JPH0351400B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製造
法に関する。 従来、Ｌ−スレオニン生産能を有する人工変異
株として、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸
（以下「AHV」と記す。）に耐性を有するブレビ
バクテリウム属（特公昭45−26708）、エシエリヒ
ア属（特公昭45−26709）、コリネバクテリウム属
（特公昭47−34956）の微生物が知られている。ま
た、エシエリヒア属のAHVに耐性を有する変異
株より得たＬ−スレオニン生合成に関与する遺伝
子をプラスミドベクターに連結させ、このハイブ
リツドプラスミドをエシエリヒア属菌に形質転換
した微生物によるＬ−スレオニンの製造法（特開
昭55−131397）が報告されている。 これに対し本発明者らは、エシエリヒア属菌の
フオスフオエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（以下「PEPカルボキシラーゼ」と記す。）の遺
伝情報を有するDNAを抽出し、次にこれをプラ
スミドベクターに連結してハイブリツドプラスミ
ドを得た。このハイブリツドプラスミドを、
AHVに耐性を有しＬ−スレオニン生産能を有す
るエシエリヒア属の微生物に導入した菌株が、Ｌ
−スレオニンを高い収率で生成蓄積することを見
い出した。 エシエリヒア属のPEPカルボキシラーゼの遺
伝情報を担うDNAを組み込んだプラスミドを得
る方法は以下の通りである。 PEPカルボキシラーゼの遺伝子を得るために
使用されるエシエリヒア属の微生物は、PEPカ
ルボキシラーゼの遺伝子を有するものならばどの
ような菌株でもよい。 PEPカルボキシラーゼの遺伝子の供与菌より
染色体DNAを抽出する方法は常法でよい。また
ベクターとして用いるプラスミドの調製方法は、
菌体をリゾチーム、SDS（Sodium Dodecyl
Sulfate）等でゆるやかに溶菌させたのち、超遠
心により菌体残渣を除去し、その上清に塩化セシ
ウム、エチジウム・ブロマイドを加えて、平衡密
度勾配遠心を行うことによりプラスミドDNAを
分取することができる。 染色体DNAは、制限エンドヌクレアーゼで処
理し、同様に処理したベクターとして用いるプラ
スミドと混合しリガーゼによつて連結せしめる。 プラスミドベクターとしては、ColE1の系統、
pSC101の系統、pBR322の系統、pACYC177の系
統、pCR1の系統、R6Kの系統など通常用いられ
ている全てのものが使用できる。 得られた組換えプラスミド混合物よりPEPカ
ルボキシラーゼの遺伝子が組込まれているプラス
ミドを選別する方法は、例えば、エシエリヒア・
コリＫ−12のPEPカルボキシラーゼ欠損変異株
に、組換えプラスミド混合物を導入し、形質転換
株の内よりプラスミドベクターのマーカーとなる
性質とPEPカルボキシラーゼ活性の両者を有す
る菌株を、選択すればよい。得られた菌株より
PEPカルボキシラーゼの遺伝子が組込まれてい
るプラスミドを抽出する方法は通常の方法でよ
い。 このようにして得られたPEPカルボキシラー
ゼの遺伝子が組込まれているプラスミドを用い
て、AHVに耐性を有しＬ−スレオニン生産能を
有するエシエリヒア属の微生物を形質転換する。 用いられるAHVに耐性を有しＬ−スレオニン
生産能を有するエシエリヒア属の微生物として
は、よりAHV耐性が大であり又よりＬ−スレオ
ニン生産能が高いものが望ましい。このような菌
株を得る方法は例えば、Ｎ−メチル−N′−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いる人工突然変
異法がある。 PEPカルボキシラーゼの遺伝子が組込まれて
いるプラスミドによりAHV耐性を有しＬ−スレ
オニン生産能を有するエシエリヒア属の微生物を
形質転換する方法はどのような方法でもよい。 PEPカルボキシラーゼの遺伝子が組込まれて
いるプラスミドが導入された菌株を選択する方法
は、プラスミドベクター支配の抗生物質耐性を示
す菌株を選択することにより可能である。 かくして得られたＬ−スレオニン生産菌を培養
する方法は、従来のＬ−スレオニン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン更に必要に応じアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース、ガラクトース等及びこ
れらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等
が用いられる。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用
できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ実質的にＬ−スレオニンの生成蓄積が
停止するまで行われる。 かくして、培養液中には、著量のＬ−スレオニ
ンが生成蓄積される。培養液よりＬ−スレオニン
を採取するには通常の方法が適用できる。 実施例 １ (1) PEPカルボキシラーゼ遺伝子が組込まれて
いるプラスミドpLC20−10（泉井ら 生化学52
744（1980））をPEPカルボキシラーゼの遺伝
子の供与源として用いた。 pLC20−10は、ColE1由来のハイブリツドプ
ラスミドであり、大腸菌の遺伝子バンクより
PEPカルボキシラーゼ欠損株AB1622のグルタ
ミン酸要求性を失わせるハイブリツドプラスミ
ドとして得られた。プラスミドの大きさは
18kbである。 (2) ベクターとしてプラスミドpBR322のDNA
を次のようにして調製した。まずpBR322をプ
ラスミドとして保有するエシエリヒア・コリ−
Ｋ−12株の１種を１のグルコース・カザミノ
酸・無機塩培地（グルコース２ｇ、NH₄Cl1
ｇ、Na₂HPO₄6ｇ、KH₂PO₄3ｇ、NaCl5ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.1ｇ、CaCl₂・2H₂O0.015ｇ、
カザミノ酸20ｇを１の純水に溶解後PH7.2に
調整したものを基本培地として用い、これにＬ
−メチオニン0.05ｇ、チミン0.05ｇ、サイアミ
ン・塩酸塩100μｇを添加）に接種し、37℃で
対数後期まで培養したのち、170μｇ／mlのク
ロラムフエニコールを添加し、更に培養した。 この操作により、細胞内にプラスミドDNA
が多量に生産される。クロラムフエニコール添
加後16時間目に集菌し、リゾチーム・SDS処理
によつて溶菌させ、30000×ｇ、１時間の超遠
心により上清を得た。 これよりプラスミドDNAを濃縮後、セシウ
ムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度
勾配遠心法によつて最終380μｇのpBR322プラ
スミドDNAを分画採取した。 (3) (1)のプラスミドpLC20−10と(2)のプラスミド
pBR322を各々5μｇとり、制限エンドヌクレア
ーゼSalIを与え、37℃で60分反応させ、完全に
切断せしめた。65℃、10分の熱処理後、両反応
液を混合し、ATP及びジチオスレイトール存
在下、T₄フアージ由来のDNAリガーゼによつ
て12℃、16時間DNA鎖の連結反応を行つた。 65℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈
澱せしめ採取した。 (4) エシエリヒア・コリ Ｋ−12株から人工突然
変異によつて誘導したPEPカルボキシラーゼ
欠損変異株 AB1622株をＬ培地10mlに接種
し、37℃で振盪培養を行い対数増殖期中期まで
生育させた後集菌し、これを氷冷下
0.01MMgCl₂、0.1MCaCl₂各溶液に順次懸濁さ
せることによつて、いわゆるコンピテントな
（DNA取込み能を有する）細胞を調製した。こ
のコンピテント細胞懸濁液に(3)で得たDNAの
溶解液を加えて氷冷下30分反応させ、直ちに42
℃、２分のヒートシヨツクを与えた後、再び氷
冷下に30分放置してDNAを細胞内に取込ませ
た。次にこの細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培
地に接種し、37℃、２時間振盪培養を行つて形
質転換反応を完了させた後、集菌洗滌し、再懸
濁液を最少培地プレート（グルコース２ｇ、
（NH₄）₂SO₄1ｇ、KH₂PO₄2ｇ、K₂HPO₄7ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.1ｇ、クエン酸ナトリウム0.5
ｇを１の純水に溶解しPH7.2に調整したもの
を基本培地とし、これに寒天２％を加えて、殺
菌した固形培地にアンピシリンナトリウムを
100μｇ／mlを加えた。）に塗抹し、37℃、３日
間培養した。 DNA受容菌、AB1622はPEPカルボキシラ
ーゼ欠損株であるため表現形質としては、グル
タミン酸要求性を示す。そこで上記培地で生育
してきた菌株（グルタミン酸非要求性且つアン
ピシリン耐性株）は、目的とする形質転換株と
考えられる。 上記プレート上に生じたコロニーを釣菌し、
その中よりPEPカルボキシラーゼをプラスミ
ドpBR322に組込んだ複合プラスミドを保有す
る菌株を選択した。 得られた複合プラスミドpS3（8.7kb）の制限
酵素切断地図を第１図に示す。 (5) エシエリヒア・コリ Ｋ−12（ATCC10798）
由来のＬ−スレオニン生産菌AJ11332（FERM
−P4898）（Pro^-，Ile^-，Met^-，Thi^-，AHV^r）
を(4)の方法により、コンピテントな細胞とし、
これにプラスミドpS3を導入することにより、
形質転換株AJ11911 NRRLB−15102を得た。 これら菌株を下記培地20mlに植菌し、37℃、
72時間振盪培養を行つた。 結果を第１表に示す。

【表】 使用培地（グルコース３％、（NH₄）₂SO₄1％、
KH₂PO₄0.2％、MgSO₄×7H₂O0.1％、
Fe⁺⁺2ppm、Mn⁺⁺2ppm、サイアミン塩酸塩１
mg／、Ｌ−プロリン300mg／、Ｌ−イソロイ
シン100mg／、Ｌ−メチオニン100mg／、
CaCO₃2％、KOHによりPH7.0に調整）

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpS3の制限酵素切断地図を
示す。 ａは、フオスフオエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼの遺伝子領域であり、ｂは、pBR322由
来の領域である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ エシエリヒア属のフオスフオエノールピルビ
   ン酸カルボキシラーゼの遺伝情報を担うデオキシ
   リボ核酸を組み込んだプラスミドを、α−アミノ
   −β−ヒドロキシ吉草酸に耐性を有しＬ−スレオ
   ニンの生産能を有するエシエリヒア属の微生物に
   含有せしめたＬ−スレオニン生産性微生物を培養
   し、培養液中に生成蓄積されたＬ−スレオニンを
   採取することを特徴とするＬ−スレオニンの製造
   法。