JPS5921388A - 細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養方法Info
- Publication number
- JPS5921388A JPS5921388A JP57131196A JP13119682A JPS5921388A JP S5921388 A JPS5921388 A JP S5921388A JP 57131196 A JP57131196 A JP 57131196A JP 13119682 A JP13119682 A JP 13119682A JP S5921388 A JPS5921388 A JP S5921388A
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- JP
- Japan
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- cell
- cells
- column
- fibrous substance
- culture solution
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- Pending
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は細胞培養方法に関し、特に生体外で生育する際
に固相を要求する細胞の培養方法に関する。
に固相を要求する細胞の培養方法に関する。
ウイルスワクチン、免疫血清学的診断用の抗原または抗
体などを産生するために細胞を培養することは今や重要
な産業となっている。初代培養細胞、正常２倍体細胞、
樹立細胞系は人工的に増殖させることが可能であるが、
初代培養細胞、正常２倍体細胞は固相、すなわち担体に
粘着しなければ成育しない。容器を担体として用いた培
養では器壁にのみ単層で生育し、増殖の目的を十分に達
成することができない。これを改善するため、微粒子状
の担体が用いられるようになり、例えば直径２００μｍ
の球形粒子を用いれば、培養用の標準ローラーボトルと
同一容積で、１００倍以上の有効面積を容易に獲得する
ことができ、細胞収量を著しく増大することができる。
体などを産生するために細胞を培養することは今や重要
な産業となっている。初代培養細胞、正常２倍体細胞、
樹立細胞系は人工的に増殖させることが可能であるが、
初代培養細胞、正常２倍体細胞は固相、すなわち担体に
粘着しなければ成育しない。容器を担体として用いた培
養では器壁にのみ単層で生育し、増殖の目的を十分に達
成することができない。これを改善するため、微粒子状
の担体が用いられるようになり、例えば直径２００μｍ
の球形粒子を用いれば、培養用の標準ローラーボトルと
同一容積で、１００倍以上の有効面積を容易に獲得する
ことができ、細胞収量を著しく増大することができる。
しかし、このような球形粒子からなる世体を用いて細胞
を培養するには、粒子を培養液中に浮遊させる必要があ
り、このため培養液や空気の送入中に一般にゆるやかに
かきまぜて浮遊状態を保つが、粒子同士または粒子と攪
拌翼との衝突による細胞破壊を免がれることができない
。
を培養するには、粒子を培養液中に浮遊させる必要があ
り、このため培養液や空気の送入中に一般にゆるやかに
かきまぜて浮遊状態を保つが、粒子同士または粒子と攪
拌翼との衝突による細胞破壊を免がれることができない
。
本発明の目的は、広い有効面積をもち、細胞の破壊など
による損失が少なく、かつ増殖した細胞の回収が容易な
細胞培養方法を提供することにある。
による損失が少なく、かつ増殖した細胞の回収が容易な
細胞培養方法を提供することにある。
本発明は、繊維状物質に細胞を粘着させた後、培養液と
接触させることを特徴とする。
接触させることを特徴とする。
本発明においては、カラム内に繊維状物質を充填し、該
カラム内で繊維状物質に細胞を粘着させた後、培養液を
流通させることが好ましい。
カラム内で繊維状物質に細胞を粘着させた後、培養液を
流通させることが好ましい。
本発明において、担体として用いる繊維状物質は、細胞
が付着ないし粘着するものであれば特に限定されず、例
えばセルロース、絹、コラーゲン、レーヨン、ポリアミ
ド、ポリエステル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビ
ニル、またはポリプロピレン等からなる有機繊維や、ガ
ラス繊維、炭素繊維、金属繊維などが用いられる。これ
らのうち、特に好ましいものはコラーゲンまたはポリ塩
化ビニルからなる有機繊維もしくはガラス繊維である。
が付着ないし粘着するものであれば特に限定されず、例
えばセルロース、絹、コラーゲン、レーヨン、ポリアミ
ド、ポリエステル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビ
ニル、またはポリプロピレン等からなる有機繊維や、ガ
ラス繊維、炭素繊維、金属繊維などが用いられる。これ
らのうち、特に好ましいものはコラーゲンまたはポリ塩
化ビニルからなる有機繊維もしくはガラス繊維である。
繊維の太さは１〜３００μｍ程度、好ましくは１０〜２
００μｍが適当であり、その形態としては、モノフイラ
メント、マルチフイラメント、ステープル、捲縮加工糸
、バルキー糸等があげられ、また単繊維の断面は円形の
みならず異形断面としてもよい。これらの繊維の表面は
、細胞の粘着、生育を増すために必要に応じ表面処理し
てもよく、例えばシランカップリング剤、チタンカップ
リング剤による処理、スルホン化処理、プラズマ処理、
部分加水分解、グラフト重合などを施すことができ、こ
のようにして繊維表面の荷電は、親疎水性などを調節す
ることができる。また繊維はカラム（または培養タンク
）に充填したときに揺動接触しないように、長繊維状、
織布、または不織布の形状で用いるのが好ましい。この
場合、繊維が圧密化しないように、繊維集合体に適当に
ネットを挿入して多段式にすることができる。カラム中
の繊維の充填密度は１〜５０容量％、特に５〜３０容量
％が適当であるが、繊維の間隔は、交差点近傍を除き５
０μｍ以上、好ましくは６０μｍ以上離した方がよい。
００μｍが適当であり、その形態としては、モノフイラ
メント、マルチフイラメント、ステープル、捲縮加工糸
、バルキー糸等があげられ、また単繊維の断面は円形の
みならず異形断面としてもよい。これらの繊維の表面は
、細胞の粘着、生育を増すために必要に応じ表面処理し
てもよく、例えばシランカップリング剤、チタンカップ
リング剤による処理、スルホン化処理、プラズマ処理、
部分加水分解、グラフト重合などを施すことができ、こ
のようにして繊維表面の荷電は、親疎水性などを調節す
ることができる。また繊維はカラム（または培養タンク
）に充填したときに揺動接触しないように、長繊維状、
織布、または不織布の形状で用いるのが好ましい。この
場合、繊維が圧密化しないように、繊維集合体に適当に
ネットを挿入して多段式にすることができる。カラム中
の繊維の充填密度は１〜５０容量％、特に５〜３０容量
％が適当であるが、繊維の間隔は、交差点近傍を除き５
０μｍ以上、好ましくは６０μｍ以上離した方がよい。
繊維の充填量を増加して繊維間の間隔が５０μｍ未満に
なると細胞の生育が低下してくる。
なると細胞の生育が低下してくる。
本発明において、培養される細胞としては、例えば腎細
胞、胎児肺、繊維茅細胞、包皮細胞、リンパ球などがあ
げられ、その初濃度は１×１０４〜１０×１０４ケ／ｍ
ｌが適当である。この場合の培養液としては、例えば仔
牛血清または牛胎児血清を２〜２０重量％加えた培地（
例えばイーグルＭＥＭ培地、日水製薬（株）の商品名、
以下、ＭＥＭと略称する）、ラクトアルブミンヒドロラ
イゼートを含むＭＥＭなどが好ましく用いられ、これら
は１〜４日で更新されるようガラムに連続的に送入する
ことが好ましい。高さ１００ｍｍのカラムの場合、好ま
しい線速度は約０．１〜０．４ｍｍである。
胞、胎児肺、繊維茅細胞、包皮細胞、リンパ球などがあ
げられ、その初濃度は１×１０４〜１０×１０４ケ／ｍ
ｌが適当である。この場合の培養液としては、例えば仔
牛血清または牛胎児血清を２〜２０重量％加えた培地（
例えばイーグルＭＥＭ培地、日水製薬（株）の商品名、
以下、ＭＥＭと略称する）、ラクトアルブミンヒドロラ
イゼートを含むＭＥＭなどが好ましく用いられ、これら
は１〜４日で更新されるようガラムに連続的に送入する
ことが好ましい。高さ１００ｍｍのカラムの場合、好ま
しい線速度は約０．１〜０．４ｍｍである。
上記細胞をカラム内の繊維状物質に粘着させるには、繊
維を充填したカラム内に、所定の細胞を浮遊させた培養
液を供給して適当な時間（例えば１〜５時間）放置すれ
ばよい。その後、酸素または酸素と炭酸ガスを供給しな
がら前記のように緩慢な線速度で培養液を流通させ、細
胞の培養が行なわれる。培養時間は細胞の種類、培養液
の条件等によって異なるが、通常は数時間〜数１０時間
以上を要する、培養が終了した時点で培養液をＭＥＭに
置換し、繊維状物質（担体）から細胞を剥離させる作用
を有する液（例えば０．２５重量％トリプシン溶液）を
加え、生育した細胞を担体から剥離し、その後、液をカ
ラム外に排出し、濾過、遠心分離等の固液分離手段によ
り目的の細胞を採取すればよい。
維を充填したカラム内に、所定の細胞を浮遊させた培養
液を供給して適当な時間（例えば１〜５時間）放置すれ
ばよい。その後、酸素または酸素と炭酸ガスを供給しな
がら前記のように緩慢な線速度で培養液を流通させ、細
胞の培養が行なわれる。培養時間は細胞の種類、培養液
の条件等によって異なるが、通常は数時間〜数１０時間
以上を要する、培養が終了した時点で培養液をＭＥＭに
置換し、繊維状物質（担体）から細胞を剥離させる作用
を有する液（例えば０．２５重量％トリプシン溶液）を
加え、生育した細胞を担体から剥離し、その後、液をカ
ラム外に排出し、濾過、遠心分離等の固液分離手段によ
り目的の細胞を採取すればよい。
本発明方法によれば、充填繊維によって大きな表面積が
得られ、これにより有用な細胞産生成分を大量かつ容易
に取得することができる。
得られ、これにより有用な細胞産生成分を大量かつ容易
に取得することができる。
以下、本発明を実施例および図面によりさらに詳細に説
明する。
明する。
実施例
第１図は、本発明を実施するための細胞培養装置の系統
図である。容器ｌ内には繊維保持用のネット２上に繊維
３が充填され、その上底部にはフィルター４を介して排
液パイプ６が、またその下底部には培養液送入パイプ８
が連結され、各パイプにはそれぞれバルブ５および７が
配設されている。前記送入パイプ８は培養タンク９に連
結され、該タンク９には酸素または空気の送入管１０お
よび炭酸ガス送入管１１が付設され、さらに培養液の供
給パイプ１２および送液ポンプ１３が設けられている。
図である。容器ｌ内には繊維保持用のネット２上に繊維
３が充填され、その上底部にはフィルター４を介して排
液パイプ６が、またその下底部には培養液送入パイプ８
が連結され、各パイプにはそれぞれバルブ５および７が
配設されている。前記送入パイプ８は培養タンク９に連
結され、該タンク９には酸素または空気の送入管１０お
よび炭酸ガス送入管１１が付設され、さらに培養液の供
給パイプ１２および送液ポンプ１３が設けられている。
上記のような装置を用い、ジエチルアミノ基を有するシ
ランカップリング剤で処理した直径２０μｍのガラス長
繊維５０ｇを直径５ｃｍ、高さ６ｃｍの円筒カラムに充
填した。培養液タンク９内で牛胎児血清を５重量％加え
たＭＥＭ８０ｍｌにＶ７９細胞チャイニーズハムスター
の肺の繊維芽細胞約２×１０６ケを浮遊させ、これをパ
イプ８を通してカラムに入れた後、バルブ７および５を
閉じ、４時間放置すると、繊維表面に細胞が粘着した。
ランカップリング剤で処理した直径２０μｍのガラス長
繊維５０ｇを直径５ｃｍ、高さ６ｃｍの円筒カラムに充
填した。培養液タンク９内で牛胎児血清を５重量％加え
たＭＥＭ８０ｍｌにＶ７９細胞チャイニーズハムスター
の肺の繊維芽細胞約２×１０６ケを浮遊させ、これをパ
イプ８を通してカラムに入れた後、バルブ７および５を
閉じ、４時間放置すると、繊維表面に細胞が粘着した。
次に培養液タンク９内でウシ胎児血清を５％加えたＭＥ
Ｍに管１０、１１から空気と炭酸ガスを吹込んで混和し
、バルブ７および５を開き、カラム１内に培養液を１ｍ
ｌ／ｈｒの速度で送液した。９６時間後、タンク９内の
培養液をＭＥＭに置換し、０．２５重量％トリプシン溶
液を加えてカラム１に送給し、繊維表面上に成育した細
胞を剥離させ、カラム下部の細胞抜出しパイプ１４のバ
ルブ１５を開いて、細胞液を採取した。この液中に細胞
は約４×１０６ケ／ｍｌ存在し、約２００倍の増殖を示
したことが分った。一方、Ｖ７９細胞を３５ｍｍのプラ
スチックシャーレで培養した場合、９６時間後では１０
倍に増殖したとどまった。また直径２００ｍｍの球状担
体を同一充填率でカラム１内に充填し、前記と同様な条
件で細胞を培養したところ、その増殖率は１００倍にす
ぎなかった。
Ｍに管１０、１１から空気と炭酸ガスを吹込んで混和し
、バルブ７および５を開き、カラム１内に培養液を１ｍ
ｌ／ｈｒの速度で送液した。９６時間後、タンク９内の
培養液をＭＥＭに置換し、０．２５重量％トリプシン溶
液を加えてカラム１に送給し、繊維表面上に成育した細
胞を剥離させ、カラム下部の細胞抜出しパイプ１４のバ
ルブ１５を開いて、細胞液を採取した。この液中に細胞
は約４×１０６ケ／ｍｌ存在し、約２００倍の増殖を示
したことが分った。一方、Ｖ７９細胞を３５ｍｍのプラ
スチックシャーレで培養した場合、９６時間後では１０
倍に増殖したとどまった。また直径２００ｍｍの球状担
体を同一充填率でカラム１内に充填し、前記と同様な条
件で細胞を培養したところ、その増殖率は１００倍にす
ぎなかった。
第１図は、本発明方法の一実施例を示す装置系統図であ
る。符号の説明は下記のとおりである。 １・・・・・・・カラム、３・・・・・・繊維状物質、
９・・・・・・培養液タンク、１０・・・・空気供給管
、１１・・・炭酸ガス供給管、１６・・・・・攪拌器。 代理人弁理士 川北武長
る。符号の説明は下記のとおりである。 １・・・・・・・カラム、３・・・・・・繊維状物質、
９・・・・・・培養液タンク、１０・・・・空気供給管
、１１・・・炭酸ガス供給管、１６・・・・・攪拌器。 代理人弁理士 川北武長
Claims (1)
- （１）繊維状物質に細胞を粘着させた後、培養液と接触
させることを特徴とする細胞培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57131196A JPS5921388A (ja) | 1982-07-29 | 1982-07-29 | 細胞培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57131196A JPS5921388A (ja) | 1982-07-29 | 1982-07-29 | 細胞培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5921388A true JPS5921388A (ja) | 1984-02-03 |
Family
ID=15052269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57131196A Pending JPS5921388A (ja) | 1982-07-29 | 1982-07-29 | 細胞培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5921388A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61271987A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Green Cross Corp:The | ウロキナ−ゼ前駆体の製造方法 |
| JPS62274A (ja) * | 1985-06-24 | 1987-01-06 | Koken:Kk | 細胞の大量培養方法 |
| JPS6265681A (ja) * | 1985-09-18 | 1987-03-24 | Green Cross Corp:The | 付着性細胞の連続大量培養法 |
| US5264359A (en) * | 1988-04-18 | 1993-11-23 | Nitta Gelatin Inc. | Methods for large-scale cultivation of animal cells and for making supporting substrata for the cultivation |
| US5492826A (en) * | 1993-12-10 | 1996-02-20 | William Beaumont Hospital | Apparatus and method for seeding endothelial cells |
-
1982
- 1982-07-29 JP JP57131196A patent/JPS5921388A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61271987A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Green Cross Corp:The | ウロキナ−ゼ前駆体の製造方法 |
| JPS62274A (ja) * | 1985-06-24 | 1987-01-06 | Koken:Kk | 細胞の大量培養方法 |
| JPS6265681A (ja) * | 1985-09-18 | 1987-03-24 | Green Cross Corp:The | 付着性細胞の連続大量培養法 |
| US5264359A (en) * | 1988-04-18 | 1993-11-23 | Nitta Gelatin Inc. | Methods for large-scale cultivation of animal cells and for making supporting substrata for the cultivation |
| US5492826A (en) * | 1993-12-10 | 1996-02-20 | William Beaumont Hospital | Apparatus and method for seeding endothelial cells |
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