JPH03504560A - 多薬剤耐性を試験するためのトランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多薬剤耐性を試験するためのトランスジェニック動物本発明は一般的には生物の 遺伝子操作に関する。より詳細には、本発明は多薬剤耐性遺伝子の発現の有用性 の生体内での試験およびガンに対する新規な化学療法剤の開発に適当なトランス ジェニック動物の作出に関する。

発明の背景 多数の化学療法剤に対する内在的および後天的耐性はガンの治療において主要な 臨床的問題である。多数の薬剤例えばニチニチソウ属のアルカロイド、ドキソル ビシン（アドリアマイシン）、コルヒチンおよびアドリアマイシンＤに対して耐 性な細胞系が、単一の薬剤に対する耐性を培養液中で選択した後のヒトＫＢカル シノーマ細胞系から誘導された系（Ａｋｉｙａｍａ等、　１９８５．　Ｓｏｍａ ｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、　１１：１１７−１２６）を含めて研 究された。多薬剤耐性に関するＭＤＲＩと呼ばれる１種のヒト遺伝子は、高度に 多薬剤耐性の細胞系、いくつかの通常の組織および多くの腫瘍において高められ ている４、５ｋｂ　　ＭＲＮＡをコード化する（Ｐｏｊｉ等、　１９８７．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８４：２６５−２６９）　、　コれらの腫瘍は結腸、副腎 および腎臓の内在的に薬剤耐性なガン、ならびに化学療法の後に薬剤耐性を獲得 した腫瘍からのものである。ＭＤ足１遺伝子のタンパク質産物は１７０ｋＤの膜 糖タンパク質（Ｐ−糖タンパク質）であり、多薬剤耐性細胞系において過剰発現 され、そして細胞外に化学療法剤を輸送するためのポンプとして作用する。薬剤 流出ポンプとして考えられているように、Ｐ−糖タンパク質は耐性細胞の原形質 膜中に局在し、細胞毒性薬剤およびＡＴＰの両方を結合し、そして配列分析によ り示されるように膜に広がる１２のドメインを有する（　Ｃｈｅｎ等、　１９８ ６．　Ｃｅ１ｌ。

４７：３８１−３８９）。

全長がクローン化されたヒトＭＤＲ１またはマウスｍｄｒｃＤＮＡは、レトロウ ィルスベクターでのトランスフェクションまたは感染の後、マウスおよびヒトの 薬剤感受性細胞に多薬剤耐性を付与し得ることも報告されている（　Ｇｒｏｓ等 、　　１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ　　３２３　ニア２８−７３１．υｅｄａ等。

１９８７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　　８４： ３００４−３００８）。

しかしながら、後天的薬剤耐性が胚または生殖質の遺伝子操作を介してヒトＭＤ ＲＩ遺伝子の生体内での体細胞発現を生じ得ることは実際の実験的研究によりこ れまで示されていなかった。

発明の要約 それ故に、本発明の目的は、ヒトＭＤＲ１遺伝子を有し、そして発現するトラン スジェニック動物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、腫瘍に対する高い程度の化学療法の有効性を試験す るための動物モデルを提供することである。

本発明のその他の目的および利点は本明細書の以下の詳細な記載から明らかにな るであろう。

図面の簡単な説明 本発明の上記目的およびその他の目的ならびに態様および多くの利点は、添付し た図面を参照して以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろう。

図ＩＡおよびＩＢは、発現ベクターｐＨＧ１およびｐＨＧ２の構築の模式図であ る。

図ＩＡはｐＨ０１の構築および前核の注入断片の単離を示す。

図ＩＢはｐＨ０２の構築を示す。文字はクローニングおよび配向の特徴づけのた めに使用された制限酵素を示す：Ｂ、　ＢａｍＨＩ　　；Ｅ、　ＥｃｏＲＩ　　 ；Ｎ、　Ｎｄｅｌ；Ｓ、　５ａｉｌ；Ｘ。

位を示す。

図２人および２Ｂはマウスからの尾部ゲノムＤＮＡのサザンハイプリダイゼーシ ョンの結果を示す。

図２Ａはマウスゲノム内に組み込まれたＢ−アクチンプロモーターＭＤＲ１融合 トランス遺伝子の模式図である。もしトランス遺伝子が組み込まれているならば 、マウスゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化およびＭＤＲ１ｃＤＮＡの中央部から誘 導された５Ａプローブとのノ１イブリダイゼーションの後に３．ｌｋｂの標識断 片が予想される。

制限部位の記号および文字は図１に記載したものと同じである。

図２Ｂは、ＥｃｏＲＩでの消化および５Ａプローブとの低い緊縮条件下（列１− ５）および高い緊縮条件下（列６−１０）でのハイブリダイゼーションの後のゲ ノムＤＮＡ（２０μｇ）のサザンプロット分析を示す。ゲノムＤＮＡはそれぞれ 以下のものから単離された：ＫＢ−１−１細胞（列１，６）；注入ＤＮＡ断片１ ０９ｇと混合された通常マウス（列２，７）；通常マウス（列３，８）；前核の 注入後に産まれた同腹からの陰性マウス（列４゜９）；該同腹からのトランスジ ェニックマウス（列５゜１０）。

図３Ａおよび３ＢはＭＤＲＩ）ランス遺伝子を有する創始マウスからのＤＮＡの ブロントノ１イブリダイゼー２９２分析を示す。

図８Ａは変性および５Ａプローブとの高い緊縮条件下でのハイブリダイゼーショ ン後の尾部ＤＮＡｌ０μｇのＤＮＡスロットプロット分析を示す。ＮＭ、通常マ ウス、ＭＢ２−Ｍ２Ｂ５．）ランスジェニック創始マウス；ＩＣまたは１０Ｃ１ 図２Ｂ中の列２および７に対して説明されたようなトランス遺伝子のコピー数を 示す。

図３Ｂは図３Ａに記載された創始マウスからの尾部ＤＮＡのサザンプロット分析 を示す。ノ１イブリダイゼーションは５Ａプローブとの高い緊縮条件下で行われ た。検印は８．ｌｋｂ断片を指し示し；矢印はトランス遺伝子の再配置産物の断 片を示す。

図４Ａおよび４Ｂは創始Ｍ３９（図３）から産まれたマウス中のＭＤＲＩ）ラン ス遺伝子の遺伝を示す。

図４ＡはＭＢ２および子孫の系図を示す。四角、オス；丸、メス；半分が黒ヌリ の記号、キャリヤーマウス：白ヌキ記号、非キャリヤー。

図４８はＦ２世代マウスからの尾部ＤＮＡのサザンプロット分析を示す。マウス の数字は上の系図に示された数字に相当する。分子量標準（ｌｋｂラダー）（Ｂ ＲＬ）が示されている。

図４Ｃはマウス３９ならびにそのＦｌおよびＦ２世代の子孫からの尾部ＤＮＡの スロットプロット分析を示す。

プローブおよびハイブリダイゼーション条件は図３Ａおよび３Ｂに記載されたも のと同じである。

図５はＭＤＲ−３９マウス系の系統発現分析を示す。

四角、オス；丸、メス；白ヌキ記号、非キャリヤーマウス；下半分が黒ヌリの記 号、ヘテロ接合体；全体が黒ヌリの記号、ホモ接合体；上半分が斜線の記号、Ｒ ＮＡ試験による検出の際にトランス遺伝子を発現するマウス；上半分がハツチの 記号、タンパク質免疫蛍光局在による検出の際にトランス遺伝子を発現するマウ ス。ネ、肺臓中にトランス遺伝子を発現するが骨髄には発現しないマウス。文字 が付されたマウスは図６においてＲＮＡ試験が示されているマウスである。

図６は通常マウスおよびトランスジェニックマウスのＲＮＡ発現分析の結果を示 す。マウスＡ−Ｅ　（図５に示されているような）の骨髄および肺臓から抽出さ れた全体のＲＮＡ試料（１０μｇ）のスロットプロットはＭＤローブ（右側）と それぞれ高い緊縮および低い緊縮条件下でハイブリダイゼーションされた。３− １．親の薬剤感受性ＫＢ細胞系；８−５およびｖ−１，多薬剤耐性サプライン、 ＢＭ、骨髄；ＳＰ、肺臓。

図７はトランス遺伝子発現の組織特異性を示す。

図７Ａは使用されたＭＤＲ１ｃＤＮＡとプローブの模式的な制限地図を示す、　 Ｅ、　ＢｃｏＲＩ　　；　Ｐ、　ＰＶＵＩＩ。

図７Ｂは以下のものから抽出された全体のＲＮＡ試料（１０μｇ）のプロットハ イブリダイゼーションを示す：上側：　１．ＫＢ−８−５薬剤耐性細胞系、２． ＫＢ−３−１薬剤感受性細胞系およびＫＢ−Ｖ−１薬剤耐性細胞系；下側：　１ ．ＭＤＲＩ非キャリヤーマウス；２１ＭＤＲＩキャリヤーマウス。Ｌｉ、肝臓Ｈ Ｋｉ、腎臓；ＬＵ、肺；Ｏｖ、卵巣；Ｍｕ、骨格筋、ＢＭ、骨髄；ｓｐ。

婢臓；Ｈｅ、心臓ＨＢｒ、脳。示されるように同じプロットが異なるプローブと ハイブリダイゼーションされた。

図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８ＤはＭＤＲＩ）ランスジェニックマウスからの骨髄 細胞中のヒトＰ１７０の免疫蛍光局在を示す。ＭＤＲＩ）ランスジェニックマウ ス（図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃ）または通常の同腹の子（図８Ｄ）のいずれかから の骨髄試料をスライドガラス上に塗布し、風乾し、そしてホルムアルデヒドで固 定する。

塗布物をモノクローナル抗体ＭＲＫ１６（抗ヒトＰ１７０）を用いて標識し、そ してローダミンで間接的に標識する。同じ時間の露光によりＭＤＲマウスからの 全ての細胞中にＰ１７０の明るい発現が見られるが（図８Ａ’、８Ｂ’　および ８Ｃ’）、対照マウスからの細胞には見られない（図８Ｄ′）。（図８Ａ、８Ｂ 、８Ｃおよび８Ｄ）は（図８Ａ’　、８Ｂ’　、８Ｃ’　および図８Ｄ°）に示 °された細胞の位相差画像を表す。（倍率＝ｘｓｓｏ、バー＝６．５ｍ） 発明の詳細な説明 本発明の上記目的および種々のその他の目的ならびに効果は、ヒトＭＤＲＩ遺伝 子を有し、そして発現するトランスジェニック動物により達成される。

特記しない場合、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は本発明 の属する技術の通常の熟練者（当業者）により通常理解されているものと同様の 意味を有する。本明細書に記載されている同様または等価のあらゆる方法および 材料が本発明の実施または試験において使用され得るけれども、好ましい方法お よび材料はここで記載される。以下に記載される全ての刊行物は参照により本明 細書に編入される。特記しない限り、本明細書で使用されている技術は当業者に 十分に公知の標準的な方法論である。

トランスジェニック動物を作出するに向けて第１段階た。

ヒトおよびマウスの両方には半数性ゲノムあたり機能的旦−アクチン遺伝子が１ 個あるだけであるけれども、胚の起源に関係な（、旦−アクチンは真核細胞中に 最も豊富にあるタンパク質の１つであり、そして種々の組織クチンプロモーター は以下の両方の要求：薬剤感受性細胞を包含する広範囲の細胞タイプにおける高 レベルの発現および活性を満たし得ると考えられた。以下の材料および方法にお いて、本発明に係るＭＤＲ１発現性トランスジェニックマウスの作出および試験 における種々の段階を例示する。

材料および方法 材料 制限エンドヌクレアーゼおよびＴ、ＤＮＡリガーゼは二ニー・イングランド・バ イオラプスまたはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社から購入され、そして 供給者により推奨される条件下で使用された。アガロース（シーケム、ＧＴＧお よびシー・プラーク、ＬＭＢ）はＦＭＣ（メーン州ロックランド）により供給さ れた。ＰＡＧＥ用の試薬はパイオーラドからのものだった。コルヒチンはシグマ ・ケミカルズから購入された。その他の全ての化学物質は分析規格のものだった 。細胞培養培地はギブコから得られ、そして血清はエム、ニー、バイオプロダク ツ社から得られた。（Ｐ”）−ｄｃｒｐおよびニックトランスレージ３ンキツト はアマルシャムまたは二ニー・イングランド・ヌクレアーから購入された。

細菌株、プラスミド、細胞系およびマウス系大腸菌Ｄ８５株は形質転換のために 使用された。全長（７）ＭＤＲＩＣＤＮＡを８′末端の単−Ｘｈｏ１部位ととモ ニ有するｐＭＤＲ２０００ＸＳは本実験室で構築された（Ｐａｓｔａｎ等、　　 １９８８．　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　　 ８５：４４８６−４４９０）。ｐＧＥＭ２ベクターはプロメガ・バイオチク（ラ イスコンシン州マジソン）から得られた。ｐＵｃ１８中にニワトリ旦−アクチン プロモーターの制御下の細菌ＣＡＴ遺伝子を育するｐＢＡ−ＣＡＴはビー、パタ ーソン博士から贈られた。ＮＩＨ８Ｔ３およびＫＢ−３−１細胞をそれぞれ１０ ％ウシ胎児血清およびウシ血清を補足したダルベツコの変形イーグル培地中増殖 させた。

マウス系ＲＣＮＩＨおよびＢ６ＳＪＬ　　Ｆはジャクソン・ラボラトリーズ（メ ーン州パーハーバ−）から得られた。

プラスミド構築 されるように構築された。ニワトリ旦−アクチンプロモーターを有するｐＢＡ− ＣＡＴは５ａｌｌで切断され、そして必須の旦−アクチンプロモーター配列を含 む０．３３ｋｂ断片をアガロースゲル上での電気泳動後に溶離させた。ｐＧＥＭ ２ベクター（Ｐａ５ｔａｎ等、　１９８Ｂ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＩＪｓＡ　　８５：４４８６−４４９０）中のＴ７ブ０ ％−ターから下流に全長のＭＤＲ１ｃＤＮＡを有するｐＭＤＲ２ｏｏｏｘｓの単 一５ａ１１部位に生成断片を挿入した。生成ミドを同定するために使用された。

生成プラスミドはｐンジェクションのために使用された。ｐＨＧ−１はマイクロ インジェクションの前にＸｈｏｌで消化され（下記参照）、Ｘｈｏｌでアクチン プロモーターの先端を切断する影響が決定された。従って、先端切断旦−アクチ ンプロモーターの制御下でのＭＤＲＩの発現レベルを試験するために、ｐＨＧ− ２（を旦ＡＰ−ＭＤＲ）は図ＩＢに示されるようにｐＨＧ−１から構築された。

ｐＨＧ−１をＸｈｏｌで切断し、生成する４、８ｋｂおよび２．９ｋｂ断片をア ガロースゲル上での分離後溶離した。Ｂ−アクチンプロモーターの５′領域の６ ０塩基対を含む２．９ｋｂ断片を５ａｉｌで切断し、これらの６０ｂｐ配列を除 去し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化して、Ｘｈｏｌ−Ｓａｉｌ　（２７ ０ｂ　ｐ）先端切断ブｏ％−９−から下流にＭＤＲｌｃＤＮＡを含む４．８ｋｂ 断片に連結した。生成するプラスミドはｐＧＥＭ２ベクター配列の多数のクロー ニング部位の５゛末端に２つの配向で旦−アクチンプロモーター−ＭＤＲ１配列 を有していた。

Ｘｈｏｌ／Ｎｄｅｌでの制限分析はｐＧＥＭ２ベクターのＴ７ブするために使用 された。生成プラスミドｐＨＧ−２（ｔＢＡＰ−ＭＤＲ）ならびにｐＨＧ−１は それらの大きさならびにヒトＫＢ−３−１およびマウスＮＩＨ８Ｔ３トランスフ ェクション細胞中でのＭＤＲ１ｃＤＮＡの発現が試験された。

細胞培養およびトランスフェクション ＮＩＨ３Ｔ３マウス細胞およびヒトＫＢ−３−１細胞を培養し、そして５ｈｅｎ 等、　１９８６．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　　６：４０３９−４０４ ４に記載されたリン酸カルシウム沈殿法によりトランスフェクションさせた。

マイクロインジェクション用のＤＮＡ調製ｐＨＧ−１をＸｈｏｌで切断し、そし て旦−アクチンプロモーターから下流にＭＤＲＩを存する４、７ｋｂ断片を低融 点アガロースゲル（下記の［プラークＪ参照）上での電気泳動によりベクター断 片から分離した。ＢＡＰ−ＭＤＲ−１を含む臭化エチジウム染色バンドをゲルか ら切出し、そしてＴＥ　（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　ｐＨ８，０，１ｍＭ　　 ＥＤＴＡ）平衡化フェノール溶液中７０℃で溶解させた。次いで０．２５Ｍ　　 ＮａＣ１、ＴＥを含有する緩衝液３容量を添加し、７０℃で１０分間そして４０ ℃で１０分間保温する。水相を分離し、クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）中に抽出 し、そしてエタノール沈殿させた。ＤＮＡベレットを０．２Ｍ　　ＮａＣ１、Ｔ Ｅ中に溶解させ、そしてＮＡＣＳカラム（ベセスダ、リサーチ・ラプス）上で、 ＤＮＡを１．０Ｍ　　ＮａＣ１、ＴＥ、１％カフェインで溶出させた以外は供給 者により推奨される条件下精製した。溶出液をエタノール沈殿させ、過剰の塩を 除去し、７５％エタノールおよび９５％エタノールで洗浄し、そして乾燥したＤ ＮＡベレットを殺菌ＨｔＯ中に溶解させた。ＤＮＡ試料を殺菌Ｈ，Ｏに対してミ リポアフィルタ−（＃ＶＭＷＰ　０１３００）で３０分間ミクロ透析した。試料 をフィルターから除去し、エッペンドルフ遠心機中で１５分間遠心分離し、そし て上層から２／３容量を集めた。ＤＮＡ試料の濃度はゲル電気泳動により臭化エ チジウム染色ＤＮＡ標準（λＤＮＡ／Ｈｉｎｄｌｌｌ断片）を用いて測定された 。最後に、７゜３ｍＭ　　ＰＩＰＢＳ　　ｐＨ７，４，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ 、５ｍＭ　　ＮａＣ１を含有するマイクロインジェクション緩衝液でＤＮＡを希 釈した。

マウス受精卵中へのマイクロインジェクション受精卵をＢ６ＳＪＬ　　Ｆ、のメ スの卵管から摘出し、そしてＤＮＡ　１−２　ｎ　ｇをマイクロインジェクショ ンした。このマイクロインジェクションした胚をＣＲＮＩＨ代理メスに移した。

マウスおよび卵の操作ならびにマイクロインジェクション技術はＨｏｇａｎ等、 　１９８６．　　ｒマウス胚の操作：実験マニュアル」　にューヨーク州コール ドスプリングハーバ−、コールドスプリングハーバ−研究所）により記載されて いるように行われた。

マウスゲノムＤＮＡの調製および分析 高分子量ゲノムＤＮＡを標準法により１−２■の尾部試料から単離した。Ｅｃｏ Ｒ［で消化したＤＮＡ試料２０μｇを１ＸＴＢＥＩｉｌｉ液中の１％アガロース 上で電気泳動し、そしてゲルからニトロセルロース紙ヘサザンの方法（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ、　１９７５．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１７） により移した。ＲＮＡを５ｈｅｎ等、　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　　２３２： ６４３−６４５に記載されたように１％アガロース／６％ホルムアルデヒドゲル 中で電気泳動した。全体のＲＮＡｌ０μｇを１列あたり注入した。リポソームＲ ＮＡが無傷のようにみえた試料だけを分析した。Ｍａｎｉａｔｉｓ等、　１９８ ２．　　ｒ分子クローニング：実験マニュアル」にューヨーク州コールドスプリ ングハーバ−、コールドスプリングハーバ−研究所）により記載されているよう にＲＮＡをニトロセルロース紙またはナイトランメンブレン（シュライヒヤー・ アンド・シュニル社）に移した。半定量分析のために、ＲＮＡ試料をＦｏｊｏ等 、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　 ８４：２６５−２６９により記載されているようにスロットプロット装置を用い ることによりフィルターに適用した。

ハイブリダイゼーションはＤＮＡハイブリダイゼーション用に記載されるように 行われた。ノーザンおよびスロットプロットフィルターを０．２ＸＳＳＣ，０， １％ＳＤＳ中５０℃中低０縮）またはＯ，ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中７０℃ （高緊縮）でテキストに示されたように洗浄した。

接領域から得られ、そして全メツセージのほぼ８５％に及ぶ。模式的なｃＤＮＡ 地図は図７Ａに示されている。

プローブ１０．１．６ｋｂ断片はｐＭＤＲＩＯのＥｃｏＲＩ消化により得られた ニブロープ５Ａ、１．４ｋｂ断片はｐＭＤＲ５ＡのＥｃｏＲＩ消化により得られ た；そしてプローブＰＶＵ２＃６はｐＭＤＲ２０００（Ｕｅｄａ等、　１９８７ ゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８４：３００４ −３００８）のＰＶＵＩＩ消化からの０．８４ｋｂ断片を精製することにより得 られた。

免疫蛍光局在 骨髄細胞をスライドガラス上に筒布し、風乾し、次いでリン酸緩衝液中の３．７ ％ホルムアルデヒドで２３℃５分間固定した。対照またはトランスジェニックマ ウスからのスライドを次にマウスモノクローナル抗体ＭＲＫ１６と保温し、次い でローダミン−結合アフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧと保温した（　Ｗｉ 　１１　ｉｎｇｈａｍ等、１９８７、　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏ ｃｈｅｍ、　３５：１４５１−１４５６）。

結果 でＭＤＲ１ｃＤＮＡの５゛側に挿入した（図ＩＡ）、生ロモーターｓ　ｓ　ｏｂ ｐそれに続いて−１４０（Ｓａｃ１部位）から＋４２４０　（ＢｃｏＲ１部位） までのＭＤＲ１ｃＤＮＡ４３８　ｏｂｐを含む。４６９０断片をＸｈｏ　Ｉで切 断し、そしてマイクロインジェクション試験のために使用した。

この断片は、旦−アクチンプロモーターの結合部中のｐＧＥＭ２からの多数のク ローニング部位の領域２４ｂｐ−の５°末端のｓ　Ｏｂｐはマイクロインジェク ションされた断片中に存在しない。旦−アクチンプロモーターの残りの２７０ｂ ｐはコンセンサスＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックスを含むけれども、この先端切 断断片がＭＤＲｌを発現するかどうかは知られていなかった。従って、この先端 切断プロモーターから下流にＭＤＲ１ｃＤＮＡを含むがその他の点では同一であ る発現ベクター（１−ＢＡＰ−ＭＤＲ）がＭＤＲＩの発現を試験するために構築 された。

トランスフェクション試験 Ｂ−アクチンプロモーターの制御下、ならびに先端切断旦−アクチンプロモータ ーの作用下でのＭＤＲＩの発現レベルを試験するために、発現プラスミドｐＨ０ １およびｐＨ０２を薬剤感受性ＫＢ−３−１細胞内に安定にトランスフェクショ ンさせた（表１）。ｐ　Ｈａ　Ｍ　Ｄ　Ｒ。

２個のＨａ−ＭＳＶ　　ＬＴＲを含むレトロウィルス発現ベクターを陽性対照と して使用した。陰性対照のために細胞をＤＮＡの不在下で同様のトランスフェク ションプロトコルにより処理した。同様の陰性の結果がＭＤＲＩ配列のないベク ターＤＮＡを用いるトランスフェクシヨンの後にも得られた（データは示してい ない）。

ＫＢ−３−１細胞の皿（ＩＸＩＯ’細胞／　１０　ａｎ皿）をリン酸カルシウム 沈殿法によりｐＨＧ１　ｐＨ０２またはｐＨａＭＤＲのいずれか１０μｇでトラ ンスフェクションさせ、そして種々の濃度のコルヒチン（親のＫＢ−３−１細胞 に対するコルヒチンのＬＤｓ、の３−５倍高い５５−８ｎ／ｍｌ）で１２日間選 択された。表１にまとめた試験は５１　ｇ／ｍ　１コルヒチンでの耐性コロニー の数においてｐ一旦ＡＰ−ＭＤＲおよびｐＨａＭＤＲに対して同等の結果を示す 。しかしながら、平均コロニーの大きさはｐ−ＢＡＰ−ＭＤＲ）ランスフェクシ ョン体に対する方がｐＨａＭＤＲ）ランスフエクション体に対するより小さかっ た。この大きさの違いならびにコルヒチンの高い濃度でのコロニー数の違いは、 ＫＢ細胞中で唆する。しかしながら、先端切断旦−アクチンプロモーター（を一 旦ＡＰ−ＭＤＲ）の制御下でのＭＤＲ１の発現は全長の旦−アクチンプロモータ ーの制御下でのＭＤＲｌの発現に匹敵するか、またはより高い。

マウス細胞中で旦−アクチンーＭＤＲＩ発現ベクターが機能することを確認する ために、これらのベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞中に導入し、そして親のＮＩＨ３ Ｔ３細胞とトランスフェクション体の６０ｎｇ／ｍｌコルヒチン（親細胞に対す るコルヒチンのＬＤ、。の３−５倍高い）でのコロニー形成能を測定した。この 試験において（データは示していない）、コルヒチンの存在下での同様な相対的 コロニー形成能が全長または先端切断アクチンプロモーター構築物でのＮＩＨ３ Ｔｌ）ランスフェクション体に対して得られ、それ故に、先端切断旦−アクチン プロモーターはトランスジェニックマウスにおいてＭＤＲ１ｃＤＮＡを発現させ るために適当なプロモーターであることが結論された。

片（図ＩＡ）をＢ６ＳＪＬ　（Ｆｌ）受精卵内にマイクロインジェクションして ＭＤＲＩ）ランスジェニックマウスを産ませた。ＥｃｏＲＩで消化した尾部ゲノ ムＤＮＡのサザンプロット分析によりマウスをスクリーニングした。

プロットを５Ａプローブ（図２Ａ）とハイブリダイゼーションさせた。図２Ｂは 何匹かのマウスの尾部ＤＮＡのサザンプロット分析を示し、ＭＤＲｌｃＤＮＡか らの予測された単一の３．１ｋｂ内部断片、ならびに低緊縮条外下（列１−５） で検出されるが高緊縮条件下（列６−１０）で検出されないマウス内因性断片が 見られた。各プロット分析のために、全長の４．７ｋｂ注入断片を希釈し、陰性 マウスゲノムＤＮＡと混合し、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてゲノムＤＮＡの完全 ［！ｃｏＲＩ消化に対する内部対照としてゲルに注入した。この試料もまた、大 きさを示し、ならびに各トランスジェニックマウスにおけるＭＤＲＩコピー数を 見積もるための標準として使用された（列２，７）。ヒトＫＢ−３−１ゲノムＤ ＮＡのＥｃｏＲＩ消化もまた見積もられたＭＤＲＩコピー数を確認するために用 いられた（列１，６）。ＭＤＲＩ陽性マウスからのＤＮ人試料はまた、スロット プロット分析により分析され、各トランスジェニックマウスにおけるＭＤＲＩの コピー数を確認した。

本試験において、組み込まれたヒトＭＤＲＩ配列を含む５匹の創始マウスが産ま れた（図３）：マウス３９（メス）は少ないコピー数（１−３コピー）を有して いた；マウス１３２（メス）は１００−２００コピーのＭＤＲＩを含んでいた； マウス１６８（オス）は約５０コピーの組み込まれたＤＮＡを持っていた；マウ ス９３（オス、多いコピー数）はサザン分析において付加的なＭＤＲＩ断片を示 しく再配置ＤＮＡ配列または宿主ＤＮＡを存する結合断片を多分示す）、離乳後 まもなく死んだ；マウス１０４（メス、約１０コピー）は最初の自分のお腹の子 供を殺し、そして２回目の妊娠中に死んだ。

後代へのＭＤＲＩの伝達 残っている３匹のトランスジェニック創始マウス（Ｍｇ２、Ｍ２Ｂ５およびＭ１ ６Ｂ）の各々を通常のマウスと交配し、そしてそれらの後代からの尾部ゲノムＤ ＮＡ試料はＭＤＲ１配列の存在を求めてサザンブロットハイブリダイゼーシジン ならびにスロットプロットハイブリダイゼーションにより分析された。２匹の創 始マウス（Ｍｇ２およびＭ２Ｂ５）は予想どおりに、組み込まれたＭＤＲＩ配列 を生殖系列を介して約５０％の後代に伝達した。得られたＤＮＡ配列の数または 構造に大きな変化はＦｌおよびＦ１世代に検出されなかった（図４．データは示 していない）。第３の創始（Ｍ１６８）におけるいることを示した。それ故に、 この第３の創始マウスはおそらくモザイクであったと結論された。

ＭＤＲＩ）ランスジェニックマウスにおける発現試験創始マウスＭ３９（低コピ ー数）およびその陽性後代を通常のマウスと交配させてＭＤＲ−３９と命名され るＭＤＲｌヘテロ接合性マウス系を生産した。この系はＲＮＡ発現試験用に選択 された。全体のＲＮＡは７匹のＦ。

トランスジェニックマウス（図５の系図参照）ならびに１０匹の陰性同腹マウス の１８の異なる組織（脳、肝臓、腎臓、肺臓、心臓、肺臓、胃、小腸、結腸、皮 膚、尾、骨、骨髄、骨格筋、卵巣、子宮、輸卵管および精巣）から調製された。

これらのＲＮＡ試料はＭＤＲ１プローブとのスロットプロットハイブリダイゼー ションにより分析された（図６および７）。全てのプロットを正確なＲＮＡ注入 およびフィルター移送のための標準対照としてＢ−アクチンプローブと交差ノ１ イブリダイゼーションさせた（図６．データは示していない）。公知の試料が公 知のＭＤＲＩ　ＲＮＡ含量および公知の多薬剤耐性の試料と直接比較され得るよ うに、各実験において高められたレベルのＭＤＲｌｍＲＮＡを発現する多薬剤耐 性ＫＢ細胞系からの全体のＲＮＡは含まれていた。薬剤耐性ＫＢ−３−１に比較 して、多薬剤耐性のサプラインＫＢ−８−５はＭＤＲｌｍＲＮＡにおいて４０倍 の増加を有し、そしてＫＢ−Ｖ−１（Ｖｂ　１）　は５００倍以上の増加を有し ている。図６にまとめられたこれらの実験は、ヒトていることを示す。低い発現 はまた骨格筋および卵巣においても検出されたが（図７Ｂ）、精巣には検出され なかった（データは示していない）。同じプロットを、あわせてＭＤＲｌｃＤＮ Ａの約８５％に及ぶ異なる３種の隣接するＭＤＲ１プローブ（１０，５Ａおよび ＰＶＵ　１１＃６）と交差ハイブリダイゼーションさせた。５′プローブ（プロ ーブ１０）に対してその他に対するより顕著にハイブリダイゼーションした骨格 筋を除いて、全ての陽性組織は全ての３種のプローブと同様の結果を示した（図 ７Ｂ）。これらの結果はヒトＭＤＲＩ　ＲＮＡを発現する骨格筋を除く全ての組 織において、全体のＭＤＲｌｍＲＮＡが発現されたことを示す。ノーザンプロッ ト分析（データは示していない）は４．５ｋｂ　（発現された全長のＭＤＲＩメ ツセージ）からほぼ１ｌｋｂに及ぶ不明確なメツセージサイズを示した。これら の結果は、ＭＤＲ１ｃＤＮＡの３″末端にある内因性ポリアデニル化シグナルが トランスジェニックマウスに弱く作用したことを示す。

試験された７匹のＭＤＲ−３９マウスのうち、６匹は骨髄において顕著な発現を 示し、肺臓においていくぶん低い発現を示した。しかしながら、１匹のマウスは 肺臓において発現を示したが、骨髄においては示さなかった。

１匹のオスのマウスは、骨格筋ならびに骨髄および肺臓における高いシグナルに 加えて腎臓および肝臓においていくらか発現を示した。いくらかの発現はトラン スジェニックメスの卵巣において検出されたが子宮および輸卵管では検出されず 、精巣での発現は検出されなかった。

免疫蛍光により検出されるＰ−糖タンパク質の発現対照同腹マウスから誘導され た骨髄と比較した場合に、ヒトＰ−糖タンパク質（ＭＲＫ−１６）に対するマウ スモノクローナル抗体との免疫蛍光は２匹のＭＤＲＩ陽性マウスマウ多くの異な る骨髄細胞内のヒトＰ−糖タンパク質の表面発現を示した（図８）。このことは 、ローダミン結合抗−マウスＩｇＧを用いる塗布において検出されたバックグラ ンドマウス血漿１ｇＧが存在するにもかかわらず、図８に明らかに見ることがで きた。

要するに、ここに示された結果はへテロ性プロモーターの制御下にヒトＭＤＲ１ ｃＤＮＡを有し発現するトランスジェニックマウスの作出の成功を明らかに示す 。上れ自体構造プロモーターであるように見え、そして該プロモーターの３′の 領域およびＢ−アクチン遺伝子自体のポリアデニル化シグナルの５′に位置する 小さい領域による下降制御のみである。これらの阻害領域のいずれも本発明の構 造体に包含されなかった。クローン化細菌クロラムフェニコールアセチルトラン スフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含む発現ベクターの広範囲の細胞タイプ中への ＤＮＡ介在移送の比較研究は、旦−アクチンプロモーター活性がＳＶ４０初期プ ロモーター（Ｇｕｎｎｉｎｇ等。

１９８７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８４： ４８３１−４８３５）と同等かまたはより強いことを示した。旦−アクチンは培 養液中の全ての細胞中に豊富に発現されるから、旦−アクチンプロモーターの制 御下にＭＤＲＩ配列を含むトランス遺伝子は広範囲の細胞タイプにおいて高レベ ルに発現し、そしてそれ故に薬剤耐性を付与し得ると考えられた。この予想を試 験するために、まず、旦−アクチンＭＤＲＩ発現ベクター（ｐＨ０１）が細胞培 養液中で薬剤耐性表現型を付与する能力が試験され、そして実際に顕著な後天性 多薬剤耐性が見られた。

原核ベクター配列の存在はトランスジェニックマウスにおけるある種の遺伝子の 適当な発現に対して高度に阻害性であることが示されていた。さらに、原核ベク ター配列に隣接してトランス遺伝子を有するマウスにおいて、染色体異常例えば 組み込みおよび挿入突然変異原の部位での局在不安定性が観察される。本発明に 係る前核注入ＤＮＡにおいてベクター配列を切除するために、ｐＨＧ１のＸｈｏ ｌ断片を単離した。この戦略はまた、Ｂ−アクチンプロモーターの５゛領域にお ける６　ｏｂｐを切除した。

ターのｓ　Ｏｂｐ上流を欠くプラスミド（ｐＨ０２）を構築し、そして培養液中 のヒトおよびマウス細胞にトランスフェクションさせた。これらの研究により、 先端切断Ｂ−アクチンプロモーターの活性は培養細胞中の全長プロモーターと同 等かより高いことが確立された。従って、とが見出された。

作出されたＭＤＲＩ創始マウスおよびそれらの後代系から、１系（ＭＤＲ−３９ ）が発現試験のために選択された。この創始および１００匹以上の子孫マウスか らのゲノムＤＮＡの制限断片パターン分析（図５．データは示されていない）は 、１−３コピーの注入断片がマウスＤＮＡ内に組み込まれたことを示す。また、 内部再配置、欠失および重複は検出されなかった。系図分析によりトランス遺伝 子は＝（ａ）生殖系列により伝達され；ら）トランス遺伝子はへテロ接合性およ び通常マウスの交配からの後代の約５０％により安定に遺伝されるから１本の染 色体内に組み込まれており；そして（Ｃ）トランス遺伝子のオスからオスへおよ びメスからメスへの伝達が生じるから、常染色体で遺伝され、Ｘ−またはｙ一連 鎖がないことが示された。

外来ＤＮＡ配列の細胞ゲノムへの挿入は内因性遺伝子または対照エレメントの作 用を破壊することにより突然変異的変化を引起し得ることが知られている。トラ ンスジェニックマウスにおけるほとんどの挿入突然変異は劣性であるが、ヘテロ 接合性マウス間での交配のほとんどにおいて、それらの胚致死表現型は顕著に減 少した１腹の子数およびホモ接合性マウスを産む能力の欠如により示されている 。ＭＤＲ−３９の後代のホモ接合性交配は通常の１腹の子数を示し、そして表現 型の通常ホモ接合体は産まれるから（データは示していない）、このマウス系に おいて内因性ハウスキーピング遺伝子または対照遺伝子の挿入突然変異がトラン ス遺伝子の組み込みの間に起こらないと結論づけられた。

ＭＤＲ−３９ｈランスジエニツクマウスのＲＮＡ試験は、トランス遺伝子が造血 組織例えば骨髄および膵臓において主として発現されることを示した。低発現は 骨格筋および卵巣において検出される。しかしながら、表現型の変化および形態 的変化ならびに機能的または行動的混乱は調べられたトランスジェニックマウス には検出されなかった。

ヒト特異的３５塩基合成オリゴヌクレオチド（高緊縮条件下でマウスｍｄｒ配列 に交差ハイブリダイゼーションしない）　　（Ｕｅｄａ等、　１９８７．　Ｊ、 　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：５０５−５０８）を有するトランス遺伝子 を発現する組織から検出さに予測されるように、単一の約１９２塩基の伸長物を 生じた。これらの結果は、組み込み部位に隣接するマウス内因性プロモーター制 御下よりむしろ旦−アクチンプロモーターの制御下にある単一の主要なトランス 遺伝子の転写開始部位を示唆する。

ＭＤＲ−３９）ランスジェニックマウスの骨髄におけるＲＮＡ発現の定量測定は ＭＤＲＩの比較的高い発現を示した。発現レベルはＫＢ−８−５薬剤耐性細胞に おけるＭＤＲｌｍＲＮＡの発現レベルに匹敵するか、またはいくつかのマウスに おいては３倍まで高い。これらのレベル（薬剤感受性細胞における基本的な発現 レベルに比べ４０ないし１２０倍高い）は、多薬剤耐性ヒト腫瘍におけ６ＭＤＲ ＩＲＮＡレベルと少なくとも同程度に高い。

合本発明は、骨髄細胞中にヒトＭＤＲＩ遺伝子を発現の骨髄に毒性である化学療 法の投与に耐性であることを可能にする。例えば、化学療法剤ダウノマイシンの 腹膜腔内投与は、そのように処置された大多数のマウスに処置２−３週間後骨髄 抑圧および死を招く。これに対し、本発明のトランスジェニックマウスは通常の マウスに対して致死的である化学療法剤の投与に耐性である。従って、ＭＤＲＩ トランスジェニックマウスにおいて腫瘍を確立することにより（移植もしくはマ ウスが当該腫瘍を形成しやすくする遺伝子変更の導入により、またはその他の適 当な方法論により）、単一の薬剤または薬剤の組合せを含む可能性のある調剤の 許容性の範囲が決定され得る。

本発明のトランスジェニックマウスはまた、種々の目的のためにＭＤＲ−３９お よびその他のＭＤＲＩトランスジェニックマウスの適用性を改良するような遺伝 子掃作を可能にする。これらの操作はＭＤＲＩ遺伝子座にホモ接合性のマウスを 作出するため、および腫瘍異種移植研究のためのマウスの十分な近文系を作出す るためのＭＤＲＩマウスの交配を包含する。さらに、ＭＤＲ１マウスをヌード免 疫不全マウスと交配することにより、依然多薬剤耐性でありヒト腫瘍を受は入れ る動物が得られる。

このことは、抗腫瘍剤または抗ガン剤の許容性範囲および効果の試験を可能にす る。

クローン化ＭＤＲＩのその他の用途はヒトおよび動物の骨髄およびその他の組織 中に連鎖遺伝子を導入する有力な選択可能マーカーとしてである。ＭＤＲ１マウ スはるために必要とされそして受容宿主内に導入される薬剤（例えばダウノマイ シン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＶＰ−１６、ＶＭ−２６、アドリアマ イシンＤ。

アドリアマイシン等）の投与量の決定を可能にする。これは、ＭＤＲ１遺伝子を 発現する骨髄およびその他の組織に対するこれらのおよびその他の化学療法剤の 許容投与量を決定するためにＭＤＲ１マウスを用いることにより行われる。もち ろん、そのような研究は選択可能なマーカーとしてＭＤＲＩ遺伝子を用いる有効 な遺伝子治療摂生の開発の前に必要とされる。

ＭＤＲＩ）ランスジェニックマウスはまた、この遺伝子によりコード化された多 薬剤輸送体の役割の研究を可能にする。この遺伝子が通常発現されない組織にお ける比較的高いレベルでのＭＤＲＩ遺伝子の発現は、種々の組織上での輸送体の 生理学的効果の決定を可能にする。

さらに、ＭＤＲＩ）ランスジェニック動物はヒトＭＤＲ１遺伝子を発現する種々 の細胞および組織のドナーとして作用し得る。これらの細胞は培養液中に確立さ れ得るか、または動物移植実験における多薬剤耐性組織の源として使用され得る 。

本明細書に記載された実施例および実施態様は説明のためだけのものであり、そ して本明細書の記載から種々の変形または変更は当業者には考えられ得るもので あり、それらは本願の精神および範囲ならびに添付された請求の範囲内に包含さ れるべきものであることが理解される。

表１　薬剤耐性コロニーの頻度 口＝＝コ　ＭＤＲｌ 口　　　　　　　　　　Ｂ　７りｔｔＤミー？−５脣ｔｓ　７Ｄ　ＣＡＴ　　１ ６’Ｌ ■　　　　　　　　　　　　　Ｔ７　アξ−７−ロ　　　　ＳＰ６γＤミー？− ８、　　１　　２３４５　　６　　７８９１０補正書の翻訳文提出書（特許法第 １８４条の８）平成３年４月２２日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４６８６ Ｚ発明の名称 多薬剤耐性を試験するためのトランスジェニック動物３、特許出願人 名称　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　東京都千代田区神田駿河台１の６お茶の水スクエアＢ館 氏名　（６８６１）　　萼　経夫（ほか１名）請求の範囲 １、トランスジェニック哺乳類動物の生殖細胞および体エニツク哺乳類動物。

２、ヒト址旦旦１遺伝子の転写が先端切断旦−アクチンプロモーターの制御下に ある請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物。

３、先端切断旦−アクチンプロモーターが全長足−アクチンプロモーターの５° 領域から約ｅ　ｏｔ＝影伜欠いている請求項２記載の非ヒトトランスジェニック 哺乳類動物。

４、哺乳類動物が蓄歯類動物である請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺 乳類動物。

５、Ｗ歯頚動物がマウスである請求項２記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類 動物。

６、（ａ）　　請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物に腫瘍を移 植または導入し、 （′ｂ）段階（ａ）の複数の群の哺乳類動物に、各群の哺乳類動物に増加する量 で、化学療法剤を単独または組合せて投与し、 （Ｃ）　　非許容性の副作用なしに腫瘍の成長または増殖を防ぐ化学療法剤の投 与量を決定する、ことからなる腫瘍に対する高投与量の化学療法を試験す長する 該化学療法剤の最大許容性投与量を決定し、そして （ｂ）　　多薬剤耐性体細胞が宿主哺乳類動物中に導入される後に、その中にＭ ＤＲＩ遺伝子が組み込まれた多薬剤耐性体細胞を、前記最大許容性投与量を使用 することにより選択する、 ことからなるＭＤＲ１遺伝子が選択可能なマーカーとして使用される遺伝子移送 プロトコルの有効性を試験する方法。

８、Ｔａ）　　化学療法剤の存在下でＭＤＲＩ発現細胞が成長する該化学療法剤 の最大許容性投与量を決定し、（＋４（ｂ）　　請求項１記載のトランスジェニ ック哺乳類動物の多薬剤耐性体細胞を、前記最大許容性投与量を使用することに より選択する、 て使用される遺伝子移送プロトコルの有効性を試験する方法。

９、請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類動物から得られるヒト鼠旦 旦１遺伝子を発現する細胞または組織。

国際調査報告 ＰＣＴ／！；Ｓｅｉ’＋／ｕ４６ａｃ＋ｔｒａｒ＋ｓｇｅｎｉｃ、　ａｃｔｉｎ 、　ＭＤｔｌｌ＋　ｂｅｔａ、　ｃｈｉｅｇａｎ、　ａｎｉｚａｌ、　５ｅｒｅ ｅｎｉｒ＋ｇ。

ｄｒｕｇｓ、　ｔｕｇ口ｒ、ｓ、　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、　ｒｅｖｉ嗜ｄ、　 １ｎｖｅｎｔｏｒｓ’　ｈａ＋ｎｅａ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＭＤＲ１遺伝子を有し、そして発現するトランスジェニック動物。
2. ２．マウスである請求項１記載の動物。
3. ３．（ａ）請求項１記載のトランスジェニック動物に腫瘍を移植または導入し、 （ｂ）段階（８）の複数の群の動物に、各群の動物に増加する量で、化学療法剤 を単独または組合せて投与し、（ｃ）非許容性の副作用なしに腫瘍の成長または 増殖を防ぐ化学療法剤の投与量を決定する、ことからなる腫瘍に対する高投与量 の化学療法を試験する方法。
4. ４．（ａ）化学療法剤の存在下でＭＤＲ１発現性細胞が成長する該化学療法剤の 最大許容性投与量を決定し、（ｂ）多薬剤耐性体細胞が宿主動物中に導入される 後に、その中にＭＤＲ１遺伝子が組み込まれた多薬剤耐性体細胞を、前記最大許 容性投与量を使用することにより選択する、 ことからなるＭＤＲ１遺伝子が選択可能なマーカーとして使用される遺伝子移送 プロトコルの有効性を試験する方法。
5. ５．請求項１記載の動物から得られるヒトＭＤＲ１遺伝子を発現する細胞または 組織。