JPH0354447A - バイオセンサおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明｛表　種々の微量の生体試料中の特定戒分につい
て、試料液を希釈することなく迅速かつ簡便に定量する
ことのできるバイオセンサ、及びその製造法に関すん 従来の技術 従棗　血液などの生体試料中の特定或分について、試料
液の希釈や撹拌などを行なうことなく簡易に定量しうる
方式として、以下のようなバイオセンサを提案した（特
願昭６３−３８１５６）。

このバイオセンサ（よ　絶縁性の基板上にスクリーン印
刷等の方法で電極系を形成し　上記電極系上に親水性高
分子層と酸化還元酵素および電子受容体からなる酵素反
応層を形成したものであも試料液を酵素反応層上へ滴下
すると、試料液に酸化還元酵素と電子受容体が溶解し　
試料液中の基質との間で酵素反応が進行し　電子受容体
が還元される。酵素反応終了柩　この還元された電子受
容体を電気化学的に酸化し　このとき得られる酸化電流
値から試料液中の基質濃度を求めるものである。

発明が解決しようとする課題 この様な従来の構戒でば　バイオセンサが作戒された時
点ですでに酸化還元酵素と電子受容体が接触しているた
△　高湿度雰囲気中や光照射条件下におかれると酵素活
性の失活がみられ　安定した応答が得られなかっ１，　
　また　試料液中に　電極に吸着しやすい物質や電極活
性な物質が存在するとセンサの応答に影響がみうけられ
ｔも課題を解決するための手段 本発明は上記課題を解決するた数　絶縁性の基板上に　
少くとも測定極と対極からなる電極系を設（ナ、前記電
極系上に　親水性高分子と酸化還元酵素からる第１の層
と親水性高分子からなる第２の層および電子受容体を含
む第３の層からなる反応層を設けたものであも さらに　絶縁性の基板上に　少くとも測定極と対極から
なる電極系を設けた眞　前記電極系上に親水性高分子と
酸化還元酵素からなる第１の層を形５！２，Ｌ　　次に
親水性高分子の有機溶媒溶液を前記第１の層上に展開し
て親水性高分子からなる第２の層を形成し　さらに電子
受容体の有機溶媒分散液を第２の層上に展開して電子受
容体を含む第３の層を形成することによりバイオセンサ
を製造するものであも 作用 本発明によれば　極めて容易に精度よく基質濃度を測定
することができ、かス　保存性に優れたディスポーザブ
ルタイプのバイオセンサを構戒することができも 実施例 以下、本発明を実施例により説明すも （実施例１） バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて
説明すも 第１図は本発明のバイオセンサの一実施例として作製し
たグルコースセンサの断面図であり、第２図はセンサ作
製に用いた電極部分を斜視図で示したものであも ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板１に
　スクリーン印刷により銀ペーストを印刷しリード２，
３を形成すも　次に　樹脂バインダーを含む導電性カー
ボンペーストを印刷し　加熱乾燥することにより、測定
極４、対極５からなる電極系を形威すも　さらに　電極
系を部分的に覆Ｌ＼　電極の露出部分の面積を一定とし
　かつリードの不要部を覆うように絶縁性ペーストを印
刷し　加熱処理をして絶縁層６を形威すも次に　４、　
５の露出部分を研磨眞　空気中で１００℃にて４時間熱
処理を施し１，　　このようにして電極部分を構威した
徽　親水性高分子として、カルボキシメチルセルロース
（以下ＣＭＣと略す）の０，　　５ｗｔ％水溶液を電極
上へ展阻　乾燥させてＣＭＣ層を形威すも　次に　この
ＣＭＣ層を覆うように　酵素としてグルコースオキシダ
ーゼ（以下ＣＯＤと略す）をリン酸緩衝液（ｐＨ＝５．
　　６）あるいは水に溶解したものを展開し　乾燥させ
、Ｃ　．Ｍ　Ｃ−Ｇ　Ｏ　Ｄ層７を形成しｔも　この場
合、Ｃ　ＭＣとＣＯＤは部分的に混合された状態で厚さ
数ミクロンの薄膜状となっている。さらに　このＣＭＣ
−ＧＯＤ層上を完全に覆うようにして、ポリビニルピロ
リドン（以下ＰＶＰと略す）の１％エタノール溶液を展
開し　乾燥させ、ＰＶＰ層８を形戊し九　このＰＶＰ層
の上へ　界面活性剤であるレシチンの１％トルエン溶液
中に電子受容体であるフエリシアン化カリウムの微結晶
を混ぜたものを滴下、展開し　乾燥させることによって
フェリシアン化カリウムーレシチン層９を形成した　こ
こでレシチンはフエリシアン化カリウムをトルエン熔媒
中に均一に分散させる役割を果たす。このフェリシアン
化カリウムーレシチン層を形戒する際の溶媒としてＰＶ
Ｐが難溶性を示すトルエンを用いることによって、フエ
リシアン化カリウムーレシチン溶液をＰＶＰ層上に一様
に広げることが可能となり、その結抵　均一なフェリシ
アン化カリウムーレシチン層を得ることができｔ，この
ように電子受容体を含む第３の層を展開する際の溶媒と
して、第２の層を構戒する親水性高分子が難溶性を示す
溶媒を用いると、極めて均一性の高い第３の層を形戒す
ることが可能となもしかし　この場合、第３の層は第２
の層上全面に形戊されるたム　電極系上の電子受容体量
を酵素反応に必要とされる最小限量に厳密に制御するの
は困難であも 上記のようにして構威したグルコースセンサに試料液と
してグルコース標準液を１０μ１滴下し１分後に対極を
基準にして測定極にアノード方向へ＋０．６Ｖのパルス
電圧を印加Ｌ，，５秒後の電流を測定した　試料液を滴
下すると、まずフェリシアン化カリウムーレシチン層が
グルコース標準液に溶解す４　　ＰＶＰ層（よ　試料溶
液が達すると瞬時に溶解し　これがＣＭＣ−ＧＯＤ層に
達してグルコースが酸化されると同時にフェリシアン化
カリウムがフエロシアン化カリウムに還元されもそこで
、上記のパルス電圧の印加により、生或したフエ口シア
ン化カリウムの濃度に基づく酸化電流が得られ　この電
流値は基質であるグルコースの濃度に対応した　上記の
方法で作威したグルコースセンサと、該グルコースセン
サのうち親水性高分子からなる第２の層を設けなかった
ものの２種類について乾燥状態で３５ｔ，３０日間の保
存試験を行なっｔ：ｏ　　試料液としてグルコース標準
液（　９　０　ｍｇ／ｄｉ）を用いて３０日後のセンサ
応答をみたとこ＆　第２の層を設けなかったものは応答
にばらつきがみられ　そのＣｖ値は５．３となったパＰ
ＶＰからなる第２の層を設けたもののＣｖ値は２．５と
極めて良好な値が得られ１， また　グルコースの標準液を滴下して応答電流を測定し
たとコ＆　　９　０　０ｍｇ／ｄｉ　（０．０　５モル
／１）以上という高濃度まで良好な直線関係が得られた
　さらに　上記のグルコースセンサに血液サンプルを１
０μ１滴下して１分後の応答電流を測定したところ非常
に再現性のよい応答が得られた（実施例２） ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性基板上に　
実施例１と同様にしてスクリーン印刷により第２図に示
した電極部分と同じものを形成した　さらに実施例１と
同様にしてＣＭＣ−ＧＯＤ凰　およびＰＶＰ層を形成し
ｔラ　　このＰＶＰ層の上へ　界面活性剤であるレシチ
ンの０，５％エタノール溶液中に電子受容体であるフエ
リシアン化カリウムの微結晶を混ぜたものを滴下、展開
し　乾燥させることによってフエリシアン化カリウムー
レシチン層を形戊した　このフエリシアン化カリウムー
レシチン層を形成する際の溶媒としてＰＶＰが容易に溶
解するエタノールを用いることによって、フエリシアン
化力リウムーレシチン層をＰＶＰ層上の一点に集中的に
展開することができたこれ（上　後から添加したフエリ
シアン化カリウムとレシチンの分散媒であるエタノール
がすみやかにＰＶＰ層に吸収されたために　フエリシア
ン化カリウムとレシチンがＰＶＰ上で広がることなく滴
下点に集中的に層を形戒したからであも　このように　
センサの測定電極上に集中して均一なフエリシアン化カ
リウムーレシチン層を構成することが可能となり、必要
最小限量を展開するだけで安定な応答が得られるセンサ
を作或することができた このように電子受容体を含む第３の層を展開する際の溶
媒として、第２層を構成する親水性高分子が易溶性を示
す溶媒を用いると、電極系上等の目標とされる点に集中
して均一な第３の層を形戒することが可能となり、展開
量も必要最小限で済ませることができも　しかしこの場
合、第２の層が第３の層の展開溶媒を吸収することが必
要とされるので、その吸収可能な溶媒量を越えた場合に
は　均一な第３の層が得られなくなも 上記のようにして構戒したグルコースセンサに試料液と
してグルコース標準液を１０μ１滴下し滴下１分後に電
極間に＋０．６Ｖのパルス電圧を印加Ｌ　５秒後の電流
を測定した　実施例ｌと同様にグルコースの濃度に対応
した応答電流値が得られ　これについてＬ　　９　０　
０ｍｇ／ｄｉ　（ｏ，ｏ　５モル／ｌ）以上という高濃
度まで良好な直線関係が得られた　血液を試料液として
用いた場合にも非常に再現性のよい応答が得られｔラ さらに　実施例ｌと同様にして親水性高分子からなる第
２の層を設けたものと設けなかったものの２種類につい
て乾燥状態で３５′ｔＡ　３０日間の保存試験を行なり
ｔラ　　全血を試料液として、　３０日後の応答をみた
とこ，”），ＰＶＰからなる第２の層を設けたものにつ
いては極めて良好なＣｖ値が得られた （実施例３） 実施例ｌまたは２の方法によって製作したセンサに　カ
バーをつけた　このカバーの分解斜視図を第３図に示す
。カバー１３及びスペーサーｌＯは高分子材料からなり
、カバー、スペーサー、電極系の印刷された基板は図中
破線で示すような位置関係をもって接着した　このよう
にして構威されたカバー付きセンサでζよ　スペーサー
の端開口部ｌ２またはカバーの円形穴部１４から試料液
を導入することが可能であも 上記のように構成したグルコースセンサの先端の導入口
を試料液（ヒト全血）に接触させると、試料液は開口部
より内部へすみやかに導入されカバーとスペーサーで囲
まれた空間部ｌ１は気泡が生或することなく試料液で満
たされた　さらにカバーやスペーサなど、空間部を構戒
する部材の表面を界面活性剤で予め処理して親水性とす
ることにより、より円滑な試料液の導入が可能となつ起
　親水性処理の方法として｛上　例えば以下のような方
法によっても０．５〜１秒で吸液が完了するなどの十分
な効果が得られた　すなわ板　ポリエチレンテレフタレ
ートからなる絶縁性基板上に実施例ｌまたは２のように
して第１から第３の層までを形戊し　この第３の層上か
ら端開口部ｌ２に相当する絶縁性基板上まで、　レシチ
ンの０．　　５ｗｔ％トルエン溶液を滴下、展肌　乾燥
することによって端開口部から反応層表面までを親水性
処理することができた この効果｛よ　親水性材料からなるカバー、あるいはさ
らに親水性材料からなるスペーサーを用いて作或した場
合にも得られ１， このようにカバーを設けると、カバー内の試料液の蒸発
を最小限に抑えることができた　それによって、周囲の
湿度等による影響を受けることなく、簡詠　迅速かつ高
精度にグルコース濃度を測定することが可能となり丸　
さらに　カバー内の容積を小さくすることによって、試
料液量及びセンサを構成する物質担持量を微量にするこ
とができｔ４ （実施例４） ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性基板上べ　
実施例ｌと同様にしてスクリーン印刷により第２図に示
した電極部分と同じものを形戊した　さらに実施例１と
同様にしてＣＭＣ−ＣＯＤ恩　およびＰＶＰ層を形戒し
？Ｑ＋　　このＰＶＰ層の上へ　界面活性剤であるレシ
チンの０、５％エタノール溶液中に電子受容体であるフ
エリシアン化カリウムの微結晶とＰＶＰを混ぜたものを
滴下、展開し　乾燥させることによってフェリシアン化
カリウムーレシチン−ＰＶＰ層を形戊した　エタノール
溶媒中において、フエリシアン化カリウムはレシチンに
よって分散されている力交　そのままでは均一な溶液を
得ＨＬｓ　　そこ玄　この溶液にＰＶＰのような親水性
高分子を添加することによって溶液の均一性をより高吹
　一定濃度のフェリシアン化カリウム溶液を簡易な操作
で展開することができた　さらに　この親水性高分子添
加によって乾燥状態でより強固で剥離し難い薄膜の形成
ができ、安定したセンサの作或が可能となった上記のよ
うにして構成したグルコースセンサに実施例３と同様に
してカバーをつ｛ナ、試料液としてグルコース標準液を
ｌＯμ１滴下獣　滴下１分後に電極間に＋０．６Ｖのパ
ルス電圧を印加Ｌ５秒後の電流を測定しｔも　　実施例
ｌと同様にグルコースの濃度に対応した応答電流値が得
られ　これニツいてＬ　　９　０　０ｍｇ／ｄｉ　（０
．０　５モル／１）以上という高濃度まで良好な直線関
係が得られた血液を試料液として用いた場合にも非常に
再現性のよい応答が得られ九 従来の構戊で（よ　センサが作或された時点ですでにＣ
ＯＤ−ＣＭＣ層とフェリシアン化カリウムーレシチン層
とが接触していたたべ　保存性能を高めることが難しか
った　しかし　前記実施例１、２または３で用いたＰＶ
Ｐからなる親水性高分子層（上　乾燥状態においてＣＯ
Ｄ−ＣＭＣ層とフェリンアン化カリウムーレシチン層と
を完全に分離する役目を果たしており、このことがセン
サ保存性の向上に大きな効果をもたらせていもさらに　
この親水性高分子層は試料液中に電極に吸着しやすい物
質や電極活性な物質が存在する場合においてｋ　安定な
センサ応答を確保するのに極めて有効であも　血液を試
料液として前記グルコースセンサでグルコース濃度を測
定した場合にＬ　試料液の粘度等に拘らず安定したセン
サ応答が得られ九 上記実施例ｌ、　２、　３または４では第１の層ではＣ
ＭＣを、第２の層および第３の層にＰＶＰをそれぞれ親
水性高分子として用いたバ　これらに限定されることな
く、　ビニルアルコール久　セルロース久　ビニルビロ
リドン爪　ゼラチン久　アクリル酸塩久　デンブン久　
無水マレイン酸爪アクリルアミド爪　メタクリレート樹
脂などをそれぞれ用いても同様の効果が得られた　これ
らの吸水性あるいは水溶性の親水性高分子を適当な濃度
の溶液にしたものを塗布　乾燥することにより、必要な
膜厚の親水性高分子層を電極上に形戊することができる
。

上記実施例では電子受容体を分散させるのにレシチンを
用いた力曳　この他にポリエチレングリコールアルキル
フエニルエーテ／ｔ＜　　オレイン凱　ボリオキシエチ
レングリセリン脂肪酸エステ／ｋ　　シクロデキストリ
ンなど、酵素活性に影響を与えないものであれば特に制
限されることばな賎また・上記実施例では　測定極と対
極のみの二極電極系について述べたバ　参照極を加えた
三電極方式にすれば　より正確な測定が可能であも電極
構成材料としては上記実施例に示したカーボンに限定さ
れることはなく、白全　金などの貴金属や金属酸化物な
ども使用でき４　　−Ｘ　　電子受容体として（よ　上
記実施例に示したフエリシアン化カリウム以外Ｅ　　ｐ
−ペンゾキノン、フエナジンメトサルフエート、フエロ
センなども使用できる。

さらに　酵素として上記実施例のグルコースオキシダー
ゼ以外に　アルコールオキシダーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ等を用いれば　アルコ−ルセンサ、コレステ
ロールセンサなどにも用いることができも 発明の効果 以上のように　本発明のバイオセンサ（友　乾燥状態に
おいて酸化還元酵素層と電子受容体層を完全に分離する
ことで、センサの保存性をより高めるという効果が得ら
れも　さらに　生体戒分に適用した場合などにみられる
電極応答に影響を与えるタンパク等の物質の影響を受け
ることなく、安定でより正確な測定が可能となん

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例であるバイオセンサの断面阻
　第２図は電極部分の斜視は　第３図はカバー付きバイ
オセンサの分解斜視図であも１・・・絶縁性の基楓２，
３・・・リード、　４・・・測定凰　５・・・対振　６
・・・絶縁凰　７・・・ＣＭＣ−ＧＯＤ凰　８・　ＰＶ
ＰＪｉ　　９−・・フエリシアン化カリウムーレシチン
Ｈ　　ｔｏ・・・スペーサ−　１１・・・空間敵ｌ２・
・・端間口訊　１３・・・カバー　１４・・・カバー円
形穴龜 綿縛柱の基板 ３−Ｊ−ド ”ＪＩｌ　定極． ｎ　オ１ 絶　縁屑 こｔ−１ｃ−６（Ｈ）層 ＦＶＰ畳 ７−リシアン化カリツムーレシテ／層 ３ ２ ３ ｊ ｇ ＋１ ４　　７ 第３図 ／４

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）絶縁性の基板上に設けた少くとも測定極と対極か
   らなる電極系と、前記電極系上に設けた反応層を具備し
   、前記反応層が親水性高分子と酸化還元酵素からなる第
   １の層と親水性高分子からなる第２の層および電子受容
   体を含む第３の層からなることを特徴とするバイオセン
   サ。
2. （２）電子受容体を含む第３の層が少なくとも電子受容
   体と親水性高分子からなることを特徴とする請求項１記
   載のバイオセンサ。
3. （３）電極系の上に、酵素反応層を内側に含むようにカ
   バーを設置した請求項１または２に記載のバイオセンサ
   。
4. （４）親水性高分子がセルロース系、ビニルピロリドン
   系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、ビニルアルコール系
   、デンプン系、無水マレイン酸系、アクリルアミド系、
   メタクリレート樹脂から選ばれたものである請求項１、
   ２または３に記載のバイオセンサ。
5. （５）絶縁性の基板上に、少くとも測定極と対極からな
   る電極系を設けた後、前記電極系上に親水性高分子と酸
   化還元酵素からなる第１の層を形成し、次に親水性高分
   子の有機溶媒溶液を前記第１の層上に展開して親水性高
   分子からなる第２の層を形成し、さらに電子受容体の有
   機溶媒分散液を第２の層上に展開して電子受容体を含む
   第３の層を形成することを特徴とするバイオセンサの製
   造法。
6. （６）電子受容体を含む第３の層を展開する際の溶媒と
   して、第２層を構成する親水性高分子が難溶性もしくは
   易溶性を示す溶媒を用いることを特徴とする請求項５記
   載のバイオセンサの製造法。
7. （７）親水性高分子を溶解した有機溶媒中に電子受容体
   を分散し、これを第２の層上に展開して電子受容体と親
   水性高分子を含む第３の層を形成することを特徴とする
   請求項５記載のバイオセンサの製造法。