JPH03504645A - 架橋抗体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 架橋抗体およびその製造方法 発明の分野 本発明は、架橋抗体、それを含有する組底物、その製造方法、ならびにその医薬 としておよび診断のための使用に関する。

発明の背景 抗体がレポーターまたはエフェクター基に共有結合で結合している抗体接合体は 、診断に、また限られた範囲ではあるが治療に使用されてきた。抗体は一般的に 、特定の標的抗原に対するその親和性および特異性に基づいて選択され、使用時 にはそれは所望の部位へレポーター１だはエフェクター基を送達し、そこにある 時間維持できるものでなければならない。

二重特異性異種二量体抗体としては？ａｂ’フ２グメントがチオエーテル結合を 介して連結しているものがすでに記載されている（　Ｑ／１ｌｉｎｎｉθ、　Ｍ 、　Ｊ、ら：Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．　。

１３９：２３６７．１９８７）。また、フルオレセイン誘導体、タラペセインが ジスルフィド結合で連結している抗体も記載されている（　ｐａｃｋａｒｄ、　 Ｂ、　Ｐ、ら：ＢｉＯＣｂＪｍｉｇｔｒ７．２５　：　５５４８．１９８６　） 。

本発明者らは、抗原結合ドメインから離れた架橋結合において抗体の少なくとも ２つの鎖を架橋することによって、修飾抗体の結合能力を非修飾抗体に比べて有 利に増大できることｔ明らかにした。２においては、この型の修飾抗体はまた、 良好な血液クリアランスン有し、腫瘍が存在する場合には有利な高い膿瘍：血液 および腫瘍：骨比を与える。このような抗体は、レセプターまたはエフェクター 基で標識した場合、慣用の標識抗体に優る利点を提供する可能性がある。

３」しλ二μ− すなわち、本発明は、その−態様によれば、少なくとも１個の非ジスルフィド分 子開鎖架橋を有し、その架橋は抗体の抗原結合ドメインの外部に位置する１個ま たは２個以上の架橋部位で６鎖に結合している標識抗体からなる架橋抗体接合体 を提供する。

本発明の抗体接合体においては、分子開鎖架橋は、抗体分子内の任意の重鎮また は軽鎖ｔ、同一分子内の１個または２個以上の他の重鎖および／または軽鎖に連 結する。しかしながら、好ましくは、架橋は２個の鎖とくに２個の重鎮を連結す る。このような１個の架橋χもつ接合体が好ましいが、２個以上の分子間鎖基が 存在してもよい。

非ジスルフィド分子開鎖架橋の語は、抗体に通常見出される型のＳ−Ｓ架橋は排 除すること？意図するものである。

各抗体鎖中の架橋部位は一般に、その鎖のアミノ酸残基形底部分であるが抗原結 合ドメインには直接関与しない側鎖に存在する。適当なアミノ酸には、アミノ、 スルフヒドリル、カルボキシル、フェノールまたは他の芳香性もしくは異項環芳 香性官能基？含む側鎖ｔもつアミノ酸が包含される。その官能基によって分子開 鎖架橋が連結される。これらの型の特定のアミノ酸残基としては、リジン、シス ティン、グルタミン酸、アスパライン酸およびチロシン残基を挙げることができ る。別法として、架橋部位は、抗体に結合した炭水化物残基、とくに分子開鎖架 橋が連結できる少なくとも１個のアルデヒド基を含有する酸化炭水化物残基にあ ってもよい。

とくに好ましい架橋部位は、システィン残基のスルフヒドリル基、たとえば通常 分子間ジスルフィド橋として機能する部位である。この型の好ましい部位として は、抗体の蝶番領域における重鎖に存在するシスティン残基のスルフヒドリル基 がある。

他の好ましい架橋部位シエ、正常な免疫グロブリンには存在しないが、以下に記 載するような組換えＤＮＡ技術の使用によって導入されたアミノ酸残基の＠鎖に あってもよい。このような部位［はシスティンおよびリジン残基のそれぞれスル フヒドリル基およびアミノ基が包含される。

本発明の接合体中の分子開鎖架橋は一般的には所望の任意の長さまたは組成とす ることができる。適当な架橋には、ホモまたはへテロ官能性架橋試薬の残基、と くにホモまたはへテロ官能性架橋試薬の残基が包含される。すなわち、架橋は、 ２ｍまたはそれ以上の架橋部位を連結するものである。特定の架橋として＆二任 意に置換された多価、とくに２価の、脂肪族、芳香族または芳香族脂肪族化合物 ラジカルが包含される。

分子開鎖架橋は、たとえば、次の構造をとることができる。

（−ｘｌ−）、−ｙｌ−２２−［−ｘ２］。

式中、ｘｌおよびｘ２はそれぞれ反応性官能基の残基であり、ＹｌおよびＹ２は 両者で架橋の残部を形匡し、ｍおよびｎは互いに同じまたは異なる数で１または それ以上の整数である。

上述の特定の型の架橋においては　ｙｌおよびＹ２は両者で、直鎖状または分岐 状の０１〜２ｏアルキレン（たとえば０４〜１０アルキレンのようなＣ１〜１０ アルキレ／、たとえばゾチシン、ペンチン／、ヘキシレ／またへゾチシン）、０ ２〜２ｏアルケニレンまた・工Ｃ２〜２゜アルキニレ／であり、所望によって１ 個または２個以上の−Ｏ−またＧＷ−８一原子が中間に挿入されていてもよい。

また、Ｃ５〜８シクａアルキレン（たとえばシクΩペンチシンまたはシクロヘキ シレン）、Ｃ６〜１２芳香族（たとえばフェニレンまたシスｆｆ１ｌ＊フエニレ ン）ｓＣｓ〜１０　異項Ｎ　芳香族（たとえばフラニル、ビリゾル）、−阻Ｒ１ ）−（式中Ｒ１，は水素原子またはＣ１〜６アルキル基である）、−（！０Ｎ（ Ｒ１）またＧＸ−Ｎ（Ｒ１）Ｃｏ−基であってもよい。

一般的に、ｘｌまたはｘ２で表される反応性官能基の残基には、チオール、アミ ノ、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、芳香族または異項環芳香族基と 反応できる任意の基の残基が包含される。すなわち、ｘｌまたｈｓ　Ｘ２Ｇ！、 たとえば、−（ｉｎ２−、−８−、−ＮＨ−。

−ＮＨＮ＝、　−Ｎ（ＣＨ３）Ｎ＝　、　−ＮＨＣＯＮＨＮ冨、　−ＮＨＣ８Ｎ ＨＮ＝。

−）Ｊ（Ｐｈ）Ｎ＝　（式中Ｐｈはフェニルである）、−Ｎｃ（ｏ）−。

Ｈｅｔ”および１（８ｔＪ＄互いに同種でも異種でもよく、それぞれ窒素含有異 項環基たとえばピリゾル基であるか、または！（ｅｔｌは窒素含有異項環基、Ｈ ｅｔ２は水素原子でたとえばメチル基である］である。

架橋が分岐している場合には、反応性官能基は各分岐に供給され、架橋が２８以 上の架橋部位を介して６鎖への架橋の結合ン可能にすることが望フしい。

本発明の接合体におけるｅｉ識抗体分子の語は、エフェクター基のレポーターが 結合する抗体分子を意味するものである。

レポーター基は、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ　ＶｉＶＯにおいて分析 手段により容易に検出できて、この性質！接合体に付与する、任意の基または化 合物を意味するものと理解すべきである。エフェクター基は、生体系の変化また は生体系からの応答を誘導できて、この性！ｘｔ本発明の接合体ＩＣも付与する 、任意の基または化合物乞意味するものと理解すべきである。

適当なレポーターまたはエフェクター分子には、放射性核種たとえば１２５工お よび１３１工；キレート金属；螢光化合物またはＮＭＲもしくはＥＢＲスペクト ルによって検出できる化合物；細胞毒性化合物およびトキシン、たとえばリシン およびその７ラグメ／トヲ含む薬理学的性質、酵素；ならびにホルモンが包含さ れる。

キレート金属には、２から８までの配位数Ｙ：有する２筐だに３価の陽性金属の キレートが包含される。このような金属の特定の例としては、テクネチウムｔＴ ｃ）＊レニウＡ　（Ｒｅ入コバルト（Ｃｏ　）、銅（Ｃｕ　）、金（Ａｕ　）、 銀（Ａｇ　）、鉛（Ｐｔ＋）、　Ｗスマス（Ｂｉ　）、インゾ’ｙ　ム（Ｉｎ） 、ガリウム（Ｑａ）、イツトリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｋ）、ガドリニウム （Ｇｄ）およびスカンジウム（Ｓ（り　Ｙ挙げることができる。一般的には、金 ＦＡは放射性核種であることが好ましい。特定の放射性核種としては、９９ｍ７ Ｃ・Ｒｇ、　　　　　Ｒｇ、　　　　Ｃｏ、　　　　Ｃｏ、　　　　Ｏｕ、　　 　　　Ａｕ、　　　　　Ａｕ。

Ａｇ＠　　　　　Ａｇ、　　　　　Ｐｂ、　　　　　Ｒ４，Ｂｉ、　　　　　Ｉ ｎ、　　　　Ｇａ。

６１ＢＧａ、　Ｂａｙ、　９０ｙ、　１６０Ｔｂ、　１１３Ｇｄおよび番’ＢＣ ’ｔ’挙げることができる。

キレート金ｌＩは、たとえば非環式または環式ポリアミン、ポリエーテル（たと えばクラウンエーテルおよびその誘導体）、ポリアミド、ポルフィリン、および カルボンＨＲ導体のような任意の適当な多座キレート剤とキレートした上述の種 類の金属の１種ン例として挙げることができる。

一般に、キレート剤のＳ類は、使用される金ｍによって決定される。しかしなが ら、本発明の接合体のキレート剤としてとくに有用なキレート剤詳（工、非環式 および環式ポリアミン、とくにポリアミノカルボン酸、たとえばジエチレントリ アミンペンタ酢酸およびその誘導体、および大環式アミンたとえば環状トリアゾ およびテトラアゾ誘導体：ならびにポリアミドと（にデスフエリキソアミ／ｇよ びその誘導体である。

特定の大環式アミンの例には、式＋１１（式中、Ｌは反応性の基であり、Ｂは置 換されていてもよい１個または２個の置換窒素原子を中間にはさんでいる０２〜 １４アルキレン鎖であり、ＷｌおよびＷ２ハ互いに同種でも異種でもよく、それ ぞれ置換されていてもよい窒素原子であり、ｐは０または整数１であり、ｑは０ ゛または整数１もしくは２であるが、ｐが０の場合にはｑは整数１″ｔたは２で ある）で表される化合物が包含される。基りは本発明の接合体における大環式化 合物に結合点を与えるものである。

式１１）の好ましいアミンには、式（２）〔式中、基りはすでに定義したとおり で　ｙｌおよびＷ”　ｔＸ互いに同種でも異種でもよく、それぞれ基−Ｎ［：（ （！Ｈｚ）ｒＲ１］−Ｃ式中、ｒは０または整数１〜６であり　Ｒ１はアルキル 、アルフキジアルキル、〜ｃｏ２民−８０３Ｈ，−ｐｏ３ｕ２またはアリール基 である）であり、Ｂは基−ＣＥＩｚ（ＣＨａ）６Ｎ（Ｒ）（ＣＨｚ）１；ＣＨ２ −Ｃ式中、８およびｔは互いに同じ数でも異なる数でもよく、それぞれ０または 整数１．２もしくは６であり、Ｒは−（ＯＨ２）ｒＲｌであり、ｒおよびＲ１は すでに定義したとおりである〕で表されるトリアゾ誘導体、および式（３）〔式 中、基りはすでに定義したとおりであり、ＷよおよびＷ２は同種でも異種でもよ く、それぞれ基””（ＣＨｇＪｒＲ”ｌ−（すでに定義したとおりである］であ り、Ｂ　＆Ｘ基−〇Ｈ２（ＣＨ２）ｓＮ−（Ｒ）Ｃ：Ｒ２（ＣＨ２）６Ｎ（Ｒ） （ＣＨ２）ｔＯＨ２−（式中ｄは０また（工整数１．２もしくを工３であり、８ ゜ｔおよびＲはすでに定義したとおりである）である〕で表されるテトラアゾ誘 導体が包含される。

式（２）のとくに有用なアミンは、式（４）で表される化合物である。

式（３）のとくに有用なアミンは、式（５）で表される化合物である。

本発明の接合体における好ましいキレート金属には、式（２）の化合物とくに式 （４）の化合物とキレートしたインジウム、または式（３）の化合物とくに式＋ ５３の化合物とキレートしたイツトリウムが包含される。ｌユユエｎおよび９０ ｙがとくに好ましい。

レポーターおよびエフェクター基は、抗体に［接（たとえばヨウ素のような放射 性核種の場合ンまたは反応性官能基たとえば上述の基ｘｌｖ介して間接的に結合 させることができる。

本発明の接合体における抗体は、一般に、どの免疫グロブリンクラスに属するも のであってもよい。すなわち、それはたとえば、免疫グロブＩ）７Ｎ抗体でもよ く、１だとくに、イソタイノエｇＧｉ　、工ｇＧ２　、１ｇＧ３および工ｇＧ４ 　Ｙ包含する免疫グミゾリンＧ抗体である。

本発明の接合体にはイノタイプエｇＧ１　、工ｇＧ２およびｘｇａａ　、とくに イソタイプエｇＧ１および工ｇＧ、１１が有用である。

抗体分子は動物たとえば哺乳類起源、たとえばマウス、ラットまたはヒト起源の ものである。天然抗体もしくはそのフラグメントでもよく、また所望により４１ 換え抗体または抗体フラグメント、すなわちａｌ換えＤＮＡ技術を用いて製造さ れた抗体分子またシエ抗体フラグメントを筐用できる。

特定のｌ！ｉ換え抗体または抗体フラグメントには、（１）少なくともその一部 Ｃ・工具なる抗体から誘導される抗原結合部位を有するもの、たとえばある抗体 の超可変または相補性決足領域ン第二の異なる抗体の可変枠組み領域中に移植し たもの（欧州特許明細書２３９．４００号参照）；（２１非−ｙｖ配列を池の異 なる抗原からの非−ＩＦｖ配列で置換した＠換え抗体もしくは７ラグメント、ま たハ（３）天然免疫グロブリンの実質的構造を有するが、１個または２個以上の アミノ酸残基が変更さｊまたとえば抗体の蝶番領域が天然の免疫グロブリンとは 異なる数のシスティン残基を有するか、組換え抗体もしく（エフラグメントの表 面ポケットにおける１個もしくは２個以上のシスティン残基が天然の免疫グロブ リンでを工他のアミノ酸残基が存在する位置にあるか（それぞれ国際特許明細書 ＷＯ３９１０１９７４およびｗｏ８９１０１７８２に記載されている〕、あるい は天然の免疫グロプリ／では他のアミノ酸残基が存在する位置にリシン残基があ る組換え抗体またはフラグメントが包含される。

抗体が抗体フラグメントである場合には、たとえば、全抗体の酵素消化によって 得られる蛋白分解フラグメントであってもよい。また、抗体７ラグメントは組換 えＤＮＡ技術によって得られる抗体、たとえばｙｖフラグメント（国ｆｌＡ特許 明細書ＷＯＢ９／Ｄ２Ａ６５ＶＣ記載されている〕でもよい。

一般に、抗体が抗体フラグメントである本発明の接合体では、とくにＦ（ａｂ’ ）２フラグメントが好ましい。

抗体はポリクローナルまたはモノクローナルいずれの起源でもよいが、モノクロ ーナル抗体が好箇しい。

それは任意の数の抗原決定基に対して特異的であってよいが、１個の抗原決定基 に特異的であることが好ましい。抗原決定基は、へブテンでも、任意の抗原に関 連した抗原決定基でもよい。特定の抗原としては、動物、たとえばヒト〔たとえ ば正常動物組織または臓器細胞一連抗原、腫瘍細胞関連抗原（たとえばカルシノ エンデリオ抗原またはα−フェトゾａティンのような癌胎児性抗原、絨毛性ゴナ ドトロピンおよび胎盤７Ａ。

カリホスファターゼのような胎盤性抗原、ならびにプロスタン酸ホスファターゼ および前立腺特異的抗原のような前立腺性抗原）および体液改分たとえばフィブ リンまたは血小板関連抗原〕、ウィルス、細菌およびカビに関連した抗原乞挙げ ることができる。

好ましい態様においては、抗体は、腫瘍細胞関連抗原、とくにヒト乳癌および結 腸癌に関連したＴＡＧ−７２抗原上の１種または２種以上の工ぎトープを認識し 、それに結合できる抗体である。この型のとくに好ましい抗体はモノクローナル 抗体Ｂ　７２．３　（Ｃ０１ｃｈｅｒ、　Ｉ）。

ら　：　　ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　ＡＣａａ、　　ＳＯｌ、　　ＵＳＡ、 　　７　８　　：　　３　１　９　９　　。

１９８１）またはそのフラグメント、とくにＦ（ａｂ’）２フラグメントである 。

本発明の接合体の一つの好ましい群（工、各抗体接合体が非ジスルフィド重鎮間 架橋乞有する標識抗体分子からなり、その架橋（工、その抗体分子の蝶番領域に おける上記重鎮それぞれに存在するシスティン残基のスルフヒドリル基を介して 各重鎖に結合している接合体である。

この型のと（に有用な接合体は、抗体がその蝶番領域における各重鎖に唯１　＋ ｍのシスティン残基馨有し、このシスティ／残基が重鏡開架橋の架橋部位を形部 する接合体である。

この型の他の有用な接合体は、腫瘍細胞関連抗原、とくにヒト乳癌および結腸癌 に関連したＴＡＧ　−７２抗原上の１種または２種以上のエビトー７°を認識し 、それに結合できる接合体である。抗体（・工、天然に存在する抗体もしくはそ のフラグメント、と＜　Ｋ　Ｆ（ａｂつ、フラグメントであるか、または上述し たような組換え抗体または抗体フラグメントとすることができる。抗体はＢ　７ ２．３抗体またはそのフラグメントが好ましく、また組換えＢ　７２．′５抗体 またはそのフラグメントでもよい。

この好ましい型の接合体においては、標識は、好ましくはヨウ素原子とくに１２ ５工もしくは１２１工、または金属と錯体を形部した式（１）のキレート剤とく に式（２）もしくは（３）の化合物、とくに式（４）もしくは（５）の化合物で ある。金属は、配位数２〜８の２価または３価の陽性金属の放射性核種が好丁し い。インジウムとくにＩｌｌ工ｎおよびイツトリウムとくに５ＩＯｙがとくに好 まし本発明の接合体は、診断薬または治療剤として有用である。すなわち、抗体 ならびにレポーターまたはエフェクター基の性質に応じて、接合体は、適当な検 出器と組合せて、正常または疾患組織たとえば腫瘍および血栓Ｙ：造影するため にｌｎ　ｖｌｖｏで、または異常な細胞障害たとえば腫瘍、血栓、および感染χ 含めた疾患組織の処ｆｌｌｃｆｉＥ用することができる。１だ、本発明の接合体 はｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断技術に、たとえばラジオイムノアッセイまたは酵素連 結イムノアッセイに使用することができる。

したがって、本発明はさらに他の態様として、ヒトまたは動物対象の処置または 診断方法に使用される抗体接合体であって、少なくとも１個の鏡開架橋を有する 標識抗体分子からなり、その架橋は抗体の抗原結合ドメインの外側に位置する１ ｍまたは２個以上の架橋部位において６鎖に結合する抗体接合体を提供する。

１ｎ　ｖｌｖｏで使用するためには、抗体接合体は適当な投与量で適当な組成物 として製剤化することができる。

したがって、本発明はさらに他の態様として、少なくとも１個の非ジスルフィド 性鏡開架橋を有する標識抗体分子からなり、その架橋は抗体の抗原結合ドメイン の外側に位置する１ｍまたは２個以上の架橋部位において６鎖に結合している抗 体接合体と、１種またに２種以上の医薬的に許容される担体または賦形剤より構 放される医薬組成物乞提供する。

接合体の１ｎ　ｖ１ｖｏ投与は任意の適当な経路によって行われるが、非経口投 与たとえば注射または注入が好ましい。接合体の非経口投与に適当な製剤には、 接合体の油性または水性ビヒクル中懸濁液、溶液または乳化液が包含され、これ には懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような調剤用物質ｔ２７０えてもよ い。また、接合体は粉末の形態とし、使用前１Ｃａ当なビヒクルたとえば滅菌、 パイロジエン不含水で再構築するものであってもよい。所望により、接合体は、 単位用量剤型として、また１種もしくは２種以上の他の活性部分または造影剤と ともに提供されてもよい。

接合体ン投与する場合の正確な用量は、投与経路、抗体およびレポーターまたは エフェクター基の性質、使用目的すなわち診断かまたに治療かのほか、他の変数 たとえば患者の体重および病態によって決定される。

したがって、適用の際の用量は常に、標準操作を用いて、経験的に決定される必 要がある。

本発明の接合体がｌｚ２　ＶｉｔｒＯでの診断に考慮される場合には、慣用の操 作、たとえばＭｅｔｈｏｄａ　ｔｎＩｎ２７ｍＯ１ｏｇ７．３４　：　１９８２ および９２：５７７〜５２３　、１９８３（Ｌａｎｇｏｎｅ、　：ｒ、　Ｊ、＆ 　ｖａｎ　ｖｕｎａｋｔｓ、　Ｈ。

編、　Ａｃａｄｓｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　ｌＪｅｗ　ＹＯｒｋ　）に記載された 操作を用いて、利用することができる。

本発明の接合体は一般に、抗体またはそのフラグメントを架橋剤と反応させるこ とによって製造できる。

架橋反応は、標１ｍ”ｆたは非標識抗体分子のいずれによって行ってもよい。

この反応は一般に、適当な溶媒、たとえば水またシェ水性無機もしくは水性有機 緩衝液ののような水性溶媒、たとえばリン酸、クエン酸もしくは酢酸緩衝液筒た はそれらの混合物、あるいはたとえば含水アセトンもしくはジメチルホルムアミ ドのような水性有機溶媒中、適当な＠度、たとえば００〜３０℃の範囲、とくに 室温付近で行われる。

抗体オヨび／または存在するレポータおよびエフェクター基が多数の反応にあず かる可能性のある基を含有する場合には、上述の一般的な形の架橋反応では、無 差別の反応が起こり、不均一な混合土放物が得られることになる。これｔ避ける ためには、適当な反応試薬および／または反応条件χ単独でまたは組合せて選択 することにより、一般的架橋方法ｔ、均一な生成物が得られるように適合させる 。

すなわち、ひとつの選択としては、架橋試薬を抗体中の特定の官能基と選択的に 反応する官能基音もつように選択することができる。適当な条件下に選択的様式 で反応する基には多くの例があり、たとえばアミノ反応性およびチオール反応性 官能基等、熟練者【工よく知られている通りである（たとえば、欧州特許明細書 １７３６２９号および１７５６１７号、英国特許明細書２１０９４０７号ならび に国際特許明細書ＷＯ３８１０５４３３号参照）。

第二の選択としては、抗体および／またはレポーターもしくはエフェクター基中 の反応可能な基で架橋することが望でしくないものｔ、架橋反応を行う前に保護 することができる。蛋白質の反応性の基の保護に際しての慣用方法χ、標準的な 脱保護技術とともに採用することができる。

その池の選択としては、抗体ｔ、架橋に利用できる少なくとも１対の独特の架橋 部位を有するように選択する方法がある。たとえば、β−メルカプトエチルアミ ンのような緩和な還元剤を用％Ｎで、たとえば抗体の重鎮を連結するジスルフィ ド橋から遊離のスルフヒドリル基を生成させるが分子の他の部分には実質的に影 響がないように抗体χ部分還元することも可能である。

ついでスルフヒドリル基ン、チオール特異的架橋剤との選択的反応の架橋部位と して使用できる。別法として、抗体？、化学的方法または酵素的方法で、たとえ ば欧州特許明細書１７３６２９号に記載されているようにして酸化し、炭水化物 側鎖にアルデヒド基を生成させ、これをついで一般的に上述した架橋剤と反応さ せることもできる。

さらに別の方法として、架橋剤との反応に先立って、組換えＤＮＡ技術χ用いて 抗体に独特の架橋部位を導入することもできる。たとえば、各重鎮の蝶番領域に おけるシスティン残基の数を１個に減らした抗体を準備する。これは、抗体分子 のＯＨ１ドメインを通常伴５蝶番領域を有する抗体重鎖ｔコードするＤＮＡ配列 が含まれるオペロン′１ｊ！：１ず発現ベクター中に作成することによって得る のが便利である。

オベロ／ヲ工、あるクラスの抗体からのＣＨ１領域領域−コードＤＮＡ配列乞、 別のクラスの抗体からの蝶番領域ＺコードするＤＮＡ配列に結合させることによ って作成できる。また、あるクラスのＯＨ１ドメインと蝶番領域ｔクローニング し、特定部位の突然変異たとえばアラニンをコードする配列への突然変異によっ てシスティン残基をコードするＤＮＡ　）リプレットの数ｔ１偏に変換すること によっても作成できる。適当な細胞系をそのベクターでトランスフェクトし、つ いでトランスフェクトされた細胞系を培養することによって、所望の重鎮ポリペ プチドが産生される。

このベクターは重鎮ポリペプチドのみ乞コードするので、細胞系が相補的な軽鎖 を産生ずるように調整することが必要になる。これ’Ｊｌｆｆするためには、３ つの別個の方法のいずれかを使用できる。第一の方法としては、細胞系を第二の ベクターでトラ／フエクトし、第二のベクターは相補的軽鎖誘導ポリペプチドを コードするものとする。各ポリペプチド鎖が等しく発現されることｔ可能な限り 確実にするため、ベクターは、コードする配列と選択可能マーカーに関する点を 除いては、同一であることが好ましい。

第二の！法においては、ベクターに、軽鎖および重鎖の両者ン誘導するポリ被ゾ チドｔコードする配列を包含させる。第三の変法においては、天然に相補的な軽 鎖を分泌する宿主細胞を使用する。これらのベクターを構築する一般的方法、ト ランスフェクション法および培養法はよく知られている（たとえば、ｙａｎｌａ ｔｌａら：　Ｍｏ１ｅｃｕ：ｔａｒ　Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ、　（１！ｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹＯｒｋ、　１９８２　；　ｐｒｔｍｒｏｓｅ 　＆　ｏｌａ　：　ｐｒｌｎｃｌｐｌｅｓ　ｏｆＧｏｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔ ｉｏｎ、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　Ｏ：ｃｆｏｒｄ、　１９８０参照）。上述の 方法は、国際特許明細書ｗｏ８９１０１９７４号にとくに詳細に記載されている 。

上述の方法は、１個のシスティン残基をもつ蝶番領域を含有する任意のサイズの 重鎖−軽鎖対の生成に適用できる。このような構築体は、一般的に上述しまた以 下の実施例に述べる架橋剤と反応させることができる。

上述した組換えＤＮＡ技術と類似の方法を用いて（国際特許明細書ｗｏ８９１０ １７８２号も参照〕、抗体分子の各重鎮にシスティン残基を導入し、本発明の接 合体を生成させるための以後の架橋剤との反応のための独特の架橋部位χ提供す る。上述の方法はまた、他の組換え抗体、たとえば付加的リジン基または架橋試 薬に対する独特の架橋部位を与える他のアミノ基を含有する岨換え抗体の製造が 所望の場合、適当な出発原料χ用い、適宜適合させた形で使用することができる 。

一般に、本発明の化合物を製造するための架橋反応では、とくに抗体がたとえば 上述のように独特の架橋部位ｔもつ場合、架橋剤は過剰の抗体と反応させること が好ましいことが明らかにされている。こうすることによって、無差別な架橋（ ・工回避され、所望の抗体生成物が好収率、高純度に生成される。抗体が架橋剤 に対して過剰源［（たとえば２倍およびそれ以上の過剰）で用いられる架橋反応 もさらに本発明の特ｇ１を形成する。

本発明の接合体にＳいてレポーターまたはエフェクター基がキレート化金属であ る場合には、接合体襲造の最終工程は、金属を導入する反応となる。金Ｉ！ｉは 、抗体を金ＩＥ［（たとえば金属パライト）と、適当な溶媒たとえば水性または 非水性溶媒（たとえばアセトニトリル、アセトン、ゾロピレンカルボネート、ジ メチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシド）中、０℃〜５Ｄ’Ｃの適当な 温度たとえば室温付近で反応させることによって導入できる。

本発明の接合体の製造に際して出発原料として使用される抗体は、慣用方法によ り、たとえば免疫動物の血清から、または好ましくは骨髄腫もしくはハイプリド ーマ細胞から、あるいは欧州特許明細書１７１４９６号、１７３４９４号、１９ ４２７９号および２３９４００号ならびに国際特許出願明細書ｗｏ８９１０１９ ７４号、ｗｏ８９１０１７８２号。

ｗｏ　８９　／　０２４６５号およびＷＯ３９１０１７８３号に記載されている よ５な組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。抗体７ラグメントを工、全 抗体から＃素的もしくは化学的方法または両者Ｙ：岨合せた方法により、慣用の 実用的操作に従って、あるいは全抗体の代わりに７ラグメント馨産生するように 適宜適合させた上述の組換えＤＮＡ技術によって製造できる。

本発明の接合体Ｙ＃造するための架橋剤は、一般的に異種官能性架橋剤である。

異種官能性架橋剤ン得る方法はよく知られている（たとえばＣｈｏｓｅ、　Ｔ、 工、ら：ｕｅｔｈｏｉｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌＯｇ７．　エ五：　２８０〜５ ３３　＊１９８３参照）。

本発明の接合体に使用されるエフェクターまたはレポーター基は、容易に入手で きるか（たとえば英国特許明細書２１０９４０７号、米国特許明細書４４７２５ ０９号、欧州特許明細書１７５６１７号ならびに国際特許明細書ＷＯ３９１０１ ４７５号およびｗｏ　８９　／　０１４７６号参照］、もしくはこれらの既た方 法と類似の方法を用いて既知の出発原料から製造できる。

式（１１、＋２１および（３）の特定の巨大環状アミンは、国際特許明細書ＷＯ ３９１０１４７５号およびＴｏ　８９　／　０１４７６号に記載された方法で製 造できる。

レポーターまたはエフェクター基は慣用手段を用いて抗体に連結される。たとえ ば、ヨウ素はクロラミンτ法（たとえば米国特許明細書４３３１６４７号参照］ を用いて、抗体に直接連結させることができる。一方、他のレポーターまたはエ フェクター基は、レポーターまたはエフェクター基土の適当な官能基と抗体とｔ 。

標準的操作を用い、たとえば英国特許明細書２”！０９４０７号ならびに国際特 許明細書ｗｏ８９１０１４７５号およびＷＯ３９１０１４７６号に記載されたよ うにして反応させることにより、連結させる。

特　の態様の説明 以下の例を工本発明を例示するものである。

例１ （ａ）Ｂ７２．３工ｇＧ　（Ｃｏａｃｈｅｒ、　Ｄ、ら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　σ８Ａ、７８　：　３１９９，１９８１　ンからＩ’（ ａｂ’）２の製造 Ｐ（’ｂ’）２７　Ｆダメ７１１ＸＢ　７２．３　ｘｇａカラフａ　ｙｔ　ライ ンでの消化によって製造した。デａメラインはまず、１．０１１Ｆ／−溶液Ｙ　 ３　ｍＭ　ＨＤＴＡ含有０．１Ｍ酢酸塩−１５，５０中５　Ｑ　ｍＭシスティン と３７℃で３０分間イ／キュベートして活性化した。活性化デａメラインを、Ｆ ＤＩＱ　（５ｅｐｂＬ（１６１０２５）　２）　ニア　Ａ　’ｔ’用い、３ｍＭ 　ＥＤＴ’Ａ含有０．１Ｍ酢散塩−５゜５０中に脱塩してシスティンχ除き、同 一緩衝液中Ｂ　７２．３　（１”／ｗ　：　５０　”／ｗ酵素：　ＸｇＧ　）の ２．０■／−溶液に卯えた。消化液’に３７℃で約２時間インキュベートし、工 ｇＧからｙ　（ａｂ’）２サイズのピークへのに換Ｙ：　Ｅ３ＤＢ−ＰＡＧＥで モニタリングした。

消化完了後、アンチパインおよびロイペプチンｔ１ｘＪえ（終濃に０．０５ｗｖ ／ｘｔ）、混合物のｐ）ｆ　Ｙ　５ａｏａで６．０で１ＥＱｌ！ＩＬ、ついでＳ 　５ｅｐｈａｒＯａ６　Ｆａａｔ　ＩＦＩＯＷイオン交換クロマトグラフィーに 付した。、Ｆ（ａｂ’）２．　ＦＣおよび残った工ｇＧは流出液中に溶出するが 、デロメラインはマトリックスに結合して残った。この陰性精製工程により、消 化混合物からすべてのベロメラインが効率的に除去された。

（ｂ）　　Ｆ（ａｂ’　）　２フラグメントの精―残った消化混合物乞まず２　 Ｑ　２１１Ｍ　Ｔｒｘａ　ｐＪ（７，８ＩＣ透析し、Ｄｌ！ＡＥ　８ｅｐｈａｒ Ｏｓｅ　Ｆａｓｔ　′ＸＰｌｏｗ　ｆｊ　ニア　Ａ上に負荷シタ。

ＦＣａｂ’）２はカラムから流出液中に溶出したが、Ｆ′ｃ部分および残った完 全な工ｇＧはカラムに残った。結合した物質ｋＺ　２０　ｗＭＴｒｌｓ　ｐＨ７ ，Ｂ中Ｑ、Ｉ　Ｍ　Ｎａ’！　テ？　）　ＩＪ　７クスから溶出され、カラムが 再生された。

（Ｃ）　　化学的架橋ＦＣａｌｌ’）２分子の製造２　ｍＭ　ＩＣＤＴＡ含有０ ．１５　Ｍυノ酸塩緩衝液−８，０中０．５　ｍｙ／、ｔｖ　Ｂ　７２．３　Ｆ （ａｂっ２に、終湯ｆ５ｍＭ’０２−ンキュペートして還元した。還元後、サン プルンイ、２ｍＭ　ＫＤＴａ含有０．１Ｍクエン酸／　０．２　Ｍ　Ｎａ２ＨＰ Ｏ，、ｐｌ（６，０で平衡化した８ｅｐｈｌＬｄＪＸ　Ｇ　２５　（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　）カラムを通して脱塩した。

１．６−ピスマレイミドヘキサンＹＭ濃［７２ｍＭにジメチルホルムアミドに溶 解し、Ｑ、９　ｍｙのレベルの新たに還元したＦａｂ’８Ｈに加えた（滴定され るチオールに対して約２２倍過剰〕。室温で絶えず攪拌しながら９０分間インキ エペートしたのち、Ｎ−エチルマレイミドを終濃度５）ＨｌＭになるように加え 、さらに３０分間インキエベートし、ついで０．１ＭクエンＩＩ！１０．２Ｍ　 Ｎａ２ＨＰＯ，、２ｍＭ　ＫＤＴＡ中に脱塩シタ。マレイミド化Ｆａｂ’　（Ｆ ａｂ’ｍａｊ）　Ｙ直ちに、新鮮なＦｌｌｂ’　８Ｈに、Ｆａｌ）’　ｍａｌ： 　Ｆａｂ’８Ｈ１，１：　１．Ｑのモル比で加え、絶えず攪拌しながら約２０分 間、室温でインキュベートした。架１ｌｙ（ａｂ’）２を反応混合物から、ＨＰ ＬＣｒル濾過によって精製した。

架ｌ１反応混合物の組成は、−夜インキエベートシタのち、ＨＰＩ、Ｏデル濾過 によって測定した。反応混合物１０μｍ”＆　２００　ｍＭ　２−メルカプトエ チルアミン１０μｍに卯え、１５分間インキュベートした。８００　ｍＭヨード 酢酸アミド２０μｍをさらに卯え、１５分間反応させた。還元されアルキル化さ れたサンプシンつで、ＨｐＬｃ　ＧＦ　２５０で分析し、クロマトグラムの百分 率組成を積分で求めた。移動相０．２　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液−７，０，流速１ −７分の標準ＨＰＬＣ条件下に、化学的に架橋された分子は保持時間８．６２分 で溶出したが、未反応Ｆａｂ’は遅れて９．４８分で溶出した。架橋Ｆ（ａｂ’ ）ｇはまた、精製後、還元５Ｄ８−ＰＡＧＥによっても確認された。

すなわちこのＦ（ａｌ）’）２は架橋ぎ−ｌバンド（Ｍｒ＝〜４６．０００）と Ｌバンド（Ｍｒ＝　〜２２．０００　）’に示したが、対照は通常のＨ’（Ｍｒ ＝２３．０００）とＬバンド（Ｍｒ＝２２．０００）Ｙ示り、　タ。

こ（Ｄ反応Ｙ：１１．６−ビスマレイミドヘキサンの代わりに、架橋剤としてＮ 、Ｎ’−０−フェニレンジマレイミド、ビスマレイミドメチルエステルおよびリ ジンビスマレイミドを用いて反復した。

上に製造した各架橋抗体ンクロ２ミンＴ法でヨード化すると、標識がヨウ素で、 架橋基が蝶番領域に存在するシスティン架橋部位によって抗体の各重鎖を連結す る１、６−ビスマレイミドヘキサン、Ｎ、Ｎ’−０−フェニレンジマレイミド、 ビスマレイミドメチルエステルまたはリジンビスマレイミドの残基である本発明 の接合体抗体が生収した。

例２ この例）！、１．（５−ビスマレイミドヘキサン１だはりシンビスマレイミドの いずれかで架橋されたキメラＢ　７２．３　Ｆａｂ’デルタａｙｓの製造を例示 する。Ｂ７２．３ｙａｂ’デルタｅｙｅ出発原料は、国際特許明細書ＷＯ３９１ ０１９７４号およびｖｒｏ８９１０１７８３号に特定的に記載されている方法に 従って製造された。

０．８６　ｍＭクエン駿と２　ｍＭ　ＫＤＴＡ　’！’含有する０、１Ｍ酢酸ナ トリウム緩衝液−６，０中、１．０〜２．０岬７′−のキメラＢ　７２．３７ａ ｂ’デルタ０７ｇ＋に、終濃ｌｆ５　ｍＭの２−メルカプトエチルアミン’ｔ’ ７１０え、３７℃で３０分間インキュベートして還元した。還元後、サンダルｔ １２　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ酢酢酸ナトリウム／クエンナナトリ１７Ａ緩 衝ａｐＨ６０で平衡化り、　ｊｔ：　５ｅｐｈａａｅｘ　ａ　２５（ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　）　’ａ’通して脱塩した。

リジンビスマレイミドを水に溶解し、新たに還元しり３．８ｍＭ濃度のｙａｂ’ 　ＳＨＩｃ　７Ｍえ（滴定されるチオールに対して約４０倍過剰）、絶えず攪拌 しながら室温で６０分間インキュベートした。Ｎ−エチルマレイミドを終濃度９ 　ｍＭになるように卯え、さらに３０分間インキュベートしたのち、リン酸緩衝 食塩溶液ｐＨ７，５中に脱塩した。マレイミド化Ｆａｂ’　（Ｆａｂ’　ｍａｄ ）　ｆ直ちに、新鮮なパッチのＦａｂ’　ＳＨに、ｙａｂ’ｍａＪ　：　Ｆａｂ ’ＳＨ１，１：　１．Ｑの重量比で卯え、絶えず攪拌しながら約２０分間、室温 でインキュベートした。

架橋反応混合物の組５１！は、−夜インキユベートしたのち、ａｐＬｃ　ｌｆル 瀞過によって測定した。反応混合物１０μＪ　Ｙ　２００　ｍＭ　２−メルカプ トエチルアミン１０μｍに加え、１５分間インキュベートした。さらに８００　 ｍＭヨード酢酸アミド２０　ｐＪ−Ｙ：添加し、１５分間反応させた。還元され アルキル化されたサンプルを次に、ＨＰＬＣ！　（ＺＯｒｂａｘ　ＧＦ　−２５ ０デル濾過カラム〕を用いて分析し、クロマトグラムの百分率組成乞積分で求め た。０．２　Ｍ　ＩＪンＷ１．塩緩衝液ｐ）１７．ＯＹ移動相とし、流速１−７ 分とした標準１（ＰＬＯ条件下に、リシンＣエマレイミドとの架橋物質は保持時 間８．６２で溶出されたが、未反応ｃＦａｂ’は遅れて９．４８分で溶出した。

架橋物質はまた、精製後、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥによっても確認された。すなわ ち、架橋物質は、架橋ａ’−ａ’ｓンド（ｍｒ＝　〜４６．０００　）とＬバン ド（Ｍｒ＝　〜２２．０００）’に：　示り、　タカ、Ｒ照ｆｉ通’１ＫＣＩ　 Ｈｌ　（Ｍｒ　＝〜２３．０００　）およびＬバンド（Ｍｒ＝２２．０００）Ｙ ：示した。

この実験ｔ、水中リジンビスマレイミドの代わりに、乾燥ジメチルホルムアミド 中１．６−ビスマレイミドヘキサンχ用いて反復し、ビスマレイミドヘキサンで 架橋された抗体物質が得られた。

両実験からの生成物ｔクロラミンＴ法でヨード化すると、標識がヨウ素で、架橋 基が抗体の各重鎖に６鎖に存在する１個のシスティン残基を介して連結したりシ ンビスマレイミド筐だ４１．６−ビスマレイミドヘキサンの残基のいずれかであ る本発明の接合体抗体が生放した。

例６ 例２に記載した実験ｔ１還元Ｆａｂ’　ＳＨに各架橋剤ｔ。

Ｆａｔ）’ＳＨと架橋剤のモル当量比が２．２：１になるように加えたほかは同 様にして反復した。３７℃で６０分間インキュベートしたのち、架橋物質を例２ に記載したようにして単離し、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより例２で得られた物質と同 一であることχ確認した。つ−・で例２に記載したようにヨード化して、標識架 橋抗体を得た。

手続補正書（自発） 平成２年１・１月１３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも１個の非ジスルフイド性鎖間架橋を有する標識抗体分子からな り、その架橋は抗体の抗原結合ドメインの外側に位置する１個または２個以上の 架橋部位で各鎖に結合している架橋抗体接合体。 （２）架橋部位はアミノ酸残基の側鎖に存在するアミノ、スルフヒドリル、カル ボキシル、フェノールまたは他の芳香族もしくは異項環芳香族官能基である請求 項（１）記載の接合体。 （３）架橋部位はシステイン残差の側鎖に存在するスルフヒドリル基である請求 項１２１記載の接合体。 （４）システイン残基は蝶番領域における各重鎖中に存在する請求項（３）記載 の接合体。 （５）システイン残基は蝶番領域に存在する唯一のシステイン残基である請求項 （４）記載の接合体。 （６）抗体は組換え抗体である請求項（１）〜（５）のいずれかに記載の接合体 。 （７）抗体は抗体フラグメントである請求項（１）〜（６）のいずれかに記載の 接合体。 （８）フラグメントはＦ（ａｂ′）２フラグメントである請求項（７）記載の接 合体。 （９）非ジスルフィド性鎖間架橋は同種または異種官能性架橋剤の残基である請 求項（１）〜（８）のいずれかに記載の接合体。 （１０）標識抗体分子は、レポーターまたはエフェクター基が結合している抗体 分子である請求項（１）〜（９）のいずれかに記載の接合体。 （１１）レポーターまたはエフェクター基は、放射性核種、キレート化金属、螢 光化合物、ＮＭＲもしくはＥＳＲで検出できる化合物、薬理学的物質、酵素また はホルモンである請求項（１０）記載の接合体。 （１２）レポーターまたはエフェクター基は、放射性核種またはキレート化金属 である請求項（１１）記載の接合体。 （１３）放射性核種は放射性ヨウ素である請求項（１２）記載の接合体。 （１４）キレート化金属は、配位数２から８までの二価または三価陽性金属と多 座キレート剤のキレートである請求項（１２）記載の接合体。 （１５）多座キレート剤は、非環式もしくは環式ポリアミン、ポリエーテル、ポ リアミド、ポルフイリンまたは炭素環式誘導体である請求項（１４）記載の接合 体。 （１６）非環式ポリアミンはポリアミノカルボン酸である請求項（１５）記載の 接合体。 （１７）環式ポリアミンは環式トリアザまたはテトラアザ誘導体である請求項（ １５）記載の接合体。 （１８）少なくとも１個の非ジスルフイド性鎖間架橋を有する標識抗体分子であ って、その架橋は抗体の抗原結合ドメインの外側に位置する１個または２個以上 の架橋部位で各鎖に結合している抗体と、１種または２種以上の医薬的に許容さ れる担体または賦形剤からなる医薬組成物。 （１９）少なくとも１個の非ジスルフイド性鎖間架橋を有する標識抗体分子から なり、その架橋に抗体の抗原結合ドメインの外側に位置する１個または２個以上 の架橋部位で各鎖に結合している抗体接合体を製造するにあたり、架橋剤を抗体 と反応させる方法。 （２０）抗体は架橋剤に対して過剰濃度で存在させる請求項（１９）記載の方法 。 （２１）少なくとも１個の非ジスルフイド性鎖間架橋を有する標識抗体分子から なり、その架橋は抗体の抗原結合ドメインの外側に位置する１個または２個以上 の架橋部位で各鎖に結合している、ヒトまたは動物対象の処置またに診断方法に 使用するための抗体接合体。