JPH0354678B2 - - Google Patents
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- JPH0354678B2 JPH0354678B2 JP57210699A JP21069982A JPH0354678B2 JP H0354678 B2 JPH0354678 B2 JP H0354678B2 JP 57210699 A JP57210699 A JP 57210699A JP 21069982 A JP21069982 A JP 21069982A JP H0354678 B2 JPH0354678 B2 JP H0354678B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
- C07K14/625—Extraction from natural sources
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
天然の豚インシユリンにおけるB30位のアラニ
ンを化学的または酵素的にスレオニンと交換する
ことにより半合成的方法で前記豚インシユリンを
ヒトインシユリンに変換することは知られている
〔「Hoppe−Seyler′sZ.physiol.Chemie」第357巻
第759〜767頁（1976年）、「Science」第177巻第
623〜626頁（1972年）、「Nature」第280巻第412
〜413頁（1979年）、「J.Am.Chem.Soc.」第101巻
第751〜752頁（1979年）、「Hoppe−Seyler′sZ.
physiol.Chem.」第359巻第799〜802頁（1978年）
および「Biochem.Biophys.Acta」第133巻第219
〜223頁（1967年）参照〕。
ンを化学的または酵素的にスレオニンと交換する
ことにより半合成的方法で前記豚インシユリンを
ヒトインシユリンに変換することは知られている
〔「Hoppe−Seyler′sZ.physiol.Chemie」第357巻
第759〜767頁（1976年）、「Science」第177巻第
623〜626頁（1972年）、「Nature」第280巻第412
〜413頁（1979年）、「J.Am.Chem.Soc.」第101巻
第751〜752頁（1979年）、「Hoppe−Seyler′sZ.
physiol.Chem.」第359巻第799〜802頁（1978年）
および「Biochem.Biophys.Acta」第133巻第219
〜223頁（1967年）参照〕。
この変換の目的は人間の糖尿病治療において、
免疫学的理由から、同種インシユリンが使用され
うることである。
免疫学的理由から、同種インシユリンが使用され
うることである。
この治療の利点は、半合成工程で得られた粗製
物質中のインシユリン誘導体および不純物をヒト
インシユリンから確実に分離しうる場合にのみ達
成されうる。
物質中のインシユリン誘導体および不純物をヒト
インシユリンから確実に分離しうる場合にのみ達
成されうる。
既知の分離法は豚インシユリン成分からのヒト
インシユリンの分離を確実に保証するには適当で
ない。文献に記載されているアミノ酸分析から、
半合成的ヒトインシユリンにおいては25％のレベ
ルまでの豚インシユリンによる汚染が起り得るこ
とが見出されている。
インシユリンの分離を確実に保証するには適当で
ない。文献に記載されているアミノ酸分析から、
半合成的ヒトインシユリンにおいては25％のレベ
ルまでの豚インシユリンによる汚染が起り得るこ
とが見出されている。
再生可能な充填物質をクロマトグラフイーカラ
ムに反復使用することによりヒトインシユリンの
豚インシユリンまたは酵素による痕跡量の汚染す
らをも回避するためには最適の分離効率を有する
安価な使い捨て物質がカラム充填剤として望まし
い。分析用高速液体クロマトグラフイーにおいて
は高分解能クロマトグラフイー分離は疎水性の有
機基を用いて誘導された疎水性のシリカゲル「逆
性（veversed phase）」でのみ達成される。しか
しながらこの物質は高価なので使い捨てカラム充
填剤としてのその使用が制限されている。
ムに反復使用することによりヒトインシユリンの
豚インシユリンまたは酵素による痕跡量の汚染す
らをも回避するためには最適の分離効率を有する
安価な使い捨て物質がカラム充填剤として望まし
い。分析用高速液体クロマトグラフイーにおいて
は高分解能クロマトグラフイー分離は疎水性の有
機基を用いて誘導された疎水性のシリカゲル「逆
性（veversed phase）」でのみ達成される。しか
しながらこの物質は高価なので使い捨てカラム充
填剤としてのその使用が制限されている。
今やインシユリンの酵素的半合成工程から得ら
れた粗製混合物を、例えばクロロホルム／メタノ
ール／水／トリエチルアミン／蟻酸のようなある
種の有機溶媒混合物を使用して、商業上入手しう
るシリカゲルを充填したカラムでクロマトグラフ
イー分離するのがすべての他の分離法より優れて
いると見出された。この優越性は一方では分離さ
れるべき混合物の構成分の保持時間の相違（ある
ものはそれが大きいという点）そして他方ではカ
ラム中の移行の迅速さから生ずる。１回の操作後
に捨てられるシリカゲルの価格は処理されたイン
シユリンと比較して無視されうる。
れた粗製混合物を、例えばクロロホルム／メタノ
ール／水／トリエチルアミン／蟻酸のようなある
種の有機溶媒混合物を使用して、商業上入手しう
るシリカゲルを充填したカラムでクロマトグラフ
イー分離するのがすべての他の分離法より優れて
いると見出された。この優越性は一方では分離さ
れるべき混合物の構成分の保持時間の相違（ある
ものはそれが大きいという点）そして他方ではカ
ラム中の移行の迅速さから生ずる。１回の操作後
に捨てられるシリカゲルの価格は処理されたイン
シユリンと比較して無視されうる。
従つて本発明はインシユリン、インシユリン誘
導体および場合により不純物からなる混合物を分
離するに当り、その混合物をシリカゲルで充填さ
れたカラムでクロマトグラフ処理することを特徴
とする方法に関する。
導体および場合により不純物からなる混合物を分
離するに当り、その混合物をシリカゲルで充填さ
れたカラムでクロマトグラフ処理することを特徴
とする方法に関する。
この方法はインシユリンの精製、およびトリプ
シンまたは同様の酵素およびインシユリンエステ
ルまたはその他インシユリン誘導体からのインシ
ユリンまたはその分解産物の分離に特に適する。
シンまたは同様の酵素およびインシユリンエステ
ルまたはその他インシユリン誘導体からのインシ
ユリンまたはその分解産物の分離に特に適する。
カラム充填剤としては商業上入手しうるあらゆ
るシリカゲル、例えばメルク社（ドイツ国ダルム
スタツト社）の商業的製品たるSiO260があげら
れる。
るシリカゲル、例えばメルク社（ドイツ国ダルム
スタツト社）の商業的製品たるSiO260があげら
れる。
クロマトグラフイー用溶離剤としては、一方で
インシユリンエステルまたはインシユリン誘導体
がそしてもう一方ではインシユリンまたはその分
解産物が商業上入手しうる薄層クロマトグラフイ
ー用プレート上に異なるPH値を示すようなすべて
の溶離剤混合物が使用されうる。
インシユリンエステルまたはインシユリン誘導体
がそしてもう一方ではインシユリンまたはその分
解産物が商業上入手しうる薄層クロマトグラフイ
ー用プレート上に異なるPH値を示すようなすべて
の溶離剤混合物が使用されうる。
粗生成物をクロロホルム1500〜2100容量部、メ
タノール1000〜1500容量部、水350〜450容量部、
トリエチルアミン35〜55容量部および蟻酸15以下
の容量部からなる溶離剤混合物中でクロマトグラ
フ処理する場合に特に良好な分離効果が達成され
る。
タノール1000〜1500容量部、水350〜450容量部、
トリエチルアミン35〜55容量部および蟻酸15以下
の容量部からなる溶離剤混合物中でクロマトグラ
フ処理する場合に特に良好な分離効果が達成され
る。
この方法は豚インシユリンをヒトインシユリン
に酵素的に変換させる場合に生ずるような混合物
において豚インシユリンおよびトリプシンからヒ
トインシユリン−B30−ジ第３ブチルスレオニン
を分離する場合に特に好都合である。
に酵素的に変換させる場合に生ずるような混合物
において豚インシユリンおよびトリプシンからヒ
トインシユリン−B30−ジ第３ブチルスレオニン
を分離する場合に特に好都合である。
例 １
ヒトインシユリン−B30−ジ第３ブチルスレオ
ニン70％および豚インシユリン30％からなる混合
物４ｇをクロロホルム／メタノール／水／トリエ
チルアミン／蟻酸〔1800：1500：375：45：９
（ｖ／ｖ）〕からなる溶媒20ml中に溶解させそして
使い捨て注射器を用いてロバール（Lobar ）
（乾時サイズＣ、シリカゲル粒子サイズ63〜125μ
ｍ）充填ずみカラムに適用する。このカラムを同
じ溶媒を用いて展開させる。溶媒先端が出現した
後、個々のフラクシヨン（10ml）を集める。
ニン70％および豚インシユリン30％からなる混合
物４ｇをクロロホルム／メタノール／水／トリエ
チルアミン／蟻酸〔1800：1500：375：45：９
（ｖ／ｖ）〕からなる溶媒20ml中に溶解させそして
使い捨て注射器を用いてロバール（Lobar ）
（乾時サイズＣ、シリカゲル粒子サイズ63〜125μ
ｍ）充填ずみカラムに適用する。このカラムを同
じ溶媒を用いて展開させる。溶媒先端が出現した
後、個々のフラクシヨン（10ml）を集める。
ヒトインシユリン−B30−（But）2はフラクシヨ
ン37〜53に現われる。これらを合し、回転蒸発器
で30〜50mlとなるまで濃縮する。この溶液中に約
500mlのアセトンを添加しそして沈殿した生成物
を遠心分離により単離する。
ン37〜53に現われる。これらを合し、回転蒸発器
で30〜50mlとなるまで濃縮する。この溶液中に約
500mlのアセトンを添加しそして沈殿した生成物
を遠心分離により単離する。
豚インシユリンはフラクシヨン120〜137中に溶
離されそして前記のようにして単離される。いず
れの生成物も軽度の真空下に乾燥する。
離されそして前記のようにして単離される。いず
れの生成物も軽度の真空下に乾燥する。
収 量：ヒトインシユリン−B30−（But）2 2.59
ｇ インシユリン（豚） 1.03ｇ 例 ２ NαB1−第３ブチルオキシカルボニル−B30−
ジ第３ブチルスレオニン−インシユリン（４ｇ）
を例１におけると同様にして溶解させ、そしてク
ロロホルムで平衡化させたシリカゲルSiO2−60
（メルク社製、粒子サイズ63〜200μｍ）300ｇを
充填したカラム（2.5×50cm）に適用する。この
カラムを例１におけると同じ溶媒混合物を用いて
溶離する。最初に現われるピークがB1−BOC−
インシユリン−B30−（But）2を含有しており、豚
インシユリンは遅い方のフラクシヨン中に溶離さ
れる。後処理は例１におけると同様にして行われ
る。
ｇ インシユリン（豚） 1.03ｇ 例 ２ NαB1−第３ブチルオキシカルボニル−B30−
ジ第３ブチルスレオニン−インシユリン（４ｇ）
を例１におけると同様にして溶解させ、そしてク
ロロホルムで平衡化させたシリカゲルSiO2−60
（メルク社製、粒子サイズ63〜200μｍ）300ｇを
充填したカラム（2.5×50cm）に適用する。この
カラムを例１におけると同じ溶媒混合物を用いて
溶離する。最初に現われるピークがB1−BOC−
インシユリン−B30−（But）2を含有しており、豚
インシユリンは遅い方のフラクシヨン中に溶離さ
れる。後処理は例１におけると同様にして行われ
る。
B1−BOC−インシユリン−B30−（But）2の収
量は2.5ｇ、豚インシユリンの収量は0.6ｇであつ
た。
量は2.5ｇ、豚インシユリンの収量は0.6ｇであつ
た。
例 ３
例１におけると同じ混合物（４ｇ）をエタノー
ル70％／トリス緩衝液（0.05M、PH8.0）30％を
用いて平衡化したロバール充填ずみカラムＣに適
用しそして同じ溶離剤を用いてクロマトグラフ処
理する。相互に分離されたヒトインシユリンB30
−ジ第３ブチルスレオニンおよび豚インシユリン
を含有する相当するフラクシヨンを例１における
と同様にして後処理する。
ル70％／トリス緩衝液（0.05M、PH8.0）30％を
用いて平衡化したロバール充填ずみカラムＣに適
用しそして同じ溶離剤を用いてクロマトグラフ処
理する。相互に分離されたヒトインシユリンB30
−ジ第３ブチルスレオニンおよび豚インシユリン
を含有する相当するフラクシヨンを例１における
と同様にして後処理する。
収 量：ヒトインシユリン−B30−（But）2 2.56
ｇ 豚インシユリン 0.6ｇ 例 ４ 未精製の豚インシユリン（４ｇ）をクロロホル
ム／メタノール／水／トリエチルアミン／蟻酸
（1200：1100：370：47：11）の混合物中に溶解さ
せそして例２におけるようにしてシリカゲルカラ
ム（シリカゲルSiO2、メルク社製、シリカゲル
粒子サイズ63〜200μｍ）上でクロマトグラフ処
理する。10mlずつに分別された溶出液を例１にお
けるようにして後処理する。HPLCおよびポリア
クリルアミドゲル電気泳動における再検査によれ
ば純粋な豚インシユリンを含有するフラクシヨン
を合する。収量3.61ｇ 上記実施例１〜４における分離収率は約75％以
上であつた。
ｇ 豚インシユリン 0.6ｇ 例 ４ 未精製の豚インシユリン（４ｇ）をクロロホル
ム／メタノール／水／トリエチルアミン／蟻酸
（1200：1100：370：47：11）の混合物中に溶解さ
せそして例２におけるようにしてシリカゲルカラ
ム（シリカゲルSiO2、メルク社製、シリカゲル
粒子サイズ63〜200μｍ）上でクロマトグラフ処
理する。10mlずつに分別された溶出液を例１にお
けるようにして後処理する。HPLCおよびポリア
クリルアミドゲル電気泳動における再検査によれ
ば純粋な豚インシユリンを含有するフラクシヨン
を合する。収量3.61ｇ 上記実施例１〜４における分離収率は約75％以
上であつた。
（従来法との比較）
豚インシユリンからヒトインシユリンへの酵素
による変換の際に得られるヒトインシユリンエス
テルおよび豚インシユリンを含む混合物を、粒子
サイズ35〜75ミクロン、平均約50ミクロンのシリ
カゲルを充填したカラムに吸着させた。上記吸着
インシユリンをPreparative Biochemistry、５
（５＆６）、397〜412（1975）、特に第411頁第４〜
６行に記載の混合溶離液〔メタノール／水／蟻酸
＝８：４：１（容量部）〕で溶離した。
による変換の際に得られるヒトインシユリンエス
テルおよび豚インシユリンを含む混合物を、粒子
サイズ35〜75ミクロン、平均約50ミクロンのシリ
カゲルを充填したカラムに吸着させた。上記吸着
インシユリンをPreparative Biochemistry、５
（５＆６）、397〜412（1975）、特に第411頁第４〜
６行に記載の混合溶離液〔メタノール／水／蟻酸
＝８：４：１（容量部）〕で溶離した。
他方、本発明の混合溶離液〔クロロホルム／メ
タノール／水トリエチルアミン／蟻酸＝1764：
1470：353：44：９（容量部）〕を用いて別途上記
吸着インシユリンを溶離した。
タノール／水トリエチルアミン／蟻酸＝1764：
1470：353：44：９（容量部）〕を用いて別途上記
吸着インシユリンを溶離した。
原料の変換混合液はヒトインシユリンエステル
76％、豚インシユリン13.2％および不純物4.2％
からなるものであつた。原料および精製画分の成
分組成率は高速液体クロマトグラフイーを用いて
測定した。
76％、豚インシユリン13.2％および不純物4.2％
からなるものであつた。原料および精製画分の成
分組成率は高速液体クロマトグラフイーを用いて
測定した。
前記各溶離液を用いてシリカゲルカラムからイ
ンシユリンを溶離した結果、前記従来法の溶離液
を用いた場合は、事実上ヒトインシユリンと豚イ
ンシユリンの分離はできなかつた。これに反し
て、前記本発明の溶離液を用いた場合はヒトイン
シユリンと豚インシユリンの２つの画分に分離す
ることができ、ヒトインシユリンエステル画分は
実質的に純粋であり、豚インシユリンや不純物を
その中に検出することはできなかつた。大部分の
不純物は第３画分に含まれていた。
ンシユリンを溶離した結果、前記従来法の溶離液
を用いた場合は、事実上ヒトインシユリンと豚イ
ンシユリンの分離はできなかつた。これに反し
て、前記本発明の溶離液を用いた場合はヒトイン
シユリンと豚インシユリンの２つの画分に分離す
ることができ、ヒトインシユリンエステル画分は
実質的に純粋であり、豚インシユリンや不純物を
その中に検出することはできなかつた。大部分の
不純物は第３画分に含まれていた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ インシユリン、インシユリン誘導体および場
合により不純物からなる混合物を分離するに当
り、この混合物を、有機基を用いて誘導されたも
のではないシリカゲルを充填したカラムで、クロ
ロホルム、メタノール、水、トリエチルアミンお
よび蟻酸よりなる溶離剤混合物を用いて、クロマ
トグラフ処理することを特徴とする方法。 ２ クロマトグラフイーがクロロホルム1500〜
2100容量部、メタノール1000〜1500容量部、水
350〜450容量部、トリエチルアミン35〜55容量部
および蟻酸15以下の容量部からなる溶離剤混合物
中で遂行されることを特徴とする前記特許請求の
範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813147842 DE3147842A1 (de) | 1981-12-03 | 1981-12-03 | "verfahren zur trennung von gemischen aus insulin, insulinderivaten und gegebenenfalls verunreinigungen" |
| DE3147842.5 | 1981-12-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58103323A JPS58103323A (ja) | 1983-06-20 |
| JPH0354678B2 true JPH0354678B2 (ja) | 1991-08-20 |
Family
ID=6147790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57210699A Granted JPS58103323A (ja) | 1981-12-03 | 1982-12-02 | インシュリン含有混合物の分離法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4677192A (ja) |
| EP (1) | EP0082359B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58103323A (ja) |
| KR (1) | KR880002607B1 (ja) |
| AR (1) | AR230430A1 (ja) |
| AT (1) | ATE18057T1 (ja) |
| AU (1) | AU563350B2 (ja) |
| CA (1) | CA1245633A (ja) |
| DE (2) | DE3147842A1 (ja) |
| DK (1) | DK162104C (ja) |
| ES (1) | ES8607343A1 (ja) |
| FI (1) | FI75349C (ja) |
| GR (1) | GR77764B (ja) |
| IL (1) | IL67378A (ja) |
| ZA (1) | ZA828864B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3511269A1 (de) * | 1985-04-12 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Verfahren zur reinigung von insulin |
| DE4028120C2 (de) * | 1990-09-05 | 1996-09-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
| US5278284A (en) * | 1992-05-14 | 1994-01-11 | Miller Brewing Company | Protein purification method |
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| US10155799B2 (en) | 2014-07-21 | 2018-12-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Chromatography process for purification of insulin and insulin analogs |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS532492A (en) * | 1976-06-26 | 1978-01-11 | Shimizu Seiyaku Kk | Process for preparing pure insuline |
| JPS5542185A (en) * | 1978-09-22 | 1980-03-25 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | Detecting device for arc welding or the like |
| JPS6016673B2 (ja) * | 1978-12-25 | 1985-04-26 | 川崎重工業株式会社 | サ−ボ系における被検体認識装置 |
-
1981
- 1981-12-03 DE DE19813147842 patent/DE3147842A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-11-30 EP EP82111061A patent/EP0082359B1/de not_active Expired
- 1982-11-30 DE DE8282111061T patent/DE3269252D1/de not_active Expired
- 1982-11-30 AT AT82111061T patent/ATE18057T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-12-01 IL IL67378A patent/IL67378A/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-12-01 GR GR69942A patent/GR77764B/el unknown
- 1982-12-01 ES ES517844A patent/ES8607343A1/es not_active Expired
- 1982-12-01 FI FI824135A patent/FI75349C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-12-01 AR AR291468A patent/AR230430A1/es active
- 1982-12-02 CA CA000416875A patent/CA1245633A/en not_active Expired
- 1982-12-02 DK DK536282A patent/DK162104C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-12-02 ZA ZA828864A patent/ZA828864B/xx unknown
- 1982-12-02 AU AU91102/82A patent/AU563350B2/en not_active Ceased
- 1982-12-02 JP JP57210699A patent/JPS58103323A/ja active Granted
- 1982-12-03 KR KR8205395A patent/KR880002607B1/ko not_active Expired
-
1985
- 1985-12-04 US US06/804,325 patent/US4677192A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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