JPH0352954B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は動物の細胞を培養する装置に関するも
のである。さらに詳しくは、中空繊維膜からなる
細胞培養器を用いて、効率的に細胞を高密度に培
養する方法およびその装置に関するものである。 ［従来技術］ 近年、動物細胞の産生する生理活性物質、例え
ばインターフエロン、ウロキナーゼ、モノクロー
ナル抗体、リンホカインなど付加価値の高い蛋白
質やペプチド性の生理活性物質を工業的規模で得
るために、動物細胞の大量培養技術が重要な開発
テーマになつている。 これまでに動物細胞を培養する方法について
は、種々の方法が知らている。実験室的規模では
シヤーレあるいは培養瓶などの方法がある。一方
大量に培養する方法としては、従来からの微生物
発酵技術の延長として撹拌培養による試みがなさ
れて来た。例えば、1967年Van Wezelらにより
付着性細胞の培養に細胞付着面積を大きくするた
めに担体としてDEAE−セフアデツクス（商標
名）を用いるいわゆるマイクロキヤリヤー法が開
発され、付着性細胞についても撹拌培養が可能に
なつて来た。一方、浮遊性細胞についてもマウス
骨髄腫瘍細胞と免疫されたマウス脾臓細胞などと
の細胞融合により得られるハイブリドーマからモ
ノクロナール抗体を大量に得ようとする試みが急
速に高まり撹拌培養による方法が検討されてい
る。しかし従来の通気撹拌培養では細胞数におい
て高々２×10⁶cells／ml程度しか達することがで
きず、また、産生生理活性物質濃度の点でも不十
分であり工業的には多くの困難があつた。そこで
最近、特に浮遊性細胞においてこれらの問題を解
決する方法として細胞数をおよそ５×10⁶cells／
ml以上の高密度に高める培養法が注目されて来て
いる。 すなわち、細胞を高密度に培養することにより
装置の小型化が可能となり、また、産生物濃度を
高めることにより精製を容易ならしめるなどの点
で極めて有効な方法である。細胞を高密度に培養
するための条件は必ずしも明らかにされているわ
けではないが、一般に、培養系において絶えず細
胞増殖に適した生理的環境に保つことが必要とさ
れ、そのために細胞の増殖に必要な栄養成分を補
給し、一方で増殖の過程で産生される細胞阻害因
子の除去を連続的に行うことが考えられている。
この方法として例えば撹拌培養において、培養槽
に新しい培養液を補給し、同時に大量の培養液を
培養槽から取出す方法がいくつか提案されている
（例えば特開昭60−9482号公報、Tolbertら；In
vitro 17 885（1981））。しかしながら、これらの
共通した問題点として、培養中の細胞と培養液を
連続的に分離することが、殊に数週間からの連続
培養においては必ずしも技術的に解決されている
わけではない。また動物細胞は微生物と違つて撹
拌等の剪断力に対して抵抗性がなく、このための
工夫がなされているが必ずしも十分ではない。 一方、付着性細胞を効率的に培養する方法とし
て、Knazekらにより円筒形ケースに収められた
中空繊維膜表面に細胞を付着させ、中空繊維の中
空部に培養液を循環させ、壁膜を介して細胞に栄
養成分を供給する培養方法が報告されて以来、中
空繊維を利用した培養法がいくつか提案されてい
る（特公昭54−6634号公報、特公昭57−21978号
公報、特開昭56−42584号公報）。例えば特開昭56
−42584では、中空繊維がシエルに覆われ、該中
空繊維の両端部がシエル外部に開口された細胞培
養器を用い、中空部分に培養液を流しシエルと中
空繊維の間で浮遊性細胞を培養する方法が開示さ
れている。これらの方法は前記の撹拌培養による
高密度培養の問題点を解決できる可能性を秘めて
おり注目に値する。すなわち、中空繊維の壁膜を
介して細胞を培養するので予め細胞と培養液が分
離されていること、また、細胞を付着または浮遊
状態で培養しても、撹拌培養の場合ほどの剪断力
を受けない点である。しかしながらこれらの方法
をもつてしても高密度培養から必ずしも十分に確
立しているとは云い難いのが現状である。 すなわち、中空繊維の場合には、細胞が撹拌培
養のように均一に分散した状態にはならないこと
と、栄養成分の供給および細胞の産生する老廃物
などの阻害成分の除去が壁膜を通して透析あるい
は濾過の原理によつて行なわれるため、細胞の膜
との位置関係例えば培養液の容器の入口と出口あ
るいは膜からの距離によつて細胞の増殖するため
の微小環境が異なり、全細胞に対して均一な微小
環境を維持することが難かしく、従来の方法では
細胞を高密度に維持培養するには不十分であり、
中空繊維型培養器の利点を十分に活用されてはい
ないのが現状である。 ［発明の目的］ かかる状況に鑑み、中空糸型細胞培養器の特性
と撹拌培養の利点を生かし、細胞を効率的に増殖
せしめ、かつ高密度に維持培養し、もつて細胞か
ら有用生理活性物質を大量に産生せしめることを
目的として鋭意研究を行ない本発明を完成するに
致つた。 ［発明の構成］ 本発明は、細胞の増殖に必要な栄養分に対して
は透過性を有するが、細胞に対しては透過性を有
しない壁膜を有する中空繊維分散束の両端部が容
器外部に開口するように隔壁により該容器両端部
に固定され、かつ、該中空繊維両端部で開口した
中空部分に連通する導管と、該中空繊維分散間隙
部に連通する少なくとも２つの導管が付設されて
なる細胞培養器と、該中空繊維の中空部の培養液
を循環させる第１外部循環手段および該中空繊維
分散間隙部の細胞浮遊液または培養液を循環させ
る第２外部循環手段とからなり、該第１外部循環
手段には培養液排出手段と細胞増殖に必要な成分
を含む新鮮な培養液供給手段を備えた第１培養液
貯槽及び第１ポンプ手段が具備されており、該第
２外部循環手段には細胞増殖に必要な成分を供給
する手段を備えた第２培養液貯槽、第２ポンプ手
段及び該第２ポンプ手段の上流側に細胞分離手段
が具備されていることを特徴とする細胞培養装置
に関する。 さらに本発明には、かかる細胞培養装置におい
て該中空繊維分散間隙部の浮遊細胞を系外に取り
出す手段を含むことを特徴とした装置が含まれ
る。 本発明に用いられる細胞培養器は細胞に必要な
栄養分に対しては透過性を有するが、細胞に対し
ては透過性を有しない壁膜を有する中空繊維分散
束の両端部が容器外部に開口するように隔壁によ
り該容器両端部に固定され、かつ、中空繊維両端
部の中空部分に連通する導管と、中空繊維分散間
隙部に連通する少なくとも２つの導管が付設され
たものであれば特に限定されるものではない。 第１図にその具体例を示す。多数本からなる中
空繊維１の分散束の両末端が容器２の両端部の隔
壁３ａ，３ｂに固定されている。さらに中空繊維
の両末端は該隔壁の外面に開口していて端部室４
ａ，４ｂに連通し、かつ端部導管５ａ，５ｂへつ
ながる。該端部導管５ａ，５ｂから培養液が出し
入れできるようになつている。また、中空繊維分
散間隙部６に連通する少なくとも２つの導管７
ａ，７ｂが容器１に付設されており、細胞の接
種、中空繊維分散間隙部６で培養中の細胞浮遊液
あるいは培養液を循環するための出入口などとし
て用いられる。 中空繊維としては、膜自体が細胞毒性がなく、
かつ滅菌操作または培地によつて変質分解を受け
ないものなら何でもよい。例えば高分子材料から
作られるものとしては、セルロースエステル、ア
クリル系ポリマー、ポリサルホン、ポリエーテル
サルホン、フツ素系ポリマー、ポリオフイン系ポ
リマー、ポリカーボネート、セルロース等を挙げ
ることができる。また、無機材料から作られるも
のとしてはガラス、セラミツクス等を挙げること
ができる。 本発明は上記細胞培養器を用い、中空繊維の中
空部分に培養液を流し、中空繊維分散間隙部また
は中空繊維外表面において細胞を培養するもので
あるが、中空繊維分散間隙部の細胞浮遊液または
培養液を循環させる点が大きな特色となつてい
る。さらに、循環させるに際し、循環系路に細胞
分離手段を設け、細胞が循環液に可及的に含まな
いようにすることが好ましい。また、循環系路に
酸素や栄養分を補給する手段あるいは循環液、細
胞浮遊液を系外に取り出す手段を設けることによ
り、細胞を効率的に増殖せしめ、連続的に有用生
理活性物質を産生させることができる。 第２図に本発明の細胞培養装置の具体例を示
す。即ち第１培養液貯槽８には細胞を増殖させる
ための培養液が入つており、この培養液は第１ポ
ンプ手段９により細胞培養器１０の端部導管５ａ
に送られ、中空繊維の中空部分を通つて端部導管
５ｂより出て再び第１培養液貯槽８に戻り、循環
できるようになつている。細胞は中空繊維分散間
隙部６に接種され、中空繊維外表面あるいは中空
繊維分散間隙部６で、中空繊維の壁膜を通して中
空繊維中空部分を流れている培養液より栄養分を
供給され、増殖する。なお、細胞の産生する老廃
物などの阻害成分は、中空繊維の壁膜を通して中
空繊維中空部分を流れる培養液中に除去される。
細胞の増殖する微小環境を均一にするため、中空
繊維分散間隙部６の細胞浮遊液または培養液は第
２ポンプ手段１１，１２により回路１３，１４お
よび中空繊維分散間隙部６を通つて循環できるよ
うになつている。中空繊維分散間隙部６と回路１
３の間には細胞分離手段としての細胞沈降管１５
が設けられており細胞が可及的回路１３に含まれ
ないようになつている。また、細胞沈降管１５の
底部には浮遊細胞取出口１６が付設されている。
回路１３と回路１４の間には、第２培養液貯槽１
７が設けられており、酸素あるいは栄養分を供給
するための導管１８および循環液取出口１９が付
設されている。中空繊維分散間隙部６の細胞の増
殖に必要な栄養分や酸素などの必要成分が、第１
培養液貯槽８の培養液からの供給だけでは不足し
たり、PHの調整を必要とするときに導管１８を通
して酸素などが供給される。また、循環液取出口
１９より必要に応じて循環液を取り出し、細胞の
産生する有用生理活性物質などの代謝産物を回収
することができる。第１培養液貯槽８には、新し
い培養液を供給するための槽２０および第１培養
液貯槽８から古くなつた培養液およびその中に含
まれる有用生理活性物質をポンプ手段を介して取
り出すための槽２１が併設されており、ポンプ手
段を介して槽２０から連続的に培養液を供給する
ことにより連続的に細胞を増殖させることができ
る。 この様に、第１ポンプ手段や第１培養液貯槽等
で第１外部循環手段が構成され、第２ポンプ手段
や第２培養液貯槽等で第２外部循環手段が構成さ
れる。 中空繊維分散間隙部の細胞浮遊液または培養液
を循環させる手段としては、一般に使用されるポ
ンプ類、例えばチユーブポンプ、プランジヤーポ
ンプ、ダイヤフラム型ポンプ、うず巻きポンプな
どが使用できるが、滅菌操作が容易にできるもの
が好ましく、チユーブポンプが好適である。その
他、直接ポンプを用いないで回路に陰圧を間歇的
にかけて落差方式を利用して循環させる方法も好
適である。ポンプを使用する場合は、ポンプ部を
通過する細胞は多少なりとも損傷を受けるので、
ポンプ部を通過する循環液中には細胞が可及的含
まれないようにすることが望ましい。かかる目的
のために循環回路に細胞分離手段を設けることが
好ましい。細胞を分離する方法としては、種々の
フイルターを用いて分離する方法あるいは細胞の
比重が培養液の比重より大きいことを利用して沈
降管を用いる方法などが挙げられるが、細胞を分
離するものであれば特に限定されるものではな
い。付着性細胞を培養するような場合には中空繊
維表面上で細胞は増殖し、三次元構造を構築して
いくので、必ずしも循環回路に細胞分離手段を設
ける必要はない。また、浮遊性細胞を培養する場
合でも、ポンプを使用しないで落差方式で循環さ
せる場合には、ポンプによる細胞損傷がないの
で、必ずしも細胞分離手段を設ける必要はない
が、多少なりとも循環による剪断力を受けるので
一般にはポンプで循環させる場合も落差方式で循
環させる場合にも細胞を可及的に含まないように
して循環させることが好ましい。 さらに、中空繊維分散間隙部の細胞浮遊液また
は培養液の循環回路に循環液を貯める貯槽を設
け、必要に応じて細胞の増殖に必要な酸素や栄養
分を補給できる手段を設けることが好ましい。ま
た、循環液を取り出す手段を設けることが好まし
い。一般に細胞数がおよそ５×10⁶cells／mlの高
密度になつてくると細胞の栄養摂取速度は急速に
高まり、特に酸素の供給が重要な課題になつてく
る。中空繊維中空部分を循環する培養液中の溶存
酸素を維持するため培養液槽の培養液中に酸素を
直接吹き込む方法などがとられるが、泡立ちの問
題などで必ずしも技術的に解決されてはいない。
細胞を高密度に維持するためには、中空繊維分散
間隙部の細胞浮遊液または培養液の循環液中に酸
素を供給することにより、この問題を解決するこ
とができる。このことは酸素のみでなく、殊に、
細胞培養器に用いられる中空繊維が、比較的高分
子量域の栄養成分を通過させないものが選ばれた
場合にも同様であり、通過しにくい成分あるいは
培養液を供給することが好ましい。また、必要に
応じて細胞の産生する代謝産物、特に有用な生理
活性物質を回収するために、循環液を取り出し、
それに見合う量の培養液を加えることも可能であ
る。 長期間にわたつて細胞の増殖を維持し続け、細
胞の産生する有用生理活性物質を大量に得るため
には、中空繊維分散間隙部で増殖する細胞の一部
を適時培養系外に排除し、中空繊維分散間隙部の
細胞数を可及的に一定に維持し、細胞の有用物質
産生活性を維持することが好ましい。特に浮遊細
胞の場合にはこの方法の適用が好ましい。 本発明によつて培養される細胞は動物細胞に限
らず植物細胞も含まれるが、動物細胞が好ましく
用いらる。付着性細胞としては、例えば繊維芽細
胞、腎細胞、上皮細胞などが挙げられる。また、
浮遊性細胞としては例えばリンパ球細胞、骨髄腫
細胞、白血球細胞、骨髄腫細胞と他の細胞との細
胞融合に得られる細胞（ハイブリドーマ）などが
挙げられる。 ［発明の効果］ 本発明の培養装置によれば、細胞を効率的に増
殖せしめ、かつ細胞数を高密度に維持することが
可能である。同時に細胞の産生する有用生理活性
物質を効率的に産生させることが可能であり、細
胞培養器を１個または複数個用いることにより大
量培養へ適用することができる。 以下実施例を用いて本発明を説明するが、本発
明はこれらの実施例で限定されるものではない。 実施例 １ 内径230μ、膜厚50μのポリエーテルスルホン中
空繊維4000本を集束してポリカーボネート製円筒
容器に充填し、ウレタン樹脂で隔壁を鋳型して第
１図のような細胞培養器を組立てた。膜の分画分
子量は５万、中空繊維分散間隙部の容量は70mlで
ある。本細胞培養器を用いて第２図に示す細胞培
養装置を組立て蒸気滅菌した。培養液槽８には３
の培養液（GIBCOのRPMI−1640の培地90％、
牛胎児血清10％からなる）を入れ、中空繊維の中
空部に培養液を循環させた。また、中空繊維分散
間隙部６には、マウス骨髄腫細胞P3U1を親株と
するマウス−マウス融合細胞を２×10⁵ケ／mlと
なるように上記培養液に懸濁させたものを接種し
た。循環液貯槽には60mlの上記培養液を入れ、同
様に細胞沈降管１５および回路１３，１４にも上
記培養液を満たした。装置全体を37℃の恒温槽中
に設置した。第１培養液貯槽８および第２培養液
貯槽１７には導管２２，１８を通して空気95％、
CO₂5％の混合ガスまたは酸素95％、CO₂5％の混
合ガスを槽内に通気し、培養液中の溶存酸素濃度
を5ppmに維持した。中空繊維中空部分の培養液
の循環速度は30ml／min、回路１３，１４の循環
速度は５ml／minとした。経時的に中空繊維分散
間隙部の細胞浮遊液を採取し、増殖した細胞数を
測定した。その結果を表１に示す。但し、６日
目、12日目および16日目に第１培養液貯槽８の培
養液を全量新しい培養液と交換した。

【表】 比較例として、中空繊維分散間隙部の細胞浮遊
液を循環させないで、実施例１と同様にして培養
を行つた結果は表１に示す通り、本発明に比較し
細胞の増殖は遅く細胞数も少なかつた。 実施例 ２ 内径320μ、膜厚70μのセルロースアセテート中
空繊維2000本を集束して実施例１と同様にして細
胞培養器を組立てた。膜の分画分子量は約100万、
中空繊維分散間隙部の容量は70mlである。細胞培
養器はエチレンオキシドガスで滅菌し、その他の
部分は蒸気滅菌し、第２図の細胞培養装置を組立
てた。細胞培養器は生理食塩液、続いて培養液で
循環洗浄した。次に実施例１と同様にして融合細
胞を培養した。但し、中空繊維中空部分の培養液
循環速度は60ml／minとした。経時的に細胞浮遊
液を採取し細胞数を測定し表２に示す結果を得
た。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いる細胞培養器の断面図の
１例である。第２図は本発明の細胞培養装置の１
例である。 １……中空繊維、２……容器、３……隔壁、４
……端部室、５……端部導管、６……中空繊維分
散間隙部、７……側部導管、８……第１培養液貯
槽、１０……細胞培養器、１１，１２……第２ポ
ンプ手段、１３，１４……循環回路、１５……細
胞沈降管、１６……細胞浮遊液取出口、１７……
第２培養液貯槽、１８，２２……導管、１９……
循環液取出口。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 細胞の増殖に必要な栄養分に対しては透過性
   を有するが、細胞に対しては透過性を有しない壁
   膜を有する中空繊維分散束の両端部が容器外部に
   開口するように隔壁により該容器両端部に固定さ
   れ、かつ、該中空繊維両端部で開口した中空部分
   に連通する導管と、該中空繊維分散間隙部に連通
   する少なくとも２つの導管が付設されてなる細胞
   培養器と、該中空繊維の中空部の培養液を循環さ
   せる第１外部循環手段および該中空繊維分散間隙
   部の細胞浮遊液または培養液を循環させる第２外
   部循環手段とからなり、該第１外部循環手段には
   培養液排出手段と細胞増殖に必要な成分を含む新
   鮮な培養液供給手段を備えた第１培養液貯槽及び
   第１ポンプ手段が具備されており、該第２外部循
   環手段には細胞増殖に必要な成分を供給する手段
   を備えた第２培養液貯槽、第２ポンプ手段及び該
   第２ポンプ手段の上流側に細胞分離手段が具備さ
   れていることを特徴とする細胞培養装置。 ２ 該中空繊維分散間隙部の浮遊細胞を系外に取
   り出す手段を含む特許請求の範囲第１項記載の装
   置。