JPH104974A - ラクトバチラス・カゼイ菌用ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安定性の高い形質転換体を得ることができる
ラクトバチラス・カゼイ菌用ベクターを得る。 【解決手段】 ラクトバチラス・カゼイ(Lactobacillus
casei)YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来の部位特
異的組換え酵素（インテグラーゼ，ｉｎｔ）領域及びａ
ｔｔＰ領域（宿主染色体への組込み部位）と、乳酸菌及
び大腸菌で機能する薬剤耐性領域と、大腸菌(Escherich
ia coli)由来の複製開始領域と、クローニング部位とを
備えたもの

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はラクトバチラス・カ
ゼイ(Lactobacillus casei) （以下、「Ｌ．カゼイ」と
記す）菌の染色体上への、外来遺伝子の組み込みを可能
とするベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、乳酸菌特にＬ．カゼイ菌を宿
主とするシャトルベクターについて、いくつかの報告が
あるが、その殆どが、プラスミドとして形質転換するも
のであり、安定性の点では、満足すべきものではなかっ
た。

【０００３】一方、Ｌ．カゼイ・シロタ株である YIT90
18株や YIT9029株は、広く、乳酸菌飲料や発酵乳におい
て使用されているが、特に、抗腫瘍活性、血中コレステ
ロール低下作用、血圧降下作用、抗潰瘍効果などの優れ
た生理作用を有していることが明らかになっている（特
開昭５５−１１３７１８号公報、特開平４−５２３６号
公報、特開平５−２５０５５号公報、特開平６−１１６
１５５号公報）。

【０００４】このような、Ｌ．カゼイ菌に、遺伝子組み
換え技術を応用して、外来遺伝子を導入しようとする場
合は、プラスミドベクターを利用するのが通常であった
（特開平２−１２８６９２号公報、特開平３−２５９０
８６号公報、特開平４−５８８９０号公報参照）。

【０００５】しかし、プラスミドベクターでは、安定性
に課題があり、さらに優れた方法が求められていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】一方、Ｌ．カゼイ YIT
9018株には、溶原ファージφＦＳＷの存在が知られてい
る。φＦＳＷはゲノムサイズ４１．５ｋｂの環状順列構
造をとるテンペレートファージであり、溶原化に際して
は、キャンベルタイプの部位特異的組み換えによって、
そのファージゲノムが染色体に組み込まれ、プロファー
ジとなることが解明されている。

【０００７】本発明は、従来の乳酸菌用プラスミドベク
ターの安定性の課題を解決することを目的とし、特に
Ｌ．カゼイ YIT9029株において染色体への組込みを行う
組込み型ベクターを得ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明に係るラクトバチ
ラス・カゼイ菌用ベクターでは、Ｌ．カゼイYIT9018株
の溶原ファージφＦＳＷ由来のｉｎｔ領域及びａｔｔＰ
領域と、乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性領域と、
大腸菌(Escherichia coli)由来の複製開始領域と、適当
なクローニング部位とを備えたものである。

【０００９】本発明のｉｎｔ領域とは、部位特異的組換
え酵素（所謂インテグラーゼ(integrase) ）をコードす
る領域を指す。インテグラーゼは、Ｉｎｔタンパク質，
ファージＤＮＡ挿入酵素等とも呼ばれ、ファージが宿主
菌に感染後に生産するタンパク質の一つで、ファージＤ
ＮＡの特定部位ａｔｔＰと宿主菌の染色体上の特定部位
ａｔｔＢとの間で相互的な部位特異的組換えを起こし、
ファージゲノムが菌染色体に組込まれるのに必要な酵素
である。また、ｘｉｓ遺伝子産物と共にファージの切り
出しにも働く。本発明においては、このｉｎｔ領域とし
てＬ．カゼイ YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来の
ものが選ばれた。

【００１０】また、ａｔｔＰ領域とは、宿主菌の染色体
への組換え部位を指す。テンペレートファージ（溶原性
ファージ）は宿主菌の染色体上の一定の部位（ａｔｔ
Ｂ）に組込まれる。例えばファージが宿主菌染色体に組
込まれる場合に、環状のファージと染色体ＤＮＡとが、
各々の付着部位を介して、組換えを起こし、８文字構造
を生じた後、合一体を形成する。ａｔｔＰ領域はファー
ジ側の組込み部位である。

【００１１】薬剤耐性領域は、形質転換体の検出の際の
マーカとして働く。従って、乳酸菌のみで機能する薬剤
耐性領域と大腸菌でのみ機能する別の薬剤耐性領域とを
各々有してもよく、乳酸菌と大腸菌との両者で機能する
１つの薬剤耐性領域を有してもよい。

【００１２】複製開始領域は、大腸菌由来のものが選ば
れた。これは、外来遺伝子のベクター中への導入する
は、大腸菌とそのベクター系（所謂、ＥＫ系）で行う。
この場合、この複製開始領域は宿主菌である大腸菌内部
での良好な複製が行われることを確実なものとしてい
る。

【００１３】クローニング部位は、外来遺伝子を挿入す
るための制限酵素の認識切断部位を指す。尚、外来遺伝
子の挿入によって、例えば前述のｉｎｔ領域，ａｔｔＰ
領域，薬剤耐性領域，複製開始領域を分断しない部位が
選ばれる。

【００１４】好ましいラクトバチラス・カゼイ菌用ベク
ターとして、図１のｐＭＳＫ７４２を、好ましい形質転
換体としてラクトバチルス・カゼイにこのベクターｐＭ
ＳＫ７４２を導入したものを開示する。尚、このｐＭＳ
Ｋ７４２は生工研菌寄第１５６９５号として、生命工学
研究所に平成０８年０６月２０日付けで寄託されてい
る。

【００１５】このｐＭＳＫ７４２は、4031bpの大きさ
で、Ｌ．カゼイYIT9018 株の溶原ファージφＦＳＷ由来
のｉｎｔ領域及びａｔｔＰ領域を有している。薬剤耐性
領域として、Enterococcus faecalis 由来のエリスロマ
イシン（Ｅｍ）耐性遺伝子を有している。このＥｍ耐性
遺伝子は大腸菌と乳酸菌との両者で機能する。また、ク
ローニング部位として、制限酵素 XbaＩ，BspHＩ， Kpn
Ｉ， HpaＩ等の認識切断部位を有している。

【００１６】

【発明の実施の形態】Ｌ．カゼイ YIT9018株の溶原ファ
ージφＦＳＷにおいて、ファージゲノム上での組み換え
部位は、 1.3kb XhoＩＤＮＡ断片上に限定されているこ
とが知られている（文献１：M.Shimizu-Kadota & N.Tsu
chida. J.Gen.Microbiol. 130: 423-431,1984.) 。本発
明では、安定性を高めるため、プロファージの染色体組
込み型のプラスミドベクターを開発することにした。

【００１７】本発明においては、Ｌ．カゼイ YIT9018株
の溶原ファージφＦＳＷについて、先ず、ファージゲノ
ムの 1.3kb XhoＩＤＮＡ断片を含む約3.8kb の領域のＤ
ＮＡ塩基配列を決定し、オープンリーディングフレーム
(ORF) の検索を行った。

【００１８】その結果、分子量最大45K の蛋白質をコー
ドできるＯＲＦが見いだされた。既知タンパク質のアミ
ノ酸配列との類似する領域を検索したところ、各種のフ
ァージ、トランスポゾンの部位特異的組み換え酵素と、
全体または部分的に高い類似性が見られたので、このＯ
ＲＦがφＦＳＷのインテグラーゼ(integrase) をコード
していると考え、ｉｎｔと命名した。

【００１９】次に、ファージゲノム上の組み換え部位
（ａｔｔＰ:1.3kb XhoＩＤＮＡ断片上に存在）及び、染
色体上の組み換え部位（ａｔｔＢ) を明らかにするため
に、φＦＳＷ溶原菌におけるプロファージ組込部位（ａ
ｔｔＬとａｔｔＲ）を含む領域をＴａｉｌ−ＰＣＲ法を
用いて増幅し、そのＤＮＡ塩基配列を明らかにした。

【００２０】続いてａｔｔＢを含む領域についてもａｔ
ｔＬとａｔｔＲから推定されるプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法により増幅し、ＤＮＡ塩基配列を明らかにした。ａ
ｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢの構造を比較す
ると、４０塩基の相同領域が見いだされ、これをコア配
列と名付けた。この部分で部位特異的組み換えが起きて
いることは明らかである。ａｔｔＰコア配列は、ｉｎｔ
遺伝子下流に存在した。

【００２１】φＦＳＷのｉｎｔ、ａｔｔＰ領域を含むＤ
ＮＡ断片を、 YIT9029株で複製できず同株で発現するエ
リスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子を持つプラスミドｐ
ＭＳＫ７２１上に挿入後、テトラサイクリン耐性遺伝子
を除去して、プラスミドｐＭＳＫ７４２を得た。そのＤ
ＮＡを同株細胞にエレクトロポレーション法を用いて導
入した。このプラスミドｐＭＳＫ７４２はＥｍ耐性の形
質転換体を約１０³ ／μｇ・ＤＮＡの頻度で得たが、ｉ
ｎｔを欠損させるとＥｍ耐性の形質転換体を得ることが
できなかった。従って、Ｅｍ耐性の形質転換体を得るた
めには、ｉｎｔが必須であることが明らかとなった。

【００２２】Ｅｍ耐性形質転換体におけるａｔｔＢ，ａ
ｔｔＲ，ａｔｔＬ構造をＰＣＲ法等により調べた。その
結果、調べた全ての形質転換体において、φＦＳＷ溶源
菌の場合と同様のａｔｔＲ，ａｔｔＬ構造を確認した
が、ａｔｔＢ構造は確認できなかった。

【００２３】従って、上記組換えプラスミドは、φＦＳ
Ｗゲノムの染色体への組込みによるプロファージ形成と
同様の機構によって YIT9029株染色体上に組込まれるこ
とが示された。更にテトラサイクリン耐性遺伝子を加え
た形のプラスミドでも、同様に染色体への組込みが見出
されたので、φＦＳＷのｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を持つプ
ラスミドは YIT9029株において染色体への組込み型ベク
ターとして使えることが明らかとなった。

【００２４】

【実施例】前述したことを実施例で詳しく説明する。 １．材料と方法 (1) 使用菌株と培地 Ｌ．カゼイ YIT9029（φＦＳＷ非溶源菌）及び YIT9018
（φＦＳＷ溶源菌）株はＭＲＳ培地（Difco,USA)を用い
て３７℃で好気条件で生育させた（液体培地では静
置）。必要な場合は培地に２０μｇ／ｍｌのエリスロマ
イシンを加えた。

【００２５】(2) ＤＮＡの調製と操作 Ｌ．カゼイ YIT9029株より染色体ＤＮＡの抽出は、文献
２（M.Shimizu-Kadota, T.Sakurai & N.Tsuchida. Prop
hage origin of a virulent phage appearingon fermen
tations of Lactobacillus casei S-1. Appl. Environ.
Microbiol. 45: 669-674, 1983. ）に示された方法に
よって行った。φＦＳＷファージＤＮＡも、この文献に
示した方法でファージ粒子より調製した。大腸菌(E.col
i)からのプラスミドＤＮＡ抽出は、プロメガ(Promegas
a) 社製のキット「Wizard^TM Minipreps DNA Purificatio
n System」を用いた。クローニング等のＤＮＡ操作は文
献３(J.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis. Molecul
ar cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbo
r Laboratory Press. 1989) を参照して行った。

【００２６】(3) 形質転換法 Ｌ．カゼイ YIT9029株の形質転換は文献４(M.Shimizu-K
adota, H.Shibahara-Sone & H.Ishiwa. Shuttle plasmi
d vectors for Lactobacillus casei and Escherichia
coli with a minus origin. Appl. Environ. Microbio
l. 57: 3292-3300, 1991.) に示すエレクトロポレーシ
ョン法により行った。尚、この方法でYIT9029 で複製で
きるpH4611のＤＮＡをYIT9029 に導入すると常に１０⁵/
μg ・DNA以上の頻度で形質転換体が得られる。E.coliの
形質転換はTOYOBO社製のJM109 コンピテントセルを用
い、同社プロトコルに従って行った。

【００２７】(4) ＤＮＡ塩基配列の決定とその解析。 塩基配列を決定すべきＤＮＡがプラスミドの場合はその
まま用いた。また、ＰＣＲ産物の場合は、直接行うか宝
酒造社製SpinBind DNA Recovery Systemを用いてアガロ
ースゲルより精製した。プライマーは、１７マー以上の
ものを適宜合成した。反応は「ABI PRISM^TM Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PerkinElmer社
製）」を用い、373S DNA Sequencerによって行った。塩
基配列の解析にはソフトウエア開発社製「GENETYX ver.
9.0」 と「GENETYX-CD バイオデータベースソフトウエア
ver.29.0」、及びデータベースとして「National Center
forBiotechnology Information社製Entrez Release 21.
0」を用いた。

【００２８】(5) ＰＣＲ法 YIT9029株やその形質転換体におけるａｔｔＢ，ａｔｔ
Ｌ，ａｔｔＲの検出には、各々ＩＮＴ２５とＩＮＴ２
７，ＩＮＴ２０とＩＮＴ２７，ＩＮＴ２１とＩＮＴ２５
プライマーを用いた。このＩＮＴ２０，２１，２５，２
７プライマーの詳しい塩基配列は、後述の配列表の配列
番号１又は配列番号２に示した塩基配列の一部である。
ＩＮＴ２１は配列番号１の塩基番号（存在位置）2501-2
520 までの２０塩基のプライマーであり、ＩＮＴ２０は
配列番号１の塩基番号（存在位置）3144-3163 までの２
０塩基の相補鎖のプライマーである。また、ＩＮＴ２５
は配列番号２の塩基番号（存在位置）884-903 までの２
０塩基のプライマーであり、ＩＮＴ２７は配列番号２の
塩基番号（存在位置）1463-1482 までの２０塩基の相補
鎖のプライマーである。

【００２９】被検菌一晩培養液を当量の１M Bis-Tris(p
H7.2) で洗浄後当量の蒸留水に懸濁したもの１８μｌに
生化学工業社製 N-acetyl-muramidase SG(500 μg/ml)
を１μｌと蒸留水８．５μｌを加えて１時間反応後、To
yobo社製の KOD polymeraseキットを用いて（全量 50
μl ）反応（98℃15秒、60℃５秒、74℃30秒を３０回反
復）させた。ＤＮＡ塩基配列既知の部分と未知の部分の
境界領域の構造を増幅できるＴａｉｌ−ＰＣＲ法は、宝
酒造社製「LA PCR in vitro Cloning Kit 」を用いて行
った。

【００３０】２．結果とその検討 (1) φＦＳＷゲノム上の部位特異的組換えに関与する領
域のＤＮＡ塩基配列 φＦＳＷが溶原化する時、キャンベルタイプの部位特異
的組換えによってそのファージゲノムがφＦＳＷ非溶原
菌染色体に組込まれプロファージとなることは、サザン
ハイブリダイゼーションにより周知であるとされてい
る。

【００３１】図２はＬ．カゼイYIT9029 のテンペレート
ファージφＦＳＷのゲノム制限酵素地図である。唯一の
SalＩ切断点を起点として地図上時計回りに位置をｋｂ
で示す。部位特異的組換えを起こすファージゲノム上の
位置は、図２に示す制限酵素地図上で１３．８ｋｂと１
５．１ｋｂに存在する２つのXhoI切断点の間に限定され
ている（文献１）。この領域におけるＤＮＡの塩基配列
を決定しオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）
の検索とその翻訳産物と既知蛋白のアミノ酸配列の類似
領域の検索から（データは示していない）、プロファー
ジの染色体組込みに関与する領域として更に制限酵素地
図上で位置を示す数字（ｋｂ）が大きくなる方向が考え
られた。

【００３２】そこで、更に、そのXhoI断片の約２．５ｋ
ｂに亙ってＤＮＡ塩基配列を決定した。ＤＮＡ塩基配列
を決定した領域を図２の太線で示す。その結果を後述す
る配列表の配列番号１に示す。

【００３３】配列番号１はφＦＳＷＤＮＡのｉｎｔ，ａ
ｔｔＰ領域とその近傍のＤＮＡ塩基配列及び推定される
ｉｎｔ遺伝子産物を含んでいる。ｉｎｔ遺伝子開始コド
ンとして可能性のある３箇所の[Met] が確認された。第
１の[Met] 位置は、塩基番号（存在位置）1509-1511 に
あり、第２の[Met] 位置は、塩基番号（存在位置）1716
-1718 にあり、第３の[Met] 位置は、塩基番号（存在位
置）1776-1778 にある。これらのすぐ上流には、各々リ
ボソームＲＮＡと結合する可能性のあるポリプリン領域
（ＲＢＳ）が確認された（塩基番号（存在位置）1493-1
499,1704-1708,1764-1770 ）。

【００３４】ｉｎｔ遺伝子終止コドンは塩基番号（存在
位置）2691-2693 の「TGA」 である。また、ｉｎｔ遺伝子
下流には、逆方向反復塩基配列（ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ）
が確認された（塩基番号（存在位置）2700-2714 と2716
-2729 に対して2753-2764 と2770-2784 ）。尚、配列番
号１に示した塩基配列のうち、主な制限酵素名及びその
認識切断部位は、次の通りである。 PvuＩ（塩基番号
（存在位置）1-6 ），BssHII（塩基番号（存在位置）49
3-498,2826-2831 ），EcoRＶ（塩基番号（存在位置）15
03-1508 ），BamHＩ（塩基番号（存在位置）1770-1775
）， XhoＩ（塩基番号（存在位置）2311-2316,2455-24
60,3844-3849 ）， Eco52Ｉ（塩基番号（存在位置）286
6-2871 ）， XmnＩ（塩基番号（存在位置）2880-2889
）， FspＩ（塩基番号（存在位置）3757-3762 ）。ま
た、後述するが、ａｔｔＰコア配列は、塩基番号（存在
位置）2857-2896 である。

【００３５】また、塩基番号（存在位置）2501-2520 ま
での２０塩基のプライマー（GCTCCCTCACATCCGTATCC）を
ＩＮＴ２１プライマーとし、塩基番号（存在位置）3144
-3163 までの２０塩基の相補鎖のプライマー（GCATAAAT
CAGCCGTTTGCG）をＩＮＴ２０とした。

【００３６】(2) ｉｎｔ遺伝子 ＤＮＡ塩基配列を決定した領域についてＯＲＦの検索と
それらの翻訳産物と既知蛋白のアミノ酸配列の類似領域
の検索を行った。図３は配列番号１のｉｎｔ及びａｔｔ
Ｐを含む PvuＩ(1) -XhoＩ(3849)領域におけるＯＲＦの
検索結果を示す説明図である。図において各フレームで
長い縦棒は終止コドン、短い縦棒は開始コドン（ATG 又
はGTG ）を表わしている。上３段の翻訳方向は図で左か
ら右を示す。２００塩基以上のＯＲＦには名称（ＯＲＦ
１〜８，ｉｎｔ）を付した。主な制限酵素切断点と、ａ
ｔｔＰコア領域も示した。

【００３７】図３に示すように、塩基番号1509番から26
90番目までに大きなＯＲＦが見出された。このＯＲＦの
翻訳産物（配列番号１に示す）と既知蛋白のアミノ酸配
列について類似領域を検索した。その結果、スタフィロ
コッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus) のファ
ージL54aのプロファージ組込みを担う部位特異的組換え
酵素（インテグラーゼ）（文献５；Z.H.Ye & C.Y.Lee.
Nucleotide sequenceand genetic characterization of
staphylococcal bacteriophage L54a int and xis gen
es. J.Bacteriol. 171:4146-4153,1989. ）と全体に亙
り高い類似性が見られた。

【００３８】図４は推定されるφＦＳＷのインテグラー
ゼ蛋白（第１の[Met] （塩基番号（存在位置）1509-151
1 ）より翻訳開始の場合として示す）と、スタフィロコ
ッカス・アウレウスのファージL54aのインテグラーゼ蛋
白のアミノ酸配列の比較を示す説明図である。図におい
て、「＊」は同一アミノ酸、「．」は性質の類似してい
るアミノ酸を示す。また、保存性の高いドメイン(domai
n)１とドメイン２の領域を四角で囲った。

【００３９】また、図５は各種ファージ、トランスポゾ
ンのインテグラーゼに見出せる保存性の高い２つの領域
（ドメイン１及びドメイン２）のアミノ酸配列の比較を
示す説明図である。図において、４つの代替不可のアミ
ノ酸を＊で、特に保存性の高いアミノ酸にアンダーライ
ンを付した。また、φＦＳＷのアミノ酸配列でコンセン
サス配列と一致する場合はアンダーラインを付した。

【００４０】図５に示すように、各種ファージやトラン
スポゾンの部位特異的組換え酵素integrase の間では、
ドメイン１，ドメイン２と呼ばれる２つの保存性の高い
領域が見出されているが（文献６；L.Dupont, B.Bizent
-Bonhoure, M.Coddeville, F.Auvray & P.Ritzenthale
r, Characterization of genetic elements requiredfo
r site-specific integration of Lactobacillus delbr
ueckii subsp. bulgaricus bacteriophage mv4 and con
struction of an integration proficient vector for
Lactobacillus plantarum. J.Bacteriol. 177: 586-59
5,1995 ）、このＯＲＦの翻訳産物にもその領域に合致
するアミノ酸配列が見出された。

【００４１】そこでこのＯＲＦがφＦＳＷのインテグラ
ーゼをコードしていると考え、ｉｎｔと命名した。ｉｎ
ｔの翻訳開始点としては、すぐ上流のリボソームＲＮＡ
結合領域の有無と後述のプラスミド挿入の実験から配列
番号１に示す第１，第２，第３の何れかの[Met] が考え
られた。各々の場合に推測されるＩｎｔ（ｉｎｔ遺伝子
産物）の分子量は第１の[Met] を翻訳開始点とすると４
５ｋ，第２の[Met] を翻訳開始点とすると３７ｋ，第３
の[Met] を翻訳開始点とすると３５ｋであった。また推
定等電点はいずれの場合も９．８であり、塩基性でＤＮ
Ａに結合できる蛋白であることを示唆している。また、
翻訳領域のすぐ下流にはステム−ループ(stem-loop) 構
造を取ることのできる逆向き反復配列が存在した。

【００４２】ＯＲＦ８（Ｎ末端側の塩基配列は未決定）
の翻訳産物は、エンテロコッカス(Enterococcus)属細菌
の自己溶菌酵素（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidas
e，Accession No.P37710,P39046）や、リステリア(List
eria)属細菌の細胞侵入性に関与する蛋白（P60,Accessi
on No.Q01837,Q01839,Q01838 ）といった、グラム陽性
細菌の細胞壁溶解に関与する蛋白との部分的な類似が見
られた。

【００４３】図６はＯＲＦ８のコードできる蛋白とエン
テロコッカス・フェカリス由来の自己溶菌酵素（N-acet
ylmuramoyl-L-alanine amidase) のアミノ酸配列との相
同性を示す説明図である。図において、「＊」は同一ア
ミノ酸、「．」は性質の類似しているアミノ酸を示す。
尚、図において決定されているＤＮＡ塩基配列から推定
できる最初のアミノ酸を１とした。図に示す通り、ＯＲ
Ｆ８はφＦＳＷが増殖する時に宿主の細胞壁を溶解する
機能を持つ酵素の構造遺伝子である可能性があることが
確認された。

【００４４】(3) ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢ領域の
染色体の単離と構造 φＦＳＷが溶原化するとき、キャンベルタイプの部位特
異的組換えによってそのファージゲノムがφＦＳＷ非溶
原菌染色体上の特定部位に組込まれプロファージとなる
ことが知られている。即ち、ファージ制限酵素地図上の
１３．８ｋｂと１５．１ｋｂのXhoI切断点間の特定の部
位（ａｔｔＰと命名）、及び染色体上の特定の部位（ａ
ｔｔＢと命名）で切断と再結合が起こるはずである。

【００４５】そこで、ａｔｔＰ及びその近傍のＤＮＡ塩
基配列は決定されているので、溶原菌（YIT9018 ）にお
けるａｔｔＰ相当部分（ａｔｔＲとａｔｔＬと命名）を
Ｔａｉｌ−ＰＣＲ法を用いて単離し、そのＤＮＡ塩基配
列を調べた。その結果を図７に示す。また、ａｔｔＲと
ａｔｔＬのＤＮＡ塩基配列から作製したプライマー（Ｉ
ＮＴ２５(GATGGAAACCGTTGTCTGGG)と、ＩＮＴ２７（TCGC
GATGTCGTTTATCCCC））を用いて、φＦＳＷ非溶原菌であ
るYIT9029 におけるａｔｔＢ領域の存在をＰＣＲ法によ
り確認した。確認されたａｔｔＢのＤＮＡ塩基配列も次
の図７に示した。尚、YIT9029 にはａｔｔＲ、ａｔｔＬ
の構造は確認されなかった。

【００４６】図７はａｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａ
ｔｔＢに見出される相同領域とその近傍のＤＮＡ塩基配
列とを比較した説明図である。ａｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａ
ｔｔＬ，ａｔｔＢの構造を比較すると、４０塩基の相同
領域が見出され、コア配列（四角で囲んだ）と名付け
た。この部分で部位特異的組換えが起きていることは明
らかである。このコア配列の長さは他のキャンベルタイ
プの組込みを起こすファージの場合よりかなり長い点に
特徴がある。また、制限酵素認識部位等、パリンドロー
ム構造が見出される。また、図においてコア配列の左側
もかなり塩基配列の類似度が高い。

【００４７】配列番号１に示した通り、ａｔｔＰコア配
列は、ｉｎｔ遺伝子近傍の逆向き反復配列のすぐ下流に
存在していた（配列番号１；塩基番号（存在位置）2857
-2896 ）。これは、他のキャンベルタイプの組込みを起
こすファージの場合と共通することが確認された。

【００４８】一方、φＦＳＷ非溶原菌であるYIT9029 に
おけるａｔｔＢ領域を含むＤＮＡ塩基配列を配列表の配
列番号２に示す。尚、配列番号２に示した塩基配列のう
ち、主な制限酵素名及びその認識切断部位は、次の通り
である。 PstＩ（塩基番号（存在位置）1-6 ）， XmnＩ
（塩基番号（存在位置）1190-1199 ）， Eco52Ｉ（塩基
番号（存在位置）1208-1213 ）。また、ａｔｔＢコア配
列は、塩基番号（存在位置）1183-1222 である。更に、
前述のＩＮＴ２５プライマーと同じ塩基配列（２０塩
基）が、塩基番号（存在位置）884-903 に、また、ＩＮ
Ｔプライマーの相補鎖と同じ塩基配列（２０塩基）が塩
基番号（存在位置）1463-1482 に、更に、後述するＯＲ
ＦａｔｔＢの終止コドンは塩基番号（存在位置）1257-1
262 の「TAA・TAG 」である。

【００４９】また、図８は配列番号２のＯＲＦ検索の結
果を示す説明図である。図において各フレームで長い縦
棒は終止コドン、短い縦棒は開始コドン（ATG 又はGTG
）を表わしている。上３段の翻訳方向は図で左から右
を示す。更に、この領域の大部分に亙るＯＲＦ（ＯＲＦ
ａｔｔＢと命名、Ｎ末端領域のＤＮＡ塩基配列は未決
定）の翻訳産物と既知蛋白のアミノ酸配列について類似
領域を検索した。図９は配列番号２のＯＲＦ（ＯＲＦａ
ｔｔＢ）の翻訳産物とバシラス・ステアロサーモフィル
ス由来のグルコース 6- ホスファターゼ・イソメラーゼ
Ａ及びＢの蛋白とのアミノ酸配列の比較を示す説明図で
ある。

【００５０】ＯＲＦａｔｔＢとBacillus stearothermop
hilus 由来の Glucose 6-phosphateisomerase A及びB
(Accession No.P13375,P13376)と、全体に亙り高い類似
性が見られた（図９）。プロファージの組換えが起こっ
た際、このＯＲＦａｔｔＢは、翻訳産物のＣ末端の１ア
ミノ酸がＰｒｏからＬｅｕに変化するだけでａｔｔＲ上
に殆どが保存されていた。従って、例えGlucose 6-phos
phate isomerase などＯＲＦａｔｔＢが宿主の生育にと
って必須の遺伝子であっても、φＦＳＷの溶原化に際し
て失活しない可能性が示唆された。

【００５１】(4) ラクトバチラス・カゼイ菌用ベクター プラスミドｐＭＳＫ７２１（文献４(M.Shimizu-Kadota,
H.Shibahara-Sone &H.Ishiwa. Shuttle plasmid vecto
rs for Lactobacillus casei and Escherichia coli wi
th a minus origin. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3
292-3300, 1991.) ）は、Ｌ．カゼイ YIT9029株で複製
できず、 YIT9029株で発現する薬剤耐性遺伝子［Entero
coccus faecalis 由来のエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性
遺伝子］を持つ。このプラスミドｐＭＳＫ７２１に、φ
ＦＳＷ由来のｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を含むＤＮＡ断片を
導入して、プラスミドｐＭＳＫ７４２を得た。

【００５２】図１はプラスミドｐＭＳＫ７４２の制限酵
素地図である。図に示す通り、ｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を
含むＤＮＡ断片としてEcoRV(1506)-FspI(3759)の部分を
持つ。得られたプラスミドｐＭＳＫ７４２をＬ．カゼイ
YIT9029株細胞にエレクトロポレーション法を用いて導
入した。

【００５３】その結果、ｉｎｔ，ａｔｔＰ領域を含むＤ
ＮＡ断片として、PvuI(3)-FspI(3759)及びEcoRV(1506)-
FspI(3759)の部分を持つプラスミドはＥｍ耐性の形質転
換体を約１０³/μｇ・ＤＮＡの頻度で得た。一方、ｉｎ
ｔを中断するBamHI(1771)-FspI(3759)の部分を持つプラ
スミドでは、Ｅｍ耐性の形質転換体を得ることができな
かった。従って、Ｅｍ耐性の形質転換体を得るためには
ｉｎｔが必須であることが明らかとなった。

【００５４】従って、ＯＲＦ１〜６はＥｍ耐性形質転換
体を得るためには不要である。尚、ｐＭＳＫ７４２にお
いてはｉｎｔ遺伝子の翻訳開始点として(1) の[Met] を
用いたとしても、EcoRV 切断後ベクターと連結すること
によりリボソームＲＮＡ結合領域になり得る配列(....'
5GGGGGATCCGTCGAATCATG3'...) が見出せる。

【００５５】Ｅｍ耐性形質転換体におけるａｔｔＢ，ａ
ｔｔＲ，ａｔｔＬ構造をＰＣＲ法、サザンハイブリダイ
ゼーション法、ＤＮＡ塩基配列決定により調べた。その
結果、調べた全ての形質転換体において、φＦＳＷ溶原
菌の場合と同様のａｔｔＲ，ａｔｔＬ構造を確認した
が、ａｔｔＢ構造は確認できなかった（データは示して
いない）。従って、ｐＭＳＫ７４２等のプラスミドは、
φＦＳＷゲノムの染色体への組込みによるプロファージ
形成と同様の機構によってYIT9029 染色体への組込みに
よるプロファージ形成と同様の機構によってYIT9029 染
色体上に組込まれることが示された。

【００５６】ｐＭＳＫ７４２にEnterococcus faecalis
由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を連結した型のプラ
スミドでも、同様に染色体への組込みが見出されたので
（データは示していない）、ｐＭＳＫ７４２はYIT9029
において染色体への組込み型ベクターとして使えること
が明らかとなった。

【００５７】

【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、外来遺伝
子を挿入したプラスミド自体が宿主菌の染色体上に組込
まれるので、安定性が高いという効果がある。特に、
Ｌ．カゼイ YIT9029株において染色体への組込みを行う
組込み型ベクターを得ることができるという効果があ
る。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：溶原ファージ(temperate phage) 株名：φＦＳＷ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：1493-1499,1704-1708,1764-1770 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGATCGCTTA AAGAGATTCT TTTTTACACT GATCGCGACA CTACTACCAT TCACAACGTC 60 CTAGAGAAGC CTGTGGTGGC TGTTTACTGT TTCAATGAGC TACACCACTC ATCGTTGCTA 120 TTGCGTGCAA AGGCCGTTGT ATTGACCGCT GAGGAGGCCT TACCAAGCTT TACGGAAAGC 180 CTCAATTCTT TTCAAAAATC GTTACAGTAT GATCGACCCG TCATCATCCG TTGCAACCCA 240 CTAACCGTCA AGATTAGATA CAACAATGAC ATCGAGTTCA GCAAGCTAAA CGAAATCTAA 300 GCTCAGTTCT TGGAGATGCA CTTATGAATG GTCCAGATAC ATTAAGCGAG GCACACTTCA 360 TTGGCCTCAT CATTGTTCTT ATAGGCGTCT ACTTCGCCCT GTTTGGCCAC AGGCAGCATT 420 GGATTCGTTG GCTCATTGAC CCTGATAAGC CCGGCAGCAA CCTCTGGTGG GCAGCCGTTT 480 TTATCATTAT CGGCGCGCTC ATGATGATGG TTAGAAAGAT GCAATAATTC GGCACCATAA 540 AGGGGGCTAG TTTTCAGACA AAGAAATAGC CTTCCGCAGA AGGTCTGGAG GTGAATTCTA 600 TTGATAAAAG ATCGTTTTAA TTTAAATCCG TGCAATTTAG TAGGATTTAA AATTTCGCAA 660 CCTAGACGCA ATCCAAATGA GACTGTTTAT CAACTTGAGC CTTTGAAAAT TTTGTTAATT 720 TTGAACTCGC GTGTAATTTC ATCATTGATG GAGTTATCCC TACCTTTAAC ATTTTCGCTA 780 CGATTTACAA TATTAGATTA GATTATCCTA TATCACCTAT GGCTACCGCT CAGTCTATGA 840 TTGAAGTTAC TGATGGGCAC ACTTTTGAAC CACTTCAGGC AAACTTTCAT TTCAATATTC 900 CACTAAACCA TCTAAGAAAC GGCGACCCTA CTAATCAATT TGTTGGGATT GAATTAGCTT 960 GGTCAATTTA TACGCCTGAA GATCCGCGTA TTTATGACTC ACTAAAGAAT GGTGTTCTGT 1020 TCCGAACTAG AACTGAGGTG ATTGACAGCA ATGGTTAAGC AAAATGTTAT ACCAATCAAT 1080 GGAACTCCAA TTGAAAATCC TGCTGATCCG TATTCAATGC AAAAACATGA TACACTTAAG 1140 CCAAATACAA CTGGCGGAGG TGAGCCACCA ATGGATGGAG CAAAAAAATA CGCGACTAAA 1200 AAACAGCTTA AGCGAAAAGT AAAACGTATC GATTCACGTT TTGATGAACT TGACAAAAGC 1260 ATTGATTCAA AGATCACTAA GGCAAAGTTG CAAGCGGTTA TTTGGCTTAT TGGTACCACA 1320 ATTGCTGGAG TTGCTGCTGT TGGCTGGATC TTCAGCCTCA TAATGAATAG CATTAAGTAA 1380 CAGAACGCAA ATCTCTTCTA ACAATTAAAA ATCCAAAATA AGAGCCCTCC TTGGGGCTTT 1440 TATTTTAACG AAAAAACGAA CATACGTTTG AATTACAAAC TCTAAGAGTT CAAAAGGAGT 1500 GCGATATC ATG GCA TCA ATT AGC TCA TAT AAA CTA AAA GAT GGC AAA AAG 1550 Met Ala Ser Ile Ser Ser Tyr Lys Leu Lys Asp Gly Lys Lys GCC TGG GAA TTC TAT ATA TTC GCT GGT GTT GAT CCG CAG ACA GGA AAA 1598 Ala Trp Glu Phe Trp Ile Phe Ala Gly Val Asp Pro Gln Thr Gly Lys GAA ATA AAG ATC CAT CGG CGC GGT TTT CCA ACC GAA AAA ATA GCC CAG 1646 Glu Ile Lys Ile His Arg Arg Gly Phe Pro Thr Glu Lys Ile Ala Gln CAA GAA GCC ACT TTG GCC GAG GCC GAA ATA ATC AAA GGC CAC TCT CAC 1694 Gln Glu Ala Thr Leu Ala Glu Ala Glu Ile Ile Lys Gly His Ser His TAC CAA ACT GAA AGA ATT TTA ATG GCT GAT TAT CTT AAT CAG TGG ATC 1742 Tyr Gln Thr Glu Arg Ile Leu Met Ala Asp Tyr Leu Asn Gln Trp Ile ACT AAG CTT AAG GTT AAT GTC AAA GAG GGA TCC ATG ATT ATC TAT CGA 1790 Thr Lys Leu Lys Val Asn Val Lys Glu Gly Ser Met Ile Ile Tyr Arg TAT AAT CTT AAG AAA TAC ATC ATC CCA AAA ATT GGC GAT ATT CGA CTA 1838 Tyr Asn Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Pro Lys Ile Gly Asp Ile Arg Leu GCC AAA TAC ACG CTT AAG GAA CAT CAG GAG TTC ATC AGC AGT CTA TTC 1886 Ala Lys Tyr Thr Leu Lys Glu His Gln Glu Phe Ile Ser Ser Leu Phe AAT GAT GGC TTG TCT CTT AAC ACA GTA AAG CTC ATC AAT GGA ACG TTG 1934 Asn Asp Gly Leu Ser leu Asn Thr Val Lys Leu Ile Asn Gly Thr Leu CAC AAT GCA TTA AAA AAA GCC GTT GCA ATT GGT TAC ATT ACC AAA AAC 1982 His Asn Ala Leu Lys Lys Ala Val Ala Ile Gly Tyr Ile Thr Lys Asn CCT ACC GTT GGT GTC GAG TTC AGT GCG TAT GCT AAA GAC AAT TCC AAA 2030 Pro Thr Val Gly Val Glu Phe Ser Ala Tyr Ala Lys Asp Asn Ser Lys AAA CTT CAC TTT TGG ACA AAA GAT CAA GTT GGA TCT TTT ATA GAA GCA 2078 Lys Leu His Phe Trp Thr Lys Asp Gln Val Gly Ser Phe Ile Glu Ala GCT GAA GAA GAT AAA GAG CCC ATG TGG CTA TCA TTC TTT GTG ACG CTG 2126 Ala Glu Glu Asp Lys Glu Pro Met Trp Leu Ser Phe Phe Val Thr Leu ATT GAC TGC GGG CTT CGT GTG GGT GAA GCC ATG GCT CTC CGC TGG TCA 2174 Ile Asp Cys Gly Leu Arg Val Gly Glu Ala Met Ala Leu Arg Trp Ser GAC ATT GAC TTC AGT AAA AAT ACC TTA TCA GTC AAT GCA ACA CGA ATC 2222 Asp Ile Asp Phe Ser Lys Asn Thr Leu Ser Val Asn Ala Thr Arg Ile TAT CGT GCT GAA ACT GGA TCA AAC GCT GGC AAA ATA GCG CTT GAT CGT 2270 Tyr Arg Ala Glu Thr Gly Ser Asn Ala Gly Lys Ile Ala Leu Asp Arg CCC AAA ACA TTA AGC TCT AAG AGA ACC GAA TAC ATG ACC GCT CGA GTA 2318 Pro Lys Thr Leu Ser Ser Lys Arg Thr Glu Tyr Met Thr Ala Arg Val AAT GAT CTT CTT CAA CAA CAA TAT GAG CGC CAT TTC AGT CAC GGC AAT 2366 Asn Asp Leu leu Gln Gln Gln Tyr Glu Arg His Phe Ser His Gly Asn GTA CAA GGC TTT CGG TTT TCT ACT AGC CAC AAT AAC GAT TTT GTC TTC 2414 Val Gln Gly Phe Arg Phe Ser Thr Ser His Asn Asn Asp Phe Val Phe ACC TAT TCG TCT GAT GCA AAG TTT GGA CAA CCG CTC CGA TCT CGA GCA 2462 Thr Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Phe Gly Gln Pro Leu Arg Ser Arg Ala ACT ACC GGT GCT TTT AAT CGC ATC ACC AAT CGG GCT GGG CTC CCT CAC 2510 Thr Thr Gly Ala Phe Asn Arg Ile Thr Asn Arg Ala Gly Leu Pro His ATC CGT ATC CAT GAT TTA AGA CAC ACG CAT GCC GTT TTA ATG CGT GAG 2558 Ile Arg Ile His Asp Leu Arg His Thr His Ala Val Leu Met Arg Glu GCA GGA TTA AGC CTT GAT GAC ATC AAA GAT GAT CTT GGG CAT AAA GAC 2606 Ala Gly Leu Ser Leu Asp Asp Ile Lys Asp Asp Leu Gly His Lys Asp ATT TCA ACC ACT CAA ATT TAT GCT GAA ATC TCT CCG GCA AAA AAG AAA 2654 Ile Ser Thr Thr Gln Ile Tyr Ala Glu Ile Ser Pro Ala Lys Lys Lys GAA AAC CAT CAA CAA TTC GAA AAA TAC CTA AAT CAG TGAACACAAA 2700 Glu Asn His Gln Gln Phe Glu Lys Tyr Leu Asn Gln AAGAGCTCCA GAATTTGTGT ATAAGTCCGA AGTCTTCACC AAAACTTCAC CACGGACTTT 2760 TACAACATGA TTCTGGAGCT CTTTATTTGC CACATTTCAA ATCGCGCAAG CCCTTGCCAT 2820 TAAAGGCGCG CGTTCAATTC CTTGGTCATA TCCTCATAAC CCGGACGGCC GAGCAATGCG 2880 AACATGTTCT TCTTGTTGTG ATTTGCTTGA ACACTGATTT CATAGGGTTT CAAATCGCGG 2940 GTGTAAAAGC AAAAATAGCT ATATATCAAT TTCTTAGGTT TCACAATTTC GGATTCACTT 3000 CACCATAACT TCACCACGAA TTACTTATAT TTATATTATT GCATAAGCAA ATAAGCCCTC 3060 CACCCGCGTT AGCGAGCAGA GGACTTTTTG TTACCTGATA TATCAATATT CTTCTCCGTC 3120 CCAGCCACGT AGACCAGGAG GACCGCAAAC GGCTGATTTA TGCTCCAAGG CCATTGTCAC 3180 AGACTGAACG GAGGCAACAG CATCTATAAG TTCATCAGTT GAATGCTTGT CTGAAGCGGA 3240 ATCCAGCAAC TCTGAAACGG CTCTCATTAA GTCACGTCTC ACATAACTTT GCTCAATAAC 3300 TCGTGCTTGA CCAATTTTTT TAGACATATG CACTCACCTT ATTTAAATTT TTTGGTTTCA 3360 ACGGCAACCC ATTACTTGAT GTACAGGCTT TCACCTGGGT AAATCAAACT GTAGATTGAC 3420 TTGCCATTGT TGGCTGCCAG TGTGTACATG CTGATGCCAT ACTTGCTGGC AATACTCCAG 3480 AAGCTGTCAC CAGAGCGGAC TGTATAATAC GTGTGGCTTA CCAGCGAAGT ATATCCAGAC 3540 GAACGCGAGC CATAGCTCTC CCCACCATTC ACGCCCAAGG CAACATAATG ATACCGACCG 3600 GAGTAGCTGA GGTACCGTGC CCAGACGTAT GAACCGCGAA TATACACATG ATCATACACA 3660 AGGCTCTCAC CCGGCACATA GCTGCCAACT GCCGTGTATC CTGTACCAGC ACCAGTGCGG 3720 ATGTTAACAG TCGTGGAAGG CTTGAAAACA CCAGTTTGCG CATAGTCGGA ATCACTGGCT 3780 GCATTTGATT TCGCTGGTTG GCTTGGCACC GGTGTTACAG GTGCTGACGG GGTTTCTGGT 3840 TGGCTCGAG 3849

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：１５４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Lactobacillus casei 株名：YIT9029 配列 CT GCA GCT GAC AAG GAA TTG CGT GAA GGA ACA GGT GCT GGT AAG GAT 47 Ala Ala Asp Lys Glu Leu Arg Glu Gly Thr Gly Ala Gly Lys Asp TTC CGC GGC TTT ATC GAT TTG CCA GTC AAC TAT GAC AAG GAC GAA TTT 95 Phe Arg Gly Phe Ile Asp Leu Pro Val Asn Tyr Asp Lys Asp Glu Phe GCC CGG ATC AAG GCA GCA GCC AAG AAA GTT CAA GGC AAT TCT CAA GTC 143 Ala Arg Ile Lys Ala Ala Ala Lys Lys Val Gln Gly Asn Ser Gln Val TTT GTT GCG ATT GGG ATT GGC GGT TCT TAT TTA GGC GCA CGG ATG GCG 191 Phe Val Ala Ile Gly Ile Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Ala Arg Met Ala GTT GAT TTT CTT TCC CAG ACT TTC CGT AAC CTT GAC CCT GAT CTG AAG 239 Val Asp Phe Leu Ser Gln Thr Phe Arg Asn Leu Asp Pro Asp Leu Lys TTC CCA GAA GTT TAT TTT GCT GGT AAC TCA ATC TCT GGT ACT TAT CTG 287 Phe Pro Glu Val Tyr Phe Ala Gly Asn Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Leu GCG GAC TTG CTT GAC ATT ATT GGC GAC CGT GAC TTC TCG ATC AAC GTG 335 Ala Asp Leu Leu Asp Ile Ile Gly Asp Arg Asp Phe Ser Ile Asn Val ATC AGT AAG TCT GGT ACC ACG ACT GAA CCT TCA ATT GCA TTC CGT GTT 383 Ile Ser Lys Ser Gly Thr Thr Thr Glu Pro Ser Ile Ala Phe Arg Val CTG AAG GCA AAG TTG ATC GAA AAG TAT GGC AAA GAT GGC GCA AAG GAA 431 Leu Lys Ala Lys Leu Ile Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Gly Ala Lys Glu CGG ATT TAT GCG ACA ACT GAT CGT GCC AAG GGT GCC TTG AAA CAA GAA 479 Arg Ile Tyr Ala Thr Thr Asp Arg Ala Lys Gly Ala Leu Lys Gln Glu GCA GAC GCA GAA GGC TAT GAA GAA TTC GTT GTT CCT GAT GAT GTC GGC 527 Ala Asp Ala Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Val Val Pro Asp Asp Val Gly GGT CGG TTC TCT GTG ATG TCC GCT GTT GGT CTG TTG CCA ATC GCT GTT 575 Gly Arg Phe Ser Val Met Ser Ala Val Gly Leu Leu Pro Ile Ala Val GCA GGC GGT GAC ATT GAC GAA ATG ATG CGT GGT CTC GGT GAT GGT CGT 623 Ala Gly Gly Asp Ile Asp Glu Met Met Arg Gly Leu Gly Asp Gly Arg AAG GCA TAC GCT TCA GCT GAT TTG AAG GAA AAC GAA GCT TAT CAG TAC 671 Lys Ala Tyr Ala Ser Ala Asp Leu Lys Glu Asn Glu Ala Tyr Gln Tyr GCC GCA TTG CGG AAC ATT TTG TAT CGC AAG GGC TAT ACC ACT GAA TTG 719 Ala Ala Leu Arg Asn Ile Leu Tyr Arg Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Leu TTG GAA AAC TAC GAA CCA ACG TTG CAA TAC CTT GGC GAA TGG TGG AAG 767 Leu Gln Asn Tyr Glu Pro Thr Leu Gln Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Lys CAA TTG ATG GGT GAA TCT GAA GGT AAG GAC CAG AAG GGG ATC TAT CCT 815 Gln Leu Met Gly Glu Ser Glu Gly Lys Asp Gln Lys Gly Ile Tyr Pro TCA AGT GCC AAC TTC AGT ACT GAC CTG CAC AGT CTT GGC CAA TAC ATT 863 Ser Ser Ala Asn Phe Ser Thr Asp Leu His Ser Leu Gly Gln Tyr Ile CAG GAA GGT CTG CGC AAC CTG ATG GAA ACC GTT GTC TGG GTT GAA GAA 911 Gln Glu Gly Leu Arg Asn Leu Met Glu Thr Val Val Trp Val Glu Glu CCA AAC CGC GAC CTA ACC ATT CCT GAA GAT GCT AAC AAC CTT GAC GGC 959 Pro Asn Arg Asp Leu Thr Ile Pro Glu Asp Ala Asn Asn Leu Asp Gly CTT GGC TAC TTG GCT GGC AAG AAG ATG TCC TTC GTT AAC CGC AAG GCC 1007 Leu Gly Tyr Leu Ala Gly Lys Lys Met Ser Phe Val Asn Arg Lys Ala TAT GAA GGG GTT GTT CTC GCC CAC ACC GAT GGC GGC GTG CCA GTT ATG 1055 Tyr Glu Gly Val Val Leu Ala His Thr Asp Gly Gly Val Pro Val Met ACC GTC TCC ATT CCA AAG CAG GAT GCC TAC ACC TTA GGC TAT CTG ATC 1103 Thr Val Ser Ile Pro Lys Gln Asp Ala Tyr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile TAT TTC TTC GAA GCT GTC GTT TCA ATC TCC GGC TAC CTG AAC GGG ATC 1151 Tyr Phe Phe Glu Ala Val Val Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Gly Ile AAC CCA TTC AAC CAG CCA GGT GTT GAA GCC TAC AAG AAG AAC ATG TTC 1199 Asn Pro Phe Asn Gln Pro Gly Val Glu Ala Tyr Lys Lys Asn Met Phe GCA TTG CTC GGC CGT CCG GGT TAC GAG GAT ATG ACC AAG GAA TTG AAC 1247 Ala Leu Leu Gly Arg Pro Gly Tyr Glu Asp Met Thr Lys Glu Leu Asn GCA CGG CCT 1256 Ala Arg Pro TAATAGCGTG GGTTTGAGGT CGTTTGGATA GGAAAAAATG AGAGCCTCAA AATTGTGTTG 1316 TAAATGTTCG TGACTGACTT TTGACTGAAT AGCCAAAAGG GTCAAAACAT TTATGTACCA 1376 ATTTTGAGGC TCTTTTTGTG TCCGCTGGAT TGCCAGTACT GGCTTTCTTT TGGTGTATAG 1436 ACTAAAAACA CGGTGTGATT TCAGCGGGGG ATAAACGACA TCGCGAAATC AAGCCTATAT 1496 CCATATATTG ACCCAATATC TAATTGGCAT ATTAATATCG GCGTTT 1542

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＭＳＫ７４２の制限酵素地図であ
る。

【図２】テンペレートファージφＦＳＷの制限酵素地図
である。

【図３】配列番号１のＯＲＦの検索結果を示す説明図で
ある。

【図４】φＦＳＷのインテグラーゼ蛋白とファージL54a
のインテグラーゼ蛋白とのアミノ酸配列の比較を示す説
明図である。

【図５】各種ファージ及びトランスポゾンのインテグラ
ーゼに見出せる保存性の高い２つの領域（ドメイン１及
びドメイン２）のアミノ酸配列の比較を示す説明図であ
る。

【図６】ＯＲＦ８でコードされた蛋白とエンテロコッカ
ス・フェカリス由来の自己溶菌酵素（N-acetylmuramoyl
-L-alanine amidase) とのアミノ酸配列との相同性を示
す説明図である。

【図７】ａｔｔＰ，ａｔｔＲ，ａｔｔＬ，ａｔｔＢに見
出される相同領域とその近傍のＤＮＡ塩基配列とを比較
した説明図である。

【図８】配列番号２のＯＲＦ検索の結果を示す説明図で
ある。

【図９】配列番号２のＯＲＦ（ＯＲＦａｔｔＢ）の翻訳
産物とバシラス・ステアロサーモフィルス由来のグルコ
ース 6- ホスファターゼ・イソメラーゼＡ及びＢの蛋白
とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 白澤 幸生 東京都港区新橋１丁目１番19号 株式会社 ヤクルト本社内 (72)発明者 曽根 春恵 東京都港区新橋１丁目１番19号 株式会社 ヤクルト本社内 (72)発明者 左古 知行 東京都港区新橋１丁目１番19号 株式会社 ヤクルト本社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトバチラス・カゼイ(Lactobacillus
   casei)YIT9018株の溶原ファージφＦＳＷ由来の部位特
   異的組換え酵素（インテグラーゼ，ｉｎｔ）領域及びａ
   ｔｔＰ領域（宿主染色体への組込み部位）と、 乳酸菌及び大腸菌で機能する薬剤耐性領域と、 大腸菌(Escherichia coli)由来の複製開始領域と、 クローニング部位とを備えたことを特徴とするラクトバ
   チラス・カゼイ菌の染色体への外来遺伝子の組込みを可
   能とするラクトバチラス・カゼイ菌用ベクター。
2. 【請求項２】 次の化１に示した制限酵素認識切断部位
   の配列を備えたことを特徴とするラクトバチラス・カゼ
   イ菌用ベクターｐＭＳＫ７４２。 【化１】
3. 【請求項３】 ラクトバチルス・カゼイに請求項２に記
   載のベクターｐＭＳＫ７４２を導入して得られる形質転
   換体。