JPH0355111B2

JPH0355111B2 -

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Publication number: JPH0355111B2
Application number: JP29338988A
Authority: JP
Priority date: 1988-11-19
Filing date: 1988-11-19
Publication date: 1991-08-22
Also published as: JPH02138981A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、成長ホルモン分泌調節活性を有する
ことが知られている牛成長ホルモン放出因子（以
下、GRFと略す。）のうち、一番目から29番目迄
のペプチドフラグメントの27番目のメチオニン
（Met）をイソロシン（Ile）に転換した変異体を
カルボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素
（以下、DHFRと略す。）の生産を可能とする新
規組換えプラスミドに関するものである。pSG1
−12は第２図に示されるDNA配列を有する。
pSG1−12およびpSG1−12を含有する大腸菌は、
発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。

［従来の技術および問題点］本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に
伴つて興味深いポリペプチドを微生物をもちいて
生産することが可能になつた。ポリペプチドに対
応する遺伝子であるDNAを、例えば生体よりク
ローニングと呼ばれる方法で分離するなどし、そ
の後、これを発現ベクターと呼ばれる適当なプラ
スミドなどに組み込み、その結果得られる組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞入に導入
し、目的遺伝子を微生物中で発現させ、微生物か
ら目的ポリペプチドを分離精製することが行われ
ている。このような状況においては、目的ポリペ
プチド遺伝子を含み、且つ効率よく発現させる組
換えプラスミドを構築することが最も重要な課題
である。また、目的ポリペプチドが異なれば自ず
からその方法論が異なつており、この点が解決し
なければならない技術課題である。

CRFは成長ホルモンの分泌を促すペプチドで
ある。牛のGRFは44個のアミノ酸からなり、そ
の配列はアミノ末端側からチロシン−アラニン−
アスパラギン酸−アラニン−イソロイシン−フエ
ニルアラニン−トレオニン−アスパラギン−セリ
ン−チロシン−アルギニン−リジン−バリン−ロ
イシン−グリシン−グルタミン−ロイシン−セリ
ン−アラニン−アルギニン−リジン−ロイシン−
ロイシン−グルタミン−アスパラギン酸−イソロ
イシン−メチオニン−アスパラギン酸−アルギニ
ン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタ
ミン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン
−−グルタミン酸−グルタミン−グリシン−アラ
ニン−リジン−バリン−アルギニン−ロイシンで
あり、カルボキシ末端がアミド化されている。

GRFは、視床下部に存在するが、その含量は
少なく、牛500頭からせいぜい数ミリグラム程度
分離精製できればよい方であり、効率のよい生産
方法の開発が期待されている。牛GRFは、44個
のアミノ酸よりなるが、このうち一番目のチロシ
ンから29番目のアルギニンまでのペプチド部分
（以下、GRF1−29と示す。）だけでも、GRFの約
４分の１の活性を持つことが報告されている
（N.Ling et al ．，Biochem Biophys.Res.
Commun.，vol.123，pp.854（1984））。また、
GRFの27番目のアミノ酸であるメチオニンは、
GRFの活性発現には重要ではなく、メチオニン
の構造類縁体であるイソロイシンもしくはロイシ
ンに変異してもGRF活性を有することが知られ
ている（G.M.Clore、et al.J.Mol.Biol.、
vol.191、553（1986））。GRFの27番目のメチオニ
ンが他のアミノ酸に置き替わつた場合はGRFは
メチオニンを含まないペプチドであることから、
ブロムシアン処理によるメチオニンの位置でのア
ミノ酸配列に特異的な切断操作によつても影響を
受けない。

GRF1−29を暗号化するDNAを組み込んだ組
換えプラスミドについては、本発明者らが構築し
たpGRF28−29（特開昭62−115287）および
pGRF2−15（特開平１−144978号公報）が公知で
ある。しかしながら、pGRF28−29を組み込んだ
大腸菌においては、目的ポリペプチドが発現され
るがその菌体内蓄積量が非常に少ない。また
pGRF2−15は、GRF1−29を安定に発現させるた
めに、DHFRとの融合タンパク質として発現さ
せることに成功したプラスミドであるが、
DHFRとGRF1−29との融合タンパク質から
GRF1−19を特異的に切り出す際の効率に問題が
生じている。すなわち、pGRF2−15はDHFRと
GRF1−29とをFactor Xaと呼ばれる酵素で認識
切断できるアミノ酸配列を介して結合した融合タ
ンパク質を暗号化しているが、Factor Xaが高価
であること、またその酵素反応による切断の効率
がそれほどよくないことなどの難点が生じた。

［発明の目的］本発明の目的は、上記の問題点を解決するため
に、GRF活性を有するとされているGRF1−29の
誘導体を大量生産を可能にする組換えプラスミド
を開発することにある。また、本発明は、遺伝子
操作の手法を用いてGRF1−29の誘導体を大量に
生産する方法の開発の一環として行われたもので
ある。

本発明者らは、鋭意研究の結果、GRFの27番
目のアミノ酸であるメチオニンを構造類縁体であ
るイソロイシンに変換すること、またDHFRと
GRF1−29の誘導体をメチオニンを介して結合
し、融合タンパク質として生産し、融合タンパク
質からの切り出しをブロムシアン処理によつて行
うことを考案し、そのことを実現可能とする組換
え遺伝子およびそれを組み込んだ組換えプラスミ
ドを作成し、本発明を完成させた。

［発明の構成］第１図は、本発明のpSG1−12に組み込まれて
いるDHFRとGRF1−29の誘導体との融合タンパ
ク質（以下、DHFR−GRFMと略す）のアミノ
酸配列およびそれを暗号化するDNA配列を示し
ている。DHFR−GRFMは、191アミノ酸よりな
るタンパク質であり、このうちアミノ末端側から
数えて、１から159番目までの配列が、大腸菌の
野生型DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こ
つた（Cys−152（wildtype）→Clu−152）配列で
あり、162番目がメチオニンであり、最終的にブ
ロムシアンで処理することにより、GRF1−29の
誘導体（以下、GRFMと略す）を切り出すこと
が可能である。162番目から191番目の配列が
GRFMのアミノ酸配列である。

第２図は、本発明のpSG1−12の全塩基配列を
示している。図は、２本鎖DNAのうち片方の
DNA鎖配列だけを、5′末端から3′末端の方向に
記述している。また、pSG1−12は環状DNAであ
るが記述の都合上、直鎖状で現している。従つ
て、最初と最後のが隣あつて存在することにな
る。pSG1−12は、4715塩基対の大きさであり、
宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピ
シリン耐性を付与することができる。pSG1−12
は、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、
pSG1−12を含有する大腸菌は、微工研にFERM
BP−2149として寄託されている。

pSG1−12は、DHFR−GRFMを暗号化する配
列を含む。第２図において、57番目から629番目
迄の配列がDHFR−GRFMを暗号化する配列で
ある。DHFR−GRFMを暗号化する配列の上流
には、この遺伝子の発現を効率良く行わせる配列
が存在する（特開昭63−46193号公報）。即ち、43
番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれる
もので、効率の良い翻訳に、また、4673番目から
4701番目までが、コンセンサス転写プロモーター
であり、効率の良い転写に貢献する。このことか
ら、pSG1−12は、大腸菌に導入された場合、多
量のDHFR−GRFMを作る。作られたDHFR−
GRFMは菌体内に多量に蓄積し、その量は菌体
タンパク質の15〜20％にいたる。また、蓄積した
DHFR−GRFMはジヒドロ葉酸還元酵素活性を
示し、このことによつて、pSG1−12を保持する
大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。

実施例に記載するように、pSG1−12は、すで
に本発明者らが作成している組換えプラスミド
pMEK2（特開平１−252289号公報に記載）の制
限酵素BamHIとXhoI部位の間の配列をGRFMを
暗号化する配列に置き換えることにより作成する
ことができる。pMEK2は、抗菌剤であるアンピ
シリンに対して耐性を付与する遺伝子を有してお
り、その遺伝子の発現は、BamHIとXhoI部位の
間の配列が置き換わつても影響を受けない。すな
わち、pSG1−12を保持する大腸菌はアンピシリ
ン耐性を示す。

このような特長を有するpSG1−12は、実施例
に従つて作成することができるが、組換えプラス
ミドの作成方法によつて本発明が制限されるもの
ではない。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 pSG1−12の作成 GRFMを暗号化するDNAとしては、 1.5′−
GATCCTGATGTACGCTGATGCTACTTC−
3′ 2.5′−
ACCAACTCGTACCGTAAAGTTCTGGGTC
ＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＴＣＧ−3′ 3.5′−
TAAACTGCTGCAGGATATCATCAACCGT
ＴＡＡＣ−3′ 4.5′−
TCGAGTTAACGGTTGATGATATCCTGCA
ＧＣ−3′ 5.5′−
AGTTTACGAGCCGACAGCTGACCCAGAA
ＣＴＴＴＡＣＧＧ−3′ 6.5′−
TACGAGTTGGTGAAGATAGCATCAGCGT
ＡＣＡＴＣＡＧ−3′ の６本のDNAをホスホアミダイト法に従つて化
学合成した。

化学合成したDNAを組み込むベクターとして
は、pMEK2（特開平１−252289号公報に記載）
を用いた。化学合成した６本のDNAの5′末端を
リン酸化した後、アニールし、これをあらかじめ
BamHIおよびXhoIで切断した後、アルカリホス
フアターゼ処理をしたpMEK2と混合し、T4−
DNAリガーゼを利用して化学合成DNAとベクタ
ーの結合を行わせた。このような反応は、いずれ
も、“Molecular Cloning ALoboratory
Manual”（T.Maniatis 、E.F.Fritsch、J.
Sambrook、eds.Cold Spring Harbor Labora
−tory（1982）、以下、文献１と呼ぶ。）に記載し
ている方法に従つて行つた。得られた反応物を、
形質転換法（transformation method、上記文献
１に記載）に従つて、大腸菌に取り込ませた。こ
の処理をした菌体を、50mg／のアンピシリンナ
トリウムおよび２mg／のトリメトプリムを含む
栄養寒天培地（培地11中に、２ｇのグルコース、
１ｇのりん酸２カリウム、５ｇのイーストエキ
ス、５ｇのポリペプトン、15ｇの寒天を含む。）
上に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
約50のコロニーを得ることができた。これらのコ
ロニーから適当に10個選び、1.5mlのYT＋Ap培
地（培地11中に５ｇのNaCl、５ｇのイーストエ
キス、８ｇのトリプトン、50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む。）で、37℃、１晩、菌体を培養
した。培養液を、各々エツペンドルフ遠心管にと
り、12000回転／分で10分間遠心分離し、菌体を
沈澱として集めた。これに、0.1mlの電気泳動用
サンプル調整液（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、
２％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、10％の
グリセリン、５％の２−メルカプトエタノール、
0.001％のブロムフエノールブルーを含む。）を加
え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保
ち、菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（U.
K.Lammli；Nature、vol.227、p.680−685
（1970））に従つて分析した。分子量マーカーとし
てラクトアルブミン（分子量14200）、トリプシン
インヒビター（分子量20100）、トリプシノーゲン
（分子量20400）、カルボニツクアンヒドラーゼ
（分子量29000）、グリセロアルデヒド３−リン酸
デヒドロゲナーゼ（分子量36000）、卵アルブミン
（分子量45000）、および牛血清アルブミン（分子
量66000）を含むサンプルをポリアクリルアミド
濃度の10から20％濃度勾配ゲルで泳動した。その
結果、10個のコロニーのうち、５個では分子量が
大きくなつたタンパク質（分子量約25000と推定
される。）を新たに大量に生産していることが明
かとなつた。デンシトメーターで分析することに
より、新たな現れたタンパク質の量は菌体タンパ
ク質の約20％であることが推定された。

分子量の大きい新たなタンパク質を生産するコ
ロニーのうちから適当に一つ選び、これをYT＋
Ap培地で培養し、TanakaとWeisblumの方法
（T.Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、
vol.121、p.354（1975））に従つて、プラスミドを
調製した。得られたプラスミドをpSG1−12と名
づけた。得られたプラスミドを再び大腸菌に導入
したところ、pSG1−12とまつたく同じ性質を有
する形質転換株が、10⁵〜10⁶／μｇプラスミド
DNAの頻度で得られた。ことことは、pSG1−12
の性質が安定していることを示している。また、
pSG1−12が大腸菌菌体内で安定に複製されるこ
とを示している。

pSG1−12は、pMEK2のBamHIとXhoI部位の
間の配列が合成DNA由来の配列と置き換わつて
いるはずである。pSG1−12をEcoRIとSalIによ
る切断によつて得られる約400ヌクレオチド長の
DNAについて、M13フアージを用いたジデオキ
シ法（J.Messing；Mehtodsin Enzymology、
vol.101、p.20（1983））に従つて塩基配列を決定
した。その結果、第２図に示すpGRFM1−29の
全塩基配列の471番目から937番目の配列が明らか
にされた。pMEK2の塩基配列は、本発明者らに
よつて明らかにされている（特開平１−252289号
公報に記載）。pSG1−12の配列は、pMEK2の
EcoRI−SalIの配列に間にあるBamHIとXhoI部
位の間の配列が化学合成DNAに由来する101ヌク
レオチドのDNA（GRFMを暗号化する配列）が
結合した配列であつた。

また、pSG1−12のEcoRI−SalI切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst、
Hind、Hpa、Aat、Pvu、Bgl、およ
びClaを用いた制限酵素による切断実験の結
果、pMEK2のEcoR−Sal切断によつて得ら
れる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であるこ
とが示された。

以上の結果から、pSG1−12の全塩基配列が第
２図に示した配列であることが明らかである。

［発明の効果］上記のように、新規組換えプラスミドpSG1−
12は、DHFR−GRFMを暗号化しており、かつ
pSG1−12を有する大腸菌は、DHFR−GRFMを
大量に蓄積生産する。さらに、生成したDHFR
−GRFMは、DHFRとGRFMとがメチオニンを
介して結合した構造をしており、ブロムシアン処
理により容易に両者の分離が可能である。このよ
うな性質を有することから、本発明の新規組換え
プラスミドpSG1−12およびそれを有する大腸菌
は、DHFR−GRFMの生産、およびそれを利用
したGRFMの生産に有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pSG1−12中に存在するDHFR−
GRFMを暗号化する部分の塩基配列およびタン
パク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号
は、核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニ
ンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、
Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン酸
を、Cysはシステインを、Glnはグルタミンを、
Cluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisは
ヒスチジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイ
シンを、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、
Pheはフエニルアラニンを、Proはプロリンを、
Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはト
リプトフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリ
ンを示している。図中番号は、１番目のアミノ酸
であるメチオニンを暗号化するATGコドンの
“Ａ”を１番として数えた番号を示している。第
２図は、pSG1−12の全塩基配列を示した図であ
り、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、5′末端から3′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示
している。図中番号は、pSG1−12に２箇所存在
する制限酵素Cla切断認識部位のうち制限酵素
Hind切断部位に近い方のCla切断認識部位
の、5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番
として数えた番号を示している。

Claims

【特許請求の範囲】１大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
耐性を与えることができ、下記の記１に示すアミ
ノ酸配列を有する牛成長ホルモン放出因子のペプ
チドフラグメントとジビトロ葉酸還元酵素との融
合タンパク質を暗号化し、下記の記２に示す
DNA配列を有する新規組換えプラスミドpSG1−
12。【表】【表】【表】【表】【表】【表】２大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
耐性を与えることができ、下記の記１に示すアミ
ノ酸配列を有する牛成長ホルモン放出因子のペプ
チドフラグメントとジビトロ葉酸還元酵素との融
合タンパク質を暗号化し、下記の記２に示す
DNA配列を有する新規組換えプラスミドpSG1−
12を含有する大腸菌。【表】【表】【表】【表】【表】【表】