JPH0353913B2 - - Google Patents
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- JPH0353913B2 JPH0353913B2 JP56098699A JP9869981A JPH0353913B2 JP H0353913 B2 JPH0353913 B2 JP H0353913B2 JP 56098699 A JP56098699 A JP 56098699A JP 9869981 A JP9869981 A JP 9869981A JP H0353913 B2 JPH0353913 B2 JP H0353913B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、発酵法によるＬ−イソロイシンの
製造法に関する。 発酵法によりＬ−イソロイシンを製造しようと
する場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−イソロイ
シンを生産しないので、野性株に人工的に突然変
異を生起せしめてＬ−イソロイシン生産能を付与
する方法がとられている。 従来知られているＬ−イソロイシン生産能を有
する人工変異株としては、セラチア属のイソロイ
シンヒドロキサメート耐性菌（特公昭52−
30593）、コリネバクテリウム・グルタミクムのロ
イシン要求性菌（特公昭47−38995）、ブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属のα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ−吉草酸（以下「AHV」と
記す。）耐性菌、ブレビバクテリウム株のAHV
耐性かつリジン要求性菌（特公昭51−6237）、ブ
レビバクテリウム属のAHVとＯ−メチルスレオ
ニンに耐性を有する菌株（特公昭51−21077）、コ
リネバクテリウム属のＳ−（２−アミノエチル）−
システイン耐性菌（特開昭52−61290）、エシエリ
ヒア属の２−アミノ−３−メチルチオ酪酸耐性
菌、ブレビバクテリウム属のAHVとトリクロロ
アラニンに耐性を有する菌株（特開昭54−35287）
等が知られている。 更に最近、アミノ酸生産菌の育種方法として、
エシエリヒア属微生物によるＬ−スレオニン生産
（特開昭55−131397）、エシエリヒア属微生物によ
るＬ−リジン生産（特開昭56−18596）、エシエリ
ヒア属微生物によるＬ−フエニルアラニン生産
（特開昭56−1890）及びエシエリヒア属微生物に
よるＬ−ヒスチジン生産（特開昭56−5099）にみ
られるように、プラスミドにアミノ酸生合成系遺
伝子を連結し、これを菌体内で発現させるいわゆ
る遺伝子組換え技術により、アミノ酸の生産量を
増大させる方法が報告された。また、ブレビバク
テリウムラクトフアーメンタムからプラスミドを
分離する方法（特願昭54−41392号）が知られて
いるが、このプラスミドを用いてアミノ酸の生産
性を向上させる例は知られていない。 本発明者らは前述のようなもともと高いＬ−イ
ソロイシン生産能を有するブレビバクテリウム属
及びコリネバクテリウム属の微生物の変異株を、
上述の遺伝子組換え技術を用いてより生産性の高
い菌株に改良すべく研究したところ、ついに、コ
リネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の
微生物より得たイソロイシンアンタゴニスト耐性
及びＬ−イソロイシン生産性に関与する染色体遺
伝子領域が組み込まれているコリネバクテリウム
属又はブレビバクテリウム属微生物由来のプラス
ミドを含有するブレビバクテリム属の微生物が従
来の人工変異株より高い効率でＬ−イソロイシン
を生産することを知つた。 即ちこの発明は、コリネバクテリウム属又はブ
レビバクテリウム属の微生物より得たイソロイシ
ンアンタゴニスト耐性及びＬ−イソロイシン生産
性に関与する染色体遺伝子領域が組み込まれてい
るコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム
属微生物由来のプラスミドを含有し、Ｌ−イソロ
イシン生産能を有するコリネバクテリウム属又は
ブレビバクテリウム属の微生物を培養し、培地中
に生成蓄積されたＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−イソロイシンの
製造法である。 イソロイシンアンタゴニスト耐性及びＬ−イソ
ロイシン生産性に関する染色体遺伝子領域の供与
菌は、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリ
ウム属の微生物のイソロイシンアンタゴニスト耐
性及びＬ−イソロイシン生産性株を用いればどの
ようなものでもよいが、耐性の程度がより高いも
のを用いれば、より望ましい結果が得られる。又
多くの場合、Ｌ−イソロイシン生産能がより高い
ものを遺伝子供与菌として用いれば、よりよい結
果が得られる。 これらのほか、更にDNA供与菌は、いわゆる
コリネホルムグルタミン酸生産菌にAHV耐性を
付与することにより容易に得られる。コリネホル
ムグルタミン酸生産菌としては以下のものが知ら
れている。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・イムマリオフイラム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・サツカロリイテイカム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・リウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコラ ATCC 17965 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032 イソロイシンアンタゴニストは、ブレビバクテ
リウム属及びコリネバクテリウム属の微生物の増
殖を抑制するが、その抑制は、Ｌ−イソロイシン
が培地中に共存すれば、全体的又は部分的に解除
されるようなものである。具体的には、AHV、
α−アミノ酪酸、イソロイシンヒドロキサメー
ト、チアイソロイシン、２−チアゾールアラニ
ン、β−ヒドロキシロイシン、Ｏ−メチルスレオ
ニン等がある。 ベクターDNAとしては、上記ブレビバクテリ
ウム属又はコリネバクテリウム属のコリネホルム
グルタミン酸生産菌又はそれらの変異株より得ら
れるプラスミド及びこれらプラスミドの誘導体が
使用できる。 DNA受容菌としては、上記ブレビバクテリウ
ム属又はコリネバクテリウム属のコリネホルムグ
ルタミン酸生産菌がそのまま使用できるが、これ
らコリネホルムグルタミン酸生産菌より得られた
Ｌ−イソロイシン生産菌を用いるのが望ましい。
特に、Ｌ−イソロイシン要求菌をDNA受容菌と
して用いれば、Ｌ−イソロイシン生産菌に形質転
換された株を選択する際に好都合である。Ｌ−イ
ソロイシン生産菌をDNA受容菌として用いる場
合には、よりＬ−イソロイシンの生産能が高い菌
株を用いるのが望ましい。又Ｌ−イソロイシン要
求菌をDNA受容菌として用いる場合にも、より
Ｌ−イソロイシンの生産能が高い菌株より誘導し
たものを用いるのが望ましい。 DNA供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、通常の方法が使用できる。抽出された染色体
DNAはついで制限酵素で切断される（Biochem.
Biophys.Acta383：457（1975））。制限酵素は、切
断を部分的に行なえば多くのものが使用できる。 ベクターDNAについても制限酵素によつて切
断され、上記の切断された染色体DNAとリガー
ゼによる連結反応が行なわれる。連結反応は、タ
ーミナルトランスフエラーゼにより、切断された
染色体DNA及びベクターDNAにそれぞれデオキ
シアデニル酸及びチミジル酸、又はデオキシグア
ニル酸及びデオキシシチジル酸を付加せしめ、つ
いでこれらが付加された染色体DNAとベクター
DNAをアニーリング（annealing）せしめてもよ
い。 かくして得られた組換えDNAを、組換えプラ
スミドを宿主細胞内へ移入する方法としては、E.
coli Ｋ−12で報告されているように低温のもと
で菌を塩化カルシウムで処理して菌膜の透過性を
増大せしめ、プラスミドを移入する方法
（Mandel、Ｍ and Higa、A.、J.Mol.Biol.、
53、159（1970））、枯草菌で報告されているように
増殖のある段階で自然にプラスミドを取り込みや
すくなること（いわゆるコンピーテンタな状態）
を利用して、プラスミドを移入する方法
（Duncan、C.H.、Wilson、G.A.and Young、F.
E.、Gene、１、153（1977）更には枯草菌、放射
菌、酵母の報告にあるように細胞をプロトプラス
ト又はスフエロプラストにしてプラスミドを移入
する方法（Chang、Ｓ and Cohen、S.N.、
Molec.Gen.Genet.、168、111（1979）；Bibb、M.
J.、Ward、J.M.and Hopwood、D.A.、Nature、
274、398（1978）；Hinnen、A.、Hicks、J.B.and
Fink、G.R.、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、75、
1929（1978）等が知られている。 AHV耐性に関与する遺伝情報が組み込まれて
いるプラスミドを細胞に移入せしめる方法として
は、上記の塩化カルシウム処理による方法を用い
たが、細胞をプロトプラスト化してプラスミドを
移入する方法等も用いることが可能である。 形質転換株のうちより、Ｌ−イソロイシン生産
能を有し、イソロイシンアンタゴニスト耐性に関
与する遺伝子領域が組み込まれているプラスミド
を含有する形質転換株を選択するには、例えば、
DNA受容菌として、Ｌ−イソロイシン要求菌を
用い、Ｌ−イソロイシンを含まずDNA受容菌の
生育が抑制されるような量のイソロイシンを含む
培地中又は培地上に生育しうるような菌株を選別
すればよい。又ベクターDNA上のマーカーとし
て用いることができる形質を併せもつ菌株を選別
できるような培地を用いれば、より選別が容易で
ある。 このようにして一旦選別されたイソロイシンア
ンタゴニスト耐性及びＬ−イソロイシン合成に関
与する遺伝子領域が組み込まれている組換えプラ
スミドは、DNA受容菌より抽出後他のDNA受容
菌、例えばＬ−イソロイシン生産能を有する
DNA受容菌に導入することができる。 かくして得られたＬ−イソロイシン生産菌を培
養する方法は、従来のＬ−イソロイシン生産菌の
培養方法と特に変らない。即ち、培地としては、
炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常のものである。炭素源としては、グルコース
及びシユクロース、及びこれらを含有する澱粉加
水分解液、糖密等の炭水化物、酢酸糖の有機酸、
エタノール糖のアルコールが用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩、尿素糖が使用できる。 培養方法においても、従来知られている通常の
Ｌ−イソロイシンの発酵法に使用されている方法
がそのまま適用できる。培養は、実質的にＬ−イ
ソロイシンの生成蓄積が停止するまで行われる。 かくして培養液中には著量のＬ−イソロイシン
が生成蓄積される。培養液よりＬ−イソロイシン
を採取するには通常の方法が適用できる。本発明
の微生物を用いることにより、DNA供与菌を用
いる場合に比べ、高い収率でＬ−イソロイシンを
得ることができる。 実施例 １ (1) 染色体DNAの調製 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560
（FERM−P5485）より誘導したイソロイシン
生産能を有するAHV耐性株No.11を１のCMG
培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／
dl、グルコース0.5ｇ／dl及びNaCl0.5ｇ／dlを
含み、PH7.2に調製したもの）を用い、30℃で
約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を
集めた。この菌体よりフエノール法による通常
のDNA抽出法によつて染色体DNAを抽出精製
し、最終0.8mgのDNAを得た。 尚、コリネバクテリウム・グルタミクム
AJ11560は、本発明の目的にかなう菌株として
スクリーニングした結果得られたものであり、
本菌の同定をバーヂーズ・マニユアル・オブ・
デタミネイテイブ・バクテリオロジー第８版
（1974）で行うと、コリネバクテリウム属のセ
クシヨンに属するものと認定される。しか
し、セクシヨンでは菌種名のみ記載されてい
て、菌学的性状は記載されておらず、本検索書
での本菌の同定は不可能であつた。 そこで本菌の菌学的性状をセクシヨンに記
載されている菌種の原著の報告と比較して同定
を行つた。その結果、「Bull.Agr.Chem.Soc.
Japan、22、176〜185（1958）」及び「J.Gen.
Appl.Microbiol.、13、279〜301（1967）」に記
載されているコリネバクテリウム・グルタミク
ムと同定された。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてプラスミドの１種pAM286
（分子量３×106ダルトン）のDNAを次のよう
にして調製した。まず、pAM286をプラスミド
として保有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムAJ11560を１のCMG培地に接種し、30
℃で対数後期まで培養したのち、リゾチーム・
SDS処理によつて溶菌させ、30000×ｇ、30分
の超遠心により上清を得た。これよりプラスミ
ドDNAを濃縮後、アガロースゲル電気泳動法
によつて最終60μｇのpAM286プラスミドDNA
を分画採取した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、制限エ
ンドヌクレアーゼBclを与え、37℃で10分、
30分、又は60分反応させ、DNA鎖を種々の程
度に切断した。(2)で得たベクターDNAの場合
は5μｇをとり、60分反応させ、完全に切断せ
しめた。65℃、５分の熱処理後、両反応液を混
合し、ATP及びジチオスレイトール存在下、
T4フアージ由来のDNAリガーゼによつて10
℃、24時間DNA鎖の連結反応を行つた。 65℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈
澱採取した。 (4) プラスミドによる形質転換 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560
（FERM−P5485）よりＬ−イソロイシン要求
性変異株No.144を誘導し、この菌株をCMG培地
20mlに接種し、0.6A650／mlまで増殖した菌を
遠心して集菌した。菌体を氷冷下で0.1M
MgCl2にけん濁し、菌体を集めた、次に菌体
を、氷冷下0.1M CaCl2 ５mlに懸濁して、０℃
に20分間時々振りながら保つた。ついで菌体を
集めた後、少量の0.1M CaCl2に懸濁した。 以上の操作により、コンピーテントな
（DNA取り込み能を有する）細胞を得た。 この細胞懸濁液に(3)で得たDNAの溶解液を
加え、DNAを細胞内に取り込ませた。この反
応液を最少培地プレート（グルコース20ｇ、硫
安10ｇ、尿素2.5ｇ、KH2PO4 1.0ｇ、
MgSO4・7H2O 0.4ｇ、ビオチン50μｇ、チア
ミン塩酸塩200μｇ、FeSO4・7H2O 0.01ｇ、
MnSO4・4H2O 0.01ｇ及びAHV 1.0mg／mlを
１の脱イオン水に溶解し、PH7.0に調整した
ものを基本最少培地とし、これに寒天２％を加
えて殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃で４日
間培養した。生じたコロニーを釣菌、純化後
pAM286にAHV耐性で、かつＬ−イソロイシ
ン生合成に関与する遺伝子が組み入れられてい
るようなプラスミドを保有するコロニーを、目
的とする形質転換株として保存した。 これらの形質転換株のうちより、よりＬ−イ
ソロイシンの高いAJ11686（FERM−P6011、
FERM BP−135）を得た。 (5) Ｌ−イソロイシンの生産 (4)で得られた菌株を、DNA供与菌及びDNA
受容菌と比較してＬ−イソロイシンの生産性を
調べた。 結果を第１表に示す。培養はグルコース10
ｇ／dl、硫酸アンモニウム3.0ｇ／dl、
KH2PO40.1ｇ／dl、MgSO4・7H2O 0.04ｇ／
dl、FeSO4・7H2O 1.0mg／dl、MnSO4・
4H2O 1.0mg／dl、チアミン塩酸塩0.1mg／、
ビオチン0.5mg／、大豆蛋白加水分解物（「味
液」）2.0mg／dl及び炭酸カルシウム５ｇ／dl
（別殺菌添加）を含みPH7.2に調節した液体培地
を用いた。この培地を500ml容フラスコに培地
20mlずつを入れ、これに第１表に示す微生物を
それぞれ１白金耳植えつけ、31℃で72時間培養
した。培養後、遠心上清液中のＬ−イソロイシ
ンをマイクロバイオアツセイ法により定量し
た。 【表】 実施例 ２ (1) 染色体DNAの調製 実施例１のステツプ(1)に示した方法により、
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より誘導したイソロイシン生産能
を有するAHV耐性株No.18より、最終2.4mgの染
色体DNAを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフハーメンタム
ATCC13869より、実施例１のステツプ(2)に示
した方法により、プラスミドの１種
pAM330DNA（３×106ダルトン）をベクター
DNAとして最終150μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、実施例
１のステツプ(3)に示した方法により、DNA鎖
を切断した。一方、(2)で得たベクターDNAも
実施例１のステツプ(3)に示した方法により、切
断し、切断されたベクターDNAと上記染色体
DNAフラグメントとを、実施例１のステツプ
(3)に示す方法により、リガーゼによる連絡反応
を行つた。 (4) 形質転換 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より、Ｌ−イソロイシンを要求す
るNo.146を変異誘導し、この菌株を受容菌とし
て、実施例１のステツプ(4)に示す方法により、
Ｌ−イソロイシン生産能を有する形質転換株
AJ11687（FERM−P6010FERM BP−134）を
得た。 (5) Ｌ−イソロイシンの生産 (4)で得られた形質転換株AJ11687について、
実施例１のステツプ(5)に示した方法により、Ｌ
−イソロイシンの発酵生産を行つた。第２表に
結果を示す。 【表】
製造法に関する。 発酵法によりＬ−イソロイシンを製造しようと
する場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−イソロイ
シンを生産しないので、野性株に人工的に突然変
異を生起せしめてＬ−イソロイシン生産能を付与
する方法がとられている。 従来知られているＬ−イソロイシン生産能を有
する人工変異株としては、セラチア属のイソロイ
シンヒドロキサメート耐性菌（特公昭52−
30593）、コリネバクテリウム・グルタミクムのロ
イシン要求性菌（特公昭47−38995）、ブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属のα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ−吉草酸（以下「AHV」と
記す。）耐性菌、ブレビバクテリウム株のAHV
耐性かつリジン要求性菌（特公昭51−6237）、ブ
レビバクテリウム属のAHVとＯ−メチルスレオ
ニンに耐性を有する菌株（特公昭51−21077）、コ
リネバクテリウム属のＳ−（２−アミノエチル）−
システイン耐性菌（特開昭52−61290）、エシエリ
ヒア属の２−アミノ−３−メチルチオ酪酸耐性
菌、ブレビバクテリウム属のAHVとトリクロロ
アラニンに耐性を有する菌株（特開昭54−35287）
等が知られている。 更に最近、アミノ酸生産菌の育種方法として、
エシエリヒア属微生物によるＬ−スレオニン生産
（特開昭55−131397）、エシエリヒア属微生物によ
るＬ−リジン生産（特開昭56−18596）、エシエリ
ヒア属微生物によるＬ−フエニルアラニン生産
（特開昭56−1890）及びエシエリヒア属微生物に
よるＬ−ヒスチジン生産（特開昭56−5099）にみ
られるように、プラスミドにアミノ酸生合成系遺
伝子を連結し、これを菌体内で発現させるいわゆ
る遺伝子組換え技術により、アミノ酸の生産量を
増大させる方法が報告された。また、ブレビバク
テリウムラクトフアーメンタムからプラスミドを
分離する方法（特願昭54−41392号）が知られて
いるが、このプラスミドを用いてアミノ酸の生産
性を向上させる例は知られていない。 本発明者らは前述のようなもともと高いＬ−イ
ソロイシン生産能を有するブレビバクテリウム属
及びコリネバクテリウム属の微生物の変異株を、
上述の遺伝子組換え技術を用いてより生産性の高
い菌株に改良すべく研究したところ、ついに、コ
リネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の
微生物より得たイソロイシンアンタゴニスト耐性
及びＬ−イソロイシン生産性に関与する染色体遺
伝子領域が組み込まれているコリネバクテリウム
属又はブレビバクテリウム属微生物由来のプラス
ミドを含有するブレビバクテリム属の微生物が従
来の人工変異株より高い効率でＬ−イソロイシン
を生産することを知つた。 即ちこの発明は、コリネバクテリウム属又はブ
レビバクテリウム属の微生物より得たイソロイシ
ンアンタゴニスト耐性及びＬ−イソロイシン生産
性に関与する染色体遺伝子領域が組み込まれてい
るコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム
属微生物由来のプラスミドを含有し、Ｌ−イソロ
イシン生産能を有するコリネバクテリウム属又は
ブレビバクテリウム属の微生物を培養し、培地中
に生成蓄積されたＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−イソロイシンの
製造法である。 イソロイシンアンタゴニスト耐性及びＬ−イソ
ロイシン生産性に関する染色体遺伝子領域の供与
菌は、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリ
ウム属の微生物のイソロイシンアンタゴニスト耐
性及びＬ−イソロイシン生産性株を用いればどの
ようなものでもよいが、耐性の程度がより高いも
のを用いれば、より望ましい結果が得られる。又
多くの場合、Ｌ−イソロイシン生産能がより高い
ものを遺伝子供与菌として用いれば、よりよい結
果が得られる。 これらのほか、更にDNA供与菌は、いわゆる
コリネホルムグルタミン酸生産菌にAHV耐性を
付与することにより容易に得られる。コリネホル
ムグルタミン酸生産菌としては以下のものが知ら
れている。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・イムマリオフイラム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・サツカロリイテイカム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・リウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコラ ATCC 17965 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032 イソロイシンアンタゴニストは、ブレビバクテ
リウム属及びコリネバクテリウム属の微生物の増
殖を抑制するが、その抑制は、Ｌ−イソロイシン
が培地中に共存すれば、全体的又は部分的に解除
されるようなものである。具体的には、AHV、
α−アミノ酪酸、イソロイシンヒドロキサメー
ト、チアイソロイシン、２−チアゾールアラニ
ン、β−ヒドロキシロイシン、Ｏ−メチルスレオ
ニン等がある。 ベクターDNAとしては、上記ブレビバクテリ
ウム属又はコリネバクテリウム属のコリネホルム
グルタミン酸生産菌又はそれらの変異株より得ら
れるプラスミド及びこれらプラスミドの誘導体が
使用できる。 DNA受容菌としては、上記ブレビバクテリウ
ム属又はコリネバクテリウム属のコリネホルムグ
ルタミン酸生産菌がそのまま使用できるが、これ
らコリネホルムグルタミン酸生産菌より得られた
Ｌ−イソロイシン生産菌を用いるのが望ましい。
特に、Ｌ−イソロイシン要求菌をDNA受容菌と
して用いれば、Ｌ−イソロイシン生産菌に形質転
換された株を選択する際に好都合である。Ｌ−イ
ソロイシン生産菌をDNA受容菌として用いる場
合には、よりＬ−イソロイシンの生産能が高い菌
株を用いるのが望ましい。又Ｌ−イソロイシン要
求菌をDNA受容菌として用いる場合にも、より
Ｌ−イソロイシンの生産能が高い菌株より誘導し
たものを用いるのが望ましい。 DNA供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、通常の方法が使用できる。抽出された染色体
DNAはついで制限酵素で切断される（Biochem.
Biophys.Acta383：457（1975））。制限酵素は、切
断を部分的に行なえば多くのものが使用できる。 ベクターDNAについても制限酵素によつて切
断され、上記の切断された染色体DNAとリガー
ゼによる連結反応が行なわれる。連結反応は、タ
ーミナルトランスフエラーゼにより、切断された
染色体DNA及びベクターDNAにそれぞれデオキ
シアデニル酸及びチミジル酸、又はデオキシグア
ニル酸及びデオキシシチジル酸を付加せしめ、つ
いでこれらが付加された染色体DNAとベクター
DNAをアニーリング（annealing）せしめてもよ
い。 かくして得られた組換えDNAを、組換えプラ
スミドを宿主細胞内へ移入する方法としては、E.
coli Ｋ−12で報告されているように低温のもと
で菌を塩化カルシウムで処理して菌膜の透過性を
増大せしめ、プラスミドを移入する方法
（Mandel、Ｍ and Higa、A.、J.Mol.Biol.、
53、159（1970））、枯草菌で報告されているように
増殖のある段階で自然にプラスミドを取り込みや
すくなること（いわゆるコンピーテンタな状態）
を利用して、プラスミドを移入する方法
（Duncan、C.H.、Wilson、G.A.and Young、F.
E.、Gene、１、153（1977）更には枯草菌、放射
菌、酵母の報告にあるように細胞をプロトプラス
ト又はスフエロプラストにしてプラスミドを移入
する方法（Chang、Ｓ and Cohen、S.N.、
Molec.Gen.Genet.、168、111（1979）；Bibb、M.
J.、Ward、J.M.and Hopwood、D.A.、Nature、
274、398（1978）；Hinnen、A.、Hicks、J.B.and
Fink、G.R.、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、75、
1929（1978）等が知られている。 AHV耐性に関与する遺伝情報が組み込まれて
いるプラスミドを細胞に移入せしめる方法として
は、上記の塩化カルシウム処理による方法を用い
たが、細胞をプロトプラスト化してプラスミドを
移入する方法等も用いることが可能である。 形質転換株のうちより、Ｌ−イソロイシン生産
能を有し、イソロイシンアンタゴニスト耐性に関
与する遺伝子領域が組み込まれているプラスミド
を含有する形質転換株を選択するには、例えば、
DNA受容菌として、Ｌ−イソロイシン要求菌を
用い、Ｌ−イソロイシンを含まずDNA受容菌の
生育が抑制されるような量のイソロイシンを含む
培地中又は培地上に生育しうるような菌株を選別
すればよい。又ベクターDNA上のマーカーとし
て用いることができる形質を併せもつ菌株を選別
できるような培地を用いれば、より選別が容易で
ある。 このようにして一旦選別されたイソロイシンア
ンタゴニスト耐性及びＬ−イソロイシン合成に関
与する遺伝子領域が組み込まれている組換えプラ
スミドは、DNA受容菌より抽出後他のDNA受容
菌、例えばＬ−イソロイシン生産能を有する
DNA受容菌に導入することができる。 かくして得られたＬ−イソロイシン生産菌を培
養する方法は、従来のＬ−イソロイシン生産菌の
培養方法と特に変らない。即ち、培地としては、
炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常のものである。炭素源としては、グルコース
及びシユクロース、及びこれらを含有する澱粉加
水分解液、糖密等の炭水化物、酢酸糖の有機酸、
エタノール糖のアルコールが用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩、尿素糖が使用できる。 培養方法においても、従来知られている通常の
Ｌ−イソロイシンの発酵法に使用されている方法
がそのまま適用できる。培養は、実質的にＬ−イ
ソロイシンの生成蓄積が停止するまで行われる。 かくして培養液中には著量のＬ−イソロイシン
が生成蓄積される。培養液よりＬ−イソロイシン
を採取するには通常の方法が適用できる。本発明
の微生物を用いることにより、DNA供与菌を用
いる場合に比べ、高い収率でＬ−イソロイシンを
得ることができる。 実施例 １ (1) 染色体DNAの調製 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560
（FERM−P5485）より誘導したイソロイシン
生産能を有するAHV耐性株No.11を１のCMG
培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／
dl、グルコース0.5ｇ／dl及びNaCl0.5ｇ／dlを
含み、PH7.2に調製したもの）を用い、30℃で
約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を
集めた。この菌体よりフエノール法による通常
のDNA抽出法によつて染色体DNAを抽出精製
し、最終0.8mgのDNAを得た。 尚、コリネバクテリウム・グルタミクム
AJ11560は、本発明の目的にかなう菌株として
スクリーニングした結果得られたものであり、
本菌の同定をバーヂーズ・マニユアル・オブ・
デタミネイテイブ・バクテリオロジー第８版
（1974）で行うと、コリネバクテリウム属のセ
クシヨンに属するものと認定される。しか
し、セクシヨンでは菌種名のみ記載されてい
て、菌学的性状は記載されておらず、本検索書
での本菌の同定は不可能であつた。 そこで本菌の菌学的性状をセクシヨンに記
載されている菌種の原著の報告と比較して同定
を行つた。その結果、「Bull.Agr.Chem.Soc.
Japan、22、176〜185（1958）」及び「J.Gen.
Appl.Microbiol.、13、279〜301（1967）」に記
載されているコリネバクテリウム・グルタミク
ムと同定された。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてプラスミドの１種pAM286
（分子量３×106ダルトン）のDNAを次のよう
にして調製した。まず、pAM286をプラスミド
として保有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムAJ11560を１のCMG培地に接種し、30
℃で対数後期まで培養したのち、リゾチーム・
SDS処理によつて溶菌させ、30000×ｇ、30分
の超遠心により上清を得た。これよりプラスミ
ドDNAを濃縮後、アガロースゲル電気泳動法
によつて最終60μｇのpAM286プラスミドDNA
を分画採取した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、制限エ
ンドヌクレアーゼBclを与え、37℃で10分、
30分、又は60分反応させ、DNA鎖を種々の程
度に切断した。(2)で得たベクターDNAの場合
は5μｇをとり、60分反応させ、完全に切断せ
しめた。65℃、５分の熱処理後、両反応液を混
合し、ATP及びジチオスレイトール存在下、
T4フアージ由来のDNAリガーゼによつて10
℃、24時間DNA鎖の連結反応を行つた。 65℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈
澱採取した。 (4) プラスミドによる形質転換 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560
（FERM−P5485）よりＬ−イソロイシン要求
性変異株No.144を誘導し、この菌株をCMG培地
20mlに接種し、0.6A650／mlまで増殖した菌を
遠心して集菌した。菌体を氷冷下で0.1M
MgCl2にけん濁し、菌体を集めた、次に菌体
を、氷冷下0.1M CaCl2 ５mlに懸濁して、０℃
に20分間時々振りながら保つた。ついで菌体を
集めた後、少量の0.1M CaCl2に懸濁した。 以上の操作により、コンピーテントな
（DNA取り込み能を有する）細胞を得た。 この細胞懸濁液に(3)で得たDNAの溶解液を
加え、DNAを細胞内に取り込ませた。この反
応液を最少培地プレート（グルコース20ｇ、硫
安10ｇ、尿素2.5ｇ、KH2PO4 1.0ｇ、
MgSO4・7H2O 0.4ｇ、ビオチン50μｇ、チア
ミン塩酸塩200μｇ、FeSO4・7H2O 0.01ｇ、
MnSO4・4H2O 0.01ｇ及びAHV 1.0mg／mlを
１の脱イオン水に溶解し、PH7.0に調整した
ものを基本最少培地とし、これに寒天２％を加
えて殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃で４日
間培養した。生じたコロニーを釣菌、純化後
pAM286にAHV耐性で、かつＬ−イソロイシ
ン生合成に関与する遺伝子が組み入れられてい
るようなプラスミドを保有するコロニーを、目
的とする形質転換株として保存した。 これらの形質転換株のうちより、よりＬ−イ
ソロイシンの高いAJ11686（FERM−P6011、
FERM BP−135）を得た。 (5) Ｌ−イソロイシンの生産 (4)で得られた菌株を、DNA供与菌及びDNA
受容菌と比較してＬ−イソロイシンの生産性を
調べた。 結果を第１表に示す。培養はグルコース10
ｇ／dl、硫酸アンモニウム3.0ｇ／dl、
KH2PO40.1ｇ／dl、MgSO4・7H2O 0.04ｇ／
dl、FeSO4・7H2O 1.0mg／dl、MnSO4・
4H2O 1.0mg／dl、チアミン塩酸塩0.1mg／、
ビオチン0.5mg／、大豆蛋白加水分解物（「味
液」）2.0mg／dl及び炭酸カルシウム５ｇ／dl
（別殺菌添加）を含みPH7.2に調節した液体培地
を用いた。この培地を500ml容フラスコに培地
20mlずつを入れ、これに第１表に示す微生物を
それぞれ１白金耳植えつけ、31℃で72時間培養
した。培養後、遠心上清液中のＬ−イソロイシ
ンをマイクロバイオアツセイ法により定量し
た。 【表】 実施例 ２ (1) 染色体DNAの調製 実施例１のステツプ(1)に示した方法により、
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より誘導したイソロイシン生産能
を有するAHV耐性株No.18より、最終2.4mgの染
色体DNAを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフハーメンタム
ATCC13869より、実施例１のステツプ(2)に示
した方法により、プラスミドの１種
pAM330DNA（３×106ダルトン）をベクター
DNAとして最終150μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、実施例
１のステツプ(3)に示した方法により、DNA鎖
を切断した。一方、(2)で得たベクターDNAも
実施例１のステツプ(3)に示した方法により、切
断し、切断されたベクターDNAと上記染色体
DNAフラグメントとを、実施例１のステツプ
(3)に示す方法により、リガーゼによる連絡反応
を行つた。 (4) 形質転換 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より、Ｌ−イソロイシンを要求す
るNo.146を変異誘導し、この菌株を受容菌とし
て、実施例１のステツプ(4)に示す方法により、
Ｌ−イソロイシン生産能を有する形質転換株
AJ11687（FERM−P6010FERM BP−134）を
得た。 (5) Ｌ−イソロイシンの生産 (4)で得られた形質転換株AJ11687について、
実施例１のステツプ(5)に示した方法により、Ｌ
−イソロイシンの発酵生産を行つた。第２表に
結果を示す。 【表】
Claims (1)
- １ コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウ
ム属の微生物より得たイソロイシンアンタコニス
ト耐性及びＬ−イソロイシン生産性に関与する染
色体遺伝子領域が組み込まれているコリネバクテ
リウム属又はブレビバクテリウム属の微生物由来
のプラスミドを含有し、Ｌ−イソロイシン生産能
を有するコリネバクテリウム属又はブレビバクテ
リウム属の微生物を培養し、培地中に生成蓄積さ
れたＬ−イソロイシンを採取することを特徴とす
る発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56098699A JPS58893A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
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| JP56098699A JPS58893A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
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