JPH0352955B2

JPH0352955B2 -

Info

Publication number: JPH0352955B2
Application number: JP62185565A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Saito; Hitoshi Shimoii; Shunichi Sato; Makoto Tadenuma; Kyoshi Yoshizawa; Kazuhito Morya; Chikashi Izumi
Original assignee: HOTSUKAIDO TOGYO KK; KOKUZEICHO CHOKAN
Current assignee: HOTSUKAIDO TOGYO KK; KOKUZEICHO CHOKAN
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1987-07-27
Publication date: 1991-08-13
Also published as: JPS63240775A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用方法）この発明は、例えば甜菜糖蜜を原料とするアル
コールの生産においてアルコール発酵力の高い酵
母菌株に関するものである。（従来の技術）甘蔗糖蜜はアルコール発酵の原料或はパン酵母
培養等多方面に利用されている。これに対して甜菜から砂糖を分離した後に排出
される甜菜糖蜜は、現在のところ飼料用添加物と
して利用されているに過ず、その用途は限られて
いる。甜菜糖蜜の用途拡大の一つとしてアルコール発
酵によるスピリツツの生産が考えられるが、本発
明者等は先に、サツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）に属する凝集性の180株（国税庁醸
造試験所番号）及びキラー性の909−１株（国税
庁醸造試験所番号）の２株の酵母菌株が甜菜糖蜜
並びに甘蔗糖蜜に対して優れたアルコール発酵力
を示すことを見出した。（発明が解決しようとする問題点）しかし、酵母菌株を使用して工業的にアルコー
ル発酵によりアルコール生産を行なわせる場合、
野生酵母に対するキラー性、及び凝集性等が要求
されるが、上記酵母菌株はキラー性、凝集性何れ
か一方の性質しか有していない。（問題点を解決するための手段）この発明は、上記実情に鑑み、甜菜糖蜜を原料
としてアルコール発酵を行なわせた場合にもアル
コール分及び発酵歩合が高く、しかもキラー性、
凝集性何れの性質をも兼備えた酵母菌株を見出す
べく鋭意実験と研究を重ねた結果、サツカロマイ
セス（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）Ｈ−１株で表示される酵母菌株及
びその変異株であつてサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）Ｍ−９株で表示される酵母菌株が
上述の目的に適う酵母菌株であることを見出した
ものである。この発明に係るサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）Ｈ−１株及びＭ−９株は、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8885号
及び微工研菌寄第9401号として寄託されている。上記Ｈ−１株はサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）の909−１株とサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）の180株を親株とするもので、親株
である909−１株（２倍体）はヘテロタリツクな
キラー酵母であり、サツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）の180株（２倍体）はホモタリツク
な凝集性酵母であり、Ｈ−１株の製造は次の要領
で行なう。キラー性酵母であるサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）の909−１株（ヘテロタリツク、２
倍体）を胞子形成させ、細胞壁溶解酵素
（Zymolyase100T）で胞子を露出分散させた後、
完全培地（YPDプレート）上でコロニーを生育
させる。生育したコロニーについて甜菜糖蜜によ
るアルコール発酵力が発酵後半の生存率等でスク
リーニングし、優れた半数体（接合型ａ）を分離
した。これをＡ−４株とする。一方、凝集性酵母であるサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）の180株（完全ホモタリツク、２倍
体）を胞子形成させ、形成した子のう胞子４分子
の各々に上記Ａ−４株を胞子対細胞（spore to
cell）で直接接合させる。約1/2の確立で接合す
るが、この接合子の形成を確認しつつ、この接合
子を完全培地上で培養し、コロニーの数株を得
る。これらの接合株について甜菜糖蜜によるアル
コール発酵力と発酵後半の生存率でスクリーニン
グを行ない、その中で発酵力及び発酵後半の生存
率の高い株を選択した。これがこの発明に係るＨ
−１株である。このＨ−１株の「“The Yeast”ａ
taxonomic study 3rd ed（N.J.W.Kreger−van
Rij編）」によるタキソノミツクテスト
（TAXONOMIC TESTS）の結果は下記に示す
通りである。胞子形成（Spore Formation）：陽性糖類の発酵：グルコース、ガラクトース、スクロ
ース、マルトース、ラフイノースいずれも陽性炭素源の資化性：グルコース、ガラクトース、ス
クロース、マルトース、トレハロース、ラフイ
ノース、α−メチル−Ｄ−グルコサイドいずれ
も陽性、メレチトース、DL−乳酸いずれも弱
陽性硝酸塩の資化性：なしビタミン要求性：なし 37℃における生育：あり 10％食塩培地における生育：ありこれによりＨ−１株はサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）であると、同定された。更に、本願発明者等は上記Ｈ−１株より優れた
発酵力の強い酵母を得る目的で研究を行なつた。即ち、本願発明者等の研究によれば、甜菜糖蜜
のアルコール発酵後の蒸留廃液（以下、ウエスト
と略す）中で酵母を培養すると死滅していくとい
う現象が認められた。これは、ウエスト中に何等かの増殖阻害物質が
存在すると考えられるが、その阻害物質に耐性の
あるＨ−１株の変異株を取得することによつて、
よりアルコール発酵力の強い酵母が取得できると
の結論に達した。そこで、Ｈ−１株の変異株であるＭ−９株の製
法は次の要領で行なう。即ち、Ｈ−１株を甜菜糖蜜のアルコール発酵後
のウエスト中で培養を繰返し、培養後の菌体をウ
エスト寒天培地に接種し、培養してコロニーを生
育させる。生育したコロニーについて甜菜糖蜜に
よるアルコール発酵力や発酵後半の生存率等でス
クリーニングし、優れた株を分離した。これをＷ
−９株とする。更に、Ｗ−９株を２−デオキシグルコース
（2DOG）入り甜菜糖糖蜜中で培養を繰返し、培
養後の菌株を2DOG入り甜菜糖蜜寒天培地に接種
し、培養してコロニーを生育させる。これによつ
てカタボライトリプレツシヨンが解除されたコロ
ニーが得られる。このコロニーについて再び甜菜
糖蜜によるアルコール発酵力が発酵後半の生存率
等でスクリーニングし、優れた発酵力を持つ株を
分離した。これがこの発明に係るＭ−９株であ
る。このＭ−９株について前記Ｈ−１株と同様なタ
キソノミツクテストを行なつたところ前記同様な
結果が得られた。この結果Ｍ−９株はサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）であつて、Ｈ−１株の変異株であ
ると同定された。（発明の効果）更に、本願発明者等の研究によればＨ−１株及
びＭ−９株には甜菜糖蜜等に優れたアルコール発
酵力を示すと共に、凝集性、キラー性、連続利用
性、発酵力の再現性等についても優れた性質を有
している。特に、Ｍ−９株は凝集性及び連続利用
性、発酵力の再現性について親株であるＨ−１株
より優れた性質を有している。なお、上記菌株を利用してアルコール生産を行
なう場合の原料としては、甜菜糖蜜の他に、甘蔗
糖蜜、甘藷、馬鈴薯、とうもろこし、キヤツサ
バ、米、農産廃棄物、およびこれらの加水分解物
等を使用することができる。また、この発明に係
る菌株はキラー性があるので、滅菌工程を簡略化
し、例えば無蒸煮物を原料とすることもできる。
アルコール発酵のための上記菌株の使用量は、原
料の種類により異なるが、甜菜糖蜜を原料とした
回分発酵の場合、10⁵〜10⁸cells／mlの植菌量でよ
く、また連続利用の場合も10⁵〜10⁹cells／mlの槽
内菌体濃度でよい。更に、アルコール発酵条件は、一般にPH４〜
６、温度は25〜37℃（好ましくは30℃付近）であ
る。アルコール発酵方法は、撹拌槽による回分発酵
法でも連続利用法でもよい。回分法で行なう場合
は主にスピリツツ等の生産に適し、連続法の場合
は主に燃料アルコールの生産に適する。なお、この発明に係るＨ−１株及びＭ−９株は
凝集沈降性がよいので、連続利用法を使用した場
合、高濃度仕込の発酵を行なうことができ、また
沈降槽も特別な分離手段を設けることなく、コン
パクトなものにすることができるなどの利点があ
る。（実施例）以下、この発明の実施例を示す。実施例１（Ｈ−１株の育種法）キラー性酵母であるサツカロマイセス
（Saccharomyces）属セレエヴイジエ
（cerevisiae）909−１株（ヘテロタリツク２倍
体）を胞子形成培地（酢酸カリウム１％、イース
トエキス0.2％、グルコース0.2％、寒天２％）で
胞子形成させる。形成した子のう胞子４分子につ
いて細胞壁溶解酵素（Zymolyase100T）で胞子
を露出分散させた後、マイクロマニプレータで解
剖し、完全培地（イーストエキス１％、ペプトン
２％、グルコース２％、寒天２％）に接種、培養
し、生育したコロニーについて下記の条件で発酵
テストを行なつた。［発酵テストの条件］前培養：甜菜糖蜜を全糖分10％、PH5.0、
KH₂PO₄を700ppmとなるように培養培地を調整
し、オートクレーブ後、保存スラントより一白金
耳接種し、30℃、２日間振とう培養を行なう。発酵試験：甜菜糖蜜を全糖分24％、PH5.0にな
るように培養培地を調整し、オートクレーブを行
ない、その250mlに前培養酵母懸濁液を4.0×
10⁷cells／mlとなるように接種した。発酵力の最も優れ、しかも発酵後半でも生存率
の高いＡ−４株を取得した。一方、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属セレエヴイジエ（cerevisiae）の180株（完全
ホモタリツク、２倍体）を胞子形成培地上で培養
し、形成した子のう胞子４分子の各々と上記Ａ−
４株とを胞子対細胞（spore to cell）で直接接
合させる。これを30℃程度の温度で完全培地上で
培養し、顕微鏡下で接合子の形成を経時的に確認
して接合子を形成したものを性的交雑（mating）
した株として選択し、再び上記の発酵テストを行
ない、その中で発酵力及び発酵後半の生存率の高
い株を選択した。このようにしてＨ−１株を得
た。上記製法によるＨ−１株製造と同程度の発酵力
を有する菌株の出現率は70％以上である。実施例２（甜菜糖蜜を原料とする30℃でのＨ−１株によ
るエタノール発酵テスト）前培養：実施例１と同じ発酵試験：甜菜糖蜜を全糖分24％、PH5.0、
KH₂PO₄700ppmに培養培地調整した。この培養
培地を用い、1000ml容発酵瓶（実仕込量500ml）
内でＨ−１株を、培養温度30℃、PH5.0、緩速撹
拌（100〜200rpm）、嫌気条件下で培養し、エタ
ノール発酵を行なつた。比較のためＨ−１株の親株である909−１株、
Ａ−４株、180株を同一条件下でエタノール発酵
を行なわせた。この結果を第１図及び第２図に示
す。第１，２図の結果から親株909−１株について
は、エタノール生産速度は比較的速いが、３日後
で12V／Ｖ％と頭打ちになり、菌体生存率も急速
に下降する。これに対して909−１株より分離したＡ−４株
は３日以降もエタノール生産速度は下降しない
が、エタノールの生産は12.5V／Ｖ％程度に留ま
つている。一方、180株は立ちあがりがやや遅れているが、
５日後でも徐々にではあるが、エタノールを生産
しており、生存率も極めて高いが、エタノールの
生産は12V／Ｖ％に留まつている。これに対してＨ−１株は初期エタノール生産速
度が909−１株、Ａ−４株、180株を上廻り、しか
もエタノールの生産は５日後で13V／Ｖ％に達す
る。したがつて最終エタノール濃度も909−１株、
180株より短時間内に1V／Ｖ％上廻る結果とな
る。実施例３（甘蔗糖蜜を原料とする30℃でのＨ−１株によ
るエタノール発酵テスト）前培養：２％YM培地（市販品Difco社製、
YM broth）をオートクレーブ後、保存スラント
より一白金耳接種し、30℃、２日間振とう培養を
行なう。発酵試験：甘蔗糖蜜を全糖分24％、PH5.0にな
るように培養培地を調整し、助成剤として
（NH₄）₂SO₄0.1％、KH₂PO₄0.1％を加え、オート
クレーブ後、その250mlに前培養酵母懸濁液を4.0
×10⁷cells／mlとなるようにＨ−１株を接種して
エタノール発酵を行なつた。比較のため909−１株、180株と従来甘蔗糖蜜ア
ルコール発酵の実用株として使用されてきた台研
（Taiken）396株を同一条件下で行なわせた。こ
の結果を第３図に示す。第３図より明らかなように、甘蔗糖蜜を同一糖
濃度の甜菜糖蜜とを比べると、上記何れの酵母菌
株を使用したエタノール発酵テストにおいても発
酵の立ちあがりは極めて速く、３日後に13V／Ｖ
％以上になつた。このうち、Ｈ−１株、909−１株、180株は従来
の実用株であるTaiken396株に比べて立ちあがり
が速く、特にこの発明に係るＨ−１株は立ちあが
りが速いことが明らかとなつた。実施例４（Ｈ−１株の凝集沈降テスト）Ｈ−１株並びに対照として909−１株を、温度
30℃、嫌気条件、撹拌下で培養したとき、撹拌時
の培養液及び撹拌終了後１分間静置後の培養液に
ついて濁度（O.D：波長660nｍ、10mmセルによる
吸光度）と培養液中に占る菌体の容量百分率
（Ｖ／Ｖ％）を以下に示す。濁度（0.D）撹拌時（0.D）静置１分後（0.D）Ｈ−１株8.56 0.12 909−１株8.44 7.20 培養液に占る菌体の容量百分率（％）撹拌時（％）静置１分後（％）Ｈ−１株100 ５（95％は上澄み） 909−１株100 98（２％は上澄み）以上の結果より明らかなように、909−１株を
使用した場合撹拌終了後１分間静置しても懸濁状
態にあつたが、Ｈ−１株においては撹拌を停止す
ると、直ちに凝集沈降し、１分以内に完全に沈降
分離した。この場合、菌体は沈降圧密されて培養
液全容積の1/10以下となり、上澄みは菌体を含ま
ず透明となり、強い凝集力を示す。このＨ−１株の性質により、培養後の菌体分離
工程において、遠心分離機やセパレータ等の機器
を使用することなく、単に静置するだけで、数分
のうちに培養液から菌体分離が可能となり、直ち
に上澄み液は蒸留工程等へ送り、沈降菌体はリサ
イクルして再利用することが可能となる。実施例５（Ｈ−１株の連続利用性）前培養：甜菜糖蜜を全糖分10％、PH5.0、
KH₂PO₄が700ppm含まれるように培養培地を調
整後、スラントから１白菌耳接種、30℃、２日間
振とう培養する。発酵試験：全糖分28％、PH5.0に調整した甜菜
糖蜜250mlへ初発菌数が５×10⁷cells／mlとなるよ
うに前培養液20mlを接種し、30℃で撹拌し、４日
間発酵させ、発酵後、上澄みを捨て再び上記甜菜
糖蜜を添加し、発酵を行なわせ、この操作を４回
繰り返して行なつた。発酵は、全て発酵栓を付けて嫌気条件の下で行
ない、撹拌はマグネテツクスターラー約200rpm
で行なつた。

【表】実施例６（Ｈ−１株のキラー性）培養培地として全糖分24％、PH5.0の甜菜糖蜜
を用い、協会701号（Ｋ−701）を酵母数５×
10⁸cells／mlと、Ｈ−１株を酵母数５×10⁷cells／
mlとなる様に接種し、30℃で撹拌して混合培養し
て培養後１日後のＫ−701株の生菌数をβ−アラ
ニンプレートでカウントした。また、対照として同一条件でＫ−701株のみを
接種、培養してその生菌数をカウントした。

【表】以上の結果より明らかなように、接種時にはＨ
−１株の10倍存在していたＫ−701株は１日後で
約１／1000となり死滅して行くことがわかる。一
方Ｈ−１株の菌数は変わず、この結果Ｈ−１株に
他の酵母に対するキラー性があることが明らかと
なつた。実施例７（Ｍ−９株の育種法）実施例１で得られたキラー性凝集性酵母である
サツカロマイセス（Saccharomyces）属セレエ
ヴイジエ（cerevisiae）Ｈ−１株をウエスト培地
（TOC 50000PPM、全糖分2.5％、PH5.0）で培養
し、30℃での培養後の生存菌体を再び上記ウエス
ト培地に接種し培養を行ない、このプロセスを10
回繰返して行なつた。培養後の菌体をウエスト寒
天培地（寒天２％）に接種、30℃で培養し、生育
したコロニーについて下記の条件で発酵テストを
行なつた。［発酵テストの条件］前培養：甜菜糖蜜を全糖分10％、PH5.0、
KH₂PO₄を700ppmとなるように培養培地を調整
し、オートクレーブ後、保存スラントより一白金
耳接種し、30℃、２日間振とう培養を行なう。発酵試験：甜菜糖蜜を全糖分24％、PH5.0にな
るように培養培地を調整し、オートクレーブを行
ない、その250mlに前培養酵母懸濁液を4.0×
10⁷cells／mlとなるように接種した。発酵力の最も優れ、しかも発酵後半でも生存率
の高いＷ−９株を取得した。更に、甜菜糖蜜培地（全糖分10％PH
5.0KH₂PO₄700ppm）へ２−デオキシグルコース
を150ppmとなるように加え、Ｗ−９株を接種し、
培養を行なつた。培養後、上記組成の２−デオキ
シグリコース入り甜菜糖蜜寒天培地（寒天２％）
上に生育するコロニーを釣り、同一操作を繰返し
て３回行なう。培養後の菌体を上記寒天培地に接
種、培養し、生育したコロニーについて前述の条
件で発酵テストを行なつた。その結果発酵力の最
も優れ、しかも発酵後半でも生存率の高いＭ−９
株を取得した。実施例８（甜菜糖蜜を原料とする30℃でのＭ−９株によ
るエタノール発酵テスト）前培養：実施例７と同じ発酵試験：甜菜糖蜜を全糖分24％、PH5.0、
KH₂PO₄700ppmに培養培地調整した。この培養
培地を用い、1000ml容発酵瓶（実仕込量500ml）
内でＭ−９株を、１×10⁸ceus／mlとなるように
接種し、培養温度30℃、緩速撹拌（100〜
200rpm）、嫌気条件下で培養し、エタノール発酵
を行なつた。比較のためＭ−９株の親株であるＨ−１株を同
一条件下でエタノール発酵を行なわせた。この結
果を第４図に示す。この結果から親株については、エタノール生産
速度は、比較的速いが、５日後の12.8V／Ｖ％で
頭打ちとなつた。これに対して、Ｍ−９株は、初期エタノール生
産速度がＨ−１株を上まわり、しかもエタノール
の生産は、５日後で13.5V／Ｖ％に達する。した
がつて、最終エタノール濃度もＨ−１株より短時
間のうちに1V／Ｖ％上まわる結果となつた。また、発酵５日後の生菌数を下表に示す。

【表】この結果より明らかなように、Ｍ−９株は発酵
後半でもＨ−１株より７倍多い菌体が存在し、接
種時の菌数を維持していた。実施例９（Ｍ−９株の連続利用性）Ｍ−９株を用い、回分発酵を繰返し実験を行な
つた。前培養：実施例７と同じ発酵試験：全糖分15％、PH5.0に調整した甜菜
糖蜜250mlへ初期菌数が１×10⁸cells／mlとなるよ
うに前培養酵母懸濁液を接種し、30℃で撹拌し、
２日間発酵させ、発酵後10分静置し、上澄みを捨
て、再び上記糖濃度の甜菜糖蜜を添加し、回分発
酵を行なわせ、この操作を５回繰返して行なつ
た。発酵は、全て発酵栓を付けて嫌気条件の下で行
ない、撹拌はマグネチツクスターラーで約
100rpm回転して行なつた。この結果を第５図及
び下表に示す。

【表】第５図に明らかなように、連続利用により生産
されるアルコールは、糖濃度15％の場合安定して
おり、また上記表より酵母の生菌数は、接種時の
菌数を維持することが明らかとなつた。また、発
酵終了後短時間で、且つ静止するだけで容易に本
酵母は沈殿し、密度の高いスラリーを形成するた
め、短時間で、清澄な発酵液を得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２におけるエタノール生産の
経日変化を示す図、第２図は、同じく実施例２に
おける生菌数の経日変化を示す図、第３図は、実
施例３におけるエタノール生産の経日変化を示す
図、第４図は実施例８におけるエタノール生産の
経日変化を示す図、第５図は実施例９におけるア
ルコール発酵毎のエタノール生産の推移を示す図
である。

Claims

【特許請求の範囲】１サツカロマイセス（Saccharomyces）属セ
レエヴイジエ（cerevisiae）Ｈ−１株（微工研菌
寄第8885号）で表示されるアルコール発酵力の高
い酵母菌株。２サツカロマイセス（Saccharomyces）属セ
レエヴイジエ（cerevisiae）Ｍ−９株（微工研菌
寄第9401号）で表示されるアルコール発酵力の高
い酵母菌株。