい媒体を加えた 。それから４日後に、媒体を再び交換しｔ；。４日後に、酵素結合された免疫吸 収剤効力検定（ＥＬＩＳＡ）をウェル中の抗体に対して実施してどれがＨｒＶｉ のｇｐ１２０蛋白質を結合しているかを測定した。ＥＬＩＳＡは下記の如くして 実施された。

ｄ）ＥＬＩＳＡ工程 精製されたｇｐ１２０蛋白質は、Ｗ、Ｇ、ロベイ（Ｒｏｂｅｙ）、「人間の免疫 不足ウィルス感染の予防の展望：精製された２３０−ｋＤエンベロープグリコ蛋 白質が抗体の中和を誘発する（Ｐｒｏｓｐｅｃｔ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏ ｎ　ｏｆＨｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎｆ ｅｃｔｉｏｎ：　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　３２０−ｋＤ　Ｅｎｖｅｌｏｐ■ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　＋ｎｄｕｃｅｓ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｙ）Ｊ　、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナシ２ナル・アカデミイ ・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オプ・アメリカ（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、木！、主１：　７０２３−２ ７（１９８６）に記されている如くして製造しされ。５０ｐ１７）ｇｐ１２０懸 濁液（０、１〜ｌ　−Ｏｐ　ｇ／１ｆｆ）ａ１度）　ヲ１２−チヤンネルピペツ ト付き９６−ウェル・イミュロン１板のウェルに加えた。板を覆いそして蛋白質 が板に結合できるようにして４℃で１８時間にわたり培養した。

板の液体内容物を次に空にし、そして板の上の残りの結合位置を飽和させるため に２００μＱのＯ，１Ｍ　ＮＨ，（ｌを各ウェルに加えた。

ＮＨ，Ｃｆｆ溶液をウェル中で室温において１３分間放置した。

ＮＨ，（ｌ溶液を次に除去し、そしてウェルをＰＢＳおよびンイーン２０で３回 洗浄した。下記の抗体懸濁液を加えるまで、ＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０溶 液の一部は残されていた。

１７個の９６ウエル板の各ウェルからの５０μＱの細胞融合上澄み液をイミュロ ンＩ板上の各ウェルに加え、そして１時間にわＩ；り培養した。

培養後に、未結合抗体を除去するために板をＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０溶 液で３回すすいだ。

細胞融合上澄み液は、９６クユル板中で種々のバイブリド−マスにより製造され た抗体を含有しているであろう。ｇｐ１２０に特異性である抗体はそれに結合し ているであろう。ｇｐ１２０がイミュロンエ板に結合している限り、ｇｐ１２０ に特異性である抗体も板に結合し始めるであろう。

次の段階は、各ウェルの結合された抗体の量を示すマーカーを加えることである 。選択されるマーカーはセイヨウワサビ過酸化酵素であった。

このマーカーを山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧと結合させて、過酸化酵素−結合 された山羊の抗−ハツカネズミ■ｇｃを製造した。山羊の抗−ハツカ矛ズミＩｇ Ｇは、板と結きされているハッカ不ズミ単クローン抗体と結合するであろう。過 酸化酵素マーカーを次に活性化させて酵素反応により結合された抗体の量を示す ことができる。

各ウェルにＰＢＳｌｏ、０５％ツイーンおよび］％ＢＳＡ中で１：】０００に希 釈された１００マイクロリツトルの過酸化酵素−結合された山羊の抗−ハツカネ ズミＩｇＧを加えることにより、マーカーが加えられた。板を室温で１時間にわ たり培養した。その後、板をＰ　Ｂ　Ｓ１０　。

０５％ツイーンで３回洗浄して未結合の山羊の抗−ハツカ不ズミＩｇＧ結合物を 除去した。

次の段階は、山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧに結合された過酸化酵素マーカーを 活性化することである。これは、２００マイクロリツトルの３　’、　３　’、 　５　’、　５　’テトラメチルベンジジン基質溶液を各ウェルに加えそして室 温で３０分間にわたり培養することにより、行われた。５０マイクロリツトルの ２．０Ｍ　Ｈ２ＳＯ，の添加により、色反応を停止させた。

色強度をＥＬＩＳＡ読み取り器を用いて４５０ｎｍで測定した。ｇｐ１２０に特 異性である抗体の量は色強度に比例している。

ｇｐ１２０に少なくともある程度結合されている抗体を生成した約２００個のウ ェルが９６ウ工ル微量滴定板中にあったことが見られた。これらの２００個のウ ェルの中で、最も高い色強度を示した抗体を生成した３９個を別のスクリーニン グ段階用に選択した。

ｅ）生存Ｔ−細胞を使用する免疫蛍光効力検定ＥＬＩ　ＳＡ中のｇｐ】２０と反 応性であった抗体がＨＩ　Ｖ−１で誘発された生存Ｈ９細胞と特異性があるよう に結合するかどうかを測定するために、免疫蛍光効力検定を行った。Ｈ９細胞線 はＨＩＶ−］による持持続悪感が可能であった。この細胞線はメリーランド、ロ ックヴイルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ１ンから得られた。感 染した細胞と結合していたが未感染の細胞とは結合していない抗体は多分細胞膜 の細胞外側上のＨＩ　Ｖ−３エンベロープ蛋白質の領域に対して選択的であるの であろう。免疫蛍光効力検定は、ＨＩＶ−１ウィルス粒子上のエピトープの中和 を認識する高い能力を有するｇｐ１２０反応性抗体を選択することおよび感染さ れたＴ−細胞によるシンシチウム生成を抑制することを助ける。

感染されたＨ９細胞の培養体は上記の「ウィルスの製造」の項のようにして保た れた。効力検定の実施工程を以下に記す。

（１）効力検定工程 ５．１０’個の細胞／πΩの濃度の感染Ｈ９細胞懸濁液の５０マイクロリットル 部分標本を１９個の１．５ｍ（２マイク７ユージ管のそれぞれに加えた。ＥＬＩ ＳＡ陽性クローンを含有している３９個のウェルからの上澄み液の５０μＣ部分 標本を次１こ６管に加えた。Ｈ９細胞と反応する上澄み液中の抗体は管中にある Ｈ９細胞と結合するであろう。

管を次に室温で３０分間にわたり培養した。培養後に、管を回転させ、上澄み液 を除去し、細胞を２％の牛の胎児血清および０．１％のナトリウムアジドを含有 しているＲＰＭＩ１６４０の混合物で３回洗浄した。

管を次に開けて細胞粒子をばらばらにした。

１０μｇのラベルのついた抗体すなわち蛍光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ） と結合されｔ；山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧを各試験管に１対２００の希釈度 で加えた。このラベルのついた抗体はＨＩ　Ｖ−１６染Ｈ９１Ｂ胞と結合してい る単クローン抗体と結合しそしてこれらの単クローン抗体の同定用手段となる。

管を室温で３０分間にわたり再び培養した。管を遠心し、そして細胞を前と同じ 媒体で洗浄した。細胞を次にＰＢＳ中に再懸濁させ、個々のスライドの上に置き 、そしてカバーガラスをかぶせた。細胞を蛍光顕微鏡で見た。

３９個の選択されたウェルのどれが未感染のＨ９細胞と結合した抗体を含んでい るかを測定するために、代わりに感染されたＨ９細胞を使用して上記のものと本 質的に同一の工程を行った。

（ｉｉ）精米 試験した３９個のウェルの中の７個が、生存感染Ｈ９細胞と結合しているが未感 染のＨ９細胞とは結合していない単クローン抗体を生成したクローンを含有して いた。すなわち、これらの７個のウェルからの抗体を使用した時には、感染細胞 は蛍光を発しＩ；が未感染の細胞は発しなかった。

免疫蛍光陽性クローンを含有している７個のウェルからの細胞および抗体を集め た。これらのバイブリド−マスおよび抗体はメリーランド、ロックヴイルのアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに保管されており、そして本出願の 審査継続中は特許庁による調査用に入手可能である。

ｆ）単一細胞クローニング ３９個のＥＬＩＳＡ陽性ウェルのそれぞれからの細胞懸濁液を２４個のウェル板 のウェル中で広げた。２３個のウェル板中での５日間の成長後に、７個のウェル からの細胞懸濁液を１ミリリツトル当たり３０．５０および１００個の細胞に希 釈されている感染Ｈ９細胞に対して免疫反応性試験をした。Ｑ　、　ｌ　ｔｎＱ の希釈されｔ；細胞懸濁液（それぞれ、平均３．５および１０個のクローンを含 有していた）を９６個のウェル板のウェルの中に入れた。ウェルはあらかじめヒ ストンでコーティングされたいＩ；。

各細胞が成長してコロニーを形成し始めた後に、細胞を顕微鏡下で検査した。各 コロニーの細胞は移動しておらずそして衛星コロニーを形成していた。ＥＬＩＳ Ａおよび免疫蛍光における最も強い反応性を示す７個のクローンのそれぞれから 単一細胞クローンを選択しそして培養体中に広げｔ二。

ウェスタンプロット分析では、ウィルスをそれの成分である蛋白質中に溶解させ た。ＨＩＶ７１（ｇｐ１２０）の外部エンベロープ蛋白質と結合する単クローン 抗体を生成するクローンは、希望のものであった。工程を以下に記す。

３０マイクログラムのＨＩＶ−１を試料緩衝液（２％のＳＤＳおよび５％のべ〜 ターメルカプトエタノールを含有していた）中で１００’ＯＪ：５分間加熱する ことにより溶解させた。それを次に１２％の１．５ｍｍ厚さのスラブポリアクリ ルアミド上に充填した。ゲル化を３５ｍＶの一定電圧において室温で８時間行っ た。工程はメリーランド、ロックヴイルのバイオチク・リサーチ・ラポラトリイ により発行されたｒＨＴＬＶ−■抗体のウェスタンプロット検出の調合工程（Ｐ ｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅ１ｓ　ｆｏｒ 　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　）ＩＴＬＶ−ｎＩ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）i 中に記されていた。電力を３０ボルト（約０．ｌＡ）に設定しそして室温で１６ 時間寅実施ることにより、蛋白質帯をニトロセルロース紙の上に移入させた。翌 朝、電圧を６０ボルト（約０．２Ａ）に高め、そして移入を１−２時間にわＩ； り行ってｇｐ１２０およびｇｐ１６０の移入を最大にした。移入緩衝液は２４ｇ のトリス塩基、５７．６ｇのグリシンおよびＪ３００！１ｇのメタノールを含有 していた。水を加えて溶液を４リツトルまでにした。

ニトロセルロースシートを次にＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０ですすぎ、そし てプロット緩衝液を含有しているトレーの中に入れた。トレーを室温で２時間に わｔ；り静かに振った。プロット緩衝液は５０ｇの非−脂肪ドライミルク、１− ０ｇの発泡防止剤Ａ（任意）、０．１ｇのメルチオレート、および１．０リツト ルの最終的量になるのに充分なＰＢＳからなっていた。緩衝液のｐＨを７．０に 調節した。

ニトロセルロースシートを次にＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０ですすぎ、そし て重量測定された樹脂ガラス板間の紙タオルの上で乾燥した。

ニトロセルロースシートを次に０．５ｃｍ幅の片に切断し、それぞれに連続番号 をつけた。片をすぐに使用することもでき、まｔ；はそれを乾燥状態でそして踏 所で１＋月まで貯蔵することもできた。ｇｐ１２０帯を有する片は次の段階で使 用するためのものであった。

ｇｐ１２０ニトロセルロースを次に製造して、単クローン抗体を蛋白質帯に結合 させた。これらの片の中の４０個を個別１；スロットトレーの指定スロット中に 入れ、そしてＰＢＳｌｏ、３％ツイーン２０中で２０分間にわたり予備右眼洗浄 した。予備石鹸洗浄溶液を７３０７７７７Ｍ含有トラップ中に吸引しｔ；。片ウ ェルを次にＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０で１回すすぎ、トレーを５．６回振 り、そして溶液を吸引除去した。

１個の片に２．０ｍＱのプロット緩衝液７４％の山羊血清（これは１００ｔｎｎ のプロット緩衝液および４ｔｎＱの熱不活性化された正常な山羊血清と混合する ことにより製造された）を加えそしてその後ｌＯマイクロリットルの熱不活性化 されたエイズ患者の血清をウェルに加えて、陽性対照物を製造した。２．０蛯の 上澄み液をＥＬＩ　ＳＡ陽性クローンを含有している微量滴定板中の３９個のウ ェルのそれぞれから取り出した。２．Ｏｔｔ＋Ｑの上澄み液、５％の非−脂肪ド ライミルク、５０マイクロリットルノＩＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）、および メルチオレートからなる混合物を製造しｌ；。

上澄み液の部分標本を片を含有している各片ウェルの中ｌこ加えた。混合物を次 にクロロツクス’ｒＭ含有トラップ中に吸引した。片ウェルを次にＰＢＳｌｏ、 ０５％ツイーン２０で１回すすぎ、手で５．６回ゆすり、そして洗浄緩衝液と共 に吸引除去した。片を次にＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０で３回すすぎ、各す すぎには５分間かけた。

片を次に染色試薬と反応させ、それによりｇｐ１２０と結合する特異性抗体を可 視化した。選択された試薬はセイヨウワサビ過酸化酵素であった。この試薬は、 １０ｍ０のｐＨ７，４のＰＢＳ、２．Ｏｍｎの基質法、および４．０マイクロリ ツトルの３０％Ｈ３Ｏ２からなっている活動基質と接触した時に、発色する。基 質法は、０．３ｇの４−クロロ−１−す７トールを１００ｄの無水メタノール中 に溶解させることにより、製造された。

１：１００のバイオチニル化された山羊の抗ハツカネズミＴｇＧを含有している ２　、　ＯｒｎＩ２のプロット／４％の山羊血清を次にそれぞれの片ウェルに加 えた。トレーを室温で３０分間にわたりゆれている台の上で培養した。山羊の抗 ハツカネズミＩｇＧ結合体はもちろん左上のｇｐ１２０と結合している単クロー ン抗体と結合するであろう。

片を次にＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０で１回すすぎ、そして手で５．６回振 って過剰の山羊の抗ハツカイ、ズミＩｇＧ結合体を除去した。

洗浄緩衝液を廃棄し！：。片ウェルを次にＰＢＳｌｏ、Ｑ５％ツイーン２０で３ 回洗浄した。各洗浄は５分間統けられた。

１：１ＯＯＯのセイヨウワサビ過酸化酵素−アヴイディンＤ結合体を含有してい る２−ＯｍＱのプロット／４％の山羊血清をそれぞれの片つエルに加えた。この 結合体中のアヴイディンは山羊の抗ハッカネズミ＋ｇＧ結合体中のビオチンと結 合する。従って、セイヨウワサビ過酸化酵素マーカーは山羊の抗ハツカネズミＩ ｇＧと結合し始めそしてそれにより結合された抗体にラベルを付ける。結合体の 添加後に、トレーを室温においてゆれている台の上で３０分間にわたり培養した 。

それぞれの片ウェルをＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０で１回の洗浄光たり５分 間にわたり３回洗浄し、次にＰＢＳで１回洗浄した。２．０吋の活動酵素基質を 各ウェルに加え、そしてトレーを室温で発色するまで培養した。活動基質溶液は 、Ｈ７，４の燐酸塩緩衝食塩水中に０．Ｃ１５％の４−クロロ−１−ナトリウム および０．０１％のＨ，Ｏ，を含有してし）に。

（ｉｉＩ）蓋困 以上で論じられている如（、ウェスタンブロンド分析は３９個のＥＬＩＳＡ陽性 ウェルからの抗体を使用して行われた。ウェスタンプロット分析では、これらの ３９個のウェルの中の６個からの抗体だけがｇｐ１２０と反応することが見いだ された。これらのウェルの中の６個全部が免疫蛍光効力検定で免疫蛍光陽性であ ると見いだされている７個のウェル中のものであった。従って、７個の免疫蛍光 陽性中の１個だけがウェスタンプロット分析で陽性ではなかった。

ｈ）単クローン抗体の製造および精製 希望する単クローン抗体を大量に製造するために、下記の工程を行った。

第二の２４個のウェル板中のウェルの中に置かれている７個の免疫蛍光陽性クロ ーンを１００ｍｍの組織培養板中で成長させた。選択された７個の単一細胞クロ ーンの広げられた培養体を次に別個に１匹のハッカ不ズミ当たり５００万個の細 胞を用いてブリスティン処置されたハツカネズミの腹腔内に注射した。７日後に 、各ハツカネズミの腹水流体を集めそして凍結した。

腹水流体中の単クローン抗体を下記の如く精製した。凍結されＩ；腹水流体を解 凍し、そしてナイロン布を通して濾過して粘着物質を除去した。

０．１ｍＭの最終濃度になるのに充分なフェニルメチルスルホニルフルオライド を腹水流体に加えた。１ミリリツトルの腹水流体に対して０゜Ｑ５ｍＱの１．２ Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，０）を加えた。酢酸塩緩衝液の最終濃度は６０ｍＭで あった。ｐＨを４．５に調節した。

１ミリリツトルの処理した腹水流体に対して２５μ０のカプリル酸（１４４，２ １の分子量、０．９１の密度）を激しく撹拌しながら嫡々添加した。懸濁液を室 温に保ちそしてさらに３０分間撹拌した。

沈澱を除去するために、懸濁液を次に１５，０００ｇで１０分間にわたり遠心し た。ＩｇＧを含有している上澄み液を、上澄み液量のｌ／１０に等しい量のＩＭ 　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）の添加により、中和した。

ＩｇＧを次に５０％（Ｎ　Ｈ４）２　Ｓ　Ｏ４を用いて沈澱させた。

沈澱を次にＨＥＰＥＳ食塩水緩衝液中に溶解させた。ＩｇＧから（Ｎ　Ｈ１：ｈ 　Ｓ　Ｏａを除去するために、この溶液をＨＥＰＥＳ食塩水級衝液に対して一夜 透析した。ＨＥＰＥＳ食塩水緩衝液は透析中２回交換された。透析後に、ＨＥＰ ＥＳ食塩水緩衝液は精製された溶解したＩｇＧを含有していた。精製されたＩｇ Ｇを下記の感染効力検定およびシンシチウム生成効力検定ｌこおいて使用した。

実施例■：本発明の効果の証明 ａ）中和効力検定 ＨＩＶ−１ウィルス粒子によるＴ−細胞感染の抑制における本発明の単クローン 抗体の効果を測定するために、効力検定を行った。ＨＩＶ−１だけを細胞培養体 に加えた時に感染された細胞数をＨＩＶ−１および本発明の単クローン抗体を加 えた時に感染された数と比較した。中和効力検定用に選択された細胞はＨＴ細胞 線のＨ９クローンであった。

ｉ）ウィルス、抗体および細胞の製造 細胞培養体をＨ９成成長体で洗浄することにより、Ｈ９細胞を製造した。Ｈ９成 成長体はＲＰＭＩＩ６４９中２０％ＦＢＳ中２熟年ＦＢＳされた）、５ｍＭのし 一グルタミン、５０単位／蛯のペニシリン、５　Ｑｍｇ／ｉのストレプトマイシ ン、および５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有していた。

細胞を次に２Ｘ１０’個の細胞／ＩＩＩＱの最終濃度まで再懸濁させた。懸濁液 を次ｌ二水浴中で３７″”ｊ：Ｂいて２マイクログラム／清ρのポリプレンと共 に２０分間にわたり培養した。

培養後に、細胞を７００ｇで７分間回転させた。上澄み液を次に廃棄し、細胞を Ｈ９成成長体中に再懸濁させ、そして再び洗浄してポリブレンを除去した。細胞 を次に成長媒体中で２Ｘ１０’の細胞／ＩＩＩＱとなるまで再懸濁させた。

７個の免疫蛍光陽性クローン中の６個を中和効力検定で使用するために選択した 。生成された腹水（上記）からの抗体を０．２２ミクロンの微孔フィルターを通 すことにより殺菌した。溶液を次にＨ９成成長体中で希釈して、１００．１０、 Ｌ　Ｏ，１および０．Ｏｌマイクログラム／ｒｒ＋Ｑの種々の最終濃度とした。

Ｈ９細胞の感染では２０７ＣＩＤ、ｏすなわちＴＣＩＤｂｏ値の２０倍の９イル スを使用した。ウィルス調剤のＴＣＩ　Ｄ！。値は前の感染効力検定ｌ：おける ものと同じ実験茶件下で測定されｔ；。それは突験ウェルの５０％が感染された 時のウィルス滴定量であると定義されている。２０７ＣＩＤ、。は大体４．７２ ＸＩＯ−’希釈度のウィルス株に等しい。

感染効力検定では、３０μｇのウィルス懸濁液および３０μｇの各抗体溶液を微 量滴定板のウェル中で４℃において１時間にわたり混合した。

各ウェルにつき２回ずつ行われた。板を次に培養器中で３７℃および５％ｃｏに おいて３０分間暖めｊ；。３０μａのポリプレン装置されたＨ９細胞懸濁液を次 に各ウェルに加え！；。

微量滴定板を次に培養器中で３７℃においてＬ時間培養した。１１０μｇの成長 媒体を各ウェルに加えて２００μｇの合計量にした。板を３日間培養し、そして 新しい成長媒体を３日毎に交換した。細胞を３．６．９８よび１３３日目集めｔ 二。

本発明の抗−ＨＩ　Ｖ−１抗体の１種の代わりにヒト絨毛膜ゴナドトロピン（抗 −ＨｃＧ）に対するマウスの基クローン抗体を使用して上記と同一の工程を行っ た。抗ＨＣＧ抗体で処理された細胞は陰性対照物とされた。

ｉ）感染細胞の免疫蛍光効力検定 ９日目から１３３日目集められた細胞懸濁液の１００μｇの部分標本を３１１１ ｆｆのＰＢＳで洗浄した。細胞懸濁液を７００ｇで６分間遠心し、そして再びＰ ＢＳ中で洗浄した。細胞を最後に５０μＱのＰＢＳ中に再懸濁させ、そしてｌＯ μａの懸濁液をガラススライド上に滴下した。この懸濁液を空気乾燥し、次にｌ ：１１七トン／メタノールを用いて１０分間にわたり固定させ、空気乾燥し、そ して効力検定まで一２０℃で貯蔵しｌ：Ｉｌ 効力検定では、固定されｌ；細胞をＰＢＳ中で２０分間にわｌ；り再水和し、そ して次にＰＢＳ中でさらに３０分間にわたり５％の正常山羊血清と共に培養しｌ ；。過剰の正常山羊血清を嫡々除去しｔ；後に、細胞を室温で１時間にわたり２ ％の正常山羊血清を含有している抗−ｐ２４単クローン抗体と共に（１：１００ の希釈度で）培養しｔ；。この抗体はＨＩＶ−１のｐ２４芯蛋白質と特異性があ るように結合する。スライドを湿度調節器中に保って乾燥を避けた。培養後に、 スライドをＰＢＳ中で合計３０分間にわたり３回すすいだ。次にフルオレスセイ ン結合された山羊の抗ハツカネズミ１　ｇＧ（Ｆ（ａｂ’）ｘ）断片をｌ：２０ の希釈度で加えｌ；。

スライドを室温で１時間培養した。スライドを次にＢＰＳを３回交換しながら３ ０分間すすぎ、０．５％の工ヴアンスブルーで５分間にわたり対比染色し、洗浄 し、そしてフルオロマウントＧ中に置いた。この細胞を次に蛍光顕微鏡下で観察 しｔ；。

感染細胞数を４００ｘの倍率で数えた。視界内の不規則的試料採取により、各ス ライドから４個のデータ点を集めた。

ｔｉｉ）懸 結果は第１および２図にグラフで示されており、そこでは免疫蛍光細胞の百分率 が懸濁液中の抗体濃度に対してプロットされている。第１図の結果は９日目に集 められＩ；細胞からのものである。第２図では、細胞は１３３日目集められた。

第１および２図に関すると、試験した６種類の抗体の中の４種（ＢＡＴ１２３． ２６７．５０９および０８５と称されている）が感染抑制において有効であつｌ ；。特に、ＢＡＴ１２３は９日目にほとんど完全な感染抑制を示した。この結果 は、事業上抑制を示さなかっｌ；陰性対照物である抗−ＨｃＧ抗体と対照的であ る。抗−ＨｃＧ抗体で処理されたａ胞のほとんど１００％が抗体の濃度に関係な く免疫蛍光性であった。ｇｐ１２０とは反応性であるが中和活性を示さない基ク ローン抗体ＢＡＴ４９６を用いても同様な結果が得られた。この理由のため、Ｂ ＡＴ４９６は１３３日目は効力検定されず、従って第２図には示されていない。

他の抗体であるＢＡＴ４０１を中和に関して試験したことに注目すべきである。

しかしながら、結果はシンシチウム生成抑制において効果が小さかったことが見 いだされＩ；ため第１および２図には示されていない。

第１および２図を比較すると、時間がたつにつれて懸濁液中で多くの細胞が感染 され始めることが示されている。この結果は予測されていた。

ウィルスを中和するために利用できる懸濁液中の抗体の量は媒体の交換によりそ して多分減成または内部移行によっても減少している。しかしながら、感染Ｈ９ 細胞は絶えずさらに多くのウィルスを生成しており、そしてこのウィルスは実際 に全ての細胞に感染する。

第１および２図中の点は、抗体の援度が減少するにつれてより多量の細胞が感染 されることを示している。これは、抗体の中和効果が投与量依存性であることを 示している。細胞の５０％が感染されている時点の投与量である各基クローン抗 体のＩＣ５ａ値が計算された。９日目に採取された結果を下表１に示す。

抗−ＨｃＧ　（陰性対照物）　　　　　　　ｌＸｌ０”Ｉ）ｇ／ｖｎＢＡＴＯ８ ５１００ｖｇ／１ｎＱ ＢＡＴ１２３　　　　　　　　　　　　　１０　　マｇ／ｍＱＢＡＴ２６７　　 　　　　　　　　　　　１０　１ｇ／１ｎＱＢＡＴ５０９　　　　　　　　　　 　　　３０　　ｖｇ／ａＱＢＡＴ５０９　　　　　　　　　　１ＸＩＯ’　　ｖ ｇ／ｒｎＱ抑制において最も有効である基クローン抗体（ＢＡＴ　ｌ　２３．２ ６７および５０９）がナノグラム量であることがわかる。このことは、これらの 基クローン抗体が生体内でのエイズ治療用ｌ；少量でリド常に有効であることを 示している。そのような少なし１投与量の使用は公知の治療剤より相轟有利とな るであろう。

ｂ）シンシチウム生成の抑制 本発明の基クローン抗体に関する別の試験は、それら力；シンシチウム生成を抑 制するかどうかを測定することである。生体内での細胞感染および細胞死滅の大 部分がシンシチウムｌ：より生じると信じられているであるため、シンシチウム 生成の抑制は抗体の治療価値を強化するであろう。

シンシチウム効力検定は、感染Ｈ９細胞中のウィルスの外部エンベロープ蛋白質 がＴ細胞により運ばれるＣ　Ｄ　４抗原と結合するとし１う仮定に基づいている 。効力検定では、ＣＤ、ＤＮＩ　トランスフエクシタン処理されたヘラ（ＨｅＬ ａ）細胞を含有してし−るウェルＩ；感染Ｈ９細胞を加えた。ヘラ細胞は単層で ウェルの底に付着するｔこめ、それらが使用された。これらのトランスフ二クシ ョン処理されたヘラ細胞はそれらの細胞表面上にＣＤ、を大量に表示する。従っ て、それらは感染Ｈ９細胞と融合する能力を有する。従って、ンンシチウム生成 が生じるなら、ヘラおよびＨ９細胞がウェルに結合されるであろう。これらの多 核化された巨細胞は容易に観察できそして計数することができる。

／ンンチウム生成効力検定に関する原案を以下に示す。

（ｉ）シンシチウム生成効力検定用の工程ヘラ下４細胞（これは表面上のＣＤ４ 抗原を表わす）を、ＤＭＥＭ中５％ＦＢＳ　（熱不活性化された）、５ｍＭのＬ −グルタミン、５０単位／ｍＱのペニシリン、５０　ｍ　ｇ　／ｍＱのストレプ トマイシンおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有しているヘラーＴ４成長媒体中で成 長させた。細胞をトリプシン処理により回収してフラスコから細胞を除去し、そ して洗浄した。細胞を次に９６ウ工ル微量滴定板の上で１個のウェル当たり１０ ，０００個の細胞密度で種つけした。９０％の融合に達するまで板を３７℃で３ ６時間にわＩこり培養した。

感染および未感染Ｈ９細胞を次に製造した。これらの細胞を製造するためには、 細胞懸濁液を最初にＨ９成成長体（ＤＭＥＭｌ　６４０中２０％ＦＢＳ、５ｍＭ のし一グルタミン、５０単位／ｒｂＱのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｕのストレプ トマイシンおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳ）で２回洗浄した。細胞を次にヘラーＴ４ 中に４０万／ｗＱの濃度で再懸濁させた。

中和効力検定で使用されｆ−７種の抗体溶液に対して最初に殺菌濾過を行うこと により、抗体を製造した。これらの溶液の中の６種は本発明の抗体を含有してお り、そして７番目は抗−ＨｃＧを含有していた。各溶液を次１ニー１．０および １０μｇ／ｒＡｕの最終濃度にした。

５０マイクロリンドルの各抗体溶液および５０マイクロリツトルの感染Ｈ９細胞 懸濁液を種々の微量滴定板のウェルに加えた。微量滴定板ウェルはヘラＴ４細胞 でコーティングされていた。別のヘラＴ４でコーティングされたウェルでは、感 染Ｈ９細胞懸濁液を抗体を添加せずに加えＩ；。このウェルを陽性対照物として 使用した。さらに別のコーティングされたウェルでは、未感染Ｈ９細胞懸濁液を 加えた。このウェルを陰性対照物とし使用した。実験は３回ずつ行われた。

板を次に３７℃および５％ＣＯ１において１８時間にわたり培養した。未結合Ｈ ９細胞を除去するために、板をＤＭＥＭで２回静かに洗浄した。Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ を除去し、そして１個のウェル当たり２００μａのメタノールを加えることによ り細胞を固定させた。メタノールを除去した後に、細胞を空気乾燥し、そして１ ００ｐ０．の１．４％メチレンブルーで１０分間にわたり染色した。細胞を蒸留 水で３回すすいだ。

染色後に、細胞法に逆転顕微鏡下で（１００倍の倍率で）観察し、そして視界光 たりのシンシチウム数を測定した。５個より多い核が存在しているなら、ウェル の集合体がシンシチウムであるとみなされた。各ウェルを不規則的に３回計数し た。

（ｉｉ）鼠困 陰性対照物ウェルはシンシチウム生成を示さなかった。残りのウェルに関する結 果は平均士標準偏差で表されて下表■に示されてい表■ の抑制 なし　　　　　　５４．８　＋　３．６　　　　　　　　０抗−ＨｃＧ　ｌ　　 　　　５０．０　＋　５．１　　　　　　　　　８．７０１０　　　　５４．７ 　＋　７．６　　　　　　　　　０ＢＡＴＯ８５］　　　　　３９．７÷２．８ 　　　　　　　　２７．６１０　　　　４１．３　＋　６　　　　　　　　　　 ２４．６ＢＡＴ１２３１　　　　３０．３　＋　４．５　　　　　　　　４４． ７１０　　　　１５．３÷４．７　　　　　　　　７２．０ＢＡＴ２６７１　　 　　４１．０　＋６．６　　　　　　　　２５．２１０　　　　２７．３　＋５ ．７　　　　　　　　　５０．２ＢＡＴ５０９１　　　　４１．７　＋　４．９ 　　　　　　　　２３．９］０　　　　２８．３　＋　３．３　　　　　　　　 ４８．５ＢＡＴ４９６１　　’　　　５６．３　＋９　　　　　　　　　　０１ ０　　　５２．０　＋　ｊ、６５．ｌ＊＊草　抗体の１．０マイクログラム／ｒ ｎＱ８よび１０マイクログラム／蛯溶液をそれぞれ「Ｊ」および「】０」と称す る。

林　陰性対照物と意義ある差がない。

表■かもこれらの結果が上記の方法によるスクリーニングが治療用途用に最良の 抗体を同定するのに必須であることを示唆していることがわかる。遊離ＨＩ　Ｖ −１ウイルスの感染性を低下させた同じ抗体（第１および２図に示されている） もシンシチウム生成の抑制において有効であった。ＢＡＴ　ｌ　２３．２６７お よび５０９は両方の適用で特に有効であった。ＢＡＴ４９６は両方の適用でほと んど無効であり、もちろん陰性対照物である抗−ＨｃＧでもそうであった。ＢＡ ＴＯ８５は中和においては有効であったが、シンシチウム抑制では最も有効なも ののではなかった。

ＢＡＴ４０１はシンシチウム抑制において非常に有効なものではなかったが、中 和効力検定では有効であった。この結果は、ＨＩＶ−１感染の抑制において有効 である抗体が必ずしもシンシチウム生成の抑制では有効ではないことを示してい る。従って、ＨＩ　Ｖ−１ウイルス粒子による感染およびシンシチウム生成の両 方の抑制Ｌ：おいて最も有効である本発明の３種の単クローン抗体（ＢＡＴＩ２ ３．２６４および５０９）をメリーランド州、ロツクヴイルにあるアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクションに保管した。それらは本出願の審査継続中は 特許庁により調査のために入手可能である。

表■は、表１に示されている中和と同様にシンシチウムも投与量依存性であるこ とを示している。１０マイクログラム／ｌｎＱの抗体を有する溶液は一般的に１ マイクログラム／ｍＱの溶液より有効でありに。

実施例Ｉ［１：ＨＴＶ−］の異なる株および単離体の中和数種の抗体が遊離ＨＩ Ｖ−１ウィルス粒子の感染およびＨＴＶ−ＩＢ感染ヘラ−ＣＤ、子細胞とＨ９細 胞との間のシンシチウム生成を抑制することが見いだされた。ゲノム分析ではウ ィルスが生体内および試験管内の両者でかなり突然変異することが示されてしす るため（アリシン（Ａ　ｌ　１ｚｏｎ）　、　Ｍ　、、ウニインーホブソン（Ｗ ａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ）、　Ｓ　。

、モンタグリール（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ）、　Ｌ　、およびソニゴ（Ｓｏｎｉ ｇｏ）、　Ｐ　、（１９８６）、セル（釦旦）、４６：６３−７４；スタルシッ ヒ（Ｓｔａｒｃｉｃｈ）。

Ｂ、Ｒ，、バーン（Ｈａｈｎ）、Ｂ、Ｈ９、シャクＣ５ｈａｗ）、　Ｇ　、　Ｍ 、、マックニーリイ（ＭｃＮｅｅｌｙ）、　Ｐ　、Ｄ　、、モトロウ（Ｍｏｄｒ ｏｔ）、　Ｓ　、、ウル７（Ｗｏｌｆ）、）ｆ、、バークス（Ｐａｒｋｓ）、　 Ｅ　、　Ｓ　、、パークス（Ｐａｒｋｓ）　、　Ｗ　、　Ｐ　、、ヨセ７ス（Ｊ ｏｓｅｐｈｓ）、　Ｓ　、Ｆ　、、ガロ（Ｇａｌｌｏ）、　Ｒ、Ｃ，８よびワン ースタール（Ｗｏｎｇ−５ｔａａｌ）、Ｆ、（１９８６）セル（Ｃｅｌｌ）４５ 　：　６３７−６４８）、これらの中和用単クローン抗体の治療および予防剤と しての適用はそれらが属−特異性であるかどうかおよび集団中の大割合のウィル ス株により生じるＨ　Ｉ　Ｖ−１感染を予防するかどうかＪこ非常に依存してい る。

ＢＡＴｌ　２３８よび我々が挙げた他の中和用単クローン抗体がＨｌｖ−１の異 なる株の中で保存されたアミノ酸配列順序を有するウィルスユンベローブ蛋白質 ｇｐ１２０中にある１種以上の顕著な中和エピトープを認識するかどうかを知る ことが重要である。抗体のこれらの特徴を理解するＩ；めに、我々はこれらの抗 体がｇｐ１２０のアミノ酸配列順序において相当程度の異種（ＲＦ％ＡＬ％ＭＮ 、Ｚ８４およびＺ３４）（上記のスタルシッヒ）を有するＨ　Ｉ　Ｖ−１の他の 株によりシンシチウム生成を抑制できるかどうかを研究した。

この研究では中和用抗体ＢＡＴ　ｌ　２３が選択され、その理由はそれがウィル スの中和において最も高い能力を誘発させることが示されているからである。感 染集団中に存在している異なるＨＩＶ−１変種に対する中和用抗体の効果を評価 するために、我々は種々の疾病症状の感染患者（テキサス州ヒユーストン、カリ フォルニア州ロスアンジニルス、マサチューセッツ州ボストン）から不規則的に 血液試料を集め、そして共生培養実験によりリンパ球調合物中でのウィルス感染 に対するＢＡＴ　ｌ　２３の効果を試験した。

ａ）シンシチウム生成効力検定 シンシチウム生成効力検定は貨施例２中に記されている如くして実施された。

ｂ）共生培養効力検定 使用された工程は前記のものと同様であり、３０ｍｆｆのヘパリン処理された患 者の血液を新鮮なまま集めそして密度−勾配遠心により単核白血球に関して処理 した。簡単に述べると、全血を等量の燐酸塩で緩衝されている食塩水（ＰＢＳ） で希釈した。２５ｎｆｆの希釈された血液を１０！ｌ１１２の７コールーバク（ ファーマシア）上に置き、モして１５００Ｘｇで３０分間遠心し、遠心の終わり に単核白血球を含有している界面を取り出し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。単 核白血球を次にＯ−５１Ｘ　１０”／ｒｘＱにおいて１５％の熱−活性化された 牛の胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミンＩＥｉ、１０％のインターロイキン−２ （細胞状生成物）、２５中和単位７ｍ（ｌの羊の抗−ヒトアルファインターフェ ロン（インターフェロン・サイエンス）、１００　単位／ｉｆｆのペニシリン、 １００μｇ／ｌｎＱのストレプトマイシンおよび２μｇ／ｗＱのポリブレンが補 充されているＲＰＭＩ１６４０媒体中で培養した。等量の正常供血者からの単核 白血球を１日間にわたりあらかじめ２μｇ／ｌｌ１ｆｆのＰＨＡ−Ｐ　（シグマ ）を用いて刺激した。それらをＰＢＳ中で２回洗浄して、レクチンを除去した。

ＢＡＴ１２３を試験培養体にｌＯμｇ／ｌｎＱの最終濃度で加えた。培養体の合 計量は］Ｏｘｕであった。５功βのｍ胞培養体を３−４日間隔で取り出し、１， ５００Ｘｇにおいて１５分間遠心して細胞および残屑を除去しｌ；。上澄み液を 集めそして１０％ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）を使用するウィルスの 沈澱後に逆転写酵素活性に関して効力検定した（グプタ（Ｇｕｐｔａ）、　Ｐ　 、、ガラチャントラン（Ｇａｌａｃｈａｎｄｒａｎ）。

Ｒｏ、グロヴイット（Ｃｒｏｖｉｔ）、Ｋ　、、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ ）、ＤおよびリナルディｃＲｊｎａＪｄｊ’）、Ｃ，Ｊ　ｒ、ｃｌ　９８７）、 ザ・ジャーナＪｌ、　−、ｔブ・クリニカル・マイクロバイオロジイ（逆転写酵 素活性の測定工程はこれまでに記されている（バレーシヌーシ（Ｂａｒｒｅ−５ ｉｎｏｕｓｓｉ）、　Ｆ　、、チャーマン（Ｃｈｅｒｍａｎｎ）、　Ｊ　、　Ｃ 、、レイ（Ｒｅｖ）、　Ｆ　、、ヌゲイレＣＮｕｇｅｙｒｅ）　、　Ｍ　、　Ｔ 　、、チャーマレット（ＣｈａｒＩｌｌａｒｅｔ）、　Ｓ　、、ダル−スト（Ｇ ｒｕｅｓｔ）、　Ｊ　、、ドーネット（Ｄａｕｇｎｅｔ）、　Ｃ、、アックスラ ーーブリン（Ａｘｌｅｒ−Ｂｌｉｎ）、　Ｃ、、ヴエチネットーブルン（Ｖルス を０．１％のトリトンＸ−１００，２ｍＭのジチオスレイトール、０−１２ｍＭ のロイペプチンおよび５０ｍＭのアミノ−ｎ−カプロン酸を含有している１００ μｇのトリス−緩衝されている食塩水（ＰＨ８，２）中に２０分間にわＩ；り溶 解させた。効力検定では、８ｍＭのＭｇ（１，，２０μＣｉの３Ｈ−チミジント リホス７ｚ−ト（２ｍｃｉ／ｍの、０．０５単位のテンペレート−プライマーポ リ（ｒＡ）を含有しティる５０ｍＭのｐＨ８，２のトリス−ＨＣｌ２中（７）］ 　ＯＯｔｔｇの基質溶液を２５μＱの溶解されたウィルスに加えた。対応する対 照物にはテンペレート−プライマーは加えなかったが、その代わりに蒸留水を加 えた。反応混合物を３７℃で１時間培養し、５％の冷Ｉ；いトリクロロ酢酸の添 加により反応を停止させ、ファツトマンＧＦ／Ｃフィルター上で最終的ｌこ濾過 し、それを充分洗浄し、そしてシンチレーション計数器を用いて放射活性に関し て計数した。特異性逆転写酵素活性を、テンペレート−プライマーを加えた時の 放射活性における差として計算した。

結果および議論 我々は、特許を請求している中和用単クローン抗体をそれらのウィルスに対する 風待異性並びに６種のＨＩ　Ｖ−１株（Ｈｒ　Ｖ−１お、ＨＩＶ　１１ＦＳＨＩ Ｖ−ＩＡＬ、ＨＩＶ−３ｗｗ１ＨＩＶ−１ｚａ＊、およびＨＩ　Ｖ　　１１ｓ− ）に対する交差防御に関して研究した。それぞれこれらのＨＩＶ−１株を用いて クローン状感染させたヘラ−ＣＤ４＋細胞とＨ９細胞の間のシンシチウム生成効 力検定では、ＢＡＴ１２３は２５μｇ／ｒｎＱにおいてシンシチウム生成を約８ ０％抑制した。それはＨＩ　Ｖ−１１、 ＨＩＶ　　ＩＡＬＳＨＴＶ　　ＩＩＦおよびＨＩＶ−１ｚｓａで感染させたＨ９ 細胞のシンクチ９ム生成を約５０％、そしてＨＩ　Ｖ−１ｔｓ＊で感染させ１； Ｈ９細胞のシンシチウム生成を２３％、減少させた。

旦且 Ｈ９未感染（対照物）　　・・・ ｈ９−ＨＩＶ−］、　　　　　　　２．３３　±０．５１＊１０．２５　±０． ９９　　　７７．３−ＨＩＶ−１１２，０８±０．３８　　　４．２５±０．４ ６　　　　５１．０−ＨＩＶｉＡＬ７．０８　ｆ　０．６６　　　１３．９１　 ＋　０．４６　　　４９．１−ＨＩＶ−１，、］、９１　±０．５５　　　３． ９１　＊　０．４７　　　　５１．０−ＨＩＶ−１ｚｉ＋　　　　　　　　　　 　１２．４１　　±　１．４６　　　　　１６．０８　　±　０．５５　　　　 　　２２．８−ＨＩＶ−１，３，１，５８±０．１４　　　３．０８　±０．５ ５　　　　４８．７＊顕微鏡視界当たりの数として表されている（ｘｔｈｓ、Ｅ 、、ｎ−１１または１２）、ｐ　Ｏ，０５、一対の研究者試験陽性の無症候性状 態であるエイズまたはアーク（ＡＲＣ）と臨床的に診断された患者の末梢血液か ら単離された白血球を使用する共生培養実験では、試験した３２人の患者血液被 検物で逆転写活性に関して測定した１８個の試料からウィルスを単離した。実験 の間中に１０μｇ／ＴＡＱのＢＡＴ　１２３を培養媒体中に加えた時には、１８ 個のウィルス−陽性培養体の全てでウィルス複製が抑制された。抑制の程度は４ ３．７〜】００％の範囲であった。１８個の試料の中で、８個の試料が９０％以 上有効抑制された。（表■参照）。

我々の試験官内実験からの結果は、中和用単クローン抗体ＢＡＴ　ｌ　２３は属 −特異性でありそしてシンシチウム生成抑制効力検定において多種のＨＩ　Ｖ− １株を交差−防御することが可能でありしかも患者の血液被検物中のウィルス感 染を抑制できることが示唆される。

実施例■：単ツクローン抗体反応性であるＧｐ１２０のペプチドフラグ単クロー ン抗体により認識されているＨＩＶ−１のｇｐ１２０上でエピトープ地図を作成 するＩ；めに、我々はウェスタンプロット効力検定を用いて数種の単クローン片 の反応性を測定した。片はプラウエア州、ウィルミントンのデュポン・デ・ネモ アス・アンド・カンパニー、医薬品部門のステイープ・ベラテラエイ（Ｓｔｅｖ ｅ　Ｐｅ［ｔｅｗａｙ）博士から入手した。左上の合成ペプチドは８−２０のア ミノ酸基の長さであった。これらのペプチドはＨＩＶ−１８株のｇｐ１２０の全 長を越える重複ペプチド７ラグメントを表している。数十種のペプチド溶液を等 間隔に離されている区域中の個々の片の上に吸着させ、そして片は乾燥状態で供 給された。

ニトロセルロース片を使用する免疫プロット工程は、単クローン抗体が前章に記 されているｇｐ１２０と反応するかどうかを測定するために使用されたウェスタ ンプロット工程と同じであった。

粒困 単クローン抗体の中の３種、すなわちＢＡＴ　ｌ　２３、ＢＡＴ２６７およびＢ ＡＴＯ８５、がウェスタンプロット効力検定において特定のペプチドとの非常に 明白な特異性である反応性を示した。

ＢＡＴ２６７　　　　ＰＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧ（残基　＃２４４−３０ ８）ＢＡＴＩ２３　　　　　ＲｒＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ（残基　＃３０４ −３１８ンＢＡＴＯ８３ＶＱＫＥＹＡＦＦＹＫＬＤＩＩＰ（残基　＃１７４−１ ８８）ＢＡＴ２５７およびＢＡＴ］　２３と反応性である１５アミノ酸長さのペ プチド類は５個のアミノ酸分だけ重なっている。しかしながら、抗体はそれらの 中の１個だけと反応しそして他とは測定可能な程度には反応しない。抗体は別の 端部で重なっているペプチドとは反応せず、すなわちＢＡＴ２６７はＬＮＱＳＶ ＲＩＮＣＴＲＰＮＮＮと反応せずそしてＢＡＴ１２３はＶＴＩＧＫＩＧＮＭＲＱ Ａ、ＨＣＮと反応しない。これらの結果は、抗体が中間の５個のアミノ酸または これらのアミノ酸と側部アミノ酸の一部との組み合わせの全部または一部により 生じるエピトープと反応することを示唆している。同様な所見はＢＡＴＯ８５に 対してもなされ、そしてそれに対しても同様な結論を出すことができる。

実施例ｖ：ＢＡＴＩ２３の機能的に転位されたＶＬおよびＶ□遺伝子のクローニ ングおよび同定 ＢＡＴ　ｌ　２３の機能的に転位されたＶ　Ｌ　８よびＶＨ遺伝子のクローニン グは、オイ（Ｏｌ）およびモリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）（バイオテクニクス（ ＢｉｏＬｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、４：２１４−２２１）により記されているのと 同じ方式で適当な分子探針を用いてＢＡＴ１２３ゲノム・ライブラリィのスクリ ーニングにより実施された。クローニングされた遺伝子フラグメントの同定およ び最終的確認は、ＢＡＴ　ｌ　２３免疫グロブリン分子に関するｍＲＮＡのヌク レオチド配列順序により行うことができた。この理論は、Ｋ鎖転位の場合に可変 部の遺伝子７ラグメントが適当にＪ部位遺伝子と結合さ・れている時またはＨ鎖 転位の場合に適当なＶＤＪ結合が生じる時にのみ、それが抗体生成細胞中で合成 された全長のそして適当に継ぎ合わされたｍＲＮＡであるという事寅に基づいて いる。

ｍ　ＲＮ　Ａ分子の直接的配列によりまたはｃＤＮＡクローンから測定されたこ れらのｍＲＮＡの配列順序は、従って機能的に転位された可変部遺伝子の選択お よび確認用の指針として作用するのに最も適している。

ＲＮＡ配列順序と同一の配列順序を有する遺伝子７ラグメントは機能的に転位さ れたと考えられる。

可変部に対応するｍＲＮＡ分子の配列順序は、プライマー延長／ジデオキシヌク レオチド終結方法によりＢＡＴ１２３ハイブリドーマ細胞のポリゾームから製造 されたｍＲＮＡを使用して測定されｔ；。この直接的ＲＮＡ配列方式はｍＲＮＡ 配列順序を誘導するための一般的方式における中間生成物であるｃＤＮＡクロー ニング段階を省略しており、従って、ＲＮＡ配列順序を測定するための比較的迅 速な方法を与える。

このＲＮＡ配列用に使用されるプライマーはＬ鎖ｍ　ＲＮ　Ａに対しては５’ｄ ＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡ（、ＡＴＧ３’、そしてＨ鎖ｍ　ＲＮ　Ａに対して は５’ｄＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ３’であった（両方のプライマーとも ニューシャーシー州の７フーマシアから得られた）。これらのオリゴヌクレオト ドは分子のＪおよびＣ区域の結合近くの位置で一定区域内でｍＲＮＡ配列順序を 相補していた。プライマー延長はＡＭＶ逆転写酵素を使用して行われ、そしてジ デオキシヌクレオチドにより終結されｔ；。ｍＲＮＡのヌクレオチド配列順序は ゲル電気泳動およびその後の自動放射写真により測定された。

ＢＡＴ　１２３細胞用のゲノムＤＮＡライブラリーはラムダファージベクトルλ ２００１（カリシ（Ｍａｒｉｎ）、　Ｊ　、ナラチェス（Ｎａｔｔｈｅｓ）、Ｗ 、Ｄ、Ｈ、、ガイド（Ｇａｉｔ）、Ｍ、　Ｊ　、、プレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ） 、　Ｓ　、（１９８４）、ジン（蝕凹）、１又：２１７−２７４）中で作成され た。ＢＡＴ１２３ノ−イブリドーマ細胞からの高分子量ゲノムＤＮＡを制限エン ドヌクレアーゼ５ａｕ３ＡＩを用いて部分的に消化させそして１０−４０％スク ロース密度勾配で寸法分別しＩ；。１８−２３キロベース対（Ｋ　ｂ　ｐ）のＤ ＮＡ７ラグメントをλ２００１／ＢａｍＨｌアーム（カリフォルリうア州ラジョ ラのストラタゲン・クローニング・７ステム）を用いて結合させ、そしてギガバ ック・ゴールド・パフキング抽出物（ストラタゲン）を使用することにより包装 した。このゲノム・ライブラリーを最初ｃＢＡＴ１２３Ｌ鎖（ＶＬ）の機能的に 転位された可変部遺伝子に対してスクリーニングしｔ；。このスクリーニング用 に使用された探針は、ノ＼ツカネズミゲルムラインカッパ（に）鋲結合用区域Ｊ ｌ−Ｊ５（Ｊ、探針；マックス（Ｍａｘ）、Ｅ、Ｅ、、マイゼル（Ｍａｉｚｅｌ ）、　Ｊ　、Ｖ、、およびリーダー（Ｌｅｄｅｒ）、　Ｐ　−（１９８１）、ザ ・ジャーナル・オブ・ノ（イオロジカル・ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、）、２５６：５１１６−５１２０）およびＢＡＴ　１２３Ｌ鎖ｍＲＮＡ のヌクレオチド配列順序から誘導される２種のオリゴヌクレオチド探針であるＶ 、−１およびＶ、−２の全てを含有してしする２、７ＫｂｐヒントｍＤＮＡフラ グメントを含んでいる。これらのオリポヌクレオｆ　Ｆ探針（７）配列１１１［ 序は、Ｖ、−１：　５’ｄＴＴＴＧＣＴ（１；ＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＧ３’およ びＶ、−２：　５’ｄＡＴＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡ３’である。アプ ライド・〕（イオシステムスＤＮＡシンセサイザーモデル３８１上で燐アミダイ トを使用すること番こより、探針を合成した。

約５ＸｌＯ’７７−ジ組換え体を最初に３１ｐ−ラベルの付し％ｆニノ１ツカネ ズミＪ、ＤＮＡブローでスクリーニングした。ブラークツ−イブリッド形成を５ ｘＳＳＣ中で５０％（容量／容量）ホルムアミド中で４２”ｃ＋＝おいて１６時 間にわＩ：り行った（１ｘＳＳＣ−０，１５Ｍ　ＮａＣＱ。

０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、最終的洗浄は０．２ｘＳＳＣ１０，１％Ｓ ＤＳ中で行われた。２種の陽性クローンが得られｔこ。それらをｍａｐ−ラベル の付いたオリゴヌクレオチド探針Ｖ、−１およびｖ、−２を使用してスクリーニ ングした。オリゴ探針を用し１枦１イブリツド形成は５ｘＳＳＣ中で３７℃にお いて１８時間実施され、そして洗浄１ま２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で室温に おいて実施されｔ；。これらのクローンの中では、Ｖ、−１２３−２３がＪ、Ｄ ＮＡ探針および２種のオリゴヌクレオチド探針とノルイブリッドを形成すること が示されｔ：。ジデオキシヌクレオチド終結方法によるこのクローンのＤＮＡ配 列順序の測定Ｉｆ、それがＢＡＴ１２３Ｌ鎖ｍＲＮＡか鎖側ＲＮＡたものと同一 の配列順序を有するｖＬ遺伝子７ラグメントを有することを示してし−ｔこ。こ のクローンをハツカネズミ／ヒトのキメラ性Ｌｉｄ遺伝子のその後の作成ｌこお （１て使用した。

ＢＡＴ１２３に関する機能的に転位された可変部のクローニングのｔ二めに、Ｈ 鎖（Ｖｌｌ）の部分的ゲノム性ライブラリーを製造しｌこ。Ｊ、探針を有するＥ ｃｏＲ１消化体のゲノム性すザンプロット（下記を参照のこと）はあらかじめＢ ＡＴ　１２３中で、ＢＡＴ　ｌ　２３の融合親すなわちＮ５−１から多分誘導さ れた５、５Ｋｂｐフラグメントの他ｌ；２種の陽性Ｃ；機能的に転位されｔ：ｖ ｘ’；Ｒ伝号を示しており、それらの一方１ｄ７．５Ｋｂｐでありそして他方は ４．５Ｋｂｐである。これらのＤＮＡ帯を含有している２種の部分的ライブラリ ーを製造した。高分子量ＤＮＡをＥｃｏＲｌを用いて消化完了させ、そして０． ７％アゲロースゲル上で分！＋１Ｌｔこ。

寸法４−５Ｋｂｐおよび５−ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを単離し、モしてラム ダベクトルλｇｔＷＥＳλＢと結合させｔこ（リーダー（Ｌｅｄｅｒ）。

Ｐｌ、チメイアー（Ｔｉ＋ｎｅｉｅｒ）、　Ｄ　、およびエンクイ−スト（Ｅｎ ｑｕｉｅｓｔ）、　Ｌ　。

（１９７７）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９６：１７５−１７７）、結 合されたＤＮＡを包装しそして組換え体プラークをスクリーニングしｔ；。

使用した探針プローブはノ・ツカネズミＨ鎖結合部位Ｊ３およびＪ４を含んでい る２ＫｂｐＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡフラグメント（ＪＨ７’ローブ； ガラ７　（Ｇｏｕｇｈ）　、　Ｎ　、　Ｍ　、およびベルナルト（Ｂｅｒｎａｒ ｄ）、０　、（１９８１）、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミイ・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ カ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、木！、７８　：　５０９−５１３）並び ４：ＢＡＴ１２３ｍＲＮＡ配列順序から誘導されたオリゴヌクレオチド探針ＶＨ −１である５’ｄＡＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣ３’を含んでし−る。こ れらの探針用のハイブリッド形成はに鎖に関して以上で記されてし）る如くであ つｔ；。Ｊ、ｌ探針を用いるこれらの２種のＥｃｏＲ１部分的ライブラリーのス クリーニングで７．５Ｋｂｐ、６．６Ｋｂｐまた１嘘４．５Ｋｂｐを含有してい る３種の独立ファージクローンを単離した。オリゴヌクレオチド探針ＶＨ−１を 使用するその後の７１イブリツド形成で１１．４．５Ｋｂｐを中に含有している ファージすなわちクローンＶ、１２３−Ｅ３だけが探針とハイブリッド形成した ことが示された。このクローンのＤＮＡスクリーニングは、それがＢＡＴ１２３ のＶｎｍＲＮＡ力）らのものと同一のＶお配列順序を含んでいｔ；ことを示しＩ ；。このクローンをノ＼ッカ不ズミ／ヒトのキメラ性り鎖遺伝号のその後の作成 におレ−で使用しｔ二。

マウスＶとヒトＣエクソンの融合およびマウス骨髄腫中への加入ＢＡＴ細胞から 単離された機能的に転位されたしおよびＨ鎖Ｖ遺伝子を、それぞれ優性の選択可 能マーカーであるｎｅｏ　（サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｐ、Ｊ、およびベ ルブ（Ｂｅｒｇ）、　Ｐ　、（１９８１）、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ ｍｅｔ、、上：　３２７−３４１）並びにｇｐｔ（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｒ ＋）、　Ｒ、Ｃ、およびベルブ（Ｂｅｒｇ）、　Ｐ　、ｃ　］　９８１　）、プ ロシーデインダス・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・オ ブ・ザ・ユナイテッド・ステー７・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、木！、７８：２０７２−２０７６）を含んでいる表示 ベクトル中で、ヒトにおよびγＱＣ部位遺伝子と結合させた。希望するキメラ遺 伝子を作成するために、ダンシル−特異性Ｖ、遺伝子を含有しているｐＶ１８４ △Ｈｎｅｏ、ＤＮＳＶ、−ｈｃに（オイ（Ｏｉ）、Ｖ、Ｔ、およびモリソン（Ｍ ｏｒｒｉｓｏｎ）、　Ｓ　、Ｌ　、（１９８６）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔ ｅｃｂｎｉｑｕｅｓ）、１２１４−２２１）をクローンＶｋ１２３−２３から誘 導されたＢＡＴ　１２３のＬ鎖遺伝号を含有している４、４ＫｂｐＨｉｎｄｎｌ フラグメントで置換した。生成したプラスミドであるｐｓＶ１８４△Ｈｎｅｏ、 ＢＡＴｌ２３．ＶｋｈＣにの構造は第１Ａ図に示されている。

キメラ性Ｈｐ遺伝子はダンシル−特異性７Ｍ遺伝子を含有しているｐｓＶ２△Ｈ ｇｐ　ｔ、ＤＮｓＶａ、ｈｃ、Ｑプラスミド中ｆ）ＥｃｏＲ１７ラグメントをフ ァージクローンＶＨ１２３−Ｅ２から誘導されＩ；機能的に転位されたＢＡ７１ ２３Ｈ鎖遺伝子を含有している４、５−ｋｂｐＥｃｏＲＩ７ラグメントで置換す ることにより作成された。生成したプラスミドであるｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ、ＢＡ Ｔ１２３．ＶＨ，ｈＣＪ！の構造は第１Ｂ図に示されている。

第３図に示されているＬおよびＨ鎖キメラ遺伝子を使用してマウス骨髄腫細胞に トランスフェクションした。選択された骨髄腫細胞である５ｐ２１０は、それ自 身の免疫グロブリン分子を生成しない非分泌細胞線であった（シュルマン（Ｓｈ ｕ　１ｍａｎ）　、　Ｍ　、、ウイルデ（Ｗｉｌｄｅ）、Ｃ，およびコーラ−（ Ｋｏｈｌｅｒ）、Ｇ　、（］　９７８　）、不一チャ（Ｎａｔｕｒｅ）、２７６ ＋２６９−２７０）。燐酸力ルンウム沈澱方法（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およ びファンデルニブ（ｖａｎ　ｄｅｒ　ＥｂＸ　１９７３　）、ヴイロロジ−（Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ）、ｌ又：４５６）を適用してキメラ遺伝子を５ｐ２１０細胞中 に移入させた。

ＱＮＡ）ランスフニクションを促進させるために、５ｐ２１０細胞をあらかじめ ヒストン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンバニイ）で処理さ れている１００ｍｍのベトリ皿当たり５Ｘ１０’紙胞の割合で種つけし、そして ３７°Ｃで１６時間培養した。約７．５×１０’個の５ｐ２１０細胞をＣ５ＣＱ −エチジウムブロマイド勾配で精製されているｐｓＶ１８４△Ｈｎｅｏ、ＢＡＴ １２３−ＶｋｈＣに（１５０ｔｉｇ）８よびｐｓＶ△Ｈｇｐ　ｔ、ＢＡＴｌ　２ ３−ｖ、、ｈｃ、Ｄ、（１５０μｇ）と共に燐酸カルシウム沈澱方法を使用して トランスフェクションした。

トランス７エクタント ル当たりｌＸ１０’個の細胞の密度において４００μｇ／ｍｕのＧ４１８および ０，８μｇ／ｍＩ２のミコフェノール酸を含有している培養媒体中で継代培養し た。２種の選択薬品に対するトランス７エクタントの頻度は約２ＸｌＯ−Ｓであ った。

安定なトランス７エクタント（トランスフエフトーマ）を、ＢＡＴ　１２３の顕 著な特性である精製されたＨＩＶｇｐ１２０に対するそれらの親和力によって、 分泌された機能的キメラ抗体を製造するためにスクリーニングした。精製された ｇｐ１２０は微量滴定板の上で固定され、そしてそれはトランスフェクタントか らの培養上澄み液と反応することができた。抗原−抗体複合体をヒトのＩｇＧに 特異性であるアルカリ性ホスファターゼ−結合された抗血清を用いて検出した。

表■に示されている如く、試験した１２００種のトランスフェクタントの中の７ ０７種がＥＬＩＳＡ中で陽性信号を与え、それは完全なキメラ抗体が分泌された ことおよびこの蛋白質がＨＩＶｇｐ１２０を結合する能力を保有していることを 示している。トランスフェクションされていない親細胞の線は陰性の結果を与え た。

表ｖ　トランスフエフトーマによるキメラ抗体の分泌水準５Ｐ２１０　１２００ 　　　　　　　４９３　　　５１１　　１９６　　　５９トランスフニクトーマ はＥＬＩＳＡ中でそれらのＯＤを基にして目盛り付けされている。「陰性」は０ ．０〜０．１のＯＤであると定義され、「弱陽性」は０．１〜０．２を示し、そ して「陽性」は０．２−３．０を示している。

トランス７エクトーマ細胞線からのキメラ抗体の製造ＥＬＩＳＡ中で１．０より 大きいＯＤを示す７０本のトランスフエフトーマ線を選択し、そして単独細胞ク ローニング技術によりキメラ抗体生成用細胞を精製し、そこから１２本の安定な 細胞線を制定した。これらのトランス７エクトーマ細胞線を次に分泌薬品である Ｇ４１８およびミコフェノール酸の不存在下でキメラ抗体生成安定性に関して試 験した。

細胞を媒体中で２種の選択薬品中で２週間の間隔で段階的に減少させながら培養 して、薬品を完全に除去した。薬品の各減少中、これらの細胞線中のキメラ抗体 の製造をＥＬＩ　ＳＡにより監視した。これらの細胞線の中の３本は選択圧力を 除くとキメラ抗体を分泌するそれらの能力を失った。残りの９本の細胞線は培養 媒体中での選択薬品の完全除去から５週間後もキメラ抗体の製造において安定な ままであった。

キメラ抗体製造水準を評定しそして別の同定用に抗体を製造するために、トラン スフエフトーマ線ＣＡＧＩ−５１−４を広げそして組織培養媒体中で成長させた 。約６００蛯の培養媒体を集めそしてそこから１４゜４ｍｇ　（イリノイ州ロッ クフォード、ピアースのＢＣＡ蛋白質効力検定により評定されている）のキメラ 抗体をｒ−蛋白質Ａ−セファロース親和カカラム（マサチューセッツ州ケンブリ ッジのレプリゲン・コーポレーション）の利用により精製した。このトランス７ エクトーマ細胞線の培養上澄み液中のＩｇＧ濃度は従って２４μｇ　／　ｍＯで あると評定され、それはＢＡＴ　ｌ　２３ハイブリドーマ細胞により生じる水準 （２０μｇ／蛯）より幾分高い水準であった。

キメラ抗体の生化学的分析 精製されたキメラ免疫グロブリンを使用して、キメラ抗体の生化学的性質を同定 した。

Ａ）等電点 精製されたキメラ抗体の等電焦点用（ＩＥＦ）ゲルのパターンをＢＡＴ１２３の ものと一緒に第４図に示す。ＩＥＦパターンは７アーマシアのファストシステム ７″″上での精製された抗体試料の適用により得られ、そしてＩＥＦは製作者の 推鷹する工程に従い実施された。ＩＥＦ／＜ターンは、キメラ抗体はｐＨ６，８ −７，２の範囲にｐｒを有する２種の主要種を含有しているが対応するＢＡＴ　 Ｉ　２３分子はｐＨ５，６−５，８の範囲のｐｉを表示すること示していた。従 ってマウスからヒトへの免疫グロブリン分子の一定区域の置換がＩＥＦパターン に反映される抗体の組成を大きく変更させた。

Ｂ）抗−マウスおよび抗−ヒト抗結成に対するキメラ抗体の反応性キメラ抗体を 還元性条件（レンムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、Ｏ，に、（１９７０）、浄−チャー （匣狂皿）、２２ヱ：６８０−６８５）下で１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動にかけた時には、２種の帯が観察された（第５Ａ図、レーン２）。

５３．０００ダルトンの分子量の蛋白質帯はキメラＨ４１ｔｌｌ：相当しており 、モしてＢＡＴ１２３免疫グロブリンのＨ鎖（第５Ａ図、レーンｌ）とほとんど 同様の寸法を示した。約２３．０００ダルトンの寸法を有する蛋白質帯は抗体の Ｌ鎖を示した。キメラ二鎖に対して観察されたわずかにゆっくりした移動度が田 のキメラ抗体中でも見られ、そしてそれは必ずしもヒト重鎖に一定部位（ｈｃ、 ）のマウスのそれより大きい寸法によるものではないかもしれない。免疫グロブ リンを１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ中に非還元条件下で溶解させた時には、キメラ抗 体のＨ，Ｌ、分子と似ているＩＥＦパターンはＢＡＴ１２３（分子量１４６．０ ００ダルトン）のものと同一の移動度を示した（第５Ａ図、レーン３および４） 。

キメラ抗体がヒト免疫グロブリンの一定部位に実際に入ったかどうかを試験する ために、バイオラド・ミニープロティン■シュアル・スラブ・セル装置中で蛋白 質を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ中に還元条件下で溶解させた後に、２μｇのキメラ 抗体およびＢＡＴ１２３をニトロセルロース膜の上で等電汚染した（１００ポル ト、１時間、２５ｍＭのトリス−ＨＣＱ、１９２ｍＭのグリシン、２０％（容量 ／容量）のメタノールか。

らなるｐＨ８，３のトランスプロット緩衝液中）。複製膜フィルターの一方はパ イオチニル化されｔ；抗−マウス抗体（カリフォルニア州ｌ（−リンガムのベク トル・ラボラトリイ）と反応させたが、他方のフィルターは燐酸塩で緩衝されて いる食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中の５％の非脂肪ドライミルクからなるプロットａ衝 液中でバイオチニル化された抗−ヒト抗体と反応させｔ；。３７℃における１時 間の培養後に、膜フィルターをＰＢＳ十０．１％ンイーン２０　（ＰＢＳＴ）を ２回交換して洗浄し、そして両方の膜をプロット中で室温においてセイヨウワサ ビ過酸化酵素−アヴイジン結合体と３０分間にわたり反応させた。ＰＢＳＴを用 いた最終的洗浄の後に、反応性蛋白質帯を４−クロロ−１−ナフトール（４−Ｃ Ｎ）ｊ、”よび過酸化水素を使用する展色ｌこより可視化した。第５Ｂ図に示さ れている如＜、ＢＡＴ１２３免疫グロブリンは引き統いて抗−マウス抗血清と反 応性であったが、キメラ抗体は該血清とほとんど反応性でなかっ１；。

一方、キメラ抗体は抗−ヒト抗血清と強く反応したが、ＢＡＴ１２３は抗血清と は認められる反応性を示さなかった（第５ｃ図）。この結果は、キメラ抗体分子 の一部が実際にヒト免疫グロブリンから誘導されたことを示している。

Ｃ）キメラ抗体のＩｇＧサブクラス Ｈ鎖キメラ遺伝子は、ＢＡＴ１２３のｖ、Ｉ遺伝子をヒ）Ｃ，＋部位のコード配 列順序に組み継ぐことにより、製造されＩ；。生成したキメラ抗体は従ってＩｇ Ｇ１サブクラスのものであると予測されｌ；。予測された製造されたキメラ抗体 のアイソタイプを確認するために、下記の実験を行った。マウスの抗−ヒトＩｇ Ｇ１およびＩ　ｇＧ３抗−血清（フィッシャー・バイオチク）を別個に微量滴定 ウェル上に一連の２倍希釈度でコーティングしｔ；。２０μｇ　／１ａ（ｌのキ メラ抗体をこれらのウェルに加え、そして３７℃で１時間培ａｔた。ＰＢＳＴで 洗浄した後に、山羊の抗−ヒト−セイヨウワサビ過酸化酵素結合体（ベクトル） を用いる培養およびその後の展色により複合体を検出した。結果（第６図に示さ れている）は、キメラ抗体がＩｇＧ］サブクラスのものであることを、明らかに 示している。

Ｄ）キメラ抗体の抗原特異性 抗原結合位置の生成に直接かかわっている免疫グロブリン分子内のアミノ酸残基 は一般的に、免疫グロブリンの可変領域（Ｖ）内に存在している相補性測定部位 （ＣＤＲ）中にあると信じられている。キメラ抗体が親杭体の抗原特異性を保有 しているかどうかを測定するために、下記の実験を行っＩ；。第一の実験ではキ メラ抗体を５ＤＳ−ＰＡＧＥ中に溶解されている精製ＨＩＶの全ての抗原を含有 している市販の免疫汚染片（バイオチク・リサーチ・ラポスのロバート・チン博 士の寄贈）と反応させ、その後ニトロセルロース膜フィルター上で等電トランス プロ７トを行った。反応はプロット緩衝液中で室温において１６時間行われた。

反応性複合体を次に最初にバイオチニル化された抗−ヒト抗血清（ベクトル）を 用いそしてその後アヴイジンーセイヨウワサビ過酸化酵素を用いて培養し、各培 養段階の間に洗浄し、そして最後に酵素基質である４−ＣＮおよび過酸化水素を 用いて展色することにより検出した。結果は第７Ａ図に示されている。キメラ抗 体と反応する抗原帯（レーン３）は平行反応中でＢＡＴ１２３抗体により検出さ れたもの（レーン２）と同一であり、そしてエイズ患者からの対照用血清との反 応！二より示されるウィルス抗原プロフィル中のウィルスエンベロープグリコ蛋 白質ｇｐ１２０に相当していた。この結果、キメラ抗体がＨＩＶ−ｇｐ１２０を 結合させるＢＡＴ１２３の抗原特異性を保有していることを示していた。

キメラ抗体がＢＡＴ　ｌ　２３と同様にｇｐ１２０内の抗原決定子（ユビトーブ ）を認識するかどうかをさらに試験する！こめに、抗体をｇｐ１２０中の電位抗 原決定子を代表する一連の３２重複オリゴペプチド類を含有している膜片（デニ ポンのＳ、ペラテラエイの寄ＩＩ）と反応させた。

培養工程は本質的にウィルス抗原の免疫汚染片のものと同一であった。

結果（第７Ｂ図に示されている）は、キメラ抗体がＡｒｇ、Ｉ　ｌｅ。

Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａ　Ｉ 。

Ｔｈｒ、Ｉ　ｌｅ、Ｇｌｎ、ＬＦｓ、のアミノ酸配列順序を有するＢＡＴ　１２ ３と同じオリゴペプチドと結合することを示している。

マウス抗体ＢＡＴ　１２３の抗原特異性は従ってマウス／ヒトキメラ抗体への転 化ｌ：８いても良好ｌ；保育されていた。

キメラ抗体の生物学的活性 Ａ）キメラ抗体によるＨ９細胞に対するＨ　Ｉ　Ｖ−１感染の中和Ｈ９細胞に対 するＨ　Ｉ　Ｖ−１感染を中和するキメラ抗体の能力をこれまでに記されている のと同様な工程を使用して測定した（１９８７年５月２９日に出願された米国特 許出願番号０５７，４４５の一部継続出願である１９８７年１２月２４日に出願 されｔ；米国特許出願番号１３７゜８６１）。使用したウィルスは、ＨＴＬＶ− １１１Ｂを感染させたＨ細胞の培養上澄み液から製造された。４０ｍｇの細胞を 含まない上澄み液を３５．０００Ｘｇで３時間遠心した。粒子を３ｉのｉＲ長長 体体中再懸濁させた。ウィルスの滴定量は、Ｈ９細胞にウィルス株を１０倍の連 続的希釈度で感染させることにより、測定された。ウィルス株のＴＣＩＤｓ。

は、微量培養体数の半分が感染した時の感染投与量として測定された。

中和効力検定では、２０倍のＴＣＩＤｓｏに等しい感染投与量を使用した。５０ μＱの６０ＴＣＩＤ、。のウィルス株を９６−ウェル板の微量培餐ウェル中で試 験された５０μΩの抗体と共ｌ：使用し１；。試験した抗体はキメラ抗体ＣＡＧ Ｉ−５１−４、マウスの単クローン抗体ＢＡＴ１２３およびヒト絨毛膜ゴナドト リピンに対するマウスの単クローン抗体（抗−ｈｃｃ）であった。対照用では、 ５０μ０の抗体なしの成長媒体を使用しＩ；。混合物を５％Ｃ○２培養器中で３ ７℃に１時間保った。抗体の最終的濃度は１００．５０．２５．１２．５および ６．２５　ｐ　ｇ／ｌｎＱであった。試験抗体の各濃度について３回ずつ実施し た。培養終了時に、５０ｐＱの４×１０６／ｌ１１０のＨ９細胞を加えた。Ｈ９ 細胞は対数相で回収され、そしてあらかじめ混合物に加えられである１５％の熱 −不活性化された牛の胎児血清を含をしているＲＰＭＩ−１６４０成長媒体中で １時間にわたり３７℃において２μｇ／蛯のポリブレンと共に予備培養した。培 養終了時に、各微量培養ウェル中の細胞を再懸濁させ、４０μＱの細胞懇濁液を 別の微量培養板の対応するウェル中で２００μｇの新しい成長媒体に加えた。微 量培養板を培養器中で５％ＣＯ７中に３７’Ｃ１ｍ保つＩコ。３．５．７．９． １１および１４日目に、１５０μｆｆの各微量培養体からの細胞懸濁液を取り出 し、そして別の９６−ウェル板のＵ底つェル中に入れた。板を２００ｘｇで５分 間にわたり遠心した。

ＨＩＶ−１ウイルス抗原捕獲効力検定用に、上澄み液を集めた。ウェルを１５０ μＱの新しい成長媒体と共に供給しｊ；。

抗厘捕獲効力検定においては、細胞を含まない上澄み液中のＨＩＶ−１特異性抗 原をエイズ患者からの免疫グロブリンに対するそれらの親和力により測定した。

１００μＱの希釈された精製エイズ患者免疫グロブリン（１：２０００、約５Ｐ ｇ／＋ｎｆｆ）をコビンド板の各ウェルに加え、そして３７℃で２時間培養した 。次にウェルを２００μｇの燐酸塩で緩衝されている食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で２ 回すすいだ。ウェルをＰＢＳ中で２２０μａの１％牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　 Ａ）で１時間にわたり３７℃で遮蔽した。ウェルを次に空にした。５０μＱの試 験試料（未希釈のまＩ；は適当に希釈されたもの）を５０μＱのＰＢＳＴＢ　（ １％のＢＳＡおよび０．１％のツイーン２０を含有しているＰＢＳ）と共にウェ ルに加えた。陰性対照物は５０μＱの成長媒体を含有していた。板を３７℃で１ 時間培養した。次にそれをＰＢＳＴで３回すすいだ。１００μρの希釈された過 酸化酵素結合されｊ；エイズ患者の免疫グロブリンを各ウェルに１時間にわたり 室温で加えた。板を次にＰＢＳＴで３回すすいだ。１００μＱの基質溶液（２０ ｍＭのｐＨ６，０の酢酸ナトリウム緩衝液、０゜００１％の３．３’、５．５’ テトラメチルベンジジンおよび０．００１％の過酸化水素を含有している）を各 ウェルに加え、そして室温で３０分間培養した。次に５０μＱの２Ｍ　Ｈ，Ｓｏ 、を各ウェルに加えて反応を停止させた。４９０％ｍにおいて吸収が読み取られ た。３回の読み取り値を平均し、そして中和用抗体を加えた時の抑制率に関して 対照用と試験抗体を比較した。結果（第８図）は、全ての希釈度で１４日の効力 検定においてキメラ抗体はＨ９細胞に対するＨＩＶ−１感染を完全に中和したこ とを示している。対照用のマウス抗体（抗−ｈＣＧ）および成長媒体は抑制活性 を示さなかった。

Ｂ）キメラ抗体のシンシチウム生成の抑制キメラ抗体のＨＩＶ−中和活性も、そ れがシンシチウム生成を抑制する能力により評価された。細胞融合によるＨ　Ｔ 　Ｖ−］伝播に対するキメラ抗体の効果を、接触時に融合しそして培養体中でシ ンシチウムを生成するＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞およびＣＤ４−表示ヘラ細胞（ヘ ラ−ＣＤ４＋）を使用して研究した。ヘラ−ＣＤ４＋はそれのゲノム中にトラン スフェクションにより加えられたＣＤ４フード化ＤＮＡを含有しており、従って 、それはそれの細胞表面上のＣＤ４抗原を表していた。ヘラ−ＣＤ４＋細胞線は デイヴイッド（Ｄａｖｉｄ）、　Ｄ　、ホー（Ｈｏ）　（ロスアンジェルスのカ リフォルニア大学）から寄贈された。ヘラ−ＣＤ４＋細胞の培養体を９６−ウェ ル微量培養板のウェルの上に１個のウェル当たり２０゜０００個の細胞の割合で 置いた。板を３６時間にわたり培養し、そしてこの時までに単層形容細胞はほと んど融合性となあった。ｌＸｌ０’個の感染Ｈ９細胞を融合性ヘラ−ＣＤ４＋細 胞に加えた時に、生成した細胞は接触し、融合し、そして１８時間以内に多核化 された巨細胞（シンシチウム）が生成しｔ；。５個より多い核を有するこれらの シンシチウムは容易に同定および計数できて、シンシチウム生成の定量的測定値 を与える。シンシチウム生成に対するキメラ抗体の効果を研究する時には、種々 の濃度の抗体を感染Ｈ９細胞と混合しそして−＼クラ−Ｄ４＋細胞に加えた。１ 個のウェル当たりの培養媒体の最終的な合計量は２００μΩであった。３７℃に おける１８時間の培養時間の終了時に、ウェルをＰＢＳで洗浄し、メタノールで 固定し、空気乾燥し、そしてメチレンブルーで染色した。細胞を１００Ｘ倍率で 検査し、そしてンンシチウム（５個より多い核のもの）数を４種の不規則的に選 択された視界で測定し、そして平均し、た。表■に示されているように、キメラ 抗体ＣＡＧ　１−５１−４はそれぞれ２０μｇ／ｌ１ＩＱ、１０μｇ　／　ｍｌ 、および５μｇ　／　ｍＱの水準においてはＨ９細胞およびヘラ−ＣＤ４＋細胞 の間で生成したシンシチウム数での８９．１％、６５．７％、および５８，６％ の減少を与えた。

この効果はＢＡＴ１２３により生じるものと本質的に同一であり、そしてそれは キメラ抗体がＨＩＶ伝播用の主要方式の一種であるＨＩＶ−感染細胞および未感 染の細胞の間の融合を抑制する活性を保有していたことを示している。

対照用のマウス抗体抗−ｈＣＧはシンシチウム生成に効果を与えなかった。

試験した抗体　　　　　視界光Ｉ；りのシンシチウム数本　　抑制率対照用（抗 体なし）３７±２．６０ ＢＡ丁１２３　２０　　μｇ／ｌａｎ　　　　　　　３．６７　　±　２．１　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０−０１０　μｇ／ｍＱ　　　　ｌ ｌ−３ｆ　２．１　　　　　　　　　　　６９．５５　　ｐｇ／ｌｌ１０　　　 １８．０　±２　　　　　　　　　　　　５ｌ−４ＧＡＧＩ−５］−４２０ｐｇ ／ｒｎＱ　　　４±３　　　　　　　　　　　　　８９．１１０９Ｆ、／ｍＱ　 　　１２．７　±４　　　　　　　　　　　　６５．７５　μｇ／ｒａｎ　　　 ］５−３±１．２　　　　　　　　　　　５８．６ｔ　−ｈＣＧ　　２０μｇ／ ｒｎＱ　　　　３５．０±５　　　　　　　　　　　　・・・ｌＯμｇｈｎ（１ ３３，７±７　　　　　　　　　　　　・・・５　μｇ／ば　　　３２．０±５ 　　　　　　　　　　　　・・・当技術の専門家は日常的な実験をもはや使用せ ずにここに記されている本発明の特定態様と同等な多くの態様を認識したりまた はつきとめたりできるであろう。そのような同等な態様も特許請求の範囲により 包括されるものとする。

モノクローナル抗体の濃度（、ｕｇ／ｍ１）ＦＩＧ、　１ １３日 ＦＩＧ、　２ Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈ□− ＦＩＧ、　４ Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｂ１　　　　２３　　　　　 　　　　　　　＋２９ρ１２０　−七゛　　　　　　　、 ｐ１７１！ 培養上溝中のＨＩＶ−１抗！（比較の％）補正書の写しく翻訳文）提出書　（特 許法第１８４条の８）平成１年１１月２９品司 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１７９７ ２、発明の名称 ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国テキサス用７７０２５ヒユーストン・ステラリンクロー ド１０３０１ 名　称　タノツクス・バイオシステムズ・インコーホレーテッド電話　５８５− ２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９８９年７月１０日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　１通（２）補正の説明　　 　　　　　　１通請求の範囲（補正） １、ＨＩ　Ｖ−１の異なる菌株および分離物を特徴する請求の範囲第１項記載の モノクローナルｇｐ１２０特異的抗体。

３、マウス由来である、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。

４、ＩｇＧアイソタイプである、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。

５、キメラのネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第１項記載のモノクローナル 抗体。

６、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体の抗原結合断片。

７、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合し、モしてＨＩ　Ｖ −１によるヒトＴＭ胞の感染を阻害するモノクローナル抗体。

８、ＨＩＶ−１感染細胞との融合によりヒトＴ細胞の感染をさらに阻害する、請 求の範囲第７項記載のモノクローナル抗体。

９．９日のアッセイにおいてＴＣＩＤｓ。の２０倍でＨＩＶ−１ｍによる感受性 ヒトＴ細胞系の感染を、１０ｎｇ／ｍ１２より低いＩＣｓ。で、阻害する、請求 の範囲第８項記載のモノクローナル抗体。

１０、マウス由来である、請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体。

１１％　ＩｇＧアイソタイプである、請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗 体。

１２、キメラのネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第８項記載のモノクローナ ル抗体。

１３、ネズミリンパ球およびネズミ骨髄腫の融合から形成されたハイブリドーマ により産生される、請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体。

１４、モノクローナル抗体のＢＡＴＯ８５、ＢＡＴ　ｌ　２３、ＢＡＴ２６７、 およびＢＡＴ５０９゜ １５．２つの異なる抗原結合部分からなり、１つはＨＩＶ−１のｇｐ１２０エン ベロープタンパク質に結合しかつＨＩ　Ｖ−１によるＴ細胞の感染を阻害するモ ノクローナル抗体抗ＨＩＶ−１抗体から誘導され、そして第２は異なる特異性を 有する、二特異的抗体。

１６、モノクローナル抗体抗ＨＩＶ−１抗体はＨＩ　Ｖ−１感染細胞との融合に よりヒトＴ細胞の感染をさらに阻害する、請求の範囲第１５項記載の二特異的抗 体。

５５、ＨＩ　Ｖ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和するモノクローナル ｇｐ１２０特異的抗体を産生ずる、連続の安定な抗体産生細胞系。

５６、ハイブリドーマである、請求の範囲第５５項記載の細胞系。

５７、キメラの動物／ヒト抗体を産生ずるトランス７エクシ這ンした骨髄腫であ る、請求の範囲第５５項記載の細胞系。

５８、キメラ抗体はネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第５７項記載の細胞系 。

６０、ＢＡＴＯ８５、ＢＡＴ　ｌ　２３、ＢＡＴ２６７およびＢＡＴ５０９から 成る群より選択される抗体を産生ずる、請求の範囲第５９項記載のハイブリドー マ細胞系。

６１、工程： ａ）個体から血液白血球を取り出し、 ｂ）取り出した白血球をＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体と接触させ、 そして Ｃ）白血球を個体に戻す、 からなる、ＨＩＶ−１感染個体を体外で処置する方法。

補正の説明 補正音翻訳文の第１頁〜第２頁は請求の範囲翻訳文の第７８頁第１行〜第７９頁 第１１行の補正であります。但し請求の範囲翻訳文の第２項は削除されておりま す。

補正音翻訳文の第３頁は請求の範囲翻訳文の第８３頁第１９行〜国際調査報告 １１１１市−１□１１＋１＾■１１ζ墨＄＆＋ＮｃＦロＴ／ｕｓεε１ｂ＋ｈｌ Ｉ＋１＋＋：ｃｒｙ　Ａｔｌ”ｋｌｌｌｅＡ　Ｎ６　ＰＣ７ｕＳε＋４１０１７ ９７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体。 ２、ＨＩＶ−１の異なる菌株および分離物を中和する、請求の範囲第１項記載の モノクローナル抗体。 ３、マウス由来である、請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体。 ４、ＩｇＧアイソタイプである、請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体。 ５、キメラのネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第２項記載のモノクローナル 抗体。 ６、請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体の抗原結合断片。 ７、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合し、そしてＨＩＶ− １によるヒトＴ細胞の感染を阻害するモノクローナル抗体。 ８、ＨＩＶ−１感染細胞との融合によりヒトＴ細胞の感染をさらに阻害する、請 求の範囲第７項記載のモノクローナル抗体。 ９、９日のアッセイにおいてＴＣＩＤ５０の２０倍でＨＩＶ−１■による感受性 ヒト丁細胞系の感染を、１０ｎｇ／ｍｌより低いＩＣ５０で、阻害する、請求の 範囲第８項記載のモノクローナル抗体。 １０、マウス由来である、請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体。 １１、ＩｇＧアイソタイプである、請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体 。 １２、キメラのネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第８項記載のモノクローナ ル抗体。 １３、ネズミリンパ球およびネズミ骨髄腫の融合から形成されたハイブリドーマ により産生される、請求の範囲第８項記載のモノクローナル抗体。 １４、モノクローナル抗体のＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７、およ びＢＡＴ５０９。 １５、２つの異なる抗原結合部分からなり、１つはＨＩＶ−１のｇｐ１２０エン ベロープタンパク質に結合しかつＨＩＶ−１によるＴ細胞の感染を阻害するモノ クローナル抗体抗ＨＩＶ−１抗体から誘導され、そして第２は異なる特異性を有 する、二特異的抗体。 １６、モノクローナル抗体抗ＨＩＶ−１抗体はＨＩＶ−１感染細胞との融合によ りヒトＴ細胞の感染をさらに阻害する、請求の範囲第１５項記載の二特異的抗体 。 １７、抗ＨＩＶ−１抗体はＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７およびＢＡＴ５０９から 成る群より選択される、請求の範囲第１５項記載の二特異的抗体。 １８、第２抗原結合タンパク質はヒトＴ細胞またはマクロファージの表面抗原に 対して特異的である、請求の範囲第１５項記載の二特異的抗体。 １９、表面抗原はＣＤ４分子である、請求の範囲第１８項記載の二特異的抗体。 ２０、細胞障害因子、抗ウイルス因子または血液脳バリヤーの通過を促進する因 子と接合したＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体からなる、抗体接合体。 ２１、抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する、請求の範 囲第２０項記載の抗体接合体。 ２２、モノクローナル抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７および ＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第２０項記載の抗体接合体 。 ２３、細胞障害因子または抗ウイルス因子は、細胞障害性ステロイド、ガラニン 、アブリン、リチン、ホスホリパーゼ、インターフェロン、放射性核種、アジド チミジン、またはリボビリンから成る群より選択される、請求の範囲第２０項記 載の抗体接合体。 ２４、ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体で含浸されたマイクロキャリヤ ー。 ２５、モノクローナル抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株および異なる分離物を中和 する、請求の範囲第２４項記載のマイクロキャリヤー。 ２６、モノクローナル抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７および ＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第２４項記載のマイクロキ ャリヤー。 ２７、リボソームである、請求の範囲第２４項記載のマイクロキャリヤー。 ２８、ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体をその表面に接合して有し、そ してそれと関連して細胞障害因子または抗ウイルス因子を有する、マイクロキャ リヤー。 ２９、抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する、請求の範 囲第２８項記載のマイクロキャリヤー。 ３０、．モノクローナル抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７およ びＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第２８項記載のマイクロ キャリヤー。 ３１、因子は、細胞障害性ステロイド、ガラニン、アブリン、リチン、ホスホリ パーゼ、インターフェロン、放射性核種、アジドチミジン、またはリボビリンの １種または２種以上のである、請求の範囲第２８項記載のマイクロキャリヤー。 ３２、ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体の治療量を個体に投与すること からなる、ＨＩＶ−１が感染した個体を処置する方法。 ３３、個体はＨＩＶ−１キャリヤーまたはエイズまたはエイズ関係複合体をもつ 患者である、請求の範囲第３２項記載の方法。 ３４、抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する、請求の範 囲第３２項記載の方法。 ３５、モノクローナル抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７および ＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第３２項記載の方法。 ３６、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープタンパク質と結合し、ＨＩＶ−１に よるＴ細胞の感染を阻害し、そしてＨＩＶ−１感染細胞との融合によりＴ細胞の 感染を阻害するモノクローナル抗体抗ＨＩＶ−１抗体の治療量を個体に投与する ことからなる、ＨＩＶ−１キャリヤーまたはエイズまたはエイズ関係複合体をも つ患者である個体を処置する方法。 ３７、治療量の二特異的抗体を投与することからなり、前記二特異的抗体は２つ の異なる抗原結合部分からなり、１つはＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープタ ンパク質に結合しかつＨＩＶ−１によるＴ細胞の感染を阻害するモノクローナル 抗体抗ＨＩＶ−１抗体から誘導され、そして第２は異なる特異性を有する、ＨＩ Ｖ−１感染個体を処置する方法。 ３８、抗ＨＩＶ−１抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７およびＢ ＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第３７項記載の方法。 ３９、第２抗原結合部分は表面抗原、ヒトＴ細胞またはマクロファージに対して 特異性である、請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０、表面抗原はＣＤ４分子である、請求の範囲第３９項記載の方法。 ４１、個体に治療量の抗体接合体と投与することからなり、前記抗体接合体は細 胞障害因子、抗ウイルス因子または血液脳バリヤーの通過を促進する因子と接合 したＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体からなる、ＨＩＶ−１感染個体を 処置する方法。 ４２、抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する、請求の範 囲第４２項記載の方法。 ４３、モノクローナル抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７および ＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第４２項記載の方法。 ４４、細胞障害因子または抗ウイルス因子は、細胞障害性ステロイド、ガラニン 、アブリン、リチン、ホスホリパーゼ、インターフェロン、放射性核種、アジド チミジン、またはリボビリンから成る群より選択される、請求の範囲第４１項記 載の抗体接合体。 ４５、個体にＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体を投与することからなる 、個体をＨＩＶ−１に対して受動的に免疫化する方法。 ４６、モノクローナル抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和 する、請求の範囲第４５項記載の方法。 ４７、モノクローナル抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７および ＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第４５項記載の方法。 ４８、個体にＨＩＶ−１に対する免疫化を誘発する抗原を投与する、請求の範囲 第４５項記載の方法。 ４９、個体はＨＩＶ−１感染であるが、無症候性である、請求の範囲第４５項記 載の方法。 ５０、ＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和するモノクローナル抗 体のイディオタイプに対して特異的の抗イディオタイプ抗体。 ５１、キメラのネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第５０項記載の抗イディオ タイプ抗体。 ５２、キメラのネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第５１項記載の抗イディオ タイプ抗体。 ５３、ＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７およびＢＡＴ５０９から成る 群より選択される抗体のイディオタイプに対して特異的な抗イディオタイプ抗体 。 ５４、ＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和するモノクローナル抗 体のイディオタイプに対して特異的の抗イディオタイプ抗体の免疫原量を投与す ることからなる、ＨＩＶ−１に対して免疫化する方法。 ５５、ＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体を産生する、連続の安定な抗体 産生細胞系。 ５６、ハイブリドーマである、請求の範囲第５５項記載の細胞系。 ５７、キメラの動物／ヒト抗体を産生するトランスフエクションした骨髄腫であ る、請求の範囲第５５項記載の細胞系。 ５８、キメラ抗体はネズミ／ヒト抗体である、請求の範囲第５７項記載の細胞系 。 ５９、ＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和するモノクローナル抗 体を産生する、ハイブリドーマ細胞系。 ６０、ＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７およびＢＡＴ５０９から成る 群より選択される抗体を産生する、請求の範囲第５９項記載のハイブリドーマ細 胞系。 ６１、工程： ａ）個体から血液白血球を取り出し、 ｂ）取り出した白血球をＨＩＶ−１を中和するモノクローナル抗体と接触させ、 そして ｃ）白血球を個体に戻す、 からなる、ＨＩＶ−１感染個体を体外で処置する方法。 ６２、白血球を免疫沈澱薬物で刺激することをさらに含む、請求の範囲第６１項 記載の方法。 ６３、免疫沈澱薬物はインターリューキン−２である、請求の範囲第６２項記載 の方法。 ６４、モノクローナル抗体はネズミ／ヒトのキメラ抗体である、請求の範囲第６ ２項記載の方法。 ６５、モノクローナル抗体はＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和 する、請求の範囲第６２項記載の方法。 ６６、モノクローナル抗体はＢＡＴ０８５、ＢＡＴ１２３、ＢＡＴ２６７および ＢＡＴ５０９から成る群より選択される、請求の範囲第６２項記載の方法。 ６７、ＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する抗ＨＩＶ−１抗体 により結合されたエピトープと同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ酸 配列を有する免疫原ペプチド。 ６８、キャリヤータンパク質と結合した、請求の範囲第６７項記載の免疫原ペプ チド。 ６９、アミノ酸配列ＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫまた はその実際のエピトープ部分を有する、請求の範囲第６７項記載の免疫原ペプチ ド。 ７０、キャリヤータンパク質と結合した、請求の範囲第６７項記載の免疫原ペプ チド。 ７１、製剤学的に許容されうるベヒクル中にＨＩＶ−１の異なる菌株または異な る分離物を中和する抗ＨＩＶ−１抗体により結合されたエピトープと同一である か、あるいはそれに類似するアミノ酸配列を有する免疫原ペプチドを含む、免疫 原組成を投与することからなるＨＩＶ−１に対して免疫化する方法。 ７２、ペプチドはＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫを有す る、請求の範囲第７１項記載の方法。 ７３、キャリヤータンパク質と結合した、請求の範囲第７２項記載の方法。 ７４、ペプチドはＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧを有する、請求の範囲第７１ 項記載の方法。 ７５、ペプチドはＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫを有する、請求の範囲第 ７１項記載の方法。 ７７、非ヒト由来のウイルス特異的抗原結合領域およびヒト由来の領域からから なる、キメラのウイルス中和免疫グロブリン。 ７８、ウイルスはヒト免疫欠損ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルスＩま たはＢ型肝炎ウイルスである、請求の範囲第７７項記載のキメラ免疫グロブリン 。 ７９、ウイルスはヒト免疫欠損ウイルスである、請求の範囲第７８項記載のキメ ラ免疫グロブリン。 ８０、抗原結合領域はネズミ由来である、請求の範囲第７７項記載のキメラ免疫 グロブリン。 ８１、非ヒト由来のＨＩＶ−１特異的抗原結合領域およびヒト一定領域からなる 、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。 ８２、ＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する、請求の範囲第５ 項記載のキメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。 ８３、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパク質と結合し、ＨＩＶによるＴ細 胞の感染を阻害し、そしてＨＩＶ感染細胞との融合によるＴ細胞の感染を阻害す る、請求の範囲第８２項記載のキメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。 ８４、構成成分： ａ、ヒト重鎖の一定領域の少なくとも一部分に結合した非ＨＩＶ中和性免疫グロ ブリンの重鎖から誘導された抗原結合領域からなる、少なくとも１つのキメラ重 鎖、前記キメラ重鎖は次のｂと関連している；ｂ、ヒト軽鎖の一定領域の少なく とも一部分に結合した非ヒト免疫グロブリンの軽鎖から誘導された抗原結合領域 からなる、少なくとも１つのキメラ軽鎖、 からなる、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。 ８５、ＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離物を中和する、請求の範囲第８ ４項記載のキメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。 ８６、抗原結合領域はネズミ由来である、請求の範囲第８４項記載のキメラＨＩ Ｖ中和性免疫グロブリン。 ８７、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパク質と結合し、ＨＩＶによるＴ細 胞の感染を阻害し、そしてＨＩＶ感染細胞との融合によるＴ細胞の感染を阻害す る、請求の範囲第８４項記載のキメラＨＩＶ中和性免疫グロブリン。 ８８、ネズミＨＩＶ中和性免疫グロブリンＢＡＴ１２３から誘導された抗原結合 領域またはＢＡＴ１２３と同一のエピトープを反応性の免疫グロブリンおよびヒ ト一定領域からなるキメラ免疫グロブリン。 ８９、キメラ免疫グロブリンＣＡ１２３−Ｇ１−２６。 ９０、構成成分： ａ、非由来のウイルス中和性抗体の免疫グロブリンの可変領域をエンコードする 第１ＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列は次のｂに結合している；および ｂ、ヒト由来の免疫グロブリンの一定領域をエンコードする第２ＤＮＡ配列、 からなる、キメラの軽鎖または重鎖をエンコードする融合した遺伝子。 ９１、第１ＤＮＡ配列はＨＩＶ中和性抗体の免疫グロブリンの可変領域をエンコ ードする、請求の範囲第９０項記載の融合した遺伝子。 ９２、ＨＩＶ中和性免疫グロブリンはＨＩＶ−１の異なる菌株または異なる分離 物を中和する、請求の範囲第９１項記載の融合した遺伝子。 ９３、ＨＩＶ中和性免疫グロブリンはネズミ免疫グロブリンＢＡＴ１２３である 、請求の範囲第９２項記載の融合した遺伝子。 ９４、発現された形態である、請求の範囲第９０項記載の融合した遺伝子。 ９５、発現された形態である、請求の範囲第９１項記載の融合した遺伝子。 ９６、非ヒト由来のウイルス特異的抗原結合領域およびヒト由来の一定領域から なる、キメラウイルス中和性免疫グロブリンの抗ウイルス量を、個体に投与する ことからなる、ウイルスの感染を治療または予防する方法。 ９７、ウイルスはヒト免疫欠損ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルスまた はＢ型肝炎ウイルスである、請求の範囲第９６項記載の方法。 ９８、ウイルスはヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）である、請求の範囲第９６項 記載の方法。 ９９、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリンの治療量を個体に投与することからな り、前記免疫グロブリンは非ヒト由来のウイルス特異的抗原結合領域およびヒト 由来の一定領域からなる、ＨＩＶキャリヤーまたはエイズまたはエイズ関係複合 体をもつ患者である個体を処置する方法。 １００、キメラＨｌＶ中和性免疫グロブリンはＨＩＶ−１の異なる菌株または異 なる分離物を中和する、請求の範囲第９９項記載の方法。 １０１、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリンは、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロー プタンパク質と結合し、ＨＩＶによるＴ細胞の感染を阻害し、そしてＨＩＶ感染 細胞との融合によるＴ細胞の感染を阻害する、請求の範囲第９９項記載の方法。 １０２、キメラＨＩＶ中和性免疫グロブリンはネズミＨＩＶ中和性抗体ＢＡＴ１ ２３から誘導された抗原結合領域およびヒト一定領域からなる、請求の範囲第９ ９項記載の方法。