JPH0352478B2 - - Google Patents
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- JPH0352478B2 JPH0352478B2 JP58112956A JP11295683A JPH0352478B2 JP H0352478 B2 JPH0352478 B2 JP H0352478B2 JP 58112956 A JP58112956 A JP 58112956A JP 11295683 A JP11295683 A JP 11295683A JP H0352478 B2 JPH0352478 B2 JP H0352478B2
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- alanyl
- mdp
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
この発明は、次の式（）、
（式中、Adはその１位において結合している
アダマンタン残基である。） で表わされるＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
アダマンチルアミドに関する。この新規なジペプ
チド誘導体（ADPと略す）は、有意の免疫アジ
ユバント活性及び免疫刺激活性を有する。 周知の通り、免疫応答の刺激により生物の抵抗
力を強化することができる化合物は常に不足して
いる。しばらくの間、細菌の生産物又は細胞壁の
断片が上記の目的のために使用された。しかしな
がら、、これらは、効果が安定でなく、臨床的使
用において副作用を生ずるという欠点を有してい
た。主としてミコバクテリウム・ツベルクロシス
（Mycobacterium tuberculosis）からの生産物が
しばしば鉱油と組合わせて使用される免疫アジユ
バンド活性を有する化合物の分野においても事情
は同様である。 まず酵素的に、そしてその後合成的に、細菌細
胞壁の幾つかのサブユニツトを得ることにより、
有意な進歩が達成された〔F.エロウツ（Ellouz）
等、Biochem.Biophys.Res.Commun.59，1317，
1974年〕。ほとんどの実験的経験はムラミルジペ
プチド〔Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミン（MDP）〕〔L.チエジド
（Chedid）等，Progr.Allergy25，63（カールゲ
ル．バーセル 1978年）；Ｃマーサー（Merser）
等、Biochem.Biophys.Res.Commun.66，1316，
1975年〕、及びこの幾つかの類似体を用いて行わ
れた。これらの類似体においては生物学的効果が
種々の程度に生じた。種々の構造の類似体の研究
により、アジユバント効果及び免疫刺激効果のた
めには分子中のペプチド部分が必須であり、この
活性は分子中の炭水化物部分にはあまり依存しな
いことが見知された〔L.チエジド等、C.メルサー
（Merser）等、前記；K.マセク（Masek）等、
Experientia35，1397，1979年；S.コタニ等、ビ
ケン報告、18，105，1975年；ハセガワ等，
Agric.Biol.Chem.42，（11），2187，1978年〕。 さらに、MDP及び幾つかの類似体の効果は、
これらを鉱油媒体中で、又はリボゾーーム構造に
結合せしめて投与する場合により高くなることが
記載されている〔J.フロイド（Frevd）及びK.マ
クデルモ（McDermot），Proc.Soc.Expl.Biol.
Mod.49，548，1942年；K.マセク等、
Experientia 34，1363，1978年〕。ここで試験さ
れた合成的に調製された化合物は生物学的に活性
であつたが、常に相当程度発熱性を有し、主とし
てこの理由のために臨床的に実用されなかつた。
アジユバンド効果は発熱性と直接関連するという
意見が提出された（コタニ等、ビケン報告，19，
９，1976年）。 分子の強い親脂性が生物学的効果の発現に重要
な役割を演ずる。このことは、糖部分の５位のヒ
ドロキシル基の酸素原子に高級アルキル基を結合
せしめた構造類似体を調製することにより証明さ
れた（S.コタニ等、上記第２の照考文献）。同様
の効果が、脂肪族親脂性鎖をイソグルタミン分子
上に導入した場合にも観察された（K.マセク等、
上記第１の参考文献）。 （発明の構成及びその具体的な説明） ここに、イソグルタミン部分のγ−カルボキシ
アミド基にアダマンタンの残基を導入することに
より新しい型の免疫刺激物質が調製された。こう
して得たＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダ
マンチルアミド（ADPと略す）は、顕著な免疫
刺激活性を有し、他の物質が共通に有する副作
用、特に発熱性を有さず、そして化学合成により
容易に製造することができる。 式（）で表わされるこの発明の化合物は、ペ
プチドの製造化学において常用されている一般的
な方法により、好ましくは保護されたＬ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミン誘導体を１−アミノアダ
マンタンと反応せしめることにより製造すること
ができる。すなわち、有利には、１−アミノアダ
マンタンを次の式（）、 〔式中、Ｘは酸加水分解により、又は水素化
（水素化分解）により除去し得る保護基、好まし
くはtert−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキ
シカルボニル基又はニトロフエニルチオ基であ
る、〕 で表わされるジペプチド誘導体と反応せしめ、次
に、前記の保護基を脱離することにより製造す
る。 この発明の化合物の製造方法を次の例により詳
細に説明する。但し、これによりこの発明の範囲
を限定するものではない。ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｄ
−イソグルタミン 20.3ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを、
280mlのジオキサン中19.6ｇのBOC−Ala及び12.3
ｇのＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールの溶液
に、−10℃において加える。この混合物を室温に
て60分間撹拌し、過し、そして液を60mlの水
中13.3ｇのＤ−イソグルタミンの溶液に加える。
撹拌を一夜継続する。反応混合物を過し、そし
て液を蒸発乾固する。蒸発残渣を酢酸エチル−
エーテルから結晶化する。生成物の収量は30.9ｇ
（理論量の83％）である。融点98℃。〔α〕20 D＝−
8.2（ｃ＝１、メタノール）。ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イ
ソグルタミンアダマンチルアミド 1.9ｇの１−アミノアダマンタンヒドロクロリ
ドを、2N水酸化ナトリウム溶液で処理し、そし
て遊離した塩基をクロロホルムで抽出する。これ
を蒸発せしめることにより得た1.4ｇ（９ミリモ
ル）の塩基を、30mlのジメチルホルムアミドに溶
解し、そして溶液を−10℃に冷却する。この溶液
を、10mlのジメチルホルムアミド中2.1中（10ミ
リモル）のジシクロヘキシルカルボジイミドの溶
液で処理する。５分間後、20mlのジメチルホルム
アミド中1.6ｇ（５ミリモル）のBOC−Ｌ−Ala
−Ｄ−iGln，1.3ｇのＮ−ヒドロキシベンズトリ
アゾール、0.7mlのトリエチルアミン及び５mlの
ピリジンの溶液を加える。反応混合物を室温にて
一夜撹拌する。ジメチルホルムアミドを蒸発せし
め、100mlの酢酸エチルを加え、そして溶液を
0.1N塩酸及び５％重炭酸ナトリウム溶液で反復
抽出し、乾燥し、そして蒸発せしめる。蒸発残渣
のメタノール溶液を水で沈澱せしめることにより
1.28ｇ（理論量の56％）の目的化合物を得る。元
素分析及びアミノ酸分析の結果は理論量と一致し
た。Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンチル
アミド 塩化メチレン中40％トリフルオロ酢酸溶液で処
理することにより、前記の生成物からｔ−ブチル
オキシカルボニル基を脱離する。開始から60分間
室温に置いた後、溶液を蒸発せしめ、そして残渣
をエーテルと混合する。吸引することにより0.9
ｇの生成物（トリフルオロアセテートの形で）を
得る。この生成物をただちに５mlのエタノール中
に溶解し、OH型の陰イオン交換体に適用し、メ
タノールで溶出する。溶出液を蒸発せしめること
により0.8ｇ（理論量の83％）の泡状生成物を得
る。 アミノ酸組成の分析：Ala1.01，iGln0.97。 さらに、高圧液体クロマトグラフイー
（HPLC）及びPH2.5及び5.7の緩衝液における紙
電気泳動法により生成物の純度を確認した。 Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンチ
ルアミドの分析は次の条件で行つた。不動相（標
準C18逆相溶剤）は親脂基を有する処理されたシ
リカゲル（カラム15×0.3cm）により構成し、移
動相は60〜80容量％の有機変性剤、好ましくはメ
タノール、及び40〜20容量％のトリフルオロ酢酸
２％水溶液により構成した。紫外線検知器による
検知は210nmにて行つた。移動相の流速は20〜30
ml／時とした。製造のためには、上記と同じ不動
相及び移動相を使用し、30×2.5cmの大きさのカ
ラムを使用した。 さらに、生成物の純度を、ｎ−ブタノール／酢
酸／水（４：１：１）及びクロロホルム−メタノ
ール−酢酸−水（40：20：10：５）の溶媒系を用
いるシリカゲル薄層上の薄層クロマトグラフイー
により証明した。 0.5ｇの粗生成物をHPLCにより精製すること
により0.3ｇの純化合物（ピークの面積から算出
して約95重量％）を得た。 Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンチ
ルアミドの薬理学的性質は次の通りである。 試験 １ モルモツトを使用して免疫アジユバント効果を
試験した。不完全フロインド・アジユバント
（FIA）中卵白アルブミン（2.5mg）及びＬ−アラ
ニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンンチルアミド
（APP）の混合物0.2mlを左後肢に投与した。 対照群動物は卵白アルブミンを含む不完全フロ
インド・アジユバントのみを投与した。被験化合
物の効果を、今までに知られている最も強力な細
菌性アジユバント〔ミコバクテリウム・ツベルク
ロシス（Mycobacterium tuberculosis）性のも
の〕と比較した。この群の動物には、卵白アルプ
ミン及び完全フロインド・アジユバント（FCA）
を含む混合物を投与した。同様に、新規誘導体の
効果をＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ
−イソグルタミン（MDP）と比較した。被験物
質を投与した後３週間の後に、卵白アルブミン
10μｇ及び20μｇを投与してモルモツトでの皮膚
反応を行つた。皮膚反応領域の大きさ（mm）の測
定結果を第１表に示す。 【表】 数値は16動物を使用した２回の実験の平均値で
ある。表中の記号は次の意味を有する。 FIA：不完全フロインド・アジユバント（Bayol
＋Arlacel（４：１）） FCA：完全フロインド・アジユバント（Bayol＋
ArIacel1mgのミコバクテリウム・ツベルクロ
シス） MDP：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル
−Ｄ−イソグルタミン ADP：Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダ
マンチルアミン 第１表の結果から、モルモツトにおいて卵白ア
ルブミンに対する遅延過敏症が強化され、投与量
100μｇにおける効果はMDP及びFCAの両者の効
果に匹敵する。 試験 ２ 生体内におけるDNA生合成の研究に標識チミ
ジンが最も頻繁に使用される。このあらかじめ調
製されたピリミジンデス キシヌクレオシドは、
これに続く燐酸化反応によりdTTp（デスオキシ
チミジントリホスフエート）に燐酸化され、この
ものは細胞核内でのDNA合成における直接的前
駆体となる。標識チミジンのDNAへの取り込み
の増加は、細胞の増加に先行するDNAの生合成
の活性化を示す。 この試験は最も鋭敏でしかも確実な試験の１つ
であつて、この試験により物質の免疫刺激効果及
び細胞増加に対する効果を測定することができ
る。体重150〜160ｇの雄のウイスターラツトに、
同モル量の被験物質（MDPは1.00mg／Kg、ADP
は0.74mg／Kg）を投与した。16時間後に動物を殺
した。動物を殺す２時間前にチミジン（メチル−
3H）を、0.3mlの生理溶液中20μCi／動物（比活
性20Ci／ミリモル）の投与量で腹控内投与した。 凍結した器官を取り出し、そして0.2NHClO4
中で即座にホモジナイズした。沈降物を
0.2NHClO3により反復して洗浄した後、アルカ
リ加水分解によりRNAを除去した。INHClO3中
での加水分解により、蛋白質−DNA沈澱物から
ヌクレチオド成分を遊離せしめた。上澄液を、中
和した後に蒸発乾固した。濃HCClO4により酸加
水分解することによりDNAのヌクレオチドを塩
基に変換した。ペーパークロマトグラフイーを反
復することににより、クロマトグラフ的に純粋な
型でチミン量を分離した。このものの放射能をシ
ンチレーシヨンスペクトロメータで測定した。実
験結果を第２表に示す。 【表】 第２表のデーターから、ADPを0.75mg／Kgの
投与量で１回投与しただけで胸腺DNA及び脾
DNAへのメチル−3Hチミジンの取り込みに大き
な積極効果が生ずることが明らかである。この２
種の器官は、腫瘍の発達及び細胞免疫において、
実質的な程度に役割を演ずる。表の結果は、胸腺
DNAの合成のためのチミジンの利用の有意な増
加を示しており、これはすでに長い間知られてい
るMDPの場合の効果と同じオーダーである。 脾の場合、MDPの投与によつてはチミジン利
用の増加は生じないが、ADPによつては、3Hチ
ミジンの利用の増加により示される大きな刺激効
果が生ずることが明らかである。 摘出された腓細胞における試験管内試験におい
ても脾DNAの合成のためのチミジンの利用に対
するMDPの効果に関する結果は、MDPや脾に対
して効果を有しないとする文献のデータとよく一
致する。２つの化合物、すなわちこの発明の
ADP及び先行技術のMDPの効果の比較におい
て、この発明の新規化合物は、免疫反応に重要な
役割を演ずる両器官に望ましい作用をするため
に、より有利であることが明らかである。 試験 ３ 今までに合成されたMDP類似体のほとんどの
ものが、免疫アジユバント効果及び免疫刺激効果
を有するが、同時に高い発熱性を有し、このこと
が臨床的実用における実質的な欠点である。上記
の事実のために、現在まで、非常に期待された幾
つかの新規物質が臨床的に使用されていない。こ
のため、家兎を用いる実験において、ADPの発
熱効果をMDPのそれと比較して評価した。ADP
を、100μｇ／Kgの投与量において体重1.8〜2.0Kg
の家兎に投与し、そしてその効果を、同じ投与量
でMDPを投与した場合のそれと比較した。さら
に、対照動物に同容量（0.2ml）の等張溶液を注
射し、基礎体温を測定した。直腸サーミスタ温度
計を用いて、６時間にわたり１時間間隔で体温を
測定した。結果を第３表に要約する。 【表】 数値は１群５動物の平均値である。
第３表の結果から、ADPは、臨床的使用にお
いて考慮される投与量（すなわち100μｇ／Kg）
において発熱効果を有しないことが明らかであ
る。MDPは、同じ投与量においてすでに顕著に
発熱的である。ADPが、免疫刺激効果及び免疫
アジユバント効果を保持しながらなんら発熱効果
を有しないことは、この物質の利点を示してお
り、そして真に臨床的に使用できる可能性がある
ことを示している。 この発明の化合物を薬理学的に評価した上記の
結果から、この化合物は、常用の医薬賦形剤と混
合して成る免疫刺激性医薬の形で、生物の免疫反
応を刺激するために、特に抗体生産が低下した生
物の抵抗力を強化するために使用することができ
ると期待される。
アダマンタン残基である。） で表わされるＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
アダマンチルアミドに関する。この新規なジペプ
チド誘導体（ADPと略す）は、有意の免疫アジ
ユバント活性及び免疫刺激活性を有する。 周知の通り、免疫応答の刺激により生物の抵抗
力を強化することができる化合物は常に不足して
いる。しばらくの間、細菌の生産物又は細胞壁の
断片が上記の目的のために使用された。しかしな
がら、、これらは、効果が安定でなく、臨床的使
用において副作用を生ずるという欠点を有してい
た。主としてミコバクテリウム・ツベルクロシス
（Mycobacterium tuberculosis）からの生産物が
しばしば鉱油と組合わせて使用される免疫アジユ
バンド活性を有する化合物の分野においても事情
は同様である。 まず酵素的に、そしてその後合成的に、細菌細
胞壁の幾つかのサブユニツトを得ることにより、
有意な進歩が達成された〔F.エロウツ（Ellouz）
等、Biochem.Biophys.Res.Commun.59，1317，
1974年〕。ほとんどの実験的経験はムラミルジペ
プチド〔Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミン（MDP）〕〔L.チエジド
（Chedid）等，Progr.Allergy25，63（カールゲ
ル．バーセル 1978年）；Ｃマーサー（Merser）
等、Biochem.Biophys.Res.Commun.66，1316，
1975年〕、及びこの幾つかの類似体を用いて行わ
れた。これらの類似体においては生物学的効果が
種々の程度に生じた。種々の構造の類似体の研究
により、アジユバント効果及び免疫刺激効果のた
めには分子中のペプチド部分が必須であり、この
活性は分子中の炭水化物部分にはあまり依存しな
いことが見知された〔L.チエジド等、C.メルサー
（Merser）等、前記；K.マセク（Masek）等、
Experientia35，1397，1979年；S.コタニ等、ビ
ケン報告、18，105，1975年；ハセガワ等，
Agric.Biol.Chem.42，（11），2187，1978年〕。 さらに、MDP及び幾つかの類似体の効果は、
これらを鉱油媒体中で、又はリボゾーーム構造に
結合せしめて投与する場合により高くなることが
記載されている〔J.フロイド（Frevd）及びK.マ
クデルモ（McDermot），Proc.Soc.Expl.Biol.
Mod.49，548，1942年；K.マセク等、
Experientia 34，1363，1978年〕。ここで試験さ
れた合成的に調製された化合物は生物学的に活性
であつたが、常に相当程度発熱性を有し、主とし
てこの理由のために臨床的に実用されなかつた。
アジユバンド効果は発熱性と直接関連するという
意見が提出された（コタニ等、ビケン報告，19，
９，1976年）。 分子の強い親脂性が生物学的効果の発現に重要
な役割を演ずる。このことは、糖部分の５位のヒ
ドロキシル基の酸素原子に高級アルキル基を結合
せしめた構造類似体を調製することにより証明さ
れた（S.コタニ等、上記第２の照考文献）。同様
の効果が、脂肪族親脂性鎖をイソグルタミン分子
上に導入した場合にも観察された（K.マセク等、
上記第１の参考文献）。 （発明の構成及びその具体的な説明） ここに、イソグルタミン部分のγ−カルボキシ
アミド基にアダマンタンの残基を導入することに
より新しい型の免疫刺激物質が調製された。こう
して得たＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダ
マンチルアミド（ADPと略す）は、顕著な免疫
刺激活性を有し、他の物質が共通に有する副作
用、特に発熱性を有さず、そして化学合成により
容易に製造することができる。 式（）で表わされるこの発明の化合物は、ペ
プチドの製造化学において常用されている一般的
な方法により、好ましくは保護されたＬ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミン誘導体を１−アミノアダ
マンタンと反応せしめることにより製造すること
ができる。すなわち、有利には、１−アミノアダ
マンタンを次の式（）、 〔式中、Ｘは酸加水分解により、又は水素化
（水素化分解）により除去し得る保護基、好まし
くはtert−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキ
シカルボニル基又はニトロフエニルチオ基であ
る、〕 で表わされるジペプチド誘導体と反応せしめ、次
に、前記の保護基を脱離することにより製造す
る。 この発明の化合物の製造方法を次の例により詳
細に説明する。但し、これによりこの発明の範囲
を限定するものではない。ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｄ
−イソグルタミン 20.3ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを、
280mlのジオキサン中19.6ｇのBOC−Ala及び12.3
ｇのＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールの溶液
に、−10℃において加える。この混合物を室温に
て60分間撹拌し、過し、そして液を60mlの水
中13.3ｇのＤ−イソグルタミンの溶液に加える。
撹拌を一夜継続する。反応混合物を過し、そし
て液を蒸発乾固する。蒸発残渣を酢酸エチル−
エーテルから結晶化する。生成物の収量は30.9ｇ
（理論量の83％）である。融点98℃。〔α〕20 D＝−
8.2（ｃ＝１、メタノール）。ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イ
ソグルタミンアダマンチルアミド 1.9ｇの１−アミノアダマンタンヒドロクロリ
ドを、2N水酸化ナトリウム溶液で処理し、そし
て遊離した塩基をクロロホルムで抽出する。これ
を蒸発せしめることにより得た1.4ｇ（９ミリモ
ル）の塩基を、30mlのジメチルホルムアミドに溶
解し、そして溶液を−10℃に冷却する。この溶液
を、10mlのジメチルホルムアミド中2.1中（10ミ
リモル）のジシクロヘキシルカルボジイミドの溶
液で処理する。５分間後、20mlのジメチルホルム
アミド中1.6ｇ（５ミリモル）のBOC−Ｌ−Ala
−Ｄ−iGln，1.3ｇのＮ−ヒドロキシベンズトリ
アゾール、0.7mlのトリエチルアミン及び５mlの
ピリジンの溶液を加える。反応混合物を室温にて
一夜撹拌する。ジメチルホルムアミドを蒸発せし
め、100mlの酢酸エチルを加え、そして溶液を
0.1N塩酸及び５％重炭酸ナトリウム溶液で反復
抽出し、乾燥し、そして蒸発せしめる。蒸発残渣
のメタノール溶液を水で沈澱せしめることにより
1.28ｇ（理論量の56％）の目的化合物を得る。元
素分析及びアミノ酸分析の結果は理論量と一致し
た。Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンチル
アミド 塩化メチレン中40％トリフルオロ酢酸溶液で処
理することにより、前記の生成物からｔ−ブチル
オキシカルボニル基を脱離する。開始から60分間
室温に置いた後、溶液を蒸発せしめ、そして残渣
をエーテルと混合する。吸引することにより0.9
ｇの生成物（トリフルオロアセテートの形で）を
得る。この生成物をただちに５mlのエタノール中
に溶解し、OH型の陰イオン交換体に適用し、メ
タノールで溶出する。溶出液を蒸発せしめること
により0.8ｇ（理論量の83％）の泡状生成物を得
る。 アミノ酸組成の分析：Ala1.01，iGln0.97。 さらに、高圧液体クロマトグラフイー
（HPLC）及びPH2.5及び5.7の緩衝液における紙
電気泳動法により生成物の純度を確認した。 Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンチ
ルアミドの分析は次の条件で行つた。不動相（標
準C18逆相溶剤）は親脂基を有する処理されたシ
リカゲル（カラム15×0.3cm）により構成し、移
動相は60〜80容量％の有機変性剤、好ましくはメ
タノール、及び40〜20容量％のトリフルオロ酢酸
２％水溶液により構成した。紫外線検知器による
検知は210nmにて行つた。移動相の流速は20〜30
ml／時とした。製造のためには、上記と同じ不動
相及び移動相を使用し、30×2.5cmの大きさのカ
ラムを使用した。 さらに、生成物の純度を、ｎ−ブタノール／酢
酸／水（４：１：１）及びクロロホルム−メタノ
ール−酢酸−水（40：20：10：５）の溶媒系を用
いるシリカゲル薄層上の薄層クロマトグラフイー
により証明した。 0.5ｇの粗生成物をHPLCにより精製すること
により0.3ｇの純化合物（ピークの面積から算出
して約95重量％）を得た。 Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンチ
ルアミドの薬理学的性質は次の通りである。 試験 １ モルモツトを使用して免疫アジユバント効果を
試験した。不完全フロインド・アジユバント
（FIA）中卵白アルブミン（2.5mg）及びＬ−アラ
ニル−Ｄ−イソグルタミンアダマンンチルアミド
（APP）の混合物0.2mlを左後肢に投与した。 対照群動物は卵白アルブミンを含む不完全フロ
インド・アジユバントのみを投与した。被験化合
物の効果を、今までに知られている最も強力な細
菌性アジユバント〔ミコバクテリウム・ツベルク
ロシス（Mycobacterium tuberculosis）性のも
の〕と比較した。この群の動物には、卵白アルプ
ミン及び完全フロインド・アジユバント（FCA）
を含む混合物を投与した。同様に、新規誘導体の
効果をＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ
−イソグルタミン（MDP）と比較した。被験物
質を投与した後３週間の後に、卵白アルブミン
10μｇ及び20μｇを投与してモルモツトでの皮膚
反応を行つた。皮膚反応領域の大きさ（mm）の測
定結果を第１表に示す。 【表】 数値は16動物を使用した２回の実験の平均値で
ある。表中の記号は次の意味を有する。 FIA：不完全フロインド・アジユバント（Bayol
＋Arlacel（４：１）） FCA：完全フロインド・アジユバント（Bayol＋
ArIacel1mgのミコバクテリウム・ツベルクロ
シス） MDP：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル
−Ｄ−イソグルタミン ADP：Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンアダ
マンチルアミン 第１表の結果から、モルモツトにおいて卵白ア
ルブミンに対する遅延過敏症が強化され、投与量
100μｇにおける効果はMDP及びFCAの両者の効
果に匹敵する。 試験 ２ 生体内におけるDNA生合成の研究に標識チミ
ジンが最も頻繁に使用される。このあらかじめ調
製されたピリミジンデス キシヌクレオシドは、
これに続く燐酸化反応によりdTTp（デスオキシ
チミジントリホスフエート）に燐酸化され、この
ものは細胞核内でのDNA合成における直接的前
駆体となる。標識チミジンのDNAへの取り込み
の増加は、細胞の増加に先行するDNAの生合成
の活性化を示す。 この試験は最も鋭敏でしかも確実な試験の１つ
であつて、この試験により物質の免疫刺激効果及
び細胞増加に対する効果を測定することができ
る。体重150〜160ｇの雄のウイスターラツトに、
同モル量の被験物質（MDPは1.00mg／Kg、ADP
は0.74mg／Kg）を投与した。16時間後に動物を殺
した。動物を殺す２時間前にチミジン（メチル−
3H）を、0.3mlの生理溶液中20μCi／動物（比活
性20Ci／ミリモル）の投与量で腹控内投与した。 凍結した器官を取り出し、そして0.2NHClO4
中で即座にホモジナイズした。沈降物を
0.2NHClO3により反復して洗浄した後、アルカ
リ加水分解によりRNAを除去した。INHClO3中
での加水分解により、蛋白質−DNA沈澱物から
ヌクレチオド成分を遊離せしめた。上澄液を、中
和した後に蒸発乾固した。濃HCClO4により酸加
水分解することによりDNAのヌクレオチドを塩
基に変換した。ペーパークロマトグラフイーを反
復することににより、クロマトグラフ的に純粋な
型でチミン量を分離した。このものの放射能をシ
ンチレーシヨンスペクトロメータで測定した。実
験結果を第２表に示す。 【表】 第２表のデーターから、ADPを0.75mg／Kgの
投与量で１回投与しただけで胸腺DNA及び脾
DNAへのメチル−3Hチミジンの取り込みに大き
な積極効果が生ずることが明らかである。この２
種の器官は、腫瘍の発達及び細胞免疫において、
実質的な程度に役割を演ずる。表の結果は、胸腺
DNAの合成のためのチミジンの利用の有意な増
加を示しており、これはすでに長い間知られてい
るMDPの場合の効果と同じオーダーである。 脾の場合、MDPの投与によつてはチミジン利
用の増加は生じないが、ADPによつては、3Hチ
ミジンの利用の増加により示される大きな刺激効
果が生ずることが明らかである。 摘出された腓細胞における試験管内試験におい
ても脾DNAの合成のためのチミジンの利用に対
するMDPの効果に関する結果は、MDPや脾に対
して効果を有しないとする文献のデータとよく一
致する。２つの化合物、すなわちこの発明の
ADP及び先行技術のMDPの効果の比較におい
て、この発明の新規化合物は、免疫反応に重要な
役割を演ずる両器官に望ましい作用をするため
に、より有利であることが明らかである。 試験 ３ 今までに合成されたMDP類似体のほとんどの
ものが、免疫アジユバント効果及び免疫刺激効果
を有するが、同時に高い発熱性を有し、このこと
が臨床的実用における実質的な欠点である。上記
の事実のために、現在まで、非常に期待された幾
つかの新規物質が臨床的に使用されていない。こ
のため、家兎を用いる実験において、ADPの発
熱効果をMDPのそれと比較して評価した。ADP
を、100μｇ／Kgの投与量において体重1.8〜2.0Kg
の家兎に投与し、そしてその効果を、同じ投与量
でMDPを投与した場合のそれと比較した。さら
に、対照動物に同容量（0.2ml）の等張溶液を注
射し、基礎体温を測定した。直腸サーミスタ温度
計を用いて、６時間にわたり１時間間隔で体温を
測定した。結果を第３表に要約する。 【表】 数値は１群５動物の平均値である。
第３表の結果から、ADPは、臨床的使用にお
いて考慮される投与量（すなわち100μｇ／Kg）
において発熱効果を有しないことが明らかであ
る。MDPは、同じ投与量においてすでに顕著に
発熱的である。ADPが、免疫刺激効果及び免疫
アジユバント効果を保持しながらなんら発熱効果
を有しないことは、この物質の利点を示してお
り、そして真に臨床的に使用できる可能性がある
ことを示している。 この発明の化合物を薬理学的に評価した上記の
結果から、この化合物は、常用の医薬賦形剤と混
合して成る免疫刺激性医薬の形で、生物の免疫反
応を刺激するために、特に抗体生産が低下した生
物の抵抗力を強化するために使用することができ
ると期待される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の式（） （式中、Adはその１位において結合している
アダマンタン残基である、） で表わされるＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
アダマンチルアミド。 ２ １−アミノアダマンタンを、次の式（）、 （式中、Ｘは酸により又は水素化分解により除
去し得る保護基である、） で表わされるジペプチド誘導体と反応せしめ、次
に、前記の保護基を除去することを特徴とする次
の式（）、 （式中、Adはその１位において結合している
アダマンタン残基である、） で表わされるＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
アダマンチルアミドの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS4908-82 | 1982-06-29 | ||
| CS824908A CS231221B1 (en) | 1982-06-29 | 1982-06-29 | L-alanyl-d-isoglutamine adamantylamide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5931745A JPS5931745A (ja) | 1984-02-20 |
| JPH0352478B2 true JPH0352478B2 (ja) | 1991-08-12 |
Family
ID=5392849
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP58112956A Granted JPS5931745A (ja) | 1982-06-29 | 1983-06-24 | Ｌ―アラニル―ｄ―イソグルタミンアダマンチルアミド及びその製造方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
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| JP (1) | JPS5931745A (ja) |
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