JPH03505530A

JPH03505530A - プラスミノーゲン活性化因子の修飾

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Publication number: JPH03505530A
Application number: JP2506552A
Authority: JP
Inventors: ブラシ、フランチェスコ; ストペッリ、マリア・パトリツィア; マストロニコラ、マリア・ロサリア; ウェリンダー、カレン・ギェアシング; コルレアス、イザベル
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1990-04-11
Publication date: 1991-12-05
Also published as: EP0422198B1; AU5541190A; ES2072432T3; DE69018361D1; AU623522B2; WO1990012872A1; US5416006A; CA2031210A1; ATE120797T1; KR920700285A; PT93755A; DK182289D0; NZ233321A; EP0422198A1; ZA902747B; IL94070A0; HUT56130A; US5688503A; DE69018361T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】プラスミノーゲン活性化因子の修飾この発明は、プラスミノーゲン活性化因子の形態、その生産、それらを含有する医薬組成物、およびそれらを特異的に認識する抗体に関するものである。

プラスミノーゲンの活性化（ＰＡ）は、血管内でフィブリン塊を消化するのに必要であり、血管外では細胞外マトリックスおよび基底膜のタンパク質構成成分と細胞表面との相互作用を調節するのに必要である。ＰＡ反応の生産物であるプラスミンは、フィブリン、１０チオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンおよびある種のコラーゲン類を分解することができる。また１ラスミンは潜在型コラ− ゲナーゼを活性化することができる。ＰＡ系は、２種のプラスミノーゲン活性化酵素、ウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）および組織性ＰＡ（ｔ−ＰＡ）からなり、特異的なＰＡ阻害因子（ＦＡＩ−１およびＦＡＩ−２）によって阻害される。また特異的な受容体がｕ−ＰＡで確認されでいる、これらのプロテアーゼの触媒部分の機能は比較的よく判っているが、調節ドメインの機能の方はさほど明らかではなく、情報が集まり出したのはつい最近である０例えばｕ−ＰＡでは、成長因子ドメインがｕ−ＰＡ受容体への結合の機能を担っている。ｔ−ｐＡでは、フィンガー・ドメインおよび第２クリングル・ドメインがこの酵素のフィブリンへの結合を媒介している。

この系は、溶液中および細胞表面の両方で１ラスミン生成を行うことができる。

後者の場合、ヒトＵ９３７細胞およびＨＴＩ″０８０細胞の場合のように、プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン活性化因子の両者の受容体を共に同一の細胞に有し得る。第２にＨＴ１０８０細胞では、受容体結合したｕ−ＰＡは受容体結合したプラスミンを産生できる６表面プラスミンに対するタンパク質分解は、（ａ）受容体結合したプロ〜ｕ−ＰＡでは、溶液中の方が、はるかに速やかな速度で２重鎖ｕ−ＰＡへ活性化され、（ｂ）表面結合したプラスミンはα＝２−抗プラスミンに対して抵抗性であり、（Ｃ）これに反して、受容体結合したｕ−ＰＡは活性であって、少なくともＵ９３７細胞ではＦＡＩ−１によって阻害を受は易いという幾つかの特殊性を有するようである。

ｕ−ＰＡは４３１個のアミノ酸からなる不活性タンパク質、プローウロキナーゼ（プローｕ−ＰＡ）として分泌される。このタンパク質は表面受容体（ｕ−ＰＡＲ）へ結合して、タンパク質分解によるただ一度の切断によって活性化され得る。悪性Ａ４３１細胞系では、自己分泌により同じ細胞で産生されたプローｕ−ＰＡリガンドによってすべてのｕ−ＰＡＲ部位が占有される。ｕ−ＰＡを産生する多くのヒト腫瘍細胞で類似の結果が報告されている。

ブ０−ｕ−ＰＡは、１５７−アミノ酸（Ｌｙｓ）と１５８−アミノ酸（Ｉｌｅ）の間を切断されてプロ酵素が活性化する。切断によって２本鎖の活性型ｕ−ＰＡが生成する。詳細は判っていないが、この切断は１０テアーゼの２次構造および３次構造を変化させて活性部位を露出し、これを基質（プラスミノーゲン）および阻害因子（ＰＡｌｌ、ＰＡＩ−２，１０テアーゼネキシン、α２−マクログロブリン、その他）へ近づき易くさせるものと考えられる。事実、活性化部位でのプローｕ−ＰＡの切断は立体配座上の変化を生じ、天然および合成のいずれの基質でも、プラスミノーゲン活性化因子活性を増大させる結果となる。

［治療に使用されるプラスミノーゲン活性化因子の半減期コブラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ、プローｕ−ＰＡ、ストレプトキナーゼおよびそれらの誘導体）は血栓塞栓性疾患の治療に利用され、あるいは利用可能である。

この治療に関連した問題点の一つは、少なくともある程度これらの薬剤の極めて速ばクリアランスのために、非常に高投与量を要することである。半減期が短いことについて考えられる理由は、循環している特異的阻害因子への結合、受容体への結合、阻害因子結合型および／または受容体結合型プラスミノーゲン活性化因子のインターナリゼーションおよびその分解等があげられる。

実施例８．９．１０に示した成績から、リン酸化されたプローＵ−ＰＡは受容体結合型であること、リン酸化にとって受容体結合は必要でないこと、リン酸化された２重鎖ｕ−ＰＡはＦＡＩ−１に対する感受性が劇的に低下することが判る。

したがって、第１に、リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子はＦＡＩ−１を結合しない筈なので、非リン酸化プラスミノーゲン活性化因子より一層長い半減期を有し得る。第２に、完全にリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子は、それ、らの非リン酸化同族体のように、例えばプローＵ−ＰＡの場合、２本鎖活性型へ活性化されるから（例えば実施例２を参照）、血栓塞栓性疾患の治療に使用することができる。第３に、完全にリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子は表面結合しているホスファターゼの存在によって（バルーおよびフィッシャー）、あるいは現在なお発見されている合成または天然ホスファターゼによって、その位置で脱リン酸化できることが予想される。このようにリン酸化された１０テアーゼは循環内では不活性で、それと必要とする部位で活性化でき、全身循環に存在している阻害因子の作用に抵抗性である筈である。

この発明は、最も広い意味でリン酸化されていないプラスミノーゲン活性化因子を実質上音まないリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子を提供する。原則的に、プラスミノーゲン活性化因子の実質上すべての分子が、実質上すべてのリン酸化可能な部分をリン酸化される。

この発明のリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子は、原核細胞または真核細胞によって生産されたリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子とリン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子の混合物から、リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子を分離することによって入手し得る。好ましくはリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子は（ｉ＞１ラスミノーゲン活性化因子を産生ずるヒト細胞系を培養し、（１１）このようにして生産されたプラスミノーゲン活性化因子を単離し、（ｉ）リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子をリン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子から分離することによって得ることができる。

リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子は、原則的に、段階（ｉ）でクロマトグラフィーにより１例えばＦｅ　５　＋−キレート・クロマトグラフィーによって分離する。架橋したデキストランを使用し得る０例えばカラムクロマトグラフィーによって分離を行い得る。

セファロースを使用し得る。原則的にプラスミノーゲン活性化因子はｐＨ約３の溶液として提供される。ｐＨは酢酸（例えば０．１Ｍ酢酸）を使用して調節し得る。溶液をカラムへ通導する。リン酸カリウム緩衝液を使用してカラムを溶出する。緩衝液ｐＨは原則的に約８．０である。リン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子を含んでいないリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子の溶出画分を採取する。

別法として、リン酸化されていないプラスミノーゲン活性化因子をり〉゛酸化酵素でリン酸化することにより、リン酸化されないブラスミノーゲ〉′活性化因子を実質上含んでいないリン酸化された１ラスミノーゲン活性化因子を得ることができる。リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子とリン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子の混合物を、リン酸化酵素で処理することができる。

この発明のリン酸化したプラスミノーゲン活性ｆヒ因子は、心筋梗塞、深部静脈血栓症および発作のような静脈または動脈性血栓症の既往を有する疾患例の治療剤として有用である。リン酸化したプラスミノーゲン活性化因子はいずれもプラスミノーゲン活性化因子阻害因子を結合しないことが期待し得る。したがってリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子は、全身循環に存在している阻害因子の作用に抵抗性であるから、一層長い半減期を示すことができる。

この発明のリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子の有勧量をこれを必要とする患者に投与する。哺乳動物への投与、好ましくは人間への投与は、非経口的に好ましくは静脈内投与で実施する。リン酸化したプラスミノーゲン活性化因子を非経口的に１Ｍ則的には４〜４０ｍｇ、例えば５〜１０ｍｇ投与する。

この発明はまた、この発明のリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子と製薬上許容し得る担体または希釈剤を含有してなる医薬組成物に関する。したがってリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子は、無菌でパイロ−ジエンを含まない水溶液、または任意の好適なその他の形式で提供され得る。

したがって、この発明の極めて重要なＲ様は、ｕ−ＰＡ、プローＵ−ＰＡまたはｔ−ＰＡをリン酸化酵素（特にプロティンキナーゼ）で処理してｕ−ＰＡ、プローｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡをリン酸化することにある。リン酸化した物質は、上記の例えば血栓塞栓疾患またはその他の疾患の処置に使用したｕ−ＰＡ、プローｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡと同様の態様で使用し得る。リン酸化によって阻害因子（ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−２のような）による物質の不活性化が防止きれる前述の原理にしたがい、投与（例えば注射）した物質の半減期が増大されるから、投与量を軽減し得る。

実施例で詳細に説明するように、プローｕ　−Ｐ　Ａはリン酸化されることが判明した。ことにリン酸化は特定のセリン残基で起こることが判った。リン酸化されない１０−ｕ−ＰＡを実質上含んでいないリン酸化したプローｕ−ＰＡが得られ、これをプラスミンで切断することによってリン酸化したｕ−ＰＡが生成する。またリン酸化したＵ−ＰＡは都合よく阻害因子ＦＡＩ−１へ結合できないことが判った。

したがってこの発明は、リン酸化されないプローｕ−ＰＡを実質上含んでいないリン酸化されたプローｕ−ＰＡを提供する。原則的には実質上すべてのプロー１ｌ−ＰＡ分子が、実質上すべてのリン酸化可能な部分をリン酸化される。

リン酸化したプローｕ−ＰＡをプラスミンで処理することによって、リン酸化されないｕ−ＰＡを実質上含んでいないリン酸化したプローｕ−ＰＡが得られる。

リン酸化したｕ−ＰＡはＰＡＩ−１に対して抵抗性である。したがってリン酸化したプローｕ−ＰＡは、リン勧化したプローｕ−ＰＡをプラスミンで処理して生じたリン酸化したｕ−ＰＡが、ＰＡＩ−１に対して怒受性でないことが確がであるアミノ酸残基でリン酸化される。

完全にリン酸化されたプローｕ−ＰＡが、２つの部位でり７酸化されることを実際に確かめた。それらの部位はいずれもセリン残基である。一方の部位は３０３位−アミノ酸のセリン残基である。他方の部位は１３８−および／または１３９ −位のセリン残基である。アミノ酸番号はバーブら（１９８４年）にしたがった、リン酸化されたプローｕ−ＰＡの分子量は、アガロースゲル電気泳動測定で４７ｋＤである。リン酸化したプローｕ−ＰＡはＰＡＩ−１へ結合しない。

この発明のリン酸化したプロー〇−ＰＡは、リン酸化されたプローｕ−ＰＡとリン酸化されないプローｕ、−ＰＡの混合物から、リン酸化されたプローｕ−ＰＡを分離することによって入手し得る。事実、原核細胞または真核細胞、例えば細菌、酵母または明乳動物細胞によって生産されたリン酸化したプローｕ−ＰＡは、リン酸化されたプロー　＋」−Ｐ　Ａとリン酸化されないプローｕ−ＰＡの混合物である。″好ましくはリン酸化されたプローｕ−ＰＡは（ｉ）プローｕ−ＰＡを産生ずるヒト細胞系、例えばＡ４３１またはＨＴ１０８０細胞系を培養し、（１１）このようにして生産されたプローｕ−ＰＡを単離し、（ｉ）リン酸化されたプローｕ−ＰＡをリン酸化されないプローｕ−ＰＡから分離することによって得ることができる。

リン酸化されたプローｕ−ＰＡは、原則的に、段階（ｉ）でクロマトグラフィーにより５例えばＦｄ１キレート・クロマトグラフィーによって分離する。架橋したデキス１−ランを使用し得る９例えばカラムクロマトグラフィーによって分離を行い得る。セファロースを使用し得る。原則的にプローｕ−ＰＡはＰＨＨ３Ｏ溶液として提供される、ｐＨは酢酸（例えば０．１Ｍ酢Ｒ）を使用して調節し得る。

溶液をカラムに通導する。リン酸カリウム緩衝液を使用してカラムを溶出する。

Ｎ衝液ｐＨは原則的に約８．０である。リン酸化されないプローｕ−ＰＡを含まないリン酸化された１０−ｕ−ＰＡの溶出画分を採取する。

別法として、リン酸化されていないプローｕ−ＰＡをリン酸化酵素でリン酸化することにより、リン酸化されないプローｕ−ＰＡを実質−Ｅ含んでいないリン酸化されたプローｕ−ＰＡを得ることができる。

リン酸化されたプローｕ−ＰＡとリン酸化されないプローｕ−ＰＡの混合物を、リン酸化酵素で処理することができる。１３８−および７／または１３９−位のセリン残基（複数もあり）からなるリン酸化可能な部位をリン酸化するため、カゼインキナーゼ■を使用し得る。

この発明のリン酸化したプロー’ｕ　−Ｐ　、Ａおよびｕ−ＰＡは、心筋梗塞、深部静脈血栓症および発作のような静脈または動脈性血栓症の既往を有する疾患例の治療剤として有用である。リン酸化したプローＩＩ−ＰＡを切断して、リン酸化した２本［ｕ−ＰＡを得ることができる。リン酸化した２重鎖ｕ−ＰＡ、またはそのためのリン酸化したプローｕ−ＰＡは、阻害因子ＦＡＩ−１を適切に結合できない、したがってリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子は、全身循環に存在している阻害因子の作用に抵抗性であるから、一層長い半減期を示すことができる。

この発明のリン酸化したプローｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡの有効量をこれを必要とする患者に投与する。哺乳動物への投与、好ましくは人間への投与は、非経口的に好ましくは静脈内投与で実施する。リン酸化したプローｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡを非経口的に、原則的には４〜４０ｍｇ、例えば５〜１０ｍｇ投与する。

この発明はまた、この発明のリン酸化したプローｕ−ＰＡまたはＵ〜ＰＡと製薬上許容し得る担体まなは希釈剤を含有してなる医薬組酸物に関する。したがってリン酸化した１０−ｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡは、無菌でパイロ−ジエンを含んでいない水溶液、または任意の好適なその他の形式で提供され得る。

また組織性プラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡも、プローｕ−ＰＡの３０３− セリン残基と類似の位置にリン酸化可能な残基を含んでいる。このような理由から、プローｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡについて説明したのと同様の方法で、リン酸化したｔ−ＰＡ、特にリン酸化されないｔ−ＰＡを含んでいないリン酸化したｔ −ＰＡを得ることができ、そのような生産物は前記と同じ目的に使用できることが期待し得る。

プラスミノーゲン活性化因子は実質上１００％リン酸化されるのが望ましく、即ち実質上すべてのプロテアーゼ分子が、リン酸化可能な部分を実質上すべてリン酸化されるのが望ましいことが多い。

しかし例えば７０〜１００％の範囲（８０〜１００％のような、例えば９０〜１００％、または９５〜１００％の範囲）の一層低いリン酸ｆヒ度のプローｕ−ＰＡ、ｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡのようなプラスミノーゲン活性化因子もまた興味あ °るものである。したがってこの発明は、例えばリン酸化酵素でリン酸化することによってリン酸化度を増大させ、天然に得られる生産物より一暦高いリン酸化度（例えば７０％、８０％、または９０％）のプローｕ−ＰＡのようなプラスミノーゲン活性化因子を得ることを可能とする。

この発明のもう１つの態様は、リン酸化したプラスミノーゲン活性化因子、特にリン酸化したプローｕ−ＰＡまたはリン酸化したＵ−ＰＡを特異的に認識する抗体に関するものである。そのような抗体は、正常細胞より一層高度にリン酸化されたｕ−ＰＡを産生ずるガン細胞を認識するのに有用であり得る（実施例１参照）、そのような抗体は、リン酸化されたプロテアーゼの少なくとも一部を免疫原の形で投与し、該リン酸化したプロテアーゼと反応性である抗体を産生ずる細胞を得、抗体含有物質を微生物または細胞から単離することを含んでなる方法によって生産され得る。以下、抗体を生産する方法をさらに詳細に説明する。

抗体は好ましくは単一特異性抗体である。羊−特異性抗体は、実質上純粋なリン酸化したプロテアーゼの調製品を好適な動物に注射し、最初の採血の４または５ケ月前までに好適な期間（例えば１または２週間〜１ケ月）を置いて１またはそれ以上のブースター注射を行うことによって作成し得る。確立した免疫計画を継続し、各ブースター免疫の約１週間後に動物を採血し、好適な方法で（例えばハーボエおよびインギルド、１９７３年、参照）血清から抗体を単離する。

高度の検定特異性を必要としない目的のためには、抗体はポリクローナル抗体でもよい、ポリクローナル抗体は、例えばハーボエおよびインギルドの報告（前掲）のようにして入手し得る。より具体的にはポリクローナル抗体を得る際に、好ましくはフロイントの不完全または完全アジュバントのような好適なアジュバントを追加したあとで、リン酸化した１０テアーゼを動物へ注射する。免疫原がヒトのリン酸化した１０テアーゼである場合は、動物は家兎でもよい、動物を定期的（例えば１週間間隔）に採血し、得られた血液を抗体を含んだ血清分画に分離し、所望により、その分画にさらに抗体精製のための通常の処置および／または精製したリン酸化プロテアーゼの使用を含む処置を加える。

もう１つの好ましいＢ櫟は、モノクローナル抗体を得ることである。リン酸化したプロテアーゼの本質的な成分（即ちエピトープ）に対してモノクローナル抗体を上昇させ、または実質的に指向させ得る。モノクローナル抗体は通常の手法（例えばクーラーおよびミルスタイン（１９７５年）の報告）により、例えばハイブリドーマ細胞系の使用により、またはそれらのクローンまたはサブクローンにより、または該モノクローナル抗体を暗号化しているハイブリドーマ細胞系からの遺伝情報を運搬している細胞によって産生され得る。モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生ずる細胞を好適な細胞系の細胞と融合させ、該モノクローナル抗体を産生ずる得られたハイブリドーマ細胞を選別し、クローニングすることによって入手し得る。別法としてモノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体を産生ずる未融合細胞系を不死化し、その細胞を好適な培地で増殖させて抗体を産生させ、ついでモノクローナル抗体を増殖培地から回収することによって生゛産し得る。

この発明の抗体作成のために使用する免疫動物は、好ましくは家兎、サル、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ブタ、ウマおよびモルモットからなる群から選ばれる。この発明の抗体を生産する細胞はひ臓細胞またはリンパ細胞（例えば末梢リンパ球）であり得る。

この発明の抗体の生産にハイブリドーマ細胞を使用する場合は、試験管内または動物の体腔内でこれを増殖させる。抗体産生細胞をマウスのような動物へ注射すると、動物の腹水中に高濃度の抗体を放出する腹水腫瘍が生じる。動物は正常抗体も産生ずるが、その量は低率に過ぎず、モノクローナル抗体を遠心、ｒ過、沈降、クロマトグラフィー、またはそれらの組合わせのような標準的な精製処理によって腹水から精製し得る。

モノクローナル抗体を生産し得る好適な方法を例示すれば、免疫したマウス（Ｂａｌｂ／ｃマウスのような）から得たひ臓細胞とミエローマ細胞とを通常の手法（例えばＲ，ダルショーら、１９８０年）を用いて融合することによってこれを生産し得る。得られた融合細胞を、リン酸化した１０テアーゼを使用する結合検定のような通常の手法によってスクリーニングする。

試料中のリン酸化したプローｕ−ＰＡまたはリン酸化したｕ−ＰＡの存在を測定するため、それらを特異的に認識する抗体を使用することができる。リン酸化したプローｕ−ＰＡまたはリン酸化したＵ−ＰＡを含有することが疑われる試料を抗体と接触させ、リン酸化したプローｕ−ＰＡまたはリン酸化したｕ−ＰＡと抗体との免疫複合体の有無を測定する。この目的のために任意の便宜的な方法を適用し得る。

上記の抗体、好ましくはモノクローナル抗体、および抗体を利用してｔ−ＰＡ、プローｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡのようなリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子との免疫複合体が生成するかどうがを測定する手段を含む診断手段を提供する。この手段は、リン酸化したプロテアーゼを容器中に含んだ試験キットとして提供し得る。この診断手段はリン酸化したプロテアーゼに関連する疾恵の診断に使用し得る。

哺乳動物、好ましくは人間へ上記のリン酸化した種々のプラスミノーゲン活性化因子を投与するには、現在、ｕ−ＰＡ、プローｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡで用いられている投与法と同様に、非経口的に特に静脈内投与によって実施し得る。

以下に実施例をあげてこの発明を説明する。

［図面の説明］第１図は、Ａ４３１細胞によって分泌されたプローｕ−ＰＡがリン酸化されることを示す、アガロース（レーンＡｂ）へ結合させた５Ｂ４モノクロ一ナル抗体を使用した、３３Ｓ−標識（第１Ａ図）および３２ｐ−標識（第１Ｂ図）したＡ４３１細胞およびＨＴ−１０８ｏＩＩＩ胞培地の免疫沈降、レーンＣでは、グリシンブロックしたアガロースで培地を沈降させた。レーンＭは分子量マーカー。

第２図は、免疫沈降させた３ａｐ−プローｕ−ＰＡのプラスミンによる限定消化を示す、プラスミンで処理しくレーン２．３）、または処理しない（レーン０．１）標識培地からの重複免疫沈降、レーンＣは、標識培地をグリシンブロックしたアガロースでインキュベートした対暇の免疫沈降。

第３図は、３２ｐ−７０−ｕ−ＰＡにおけるリン酸化されたアミノ酸の測定結果を示す、免疫沈降した３２ｐ−培地を酸加水分解し、未標識のリン酸化アミノ酸マーカーの存在で、薄層プレート上で高圧電気泳動により分析した。

第４図は、外来性の２本１ｌｕ−ＰＡがＡ４３１細胞培地でリン酸化されないことを示す、　Ａ４３１．Ｊ胞の３２ｐ−標識培地の免疫沈降。

標識期間中、未標識の２重鎖ｕ−ＰＡを添加せず（レーン−）、または７．５μ ｇを添加（レーン士）、レーンＣは対照の免疫沈降。

レーンＭは分子量マーカー。

第５図は、細胞内のプローｕ−ＰＡがリン酸化されることを示す。

２組のＡ４３１ｍ胞を３ＳＳ−メチオニン（パネルＡ）または１２ｐ−オルトリン？！！（パネルＢ）で標識し、酸洗浄して、溶解した。レーンＡ、Ｃは対照の免疫沈降物、レーンＢ、Ｄは抗体５Ｂ４との免疫沈降、レーンＭは分子量マーカー。

第６図は、ＰＭＡ処理したＡ４３１細胞における１０−ｕ−ＰＡのリン酸化および分泌のパルスチェイス実験の結果を示す。

パネル左：ＰＭＡ処理したＡ４３１細胞を３２Ｐ−オルトリン酸で７時間標識し、該洗浄して、標識した培地を除き、通常のＤＭＥ八１へ置き換えた。チュイス時間は１６時間続けた。レーン１：分子量マーカー、レーン２ニア時間標識した培地からの免疫沈降、レーン３ニア時間標識期間終了時に酸洗浄した細胞溶解物の免疫沈降、レーン４：１６時間チェイス後の培地からの免疫沈降、レーン５：１６時間標識期間後、酸洗浄した細胞溶解物の免疫沈降。

パネル右：Ａ４３１細胞を３２ｐ−オルトリン酸で１８時間標識し、標識培地を通常のＤＭＥＭで置き換えて、未標識リン酸含有培地で３．５．８．１１時間追跡した。各時間毎に培地分免疫沈降した。

ｒプレーチェイス」のマークを付けたレーンは、１８時間標識した終了時に培地の免疫沈降を行ったことを示す。

第７１２１は、受容体結合したプローｕ−ＰＡがＡ４３１４Ｂ胞でリン酸Ｃヒされることを、標識したＡ４３１細胞の酸洗浄物からの３２Ｐ−プローｕ−ＰＡの特異的免疫沈降によって示す。レーン１：対照免疫沈降。レーン２＝モノクローナルｆ体５Ｂ４との免疫沈降。

第８図は、受容体結合がプローｕ−ＰＡのリン酸化に必要でないことを示す　１ｓＳ（レーン１〜３）および３２Ｐ（レーン４〜７）で標識したＡ４３１！胞の順化培地および酸洗浄物の免疫沈降、ｕ−ＰＡの受容体結合に競合する０、１ｍＭ合成ペプチド［ｕ−ＰＡ（１２−３２）　ａ　Ｉ　ａ、１９コの効果を示す、レーン１ａ、１ｂはそれぞれペプチドの存在または存在なしでインキュベートした３５３−細胞の酸洗浄物の免疫沈降、レーン２．４．５はペプチドの存在なしでインキュベートした細胞からの順化培地の免疫沈降、レーン３．６．７はペプチドの存在でインキュベートした細胞からの順化培地の免疫沈降。

第９図は、３ＳＳ−および３２ｐ−標識したＡ４３１順化培地がら免疫沈降し、１ラスミン処理した７０−ｕ−ＰＡのＰＡＩ−１への結合を示す。

レーンＭ：分子量マーカー。

レーン１，４：免疫沈降したＡ４３１培地からの未処理３２ｐ−および３５Ｓ− 標識７ｏ−ｕ−ＰＡ。

レーン２．５：上記と同じ、プローｕ−ＰＡのプラスミン処理後。

レーン３．６：レー〉・２．５と同じ、Ｐ、Ａｌ−１へ結合ｆ＆（ＰＡｌ−１のプローｕ−ＰＡに対する割合、１２．５）。

第１０図は、３２ｐ−標識プローｕ−ＰＡのトリプシン消化によって生成したペプチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離の結果を示す。

第１１図は、プローｕ−ＰＡへアチドの３０１−３１３をキモトリプシンで処理した結果を示す。

第１２図は、３２ｐ・標識プローｕ−ＰＡのトリプシン消化から生じたペプチドをＦｅ”−キレート・セファロースカラムへ負筒した結果を示す。

第１３図は、Ｆｅ”−セファロースのバッチ溶出による３Ｓｓ−、（先端）およびｍ２ｐ−（下端）分画の５ＤＳ−ポリアクリルアミド（１２゜５％）ゲル分析の結果を示す、３ｉ！元条件下にゲルを泳動した。

レーンＭ：分子量マーカー。

レーン１：インキュベーシヨジ後の上清。

レーン２　：　０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３）による溶出。

レーン３：レーン２と同じ（ｐＨ４）。

レーン４：レーン２と同じ（ｐＨ５）。

レーン５：レーン２と同じ（ｐＨ５，５＞。

レーン６：レーン２と同じ（ｐＨ６，５＞。

レーン７：１％酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０）による溶出。

レーン８：レーン７と同じ（ｐＨ８，０）。

レーンＫＰ−１ニリン酸カリウム−０，５Ｍ　ＮａＣ］　（ｐＨ８，０＞による溶出０画分１゜レーンＫＰ−２：レーンＫＰ−１と同じ０画分２゜レーンＫＰ−３：　０．ＩＭ　ＥＤＴＡ−０，０５Ｍ　　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５＞、０．５Ｍ　ＮａＣ］による溶出。

記号「プロ」は１本鎖７０−ｕ−ＰＡの移動を表す、記号ｒＢ、および「Ａ」は２重鎖ｕ−ＰＡのＡ鎖およびＢ鎖の移動を表す。

第１４図は、１ｓ３−プローｕ−ＰＡのＦ　ｅ　”−キレート・セファロースカラムからの溶出物のｐＡｒ−ｉ感受性検定の結果を示す。

［実施ＦＡ］（材料および方法）（試薬）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＝３−トリメチルシリル−１−プロパンスルホンｉｆｆ　（ＤＳＳ）　、アプロチニン、ロイペプチン、ベンズアミジン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ＞、オルトバナジン酸すトリウム、およびプラスミンはシグマ社から、アガロースはＢＲＬ社から、ダルベツコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、メチオニンを含有しないＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ、リン酸を含有しないＤＭＥＭ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、透析したウシ胎児血清（ｄＦＢＳ）およびグルタミンはギブコ社からそれぞれ入手した。

３５Ｓ−メチオニン、３２ｐ−オルトリン酸、および”Ｃ−分子量マーカー（高領域）はアマージャム社から入手した。タンパク質結合に使用するアフィゲル、アクリルアミド、ビス−アクリルアミド、テメソド、過硫酸アンモニウム、ブロモフェノールブルーはバイオラド社から、エンライトニングはＮＥＮ社から入手した。

５Ｂ４モノクロ一ナル抗体（ノリら、１９８６年）はレベチットＳ、ｐ、Ａ、ラボラトリーズ（ミラノ、イタリー）から入手した０合成ペプチド［ｕ−ＰＡ（１２−３２）ａ　ｌ　ａｌ　９コ　（アベラら、１９８７年）はエットーレ・アペラ氏（ＮＩＨ）の厚意により提供された。

（細胞系）Ａ４３１細胞系（ファブリカントら、１９７７年、ストッペリら、１９８６年）は外陰部表皮ガンを有する８５才の女性に由来するものである。この細胞系は、 ■、パスタン（ＮＩＨ、ベセスダ、マリ−ランド、米国）から入手した。ＨＴ１０８０４ｆｌ胞系（アンドリーセンら、１９８６年）は３５才の白人男性の寛骨臼の近くに生じた繊維肉腫に由来するものである。この細胞系は、Ｋ、ダネーの研究室（コペンハーゲン、アンマーク）から入手した０両細胞系とも、１０％ＣＯ，大気中で、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で組織培養皿へ粘着して増殖した。

［実施例１］生体内でのプローｕ−ＰＡのリン酸化ヒト細胞系によって分泌されたプローｕ−ＰＡがリン酸基を保有しているかどうかを測定するため、下記の方法により、Ａ４３１ｍ胞を３２ｐ−オルトリン酸で標識した。

（方法）（細胞標識）１日日：１０％ＦＢＳ十ＤＭＥＭ　　１０ｍ１を加えた１０ｃｍ皿にＡ４３１細胞またはＨＴ１０８０細胞を、１．５Ｘ１０’の細胞密度で播種し２４時間増殖させた。

２日目：培地を細胞から吸引し、メチオニンまたはリン酸を含有していないＤＭＥＭ＋５％ｄＦＢＳ　　５ｍｌで置き換えた。６時間後に、この培地をさらにメチオニンを含有せず３５９−メチオニン４００μＣｉを含有する培地２ｍｌ、またはリン酸を含有せず３２Ｐ−オルトリン酸６００μＣｉを含有する培地２ｍｌのいずれかと置き換えた。標識期間は１８時間である。

３日目：３５Ｓ−および３２ｐ−順化培黄培地をパスツールピペットで採取し、ヘラエウス・セパチック・ラボヒュージＴにより、室温で１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、死滅細胞および細胞残滓を除去した。遠心終了後、上滑を採取し、以下に述べる免疫沈降処理の出発物質として使用した。

（免疫沈降）段階１：各試料に３５８−標識培地０．３ｍｌおよび３２ｐ−標識培地１ｍｌを使用し、それぞれリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ　：　０．２２Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ，（ＰＨ７，０）、０．２Ｍ　ＮａＣ１，０，４％トリトンＸ−１００）０．１ｍｌおよび０．３ｍｌずつを室温で添加した。

段階２：実際の免疫沈降（ストッペリら、１９８６年）は５Ｂ４モノクロ一ナル抗体を使用してアフィゲルへ結合し、４倍希釈したＰＰＢに１：１で懸濁を保って実施した。対照試料を同一条件に保ち、グリシンブロックしたアフィゲルでインキュベートした。使用した５Ｂ４の容量は全反応容量の１７２５であった。室温でゆるやかに振とうしながら１時間インキュベーションを実施した。

段階３：反応試験管を微量遠心機で１１００００Ｘで３分間遠心し、上清を棄てた。ベレットを４倍希釈のＰＰＢに再浮遊し、工・ンベンドルフ微量遠心機で３分間遠心した。これと同じ処理をさらに３回繰り返した。

段階４：ついでペレットを溶出緩衝液（ＥＢ　：　０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ　（ＰＨ２，５）、０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％トリトンｘ−１００）０．４ｒｎｌに再浮遊し、ゆるやかに振とうしながら室温で１５分間インキュベートした０段階３の記載と同様に試料を遠ノＣル、上清を回収した。

段階５：チトクロームＣ（７０μｇ）を担体として加えたトリクロロ酢酸（最終濃度：２０％）で上清を沈降させた。これを水上で２０分間インキュベートして、段階３の記載のように遠心した。ペレットをジエチルエーテル１ｍｌで洗浄し、遠心し、さらにアセトン１ｍｌで洗浄して、遠心し、空気乾燥した。

段階６：ペレットをラエムリ緩衝液（ラエムリ、１９７０年、参照）（０，１４Ｍトリス（ｐＨ６，８＞、２２．４％グリセリン、６％５ＤＳ）５０μｌに再浮遊し、１’２．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥへ負荷した７予め標識した＋４０−分子量マーカー（高領域）５μｍにこれと同一の処理を加え、同じゲルへ負荷した。ラエムリの報告（１９７０年）のように１２％ポリアクリルアミドで電気泳動を実施した。

３２ｐ−試料を含有しているゲルを、直接、バイオラド・ゲル乾燥機で真空下に２時間乾燥した。３５Ｓ−試ｔ４を含有しているゲルの場合は、２５％メタノール、１０％酢酸で固定し、エンライトニング（ＮＥＮ）に埋め込んで乾燥した。

乾燥したゲルを、ついでエンライトニングプラス・スクリーンを備えたオートラジオグラフィーカセット（デュポン）で、コダックＸ−ＯＭＡＴフィルムを使用して露光した。

（結果）標準的な実験では、抗体５Ｂ４を使用した場合に現れるプローＵ−ＰＡの大きさく４７キロダル１〜ン）の３５３−または３２ｐ−標識したタンパク質が認められる。これとは対照的に、グリシン１０ツクしたアガロースでインキュベーションしたレーン（対照の免疫沈降）ではバンドが認められなかった（第１図）。第１図に示した成績はＡ４３１およびＨＴ１０８０細胞に関するものであって、１）ずれも同一の結果が得られた。したがって、少なくともこれら２つの異なった細胞系で生合成されたプローｕ−ＰＡはリン酸化されている。

［実施例２コ１０−ｕ−ＰＡの最小リン酸化部位数の測定（方法）セリンプロテアーゼであるプラスミンが１本鎖４７Ｋｄのプローｕ−ＰＡを特定部位で切断し、２本の鎖（３０Ｋｄおよび１７Ｋｄ）を有する分子を生じることが知られている（ストツベリら、１９８６年）、この分子は酵素的性質をなお保有している。Ａ鎖（１７Ｋｄ）は調節ドメインを含んでおり、Ｂ鎖は触媒性ドメインを有している（ストッペリら、１９８５年、ストツペリら、１９８６年）。

この性質を利用して、実施例１で得られた４７Ｋｄのバンドが、実際にプローｕ −ＰＡであるのかどうかを検討した。そこで実施例１と同一の条件下で、Ａ４３１ａ！胞の標識を３″Ｐ−オルトリン酸で実施し、段階６までの免疫沈降を行った。

ＴＣＡａ降から得られたベレットを、プラスミンの存在（１７５μｇ／ｍｌ濃度）または存在なしでトリス−ＭＣＩ（ｐＨ６）３０μｍに再浮遊させた。ついで試料を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了時に、２ ×ラエムリ緩衝液（実施例１）３０μｌを添加し、試料を煮沸したのち、実施例１の記載と同様番こ５ＤＳ−ＰＡＧＥへ負荷した。

（結果）異なった大きさの２本の鎖（１７Ｋｄおよび３０Ｋｄ）を生じるプローｕ−ＰＡのプラスミンによる切断から予期されたように、対照試料の単一の４７Ｋｄバンドと反して、免疫沈降した３２Ｐ−標識Ａ４３１細胞順化培地のインキュベーションからは、１７Ｋｄおよび３０Ｋｄの２本のバンドが生じた（第２図）、シたがって２本の鎖は、少なくともそれぞれ１ケ所ずつリン酸化部位を含んでいるに違いない、したがってリン酸化されたプローｕ−ＰＡは最低２ケ所のリン酸化部位を有する。

［実施例３］リン酸化したアミノ酸の測定リン酸化したタンパク質は、セリン、トレオニ〉またはチロシンと共有結合しているリン酸基を有し得る。どのアミノ酸が関与しているのかを決定する１つの方法は、タンパク質の全加水分解を実施して、これを分離し、ホスホアミノ酸を同定する方法である。

（方法）細胞標識およびリン酸化したプローｕ−ＰＡの羊離Ａ４３１細胞のｌ　Ｑｃｍ皿３枚を３２ｐで標識して、実施例１の記載のように培地を免疫沈降した。実験の３２Ｐ−免疫沈降対照を使用して５ＤＳ−ＰＡＧＥと実施した〈実施例１参照）、予め染色した１４Ｃ−分子量マーカーは、標識した１０−ｕ−ＰＡを含んでいるゲル領域をつきとめるのに役立った。

段階１ニアクリルアミドゲル切片をプローｕ−ＰＡバンドに対応して切り出した。

段階２ニゲル切片を１％ＳＤＳ　　１ｍｌに加えて１５分間煮沸し、ウルトラツラックス・ホモジナイ゛ザーを使用してホモジナイズし、４５００ｒｐｍで１５分間遠心した。

段階３：上清を採取し、冷アセトン５容量および担体としてＢＳＡ　　５０ｐｇを添加し、−１５℃で３０分間インキュベートした。

（１Ｍ加水分解）段階１：試料を４５００　ｒ　ｐ　ｒｎで１５分間遠心した。タンパク質ベレットをエーテル／エタノール（１：Ｈ容量））で洗浄し、最後に６Ｎ　ＨＣＩ　１ｍｌに浮遊させた。

段階２：試料を１１０℃で９０分間加水分解し、ついで水で希釈して１夜凍結乾燥した。

（ホスホアミノ酸の分離）段階１：冷ホスホセリン、冷ホスホトレオニンおよび冷ホスポチロシンを２ｍｇ／＋ｎｌずつそれぞれ含有している水２０μｍに乾燥した試料を加え、マツケリー−ホーゲル１００μｍ薄層プレートで酢酸／ピリジン／水（５０：５：９４５）を使用して、ｐＨ２，５，１０００ボルト、４℃で１時間、−次元薄層電気泳動を行った。

段階２二泳動後、セルロースプレートを乾燥して、ニンヒドリンで染色し、コダックＸ−ＯＭＡＴ　Ｘ線フィルムｔ＼露光し、３２ｐ−リン酸化したアミノ酸を検出した。

（結果）遊離のリン酸以外に、プローｕ−ＰＡの加水分解物から検出できた唯一の標識成分は、未標識のホスホセリンマーカーとともに移動したスポットだけであった（第３図）、免疫沈降の陰性対照（グリシンブロックしたアガロース試料、実施例１参照）でこれと同じ処理を行った対照試料では、そのようなスポットは現れなかった（図には示さない）。

［実施例４］プローｕ−ＰＡリン酸化の細胞部位の測定プローｕ−ＰＡのリン酸化が、標識期間中に細胞培養培地で起こる人為的な結果かもしれない可能性を棄却するため、標識期間中、２本鎖ウロキナーゼを細胞へ添加して、これがリン酸化されるがどうかを試験する下記の実験を実施した。

（方法）！１階１：２枚の１０ｃｍ組織培養皿のＡ４３１細胞を飢餓状態にし、実施例１の記載のように３２ｐ−オルトリン酸で標識した。２枚の皿のうちの１枚の培地には、標識期間開始時から終わりまで冷ウロキナーゼ７．５μｇを補給した。一方の皿は実験対照とした。

段Ｗｉ２：インキュベーション終了時、順化培地のアリコート（１ｍｌ）を皿から取り、実施例１と同様な免疫沈降処理を行った。試料は２回ずつ分析した。

段階３：還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ついで実施例１と同様なオートラジオグラフィーを行うことによって、実験の結果を可視化できた。

（結果）プローｕ−ＰＡを分泌した後の細胞培養培地でリン酸化が起こり得るならば、外部から添加したウロキナーゼもまたリン酸化できることが期待されよう、ゲル電気泳動の結果は、これに反して両実験例とも単一の４７Ｋｄのバンド（プローｕ −ＰＡ）だけが存在し、未標識の２木調尿ウロキナーゼがインキュベーション培地に存在している場合でも、２本鎖ウロキナーゼの標識を表す筈の３０Ｋｄおよび１７Ｋｄのバンドを伴わないことが判明したく第４図）、シたがって少なくともこの条件下では、実施例１で観察されたようなリン酸化を説明できる分泌または表面結合をしている因子は存在しないと結論した。

［実施例５］プローｕ−ＰＡの細胞内リン酸化実施例４で報告した結果から、プローｕ−ＰＡは分泌される前にリン酸化され得ることが示唆される。この点を検討するため２つの異なった実験を計画した。

（方法）段階１：標識し、酸洗浄したＡ４３１細胞（実施例８参照）を溶解して、免疫沈降により試験した。酸洗浄後、細胞をリン酸緩衝化食塩水で２回洗浄し、ゴムポリスマンで削り取り、１本の試験管に集めて、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。

段階２：上清を棄てて、ペレッ゛トを細胞溶解緩衝液（２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７，５）、１％トリトンＸ−１００、ｉｏ％グリセリン）２＋ｎｌに再浮遊した。細胞を３０秒間撹拌し、微量遠心機で１１００００ｒｐ、４℃で３０分間遠心した。

段階３：上清を免疫沈降および実施例１に記載した５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理に掛けた。

（結果）陰性対照では現れないプローｕ−ＰＡの分子量（４７Ｋｄ）に対応するバンドが観察された（第５図）。したがって酸洗浄したＡ４３１細胞の溶解物中に標識したプローｕ−ＰＡが存在し、それが細胞内にあることが判る。

［実施例６］プローｕ−ＰＡのパルスチェイス標識（方法）段階１：Ａ４３１細胞の１０ｃｍ皿４枚を１夜飢餓状態にして、３２ｐ−オルトリン酸または３５Ｓ−メチオニンで標識した。ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ’）を５０ｎｇ／ｍｌ濃度で７時間存在させると、Ａ４３１細胞のプローｕ−ＰＡ産生量は増大する（ストッペリら、１９８６年ａ）。

段階２；リン酸を含んでいない無血清ＤＭＥＭで細胞を２回洗浄し、実施例５の記載のように酸洗浄と行った。

段階３：２枚の皿に実施例５記載の細胞溶解Ｍ衝液を添加し、得られた溶解物を凍結した。残りの２枚の皿に、５０ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡを添加した無血清ＤＭＥＭ　２ｍｌ　（この場合はリン酸を含有）ずつをそれぞれ添加し、ついでこれを１０％ＣＯ□大気下で３７℃で１６時間インキュベートした。

段階４ニブレート３および４を再度酸緩衝液で洗浄し、細胞を溶解した（段階３参照）。

段階５：実験のすべての溶解物および培地を免疫沈降し、５ＤＳ−ＰＡＧＥに掛けな（実施例１および５参照）。

（結果）測定したすべての試料で４７Ｋｄのバンドが現れたが、インキュベーション培地と新しい未標識培地と置き換えると、予め合成された標識したプローｕ−ＰＡが分泌され蓄積されることが、その相対強度から判る（第６図、左パネル）、この実験によって、プローｕ−ＰＡは最初にリン酸化され、ついで分泌されることが判明した。

［実施例７コ蓄積の時間的経過（方法）段階１：Ａ４３１細胞の６ｃｍプレート５枚を飢餓状態にして。

実施例１の記載と同様に標識した。１夜インキユベーシヨンしたのち、培地をリン酸含有無血清ＤＭＥＭ　０．７５ｍ１に置き換えて、各プレートをそれぞれ時間を変えてインキュベートした（３時間、５時間、８時間、１１時間、２４時間）。

段階２：インキュベーション後、それぞれ０．７５ｍ１ずつを取り、免疫沈降して、実施例１の記載と同様に分析した。

（結果）プローｕ−ＰＡのバンドは、インキュベーション３時間でかすかに認められ、その強度は時間とともに増大して、培地に蓄積していることが判る（第６図、右パネル）。

［実施例８］受容体結合型プローｕ−ＰＡはリン酸化される受容体へ結合しているウロキナーゼまたはプローｕ−ＰＡを選択的に除去する方法は、既に報告されている（ストッペリら、１９８６年）。そのような方法を用いて、受容体結合型プローｕ−ＰＡもリン酸化されるかどうかを測定した。

（方法）段ｔａｌ：８０％集密的なＡ４３１！胞の１５ｃｍ組織培養皿１０枚を、リン酸飢餓状態にして、実施例１の記載のように標識した。

これと並行して、別の皿でメチオニン飢餓状態にして、”６−メチオニンで標識した。

段階２：標識した培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回ｆｃ浄し、ついで酸緩衝液（５０ｍ　Ｍグリシン、１００ｍＭ　ＮａＣ１＜ｐＨ２゜５））３ｍｌを添加して、プローｕ−ＰＡ）ｙ子を受容体から除いた２段階３：酸洗浄物各１ｒｎｌずつ゛の試料３個を、グリシンブロックしたアガロースで１時間室温で前装置し、免疫沈降処理の間に起こる可能性のある非特異的な結合を完全に除いた。

段階４：試＄−１と微量遠心機で遠心し、５Ｂ４抗体と免疫沈降し、実施例１の記載と同様に５ＤＳ−ＰＡＧＥ／＼掛けた。

（結果）４５Ｋｄの分子量に対応するバンドが観察された。このバンドは酸洗浄物からの３２ｐ−標識および３ＳＳ−標識した免疫沈降の両者で認められた（第７図）、シたがって酸洗浄物はリン酸化されたプローｕ−ＰＡを含有している。

［実施例９］ウロキナーゼ受容体はプローｕ−ＰＡのリン酸化プロセスに関与するか成長因子と成長因子受容体との間の多くの相互作用は、リン酸化反応を伴う、ある種の受容体はプロティンキナーゼそのものである（ハンター、１９８７年）。

ウロキナーゼ受容体は、内因的・に産生されたプローＬｌ　−Ｐ　Ａとの相互ｆ￥用の際に類似の反応を媒介し得る。分泌されたプローｕ　−Ｐ　、Ａが受容体と結合できない条件下で、即ち過剰の拮抗剤、合成ペプチドＣｕ−ＰＡ（１２− ３２）　ａ　ｌ　ａ　１９］　　（アベラら、１９８７年）の存在で細胞を標識した。

（方法）合成ペプチド［ｕ−ＰＡ（１２−３２）ａ　Ｉａ１９］は、ヒトのプローｕ　− Ｐ　Ａの１２−３２残基に対応するアミノ酸配列を有する。このペプチドは、ウロキナーゼ受容体との結合に対してプローｕ−ＰＡと競合する（アベラら、１９８７年）。

下記の処理を行った。

段階１：８０％集密的なＡ４３１細胞の１０　ｃ　ｍ組織培養皿２枚を、１夜リン酸飢餓状態にした。

段階２：培地を除去して、細胞をＰ、ＢＳで２回、ついで酸緩衝液（５０ｒｎＭグリシン′、１００ｍＭ　　ＮａＣ］　（ｐＨ：ｊ５））２ｍｌで５分間洗浄し、表面結合したウロキナーゼを除いた。ついで０．５Ｍ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７，０＞０．５’ｍｌの添加によって細胞を速やかに中和した。

段Ｉ＠３ニリン酸を含有しない無血清培地２ｍｌを両プレートへ添加した。２枚のうちの１枚は、ペプチドを最終濃度１００μＭ含有しており、両者を４℃で３０分間インキュベートした。

段階４：３２Ｐ−オルトリン酸６００μＣｉを添加した。標識期間は６時間であり、３７℃で標識を実施した。

段階５：標識培地を取り、その８００μＩを免疫沈降して、実施例１の記載のように分析した。

これと並行してＡ４３１の６ｃｍ皿２枚を、１夜メチオニン飢餓Ａ（１２−３２）ａｌａ１９］　’ｒ金含有せたく最終濃度＋１００μＭ）、細胞を４℃で３０分間インキュベートし、ついでゝ５Ｓ−メチオニン３００μＣｉで６時間３７℃ で標識し、ＭＷ衝液６００μｌで再度洗浄した。標識した培地１へ０μｌおよび酸洗浄物６００μｍの試料を実施例１の記載のように免疫沈降した。

免疫沈降後、３２ｐで標識した試料および３５３−メチオニンで標識した試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥに掛けた。

（結果）１．３５３−標識物からの酸洗浄物の免疫沈降で見られたように、ペプチドの存在は、受容体へ結合したブローｕ−ＰＡ量の著しい低下を生じる（第８図、レーンｌａ、ｌｂ）。

２、ペプチドの存在で１Ｉ２ｐ−オルトリン酸で標識した細胞では、ペプチドの存在なしで標識した対照と比べて、順化培地から免疫沈降した４７Ｋｄバンドの強度になんら低下を示さなかった（第８図。

レーン４〜７）。

したがって大部分のリン酸化は、プローｕ−ＰＡのウロキナーゼ受容体との相互作用によるものではないと結論される。Ｓ胎内に存在するプロティンキナーゼが、プローｕ−ＰＡリン酸化の原因であるに違いない。

［実施例１０］リン酸化したプローｕ−ＰＡのＰＡＴ−１阻害因子Ｉ＼の結合リン酸化は、ある種のタンパク質の生物学的活性および／まなは酵素的性質を調節する手段である（ハーグリープズら、１９８６年、サザーランド、１９７２年、バル−およびフィッシャー、１９８６年、コーエン、１９８８年）。

ウロＮナーゼプラスミノーゲン活性化因子は、池の３種の分子、。−ＰＡ受容本、ｕ−ＰＡ＠害因子、および基質プラスミノーゲンと相互作用て゛きることが知られている６したがって特異的なセリン残基のリン酸化によって、そのような活性へ影響があるかも知れないという疑問が起こり得る。

Ｐ、ｌ−１阻害因子は、非可逆的な形でウロキナーゼの活性部位へ結合し、その酵素活性を遮断することが知られている（アンドリーセンら、１９８６年）、リン酸化した分子を可視化し得る唯一の手段である、Ａ４３１プローｕ−ＰＡ９代謝的に３２Ｐ−標識する手法をすり用して、リン酸化しなｕ−ＰＡが、なおＦＡＩ・−１＠害因子と結合できるかどうかを試験した。

段階１：代謝的に標識したプローｕ−ＰＡの作成：Ａ４３１ｇ胞の３５Ｓ−順化培地０．５ｍｌおよび＞２Ｐ−順化培地２．５ｍｌ　ＨＭＩ製し、実施例１の記載のように免疫沈降した。

段階２：標識したプローｕ−ＰＡのプラスミン処理：ＴＣＡ４Ｑさせた試料を１００ｍＭ　Ｈｅｐｅ　５（ｐＨ７，５）５０μｌに再浮遊し、プローｕ−ＦＡＩ μｇ当りプラスミン２μｇと３７℃で３０分間インキュベートした。ついでアプロチニン１０μｇを添加して、反応を停止させた。

段階３：精製した阻害因子ＦＡＩ−１（アンドリーセンら、１９８６年、アンドリーセンら、１９８６年ａ）の活性化：ＦＡＩ−１阻害因子４３μｇ／２００μ Ｉに等容量の８Ｍグアニジンを添加して３７℃で１時間インキュベートした。ついで試料をＰＢＳ＋ＢＳＡ　１００μｇ／ｍｌで１０倍希釈し、セントリコン型チューブ（ＡＭＩＣＯＮ＞を使用して透析した。ＰＢＳで希釈し、ついで３５００ｒｐｍで９０分間遠心して、最終濃度１０ｍＭまでグアニジン濃度を低下させた。活性化−透析過程を終え、阻害因子を約４３μｇ７２００μｍの濃度で回収した。

段階４　：　”Ｐ−標ｍした２本ｆｉｕ−ＰＡのＰＡＩ−１への結合：ＰＡＩ− １とｕ−ＰＡの異なった比を用いて、適切な結合条件をｊ２５１−尿ウロキナーゼで試験した。８：１の比でも、３３にバンドを複合体ｕ−ＰＡ／ＰＡＩ−１の６８にバンドへ完全転換することが十分に可能である。還元条件下で５ＤＳ−ボリアクルアミドゲルによって分析するには、ｕ−ＰＡへ転換した３２Ｐ−プローｕ−ＰＡ約２．５μｇ（または５ｓｃ３−プローｕ−ＰＡの０．５μｇ）を、活性化し透析したＰＡＩ−１約２０μｇ７９３μｌ（または６μｇ）と室温で１時間インキュベートした。インキュベーション終了時、試料にラエムリＭ衡液を添加して煮沸し、１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥへ負荷した。

（結果）第９図に示したように、プラスミン活性化した３ＳＳ−標識−ｕ−ＰＡはＰＡＩＩと約９２Ｋｄの複合体を生成するが、プラスミン活性化した５ｉｐ−標識−ｕ　−Ｐ　、Ａでは認め得る量の複合体を生成しない。

（結論）１．リン酸化したＬｌ　−Ｐ　、Ａは、３５３−標識−ｕ−ＰＡより低効率でＰＡｌ−１／＼結合する。しかしリン酸化したプローｕ−ＰＡもプローＵ−ＰＡも、ともに同一効率で２重鎮形へ転換される。したがってリン酸ｆヒされたｕ−ＰＡは全体のｕ−ＰＡの一部を表しているに過ぎない。

２　生合成のプローｕ−ＰＡは一部だけがリン酸化されているのであるから、好適なプロティンキナーゼで試験管内リン酸化することによって、リン酸化されたプローｕ−ＰＡの百分率を増大することができる。

３、リン酸化したプローｕ−ＰＡが複合体生成能がないことは、活性部位またはその近くで修飾されるためであり得る。このことは必ずしも活性の低下または喪失を意味しないが、その可能性が考えられる。

４、リン酸化したｕ−ＰＡがＰＡＩ−１へ結合能がないことは、可溶性の受容体結合型プロ〜ｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡの半減期を延長するに違いない。したがって生合成されたプローｕ−ＰＡおよびｕ−Ｐ、へは阻害因子の作用から遮Ｉ＼いされる、５、血栓溶解治療に使用されるＬｌ　−Ｐ　、Ａおよびプローｕ−Ｐ、Ａ医薬品にもこれと同じ結論が適用し得る。

［実施例］１コリン酸化部位の同定３２ｐ−プローＵ・ＰＡの還元、カルボキシメチル化およびトリプシン加水分解精製した３２ｐ−ブローｕ−ＰＡ約３０μｇと混合した精製した未標識−プローｕ−ＰＡ　　２００μｇをＴＣＡ−沈降して、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．２％ＥＤＴＡ、０．２Ｍ）リス−ＨＣｌ　（ＰＨ８，４）２５　ＪＺ　Ｉに再溶解し、０．５μＭジチオトレイトールを添加し、アルゴン大気下、３７℃で２時間インキュベートした。存在する一３Ｈ基の１．２５倍過剰のヨード酢酸を添加し、ｐＨ中性に保ち、さらに室温で３０分間インキュベーションを続けた。０．１Ｍジチオトレイトールの添加によって、還元およびカルボキシメチル化反応ご停止させた。ついでタンパク質を、２　（ｌ　Ｏｍ　Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐ）（８，０）に対して４℃で透析し、トリプシン（１０ｍＭＣａＣｈ溶液、１μｓ／ｍ＋）で１７時間室温で加水分解した。０．１％トリフルオロ酢酸で加水分解を停止し、これを溶液Ｂ（７０％アセトニトリル、０．０８％トリフルオロ酢酸）の０−１００％濃度勾配で、２７５μｌ／分の流速でＨＰＬＣＣ１８２ｍｍカラムへ通導した０個々の両分を採取して、その３２ｐ−放射能を測定し、放射活性画分をアプライド・バイオシステムズ・タンパク質配列分析装置４７７Ａ型で製造業者の指示に従って分析した。

ボスホベブチドのＦｅ３＋−キレート・クロマトグラフィー分離精製し、たプローｕ−ＰＡ（上記の１２ｐ−標識および未標識のタンパク質の混合物）を上記のようにカルボキシメチル化し、トリプシン消化した。ペプチド混合物を０．１Ｍ酢酸でＰＨ３，１に調節して、Ｆｅ３“−キレート・セファロースカラムへ負荷しくアンダーンンおよびポラス、１９８６年、ミッチェルおよびペンネット、１９８７年）、カラムを０．１Ｍ酢酸で洗浄し、酢酸／ＮａＯＨ１ｉ衝液（ｐＨ５）１０ｍｌで段階的に溶出し、蒸留水１０ｍｌで洗浄し、さらにｌＯｏ酢酸アンモニウム（ｐ　Ｈ７，５−）　１０ｍｌ、酢酸アンモニウム（ｐＨ８、０）　１７　ｍ　ｌ　、最ｆ＆ｉ、二０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７゜４）１０ｍｌで溶出した。各段階毎に数個ずつ画分を採取し、凍結乾燥し、シシチレーションカウンターて′計数し、ホスホアミノ酸配列分析に掛けた。

プローＵ・ＰＡペプチドのホスホアミノ酸の同定および測定陽イオン交換に基づくアミノ酸分析装置、および液層または気層における酸加水分解処理が既に報告されている（バークホルトおよびジエンセン、１９８９年）、ただしリン酸化したタンパク質またはペプチドは２〜４時間だけ加水分解した。加水分解物を乾燥し、０．１Ｍ　ＨＣｌに再溶解して、試料４０μＩを注入した。カラムをＡ溶媒（ｐＨ１，６＞（硝酸でｐＨ１，６へ滴定して、水で４：１に希釈）で３０分間平衡化し、リン酸化したアミノ酸をこの溶媒で溶出した（Ｓｅｒ−Ｐ−４，５３分、Ｔｈｒ−Ｐ、５．２３分、Ｔｙｒ−Ｐ、１６．６分）。

トリズシンベプチドおよびＳ−カルボキシメチル化部〉・バク質をアプライド・バイオシステムズ・クロマトグラフィー装＄　１３０　、Ａ型でＲＰ−）ＩＰＬＣにより分離した、カラＬ　（２２，Ｑ　Ｘ　２．１　ｍｍ、ＲＰ１８．５μＩ＋１）含０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの５−５０°。直線濃度勾配で５０分間溶出した。手動操作により両分を採取した。

（結果）第１０図に示したように、ＨＰ　Ｌ　Ｃ’）Ｔ　Ｍによって著しい放射能量を含んだ主として２つの両分を得た（画分２４および２５）。画分２４のアミノ酸配列分析によって、プローｕ−ＰＡの配列１３６−１４５　（ＫＰＳＳＰＰＥＥ、ＬＫ）［１文字アミノ酸記号を使用（ヨーロピアン・ジャーナル　オブ・バイオクミストリー、１３８巻、９〜３７頁、１９８４年）］、３０１−３１３　（ＥＮＳＴＤＹＬＹＰＥＱＬＫ）および３２４−３３８　（ＥＣＱＱＰ）ＩＹＹＧｓＥＶＴＴＫ）に対応する３種のペプチドを得た（第１表）。画分２５の配列分析からは、１３６−１４５および３０１　３１３の最初と同じ２種のペプチドに加えてプローｕ　−Ｆ’　、Ａの配列３７　４６（ＦＧＧＱＨＣＥＩＤＫ）を得たく第１表）。この最後の配列はセリンを少しも含有していないが、池の３種はセリンを含有している、ペプチド３０１−３１３のリン酸化は、ペプチドがＦ、　Ｎ　Ｓ　Ｔ　Ｄ　’ｌ’に短縮され、したがってそのＨＰＬＣ分離が変化するペプチドのキモトリプシン処理によってことによって証明できた（第１１図）。

他のペプチドがリン酸化されるかどうかを確認するため、ホウレンソウの光化学系■で以前に報告されたように（ミツチェルおよびベン′オ＝ｙｈ、１９８７年）、Ｆｅ”−キレ−ティング・セファＯ−ス（商標）カラムを使用して、標識されたプローｕ−ＰＡのホスホペプチドを羊離した。カラムをｐＨ３，０で負荷し、数回洗浄を試みるとｐ’＋　）］が徐々に増大した。２種の両分、水の両分およびリン酸カリウム溶出物（第１２図〉だけがなんらかの放射能物質を含んでいることが判った。Ｆｅ”−キレ−ティング・クロマトグラフィーの多数の両分をホスホアミノ酸および通常のアミノ酸について分析した。

その結果、リン酸カリウム溶出物である両分５２〜５５を除くすべての両分で、どのホスホアミノ酸も完全に存在しないことが判りた（第２表）０画分５２〜５５で゛は、ホスホセリンだけがリン酸化された唯一のアミノ酸であって、ホ５スホトレオニンまたはホスホセリンは観察できなかった。ホスホセリンの推定収率は（同−条件丁に検出したりシンおよびアルギニンの収率と比較して）、リン酸化部位が１分子当り１ケ所と推定すれば約５０％、１分子当り２ケ所と推定すれば２５％であった。このようにホスホアミノ酸分析の結果から、リン酸カリウムによって溶出される物質は実際にホスホセリン残基を含んでいたが、水両分はこれを含んでいないことが判った。したがってこれは、単離および加水分解処理期間中に遊離された遊離リン酸を表していることもあり得る。ホスホセリンを含有する両分をアミノ酸配列分析に掛け、プローｕ−ＰＡのアミノ末端配列を含んでいるペプチド５ＮＥＬ）ＩＱＶＰ、および先にＨＰＬＣ分離によって同定したその他の２種のペプチド、１３６−１４５および３０１　３１３からなる３ｍのペプチドを同定した（第３表）。

第１表　第１０図のＨＰ　Ｌ　Ｃカラムの画分２４および２５に含まれているペプチドのアミノ酸配列分析画分２４　　　　　　　　　　　　画分２５ＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫ　（１３６− １４５）　　　　　ＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫ　（１３６−１４５）ＥＮＳＴＤＹＬＹＰＥＱＬＫ　　（３０１−３１３）　　　　　　ＥＮＳＴＤＹＬＹＰＥＱＬＫ　　（３０１−３１３）ＥＣＱＱＰＨＹＹＧＳＥＶＴＴＶ　（３２４−３３８）　　　ＦＧＧＱＨＣＥＩＤＫ　（３７−４６）カッコ内の数字はプローｕ−ＰＡ配列における最初および最後のアミノ酸の位置を表す（バーブら、１９８４年）８各両分を上記のようにアミノ酸配列分析に掛けな、３種のペプチドを示している３種の異なった配列は、既知のプローｕ−ＰＡの配列との比較によって確定しな（バーブら、１９８４年）。

第２表　第１２図のＦｅ′＋−セファロースカラムの画分のホスホセリン（Ｐ− ｓ　ｅ　ｒ　）含量の測定（部位はピコモル）画分　　　　Ｐ”−５ｅｒ　　　　　Ｌｙｓ　　　　　　Ａｒｇ９〜１２　　　　０　　　９１〜１ｏｏ　　９７〜１１０１３〜２０　　　　　０　　　　４５〜７０　　　５０〜７６２６〜３２　　　　　０　　　　６４〜１１３　　６０（第２表つづき）両分９〜１２．１３〜２０および２６〜３２はそれぞれ１グループとして表し、その最低量および最高量だけ？示した。

第３表　第１２図のＦｅ”−セファロースカラムの画分５２＋５３のアミノ酸配列分析５ＮＥＬＨＱＶＰ　（］−８＞ＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫ　（１３６−１４５）ＥＮＳＴＤＹＬ’ｌ’ＰＥＱＬＫ　　（３０１−３］３）力１コ内の数字はプローｕ−ＰＡ配列における最初および最後のアミノ酸の位置を表す（バーブら、１９８４年）。２つの画分５２および５３をプールして、上記と同様にアミノ酸配列分析を行った。

３種の異なった配列が存在するので、既知の１０−ｕ−ＰＡの配列との比較に基づいて正しいペプチド配列を同定した。

（結論）３２ｐ−＠識したプローｕ−ＰＡのタンパク質化学分析から、セリン−３０３は確実にリン酸化部位であり、セリン−１３８および／または−１３９はリン酸化の可能性ある第２の部位であることが強く示唆される。セリン−１３８およびセリン−１３９周辺の配列から、この場合、カゼインキナーゼ■がリン酸化を進める酵素であり得る。

配列１−８および配列３２４−３３８は、多分リン酸化されないであろう、事実、第１の配列は１２ｐ−標識の際に標識されず（第１０図）、第２の配列はｐｅ３＋−セファロースカラムで保持されない。

Ａ４３１細胞によって合成されたプローｕ−ＰＡは、セリン−１３８およびセリン−１３９部位、およびセリン−３０３部位でリン酸化されると結論する。

［実施例１２］リン酸化−および非リン酸化−ブローｕ−ＰＡのクロマトグラフィーによる分離１０−ｕ−ＰＡのリン酸化機能を分析するのに必要な手段は、リン酸化した形と非リン酸化形の分離である。これによって機能水準および分子水準の両面からリン酸化酵素および非リン酸化酵素の特性分析が可能となり、該酵素のリン酸化または脱リン酸化による両形暦間の転換手段を発見できる手法を組立てることが可能となる。

（材料および方法）Ｆ）ＭＡ処理したＡ４３１細胞内で、ブローｕ−ＰＡを３うＳ−および１２ｐ− で標識し、実施例３の記載のように精製した。

Ｆｅ■−キレート・セファロースによるパッチクロマトグラフィＰＭＡ処理したＡ４３１細胞の”Ｓ−および３２ｐ−順化培地５ｍｌを、それぞれ酢酸でｐＨ３，０に調節し、Ｆｅ”−キレート・セファロース（ファーマシア）ｌｒ＋’＋Ｉとインキュベ−１・１、ミーＩチェルおよびベンネットの報告（１９８７年）のようにウシ血清アルブミン２ｒｎｇ／ｍｌで予め飽和した０、１Ｍ酢酸（ｐＨ３，０）で１　：　１　（ｖ：ｖ）浮遊液を調製した。室温で４５分間インキュベーションした後、試料を遠心し、上清を除いた。ついで残ったベレットに０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３）を添加し、室温で１５分間インキュベートし、遠心して、ｐＨ３溶出物質を採取した。

これと同じ緩衝液でｐＨ４，５，５，５，６および６．５．１％酢酸アンモニウムＭ衝液（ｐ　Ｈ７およびｐＨ８＞、および０．５Ｍ　ＮａＣ＋を含有する２００ｍＭリン酸カリウムＭ衝液（ｐＨ８，０）で、この処理を繰り返した。ｆｔ後に０．１Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、０５Ｍ）リス−ＨＣｌ［衝液（ｐＨ７，５）、０．５ＭＮａＣ１でカラムを洗浄した。

各上清ｌ＼リン酸カリウムを添加してＭ衝化し、実施例３の記載のように５８４モノクロ一ナル抗体で免疫沈降した。免疫沈降物を、ＳＤＳで１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した（ラエムリ、１９７０年）。

（結果）リン酸化したプローｕ−ＰＡの非リン酸化ブローｕ−Ｐ、Ａからの分離Ｆｅ”− キレート・セファロースからのバッチ溶出の結果舎弟１３図に示す、３５Ｓ−プローｕ−ＰＡはｐＨ５〜ｐＨ８の画分全体にそれぞれ分布して認められた。しかしリン酸カリウムによる溶出（ＫＰ）では、実質上、全体の約５０〜６０％と推定し得る３２ｐ−標識−プローｕ−ＰＡ量を遊離した。しかし３２ｐ−標識−ブローｕ−ＰＡの場合は、ｐＨ３〜８の間でほとんどまたは全く物質３溶出しなかった。

それらの大部分はカラムに粘着して、リン酸カリウムによって溶出される。このように処理はプローｕ−ＰＡのリン酸化形を分離する。

しかも分離はプローｕ−ＰＡだけに作用するのではなく、２重鎖Ｕ−ＰＡにも作用する。また３９３−および３２ｐ−標識された両物質の両分（負荷した物質からリン酸カリウム溶出まで）は、電気泳動を還元条件下に実施するので、プローｕ−ＰＡの４５バンドのほかに、プローｕ−ＰＡから分離された２重鎖ｕ−ＰＡのＡ鎖およびＢ鎖が追加的に現ノする。

（結論）第１３図に示した実験に基づき、）：’　Ｑ３＋−セファロースのバッチ式溶出は、非リン酸化プローｕ−ＰＡおよびｕ−Ｆ’Ａからりン酸化物を分離するのに使用できる。恐らくこの方法は、カラム溶出を使用するようにまで改良できる３［実施例１３］リン酸化したプロウロキナーゼ（プローｕ−ＰＡ）の触媒活性およびＰＡ［１に対する怒受性リン酸化−および非リン酸化−プロー（ｌ　−Ｐ　、Ａの特徴を分析するために、まず２つの形を分離することが必要である。この目的のため、Ｆｅ”−キし− ティング・クロマトグラフィーを使用した。ついで分離した形を、ＰＡニー１結合および特異的触媒活性について試験した。

（材斜および方法）ＰＭＡＩ　ＯＯｎｇ／ｒｎｌの存在でプローｕ−ＰＡを過生産するヒトＡ４３］細胞から未↑ダ識の１Ｏ−ｕ−Ｐ、Ａ：調製し、精製した（ストＩべりら一１９８６年）、これら′の条件下て、へ４３１細胞は未処理のＡ４３１細胞より少なくとも１０倍多量にプローｕ−ＰＡを産生ずる。

リン酸ｆヒーおよび非リン酸化−プローｕ−Ｐ、Ａ／ｕ−ＰＡの分離Ｐ　Ｍ　Ａ処理したＡ４３１．！胞を上記と同様に３５３−　Ｌ−メチオニンで標識し、標識したプローｕ−ＰＡを実施例３の記載のように精製した。リン酸化−および非リン酸化−プローｕ−Ｐ、Ａを実施例１１の記載と同様に分離した。個々の両分を実施例１１の記載のようにプールし、７Ｏ−ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡの等量混合物をＰＡ　Ｉ−１複合体生成について分析した　３５３．−１−−メチオニンによる低水準標識によって各試料の定量が可能である。

ＦＡＩ−１／ｕ−ＰＡ複合体の生成ｕ−ＰＡのＦＡＩ−１との相互ｆｔ用によって、共有結合のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ　）抵抗性の複合体が生じる（アンドリーセン、ニールセンら、１９８６年）、Ｐ、Ａｌ−１は活性型２本鎖ｕ−ＰＡとだけ相互作用し、１木調プローｕ−Ｐ、Ａとは作用しない。したがうて精製した１０−ｕ　−Ｐ　、Ａ物質に°は２本市ｕ−ＰＡ量が十分高いので、プラスミンで予め活性化しないで、これを使用した、複合体の生成は、前記のようにグアニジン−ＨＣｌで反応性にしたＰＡＩ−１で実施したくキュベリウスら、１９８９年）やプローｕ　−Ｐ　Ａ／ｕ　−ｐ　Ａの酵素活性の測定プラスミノーゲン標品にプラスミンが混入するため、プローｕ−ＰＡを２重鎖ｕ−ＰＡへ完全に活性化することが十分保証されるので（データは示さず）、１重鎖プローｕ−ＰＡを予めプラスミンで活性化せず酵素活性を測定した。ウシ・プラスミノーゲン８８μｇ７ｍｌおよび０．１７ｍＭ　Ｓ−２３９０１ラスミン基質（カビ、ビトルム、スエーアン）の存在で、４０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５＞で活性を測定した。時間を変えて室温で試料をインキュベートし、４５０ｎｍにおける発色を時間とともに追跡した。得られた値から酵素無添加で得られたブランク値を差し引いた。酵素活性を２０分間で発現する４５０ｎｍにおけるＯＤ値で表した。

（結果）リン酸化したプローｕ　−Ｐ　、Ａ　／　ｕ　−’Ｐ　ＡのＰＡＩＩ恣受性リンｈすヒ−および非リン酸化−ｕ−ＰＡのＰ、Ａｌｌ感受性を検定するため、３ＳＳ−プローｕ−ＰＡのＦ　ｅ　”−キレ−ティング・セファ０−ス・カラムの溶出物（第１３図）をプールＡ（ｐ）４３〜５．５）、プールＢ　（ｐＨ６〜６．５）およびリン酸カリウム溶出物（ＫＰ）の３群にまとめた。Ｆｅ”−セファロースへ掛けて精製した全体のプローｕ−ＰＡの試料と−・緒に、これと同数の３８８−放射能を含んでいるアリコートを各プール毎に取り、これらをｐＡＩ−１と、異なったＰＡ　Ｉ−１：　ｕ−ＰＡの比（０，２：　１〜ｌ　Ｏ：　１　）でインキュヘ−１−Ｌ、ついで５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光光度法によって分析した。各プールは、それぞれ１本鎮ブローｕ−ＰＡと２本ｇｕ−ＰＡの同−比を含有する。ＰＡ　Ｉ−１／ＩＪ−Ｐ、Ａ複合体の生成は、約９゜Ｋｄバンドの生成によって可視化することができる。第１４図に示したように、Ｆ’Ａｌ−１／ｕ−ＰＡ複合体に対応するバンドは、全体のプローｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ、Ａプール、プールＡおよびプールＢで発現するが、ＫＰ溶出物では発現しない６したがって等容量の２重鎖Ｕ−Ｐ、Ａを含有しているにもががわら゛ず、リン酸カリウムで溶出される物質は、＠！の試料と比較すると僅がしがＰ、Ａｌ−１と反応しない。

このようにリン酸化はｕ−ＰＡのＰＡＩ−１への結合を妨害する。

す〉′酸化したプロｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ、Ａの活性の測定同数の３４３−カウシ１〜８含有するＦｅ”−セファロースのバッチ式溶出で得られた両分のアリコー） −８７ラスミン特異性のある基質５−２３．９０とともに１ラスミンの存在で、酵素活性について検定した。その結果を第４表に示す、ＫＰ画分（即ち、リン酸カリウム緩衝液で溶出し、リン酸化したプローｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡを表している）は大刃物質く即ち、Ａ４３１細胞がら！＃離したプローｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡ）に匹敵する酵素活性を有する。推測し得る非リン酸化物質（プールＡおよびプールＢ）に関しては、リン酸化されたプローｕ−ＰＡ／ｕ　−Ｐ　Ａは２０〜３０％活性が低がった。国際ウロキナーゼ標準単位と比較すると、ＫＰプールの比活性は約８５０００１Ｕ／ｍｇであった９第４表　Ｆｅ３０−セファ０−ス　バッチ溶出によって分離したプローｕ　−Ｆ ’　、Ａ　／　ｕ　−Ｐ　Ａ画分の酵素活性全体　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４４゛プールＡＯ，５０プールＢ０．５５（ａ＞使用した画分は第１４図に示した実験と同一のものであり、同じ方法で標識した。

（ｂ）ｕ−ＰＡの活性は、室温で２０分間インキュベーションして発現するＯＤ４５０ｎｍで表し、酵素無添加の際のブランク値を差し引いて示した０画分毎に３８３−放射能のほぼ等しい値に対応する５μｍアリコートを、それぞれ使用した。

（結論）この成績は、リン酸化したプローｕ　−Ｐ　Ａ／ｕ　−Ｐ　ＡがＡ４３１細胞から＃、離した酵素とほぼ同程度の活性であることを明瞭に証明している。ただしそれは特異的阻害因子Ｐ、Ａｌ−１に対する不応性である。Ｐ、ｌ−１に対する選択的怒受性は、リン酸化したｕ−ＰＡの場合の方が少なくとも１０倍低い。したがってリン酸化されたｕ−ＰＡまたはプローｕ−ＰＡは、通常のプローｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡ治療の代替薬とすることができ、有効投与量を少なくとも１０倍減少させ得る。

〔実施例１４コブローｕ−ＰＡペプチドの試験管内リン酸化実施例１１で同定したホスホセリン残基１３８および１３９周辺のプローｕ−ＰＡの配列に似せてペプチドを合成し、そのカゼインキナーゼ■に対する基質としての作用能を試験した。

（材料および方法）自動固層ペプチド合成装置（４３０Ａ型、アプライド・バイオシステムズ）でペプチドを合成し、ウォーターズ５０１装置を使用したツバパックＣ−１８カラムによる逆層ＨＰＬＣによって精製した。

ペプチドを凍結乾燥し、０．１ＭＮりＥＳ（ｐＨ６，４）、２ｍＭ　ＥＧＴＡ、５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ２に溶解し゛た。カゼインキナーゼ■はラット脳から精製し、マギオらの報告＜１９８１年）のように検定した。

１００μＭペプチドおよび１０μＭＡＴＰ（γ−３２Ｐ−ＡＴＰＯ１５μＣｉを含有）を含有する溶液（最終審ｆｉ０．１ｍ１）でキナーゼ検定を実施した９試料を３０℃でインキュベートし、ＩＭＨＣｌの添加によって反応を停止した。ついで試料を沸とう湯浴で５分間加温し、等容量の０１％トリフルオロ酢酸を添加した。その他の例では、３０％酢酸を添加して反応を停止し、試料をイーガンらの報告（１９８８年）のように処理した。試料を逆層ＨＰＬＣカラム（ツバパックＣ−１８）へ負荷し、種々のアセトニトリル濃度勾配（０〜１００％）を用いて、０．５ｒｎｌ／分の流速で分画した。

両分０　、５　＋ｎ　ｌずつを採取し、放射能を７α体シンチレーションカウンターで測定したくチェレンコフ放射線）、若干の実験では、取り込まれない放射性ＡＴＰおよびペプチドをダウエックスＡＧＩ−Ｘ８カラムて′分離したく２０〜５０メツシｘ（０，６ｍｌ＞＋２０Ｃ）−４００メノシｘ　（０、２ｍ　ｌ）、３０％酢酸で平衡化）。

（結果）プローｕ−ＰＡペプチド１３３　１４３および無関係なペプチド■ＴＫＦＧＥＱＳＴＤ’ｌ’を試験した、その結果を第５表に報告する。

この結果から、ベフ゛チド・プローｕ−Ｐ、Ａ１３３−１４３はカゼインキナーゼ■の良好な基質であることが判明した。第１５図は取り込まれない放射能からのホスホペプチドのＨＰＬＣ分離を示す。

第５表　プローｕ−ＰＡペプチド１３：１　１４３のリン酸化ＣＴＲＰＥＰＩ　　　　ＰＥＰ２カゼインキナーゼＩＩ　　　　４０００　　４８０００　２５０００ＣＴＲ：ペプチドなしの取り込みＰＥＰＩ　：　ＩＴＫＦＧＥＱＳＴＤＹＰＥＰ２　：　ＤＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥ（プローｕ−ＰＡ１３３　１４３）［参考文献］アンダーソンおよびポラス（１９８６年）、アナリチカル・バイオクミストリー、１５４巻、２５０〜２５４頁。

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ストッペリ、ＭＰ、バーブ、Ｐ、グリマルジ、Ｇ、ロカテリ、ＥＫ、ブラシ、Ｆ、＜１９８６年）：インクリーズ・イン・Ｌｌ−ＰＡ　・ｍＲＮＡ・シンセシス・イン・ヒユーマン・カルシノーマ・セルズ・イズ・ア・プライマリ−・エフェクト・オン・ボテント・ツーマー・プロモーター・ＰＭＡ、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー、１０２巻、１２３５〜１２４１頁。

サザーランド、ＥＷ（１９７２年）：スタディーズ・オン・ザ・メカニズム・オン・ホルモン・アクション；サイエンス、１７７巻、４０１〜４０８頁。

バーブら（１９８４年）：アイデンティフィケーション・アンド・プライマリ− ・ジ−フェンス・オン・アン・アンスブライスト・ウロキネース・ポリＡ＋・ＲＮＡ；プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシス・オン・ＵＳＡ、８１巻、４７２７〜４７３１頁。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．リン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子を実質上含有しないリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子。
２．リン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化されたブロ− ｕ−ＰＡ。
３．実質上すべてのブロ−ｕ−ＰＡ分子が、実質上すべてのリン酸化可能な部分をリン酸化されている請求項２記載のリン酸化されたブロ−ｕ−ＰＡ。
４．リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子とリン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子の混合物からリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子を分離することを含んでなる、リン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子を実質上含有しないリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子の入手方法。
５．リン酸化されたアロ−ｕ−ＰＡとリン酸化されないアロ−ｕ−ＰＡの混合物からリン酸化されたブロ−ｕ−ＰＡを分離することを含んでなるリン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化されたブロ−ｕ−ＰＡの入手方法。
６．Ｆｅ３＋−キレーティング・クロマトグラフィーによって分離を実施する請求項４または５記載の方法。
７．（ｉ）プラスミノーゲン活性化因子を産生するヒト細胞系を培養し、（ｉｉ）このようにして生産されたプラスミノーゲン活性化因子を単離し、（ｉｉｉ）リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子をリン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子から分離することを含んでなる請求項４記載の方法。
８．（ｉ）ブロ−ｕ−ＰＡを産生するヒト細胞系を培養し、（ｉｉ）このようにして生産されたブロ−ｕ−ＰＡを単離し、（ｉｉｉ）リン酸化されたブロ−ｕ− ＰＡをリン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡから分離することを含んでなる請求項５記載の方法。
９．プラスミノーゲン活性化因子をリン酸化酵素でリン酸化することを含んでなるプラスミノーゲン活性化因子のリン酸化度を増大させる方法。
１０．ブロ−ｕ−ＰＡをリン酸化酵素でリン酸化することを含んでなるブロ−ｕ −ＰＡのリン酸化度を増大させる方法。
１１．リン酸化されていないプラスミノーゲン活性化因子をリン酸化酵素でリン酸化することを含んでなる、リン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子を実質上含有しないリン酸化したプラスミノーゲン活性化因子の生産方法。
１２．リン酸化されていないブロ−ｕ−ＰＡをリン酸化酵素でリン酸化することを含んでなる、リン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化されたブロ−ｕ−ＰＡの生産方法。
１３．リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子とリン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子の混合物をリン酸化酵素で処理する請求項１１記載の方法。
１４．リン酸化されたブロ−ｕ−ＰＡとリン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡの混合物をリン酸化酵素で処理する請求項１２記載の方法。
１５．製薬上許容し得る担体または希釈剤と、リン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子を実質上含有しないリン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子を有効成分として含有する医薬組成物。
１６．製薬上許容し得る担体または希釈剤と、リン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化されたブロ−ｕ−ＰＡを有効成分として含有する医薬組成物。
１７．リン酸化されないウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）を実質上含有しないリン酸化されたｕ−ＰＡ。
１８．リン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化されたブロ −ｕ−ＰＡをプラスミン処理する方法を含んでなる、リン酸化されないｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化されたｕ−ＰＡの生産方法。
１９．製薬上許容し得る担体また希釈剤と、リン酸化されないｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化されたｕ−ＰＡを有効成分として含有する医薬組成物。
２０．リン酸化されたプラスミノーゲン活性化因子を特異的に認識する抗体。
２１．リン酸化されないプラスミノーゲン活性化因子を実質上含有しないリン酸化一プラスミノーゲン活性化因子の有効量を、これを必要とする患者へ投与することを含んでなる血栓溶解療法。
２２．リン酸化されないブロ−ｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化ーブロ−ｕ −ＰＡ、またはリン酸化されないｕ−ＰＡを実質上含有しないリン酸化−ｕ−ＰＡの有効量を、これを必要とする患者へ投与することを含んでなる血栓溶解療法。