JPH04117284A - ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略
す。）と抗アレルギー性ペプチドであるアスパラギン酸
（Ａｓｐ）〜セリン（Ｓｅｒ）−アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）−グリシン（Ｇｌｙ）−リジン（Ｌｙｓ）の５個の
アミノ酸配列よりなるペプチド（以下、ＤＳＤＧ）ｆと
略す。）を含む融合タンパク質を大量に産生可能とする
新規組換えプラスミド、該プラスミドを含有する大腸菌
、ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチ
ド融合タンパク質（以下、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫと略す
。）　、ＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫの製造法及びＤＳＤＧＫ
の製造法に関するものである。本発明は、発酵工学、医
薬品工業などの分野に有効に利用されるものである。

〔従来の技術〕

ＤＳＤＧＫは、抗アレルギー性ペプチドの一種であり、
ケミカルメデイエータ−に起因して発症するアレルギー
性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息及びその他の
アレルギー性疾患の予防薬及び治療薬としての利用が期
待される興味深い生理活性ペプチドである（特開平１−
３１６３９８号）。

アミノ酸の数の少ないペプチドの製造方法としては、通
常、化学合成法が知られているが、近年は遺伝子組換え
技術によっても容易に製造しうる方法が開発されている
。例えば、巖倉らは大腸菌のＤＦＩＦＲを大量に発現さ
せることが可能なプラスミドｐＴＰ７０−１を作製しく
特開昭６３−２６７２７６号）　、Ｄ）ＩＦＲのカルボ
キシル末端アミノ酸付近をコートする塩基配列を種々改
変して異種遺伝子を導入し、有用なポリペプチドをＤ）
ＩＦＲとの融合タンパク質の状態で大腸菌に産生させた
。その例としてはソマトスタチン（特開平１−１４４９
７７号、特開平１−１４４９９５号）、ブラジキニン（
特開平１−２５２２８６号）、メチオニンエンケファリ
ン（特開平１−２５２２８９号）がある。

また巖倉らはＤＨＦＲの生産効率を高める目的で、効率
のよいターミネータ領域として知られるｒｒｎＢ遺伝子
とｐＴＰ７０−１を使用して組換えプラスミドｐＴＰ１
０４−４を構築しく特開平１−１４４９７９号）、それ
を利用してＤＨＦＲ−ロイシンエンケファリン融合タン
パク質を発現させることのできる組換えプラスミドｐＬ
ＥＫ１の作製も行っている（特開平１−２５２２９０号
）。

ここで得られる融合タンパク質はＤＨＰＲの酵素活性も
保持されているので、融合タンパク質の精製はＤＨＦＲ
の特性と活性を利用して容易に行うことができる。また
目的とするペプチドは、融合タンパク質をブロモシアン
処理した後、ＨＰＬＣで精製して取得することができる
。

〔発明が解決しようとする課題］ 本発明の課題は、ＤＳＤＧＫを遺伝子操作技術により製
造することにあり、このために、ＤＳＤＧＫをコード化
する遺伝子を組み込んだを効なプラスミドを作製しよう
とするものである。そしてこのプラスミドは下記のよう
な課題を解決するものであることが必要である。

（ｉ　）　ＤＳＤＧＫを融合タンパク質として産生ずる
ことができるものであること （ｉｉ）融合タンパク質の遺伝子を大量発現させるもの
であること （１１）産生される融合タンパク質の精製が容易なもの
であること （ｉｖ）融合タンパク質からのＤＳＤＧＫの分離が容易
なものであること ［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、鋭意研究の結果、大腸菌のジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子を用いることにより、上記課題を解決で
きることを見いだし、その知見に基づいてＤ）ＩＦＲと
ＤＳＤＧＫの融合タンパク質をコード化する遺伝子を組
み込んだ組換えプラスミドを作製し、本発明を完成させ
た。

すなわち本発明は、下記のアミノ酸配列を有するジヒド
ロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タ
ンパク質（ＤＩ（ＰＲ−ＤＳＤＧＫ　）をコードする塩
基配列を含む組換えプラスミドにある。

Ｍｅｔ　Ｔｉｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＶａｌＡｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｖ
ａｌ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｕ　　Ａ
ｓｎ　　Ａｌａ　　ＭｅｔＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｒ
ｐＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　
Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌｌｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｙ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ
　ｌ１ｅＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ｌ１ｅ１１ｅ　Ｌｅｕ
　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　
Ａｓｐ　ＡｓｐＡｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｖａ
ｌ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＧｌｕＡｌａ　
Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖ
ａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕｌｉｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＴｙｒＧ
ｌｕ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｌ
ｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ　　ＬｅｕＴｙｒ
　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　
Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ＧｌｕＧｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉ
ｓ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

Ａｓｐ＾ｓｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈ
ｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＰｈｅＨｉｓ　　Ａｓｐ　　Ａｌ
ａ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｎ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｈｉｓ　　５ｅｒＴｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　１ｉｅ
Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙｓこの組換えプラスミドにおいて、ジヒドロ葉酸還元
酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質（
Ｄ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧＫ　）をコードする塩基配列とし
ては例えば下記の塩基配列が挙げられる。

ＡＴＧ　　ＡＴＣＡＧＴ　　ＣＴＧ　　ＡＴＴ　　ＧＣ
Ｇ　　ＧＣＧ　　ＴＴＡ　　ＧＣＧ　　ＧＴＡＧＡＴ　
　ＣＧＣＧＴＴ　　ＡＴＣＧＧＣＡＴＧ　　ＧＡＡ　　
ＡＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧ　ＴＧＧ　ＡＡＣＣＴＧ　Ｃ
ＣＴ　ＧＣＣＧＡＴ　ＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴ　ＡＡ
Ａ　ＣＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＡ、ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＣＣ
ＣＧＴＧＡＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＣＣＧＣＣＡＴ　ＡＣＣ
ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＴＣＡ　ＡＴＣＧＧＴ　　ＣＧＴ　　
ＣＣＧ　　ＴＴＧ　　ＣＣＡ　　ＧＧＡ　　ＣＧＣＡＡ
Ａ　　ＡＡＴ　　ＡＴＴＡＴＣ’ＣＴＣＡＧＣＡＧＴ　
ＣＡＡ　ＣＣＧ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＧＡＣＧＡＴＣＧＣ
ＧＴＡ　ＡＣＧ　ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＴＣＧ　Ｇ
ＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧ　ＧＣＧ　Ｔ
ＧＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡＡＴＣＡ
ＴＧ　　ＧＴＧ　　ＡＴＴ　　ＧＧＣＧＧＣＧＧＴ　　
ＣＧＣＧＴＴ　　ＴＡＴＧＡＡ　　ＣＡＧ　　ＴＴＣＴ
ＴＧ　　ＣＣＡ　　ＡＡＡ　　ＧＣＧ　　ＣＡＡ　　Ａ
ＡＡ　　ＣＴＧＴＡＴ　　ＣＴＧ　　ＡＣＧ　　ＣＡＴ
　　ＡＴＣＧＡＣＧＣＡ　　ＧＡＡ　　ＧＴＧ　　ＧＡ
ＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＴ　　ＴＴＣＣＣＧ　　ＧＡ
Ｔ　　ＴＡＣＧＡＧ　　ＣＣＧＧＡＴ　　ＧＡＣＴＧＧ
　　ＧＡＡ　　ＴＣＧ　　ＧＴＡ　　ＴＴＣＡＧＣＧＡ
Ａ　　ＴＴＣＣＡＣＧＡＴ　　ＧＣＴ　　ＧＡＴ　　Ｇ
ＣＧ　　ＣＡＧ　　ＡＡＣＴＣＴ　　ＣＡＣＡＧＣＴＡ
Ｔ　　ＧＡＧ　　ＴＴＣＧＡＡ　　ＡＴＴ　　ＣＴＧ　
　ＧＡＧ　　ＣＧＧ　　ＣＧＧ　　ＡＴＣＣＴＧ　　Ａ
ＴＧ　　ＧＡＴ　　ＴＣＡ　　ＧＡＴ　　ＧＧＣＡＡＡ
上記の組換えプラスミドは、大腸菌において安定に複製
され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアン
ピシリン耐性を与え、かつ４６４３塩゛基対の大きさを
有するものが含まれる。

組換えプラスミドは、第１図の塩基配列を有する組換え
プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭが含まれる。

さらに本発明は、上記の組換えプラスミドにより形質転
換された大腸菌にある。

さらに本発明は、下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ
葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タン
パク質（Ｄ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧＫ　）にある。

Ｍｅｔ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＶａｌＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ
　　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ
　ＭｅｔＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａ
ｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＴｒｐＰｈｅ　Ｌｙｓ
　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　
Ｐｒｏ　Ｖａｌｌｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　）Ｉ
ｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＴｉｅＧｌｙ
　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　
Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ｌ１ｅ１１ｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ
Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓ
ｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＧｌｕＡｌａ　　Ｉｌｅ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　　Ｐｒ
ｏ　Ｇｌｕｌｌｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　　ＴｙｒＧｌｕ　
Ｇｉｎ’　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　
Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｔ（
ｉｓ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｕＧｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　
Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐ
ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＰｈｅＨｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ
　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　
５ｅｒＴｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　１ｉｅＬｅｕ　Ｍｅｔ　
Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓさらに本発明
は、上記の組換えプラスミドにより形質転換された大腸
菌を培養し、該培養菌体からジヒドロ葉酸還元酵素−抗
アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質（ＤＪ（Ｆ
Ｒ−ＤＳＤＧＫ）を採取することを特徴とする、ジヒド
ロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タ
ンパク質の製造方法にある。

この製造方法において、ジヒドロ葉酸還元酵素抗アレル
ギー性ペンタペプチド融合タンパク質（ＤＨＦＲ−ＤＳ
ＤＧＫ　）の採取工程は、培養菌体の無細胞抽出液から
、ストレプトマイシン処理、硫安沈澱、及びメソトリキ
セート結合アフィニティカラムクロマトグラフィーを順
次用いて精製する工程を含むことが好ましい。

さらに本発明は、上記のアミノ酸配列を有するジヒドロ
葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タン
パク質（Ｄｉ（ＦＲ−ＤＳＤＧＫ　）にブロムシアンを
作用せしめることを特徴とする、アスパラギン酸−セリ
ン−アスパラギン酸−グリシン−リジンのアミノ酸配列
からなる抗アレルギー性ペンタペプチドの製造方法にあ
る。

以下に本発明の詳細を（１）新規組換えプラスミドの作
製、（２）形質転換された大腸菌、（３）ＤＨＦＲ−Ｄ
ＳＤ（、に融合タンパク質の製造工程、（４）得られた
ＤＩ（Ｆｉｔ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質、（５１ＤＨ
ＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパ質からのＤＳＤＧＫの製造
工程、の順に説明する。

（１）新規組換えプラスミドの作製 １）ＤＳＤＩＪをコードするＤＮＡの作製１　、５’−
ＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡ
ＴＡＡＣ−３’２、　５’−ＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧ
ＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＡＧ−３’の２本の２
９ヌクレオチＦからなるＤＮＡを化学合成し、これを６
０°Ｃでインキュベートすることによって両ＤＮＡをア
ニールし、下記の２本鎖ＤＮＡを得る。

５’−ＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣ
ＡＡＡＴＡＡＣ−３３’−ＧＡＣＴＡＣＣＴＡＡＧＴＣ
ＴＡＣＣＧＴＴＴＡＴＴＧＡＧＣＴ−５’ＤＳＤＧＫコ
一ド部分 （アンダーラインはベクタープラスミドのＢａｎ＋）（
■及びＸｈｏｌ切断部位に結合する２本鎖ＤＮＡの部位
を示す） ｉｉ）　ＤＳＤＧＫをコードするＤＮＡのベクタープラ
スミドへの挿入 ＤＳＤＧＫをコードするＤＮＡを発現させるためのベク
ターとしては、既に本発明者らが作製している′Ｍｉ換
えプラスミドρＭＥＫ２　（特開平１−２５２２８９号
明細書に記載）を用いる。ｐＭＥＫ２は大腸菌に安定に
保持され、ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌は微工研にＦＥ
ＲＭ　ＢＰ〜１８１６として寄託されている。

ｐＭＥＫ２は、ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌から通常行
われるプラスミドの分離方法に従って分離精製して利用
することができる。精製したｐＭＥＫ２をＢａｍＨＩ及
びＸｈｏ　Ｉで切断して得たＤＮＡ断片を、上記ｉ）の
２本鎖ＤＮＡと７４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
新規プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを得る。

ｉｊ）新規プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭの塩基配列第１
図は本発明のｐＢＢＫｌｏＭＭの全塩基配列を示してい
る。この図には、２本鎖環状ＤＮＡのうち遺伝情報をコ
ードしている片方のＤＮＡ鎖の塩基配列だけが、プラス
ミド中に唯一存在する制限酵素Ｃ１ａ　Ｉの認識切断部
位、５゛−＾ＴＣＧＡＴ−３’、の最初の“Ａ１を１番
として数えて、５“末端から３°末端の方向に記載され
ている。本発明のｐＢＢＫｌｏＭＭは新規な組換えプラ
スミドである。ｐＢＢＫｌｏＭＭは４６４３塩基対の大
きさであり、宿主である大腸菌にトリメトプリム及びア
ンピシリン耐性を付与することができる。ｐＢＢＫ１０
闘はｐ門ＥＫ２　（４６４０塩基対よりなる）のＢａｍ
ＨＩ及びＸｈｏ　Ｉ切断によって得られる大きい方のＤ
ＮＡ断片（４６１４塩基対よりなる）とＤＳＤＧＫをコ
ードする塩基配列を含む２９塩基対の化学合成りＮＡが
結合した構造をしている。第１図において、５３３番目
から５６１番目までの配列が化学合成りＮＡ由来の配列
である。

それ以外の配列は、ｐＭＥＫ２由来の配列である。

なお、ｐＭＥＫ２の全塩基配列は既に本発明者らによっ
て明らかにされており（特開平１−２５２２８９号明細
書に記載）、第１図に示す塩基配列のうち５３３番目か
ら５６１番目までの配列が、以下に示す２６塩基対の配
列に置き変わった構造である。

５’　−ＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴ
ＧＴＡＡＣ−３’化学合成したＤＮＡの配列には、制限
酵素Ｘｈｏ　Ｉの認識切断部位、５’　−ＣＴＣＧＡＧ
−３’　（第１図の５６１番目から５６６番目までの配
列）、を含ませである。ｐＭＥＫ２由来の部分にはＸｈ
ｏ　１部位が存在するので、方向を定めて異種ＤＮＡの
導入を行い、ＤＨＦＲ遺伝子との融合遺伝子を容易に作
製することができる。

第１図の５７番目から５５７番目までの配列は、ＤＨＦ
Ｒのカルボキシル末端側にＤＳＤＧＫがロイシンとメチ
オニンを介して結合したＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン
パク質をコード化している。

ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質をコード化する配
列の上流には、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質遺
伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特開昭
６３−２６７２７６号明細書）。

即ち、４３番目から５０番目までの配列がＳＤ配列と呼
ばれるもので、効率のよい翻訳に、また、４６０１番目
から４６２９番目までの配列がコンセンサス転写プロモ
ーターであり、効率のよい転写に貢献する。そのためｐ
ＢＢＫｌｏＭＭは大腸菌に導入された場合、多量のＤＩ
（ＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質を作る。作られたＤ
ＨＦＲ−ＤＳＤＧに融合タンパク質は、菌体内に可溶性
の状態で菌体タンパク賞の約２０％程度蓄積する。トリ
メトプリムはこのＤＨＰＲに対する阻害剤であるが、ｐ
ＢＢＫＩＯＭＭを有する大腸菌はＤ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧ
Ｘ融合タンパク質を菌体内に大量に蓄積するので、トリ
メトプリム耐性を示すようになる。また、ｐＢＢＫＩＯ
ＭＭはｐＭＥに２由来のアンピシリン耐性遺伝子を有し
ている。このことがら、ｐＢＢＫｌｏＭＭが導入された
大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す。ｐＢＢＫｌｏＭ
Ｍは大腸菌に導入されて安定状態に保たれる。

このような特徴を有するｐＢＢＫｌｏＭＭは、実施例１
に従って作製することができるが、組換えプラスミドの
作製方法によって本発明が制限されるものではない。

（２）形質転換された大腸菌 上記（１）で作製したｐＢＢＫｌｏＭＭを常法に従い大
腸菌に取り込ませる。この形質転換された大腸菌は、ト
リメトプリム及びアンピシリンに対して耐性を示す。ｐ
ＢＢＫｌｏＭＭを含有する大腸菌は、ｐＢＢＫＩＯＭＭ
上のＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質遺伝子の効率
のよい発現の結果、ＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク
質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。

ρＢＢＫＩＯＭＭを含有する大腸菌をＹＴ＋ＡＰ培地（
培地ＩＬ中に、５ｇのＮａＣ１，８ｇのトリプトン、５
ｇのイーストエキス及び１００ｍｇのアンピシリンナト
リウムを含む液体培地）を用いて、３７°Ｃで定常期ま
で培養した場合、蓄積するＤＩ（ＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合
タン融合タンパク体タンパク質の約２０重量％に達する
。培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁
し、フレンチプレス法もしくは超音波破砕法で破砕し、
これを遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、は
とんど全てのＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ
ク体に回収される。ｐＢＢＫｌｏｌｌＭを含有する大腸
菌は、微工研に微工研条寄第２３９４号（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２３９４）として寄託されている。

（３）　ＤＩＩＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質の製造
工程本発明のＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ
ク体程は、ｉ）菌体の培養、１１）菌体の破砕、ｉｊ）
ストレプトマイシン処理、ｉｖ）硫安沈澱、及び■）メ
ソトリキセート（ＭＴＸ）結合アフィニティクロマトグ
ラフィーの各工程より成る。

）菌体の培養 ｐＢＢＫｌｏＭＭを含有する大腸菌の培養は、ＹＴ＋Ａ
ｐ培地（培地ＩＬ中に、５ｇの！１ａｃｌ、８ｇのトリ
プトン、５ｇのイーストエキス及び５０■のアンピシリ
ンナトリウムを含む液体培地）で培養することができる
。培地としては、この他に５Ｔ−Ｉ−ＡＰ培地（培地Ｉ
Ｌ中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２ナトリウム
、５ｇのポリペプトン、５ｇのイーストエキス及び５０
ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培地）など、
菌体が成長しうる培地であれば、どの様な培地でも用い
ることができるが、ＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク
質の生産にはＹＴ＋Ａｐ培地が望ましい。

ｐＢＢＫｌｏＭＭを含有する大腸菌を培地に接種し、３
７°Ｃで対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する
。培養温度により菌体中のＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タ
ンパク質の蓄積量が変動し、調べた限りでは、培養温度
が高いほど蓄積量が大であった。

培養した菌体を４，７００Ｘ　ｇの遠心分離により集め
る。培地ＩＬより湿重量２〜４ｇの菌体が得られる。集
菌及びこれ以降の操作は、特に指示しない限り低温（通
常は０〜１０°Ｃの間、４°Ｃが望ましい）で行う。

ｉｉ）菌体の破砕 培養して得られた菌体を、培養液ＩＬにつき１０ｍ１の
割合で緩衝液１　［０，１ｍＭエチレンジアミン４酢酸
２ナトリウム（ＥＤＴＡ−Ｎａｚ）及び１４ｍＭ　２メ
ルカプトエタノールを含むｌｏ＋ｎＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐａｌ　７．０）　］に懸濁し、フレンチプレス
又は超音波破砕機を用いて菌体を破砕する。

菌体破砕液を２７，０ＯＯＸ　ｇで、２０分間遠心分離
し、上清を得る（以下、この上清を無細胞抽出液という
）。

ｉｊ）ストレプトマイシン処理 無細胞抽出液に対して１．５％（Ｗ／Ｖ）のストレプト
マイシン硫酸をスターラーで攪拌しながらゆっくり加え
る。２０分間攪拌した後、ストレプトマイシン処理した
液を２７．０ＯＯＸｇで２０分間遠心分離し、上滑を得
る。

ｉｖ）硫安沈澱 上記の操作により得られた上清１容量部に対して０．８
〜０．９容量部の飽和硫酸アンモニウム液をスターラー
で撹拌しながら徐々に加える。２０分間攪拌した後、硫
安沈澱処理した液を２７，０ＯＯＸｇで２０分間遠心分
離し、上清を得る。

ｖ）ＭＴＸ結合アフィニティクロマトグラフィ上記の操
作により得られた上清に、あらかじめ緩衝液１で平衡化
した２５ｍ１のＭＴＸ結合アガロースゲル（シグマ社製
）を加える。１０分間放置して上清をゲルに吸着させた
後、ゲルをカラムに詰める。カラムを緩衝液１及び、１
？１ＫＣ１を含む緩衝液１、ＩＭ　ＭＣＩを含む緩衝液
２　［０，１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム
（ＥＤＴＡ−Ｎａｚ）及び１４ｍＭ　２−メルカプトエ
タノールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８
，５）　］の順で洗う。

ＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質の溶出は、１Ｍの
ＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液１を２ＮのＮａＯＨ
でｐ）ｌを９．３に調整した溶液を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
ことにより行う。分画した溶出液について叶ＦＲ活性を
測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。得られた溶
液を、緩衝液１に対して透析する。この段階で、純度９
０％以上のＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質が得ら
れる。

以上の操作により、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク
質の精製を再現性良く行うことができる。

本発明に従うと、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質
の精製は、培養を含めて３日以内に行うことができ、回
収率は約５０％で、均一なタンパク質標品を得ることが
できる。

Ｄ）ＩＦＲ酵素活性の測定は、反応液［０，０５ｍＭの
ジヒドロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＩ　、　１２ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）］　１−をキュヘットに
取り、これに試料を加え、２５°Ｃで３４０ｎｍの吸光
度の時間変化を測定することにより行う。酵素活性はユ
ニットで表わし、上記反応条件において、１分間に１マ
イクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量
を１ユニツトとして定義する。

この測定は、分光光度計を用いて容易に行うことができ
る。

（４）得られたＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質第
２図は、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質をコート
化する部分のＤＮＡ配列と、それから作られるタンパク
質のアミノ酸配列を示している。Ｄ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧ
Ｋ融合タンパク質は、１６７アミノ酸よりなる新規なタ
ンパク質である。アミノ末端側から数えて１番目から１
５９番目までの配列は、大腸菌の野性型ＤＨＰＲに１箇
所アミノ酸置換が起こった［Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ
）−＋ＧＩｕ−１５２］配列であり、１６３番目から１
６７番目までがＤＳＤＧＫの配列である。

１６０番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）及び１６１番目の
ロイシン（Ｌｅｕ）は、ｐＭＥＫ２のＢａｍ）Ｉ　１部
位にＤＳＤＧＫをコード化する遺伝子を導入する際に、
遺伝情報の読み取り枠を合わせるために生じた配列であ
る。１６２番目のアミノ酸、即ちＤＳＤＧＫの配列の直
前のアミノ酸はメチオニン（Ｍｅｔ）である。そのため
、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質をブロムシアン
処理することにより、ＤＳＤＧＫを切り出すことができ
る。ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質の分子量は、
１８，８８４である。

なお、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質は、ＤＨＦ
Ｒのカルボキシル末端側にＤＳＤＧＫが結合した構造を
しているにもかかわらず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。

このため、大腸菌がＤ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパ
ク質を多量に作ると、Ｄ）ＩＦＲの阻害剤であるトリメ
トプリムに対して耐性を示すようになる。

（５）　［１ＳＤＧＫの製造 上記（４）のＤＨＰＲ−ＤＳＤＧに融合タンパク質にお
けるＤＳＤＧＫ配列の直前のアミノ酸はメチオニン（Ｍ
ｅｔ）であり、このＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク
質をブロムシアン処理してＤＳＤＧＫを得る。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により詳細に説明する。

（実施例１） ｐＢＢにｌ０ＭＭの作製 ＤＳＤＧＫをコード化するＤＮＡとしては、１．５°−
ＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡ
ＴＡＡＣ−３’２、　５’−ＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧ
ＣＣＡＴＣＴＧＡＡＴＣＣＡＴＣＡＧ−３’の２本の２
９ヌクレオチドからなるＤＮＡをホスホアミダイト法に
従って化学合成機（ミリジエン社製、７５００型）で化
学合成し、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（アプ
ライド・バイオシステムズ社製）で精製後、このＤＮＡ
含有液を約０．０２ｔｄ（約０．１μｇのＤＮＡを含む
）ずつ取り、これにカイネーション用反応液（５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，８，１０ｍＭ　ＭｇＣ１
ｚ、５ＩＩＩＭジチオトレイトール、０．５ｍＭ　ＡＴ
Ｐ）を１８０μ！とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全
酒造社製　１０ユニツト／μｌ）を１μ！加え３７°Ｃ
で３０分間インキュベートすることによって５°末端を
リン酸化した。これを−旦８０’Ｃでインキュベートし
た後、徐々に冷却させることにより両ＤＮＡをアニール
させ、下記の二本鎖ＤＮＡを得た（これを以下、ＤＮＡ
Ｉと呼ぶ）。

５−ＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡ
ＡＡＴＡＡＣ−３３’−ＧＡＣＴＡＣＣＴＡＡＧＴＣＴ
ＡＣＣＧＴＴＴＡＴＴＧＡＧＣＴ−５精製した約ｌμｇ
のｐＭＥＫ２を２０ユニツトのＢａａ＋ＨＩ（全酒造社
製）及び２０ユニツトのＸｈｏｌ（全酒造社製）で切断
した後、０．８５％アガロースゲル電気泳動法により分
離した。約４．６キロ塩基対のＤＮＡ断片を切り出し、
ゲルからＤＮＡを回収した（これを以下、ＤＮＡ２と呼
ぶ）　。Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ及びＸｈｏ　ＩによるＤＮＡの
切断の操作は、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　［Ｔ、
ＭａｎｉａｔｉｓＥ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、５ａ
ＩＩｌｂｒｏｏｋ、　ｅｄｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）
、以下、これを文献１と呼ぶ］に記載されている方法に
従って行った。

全２０μｌのＤＮＡ２に２０μ！のりガーゼ用反応液（
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ）Ｉ　７．４．５ｍＭ
　ＭｇＣｂ、１０ｍＭジチオトレイトール、５ｍＭ　Ａ
ＴＰ）、及び１０μｌのＤＮＡ１を加え、これに１μ！
の７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、３００ユニツト
／μＩ）を加えて、室温で１９時間ＤＮＡの連結反応を
行わせた。この反応物を形質転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒ
＋ｗａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　。

上記文献１に記載）に従って、大腸菌（宝酒造社製Ｅ、
ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩコンピテントセル）に取り込ませ
た。この処理をした菌体を、１００■／！のアンピシリ
ンナトリウム及び５■／！のトリメトプリムを含む栄養
寒天培地（培地ＩＬ中に、２ｇのグルコース、Ｉｇのリ
ン酸２カリウム、５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペ
プトン及び１５ｇの寒天を含む）上に塗布し、３７°Ｃ
て２４時間培養することにより、数十個のコロニーを得
ることができた。

これらのコロニーのうち１０個を、２ｍｌの￥　Ｔ　＋
　Ａｐ培地（培地ＩＬ中に、５ｇのＮａＣｌ、８ｇのト
リプトン、５ｇのイーストエキス及び１００■のアンピ
シリンナトリウムを含む）で、３７°Ｃで一晩菌体ヲ培
養した。培養液をそれぞれエッペンドルフ遠心管（１，
５ｄ容）に取り、エツペントルフ社製遠心分離機（５４
１４Ｓ型）を使用して１２，０００回転／分で１０分間
遠心分離し、菌体を沈澱として集めた。これに、０．１
ｄの電気泳動用サンプル調製液［０，０７０９ＭのＴｒ
ｉｓ−１（ＣＩ　ｐＨ６，８，２％（Ｗ／Ｖ）のラウリ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１１％（Ｖ／Ｖ）のグリ
セリン、５％（Ｖ／Ｖ）の２−メルカプトエタノール及
び０．０４５％（Ｗ／Ｖ）のブロムフェノールブルーを
含む］を加え、菌体を懸濁し、この懸濁液を沸騰水中に
５分間保ち、菌体を溶かした。このように処理したサン
プルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｉ
Ｊ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ；Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２
２７＋　ｐ６８０（１９７０）　ｉに従って分析した。

分子量マーカーとして、ラクトアルブミン（分子量１４
，２００）、トリプシンインヒビター（分子量２０．１
００）、トリプシノーゲン（分子量２４．０００）、カ
ーボニックアンヒドラーゼ（分子量２９，０００）、グ
リセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子
量３６，０００）、卵アルブミン（分子量４５，０００
）及び牛血清アルブミン（分子量６６．０００）の混合
物（シグマ社製、ＤＡＬＴＯＮ　ＭＡＲＫ−Ｌ）を使用
し、アクリルアミド濃度が１０％から２０％である濃度
勾配ゲル（第一化学社製）で泳動した。

その結果、１０個のコロニーのうち５個について、推定
される大きさのタンパク質が作られていることが明らか
になった。この５個のコロニーから適当に１個選び、こ
れをＹＴ十Ａｐ培地で培養し、Ｔａｎａｋａと−ｅｉｓ
ｂｌｕ＋ｓの方法［Ｔ、Ｔａｎａｋａ、ＢＪｅｉｓｂｌ
ｕｍ；Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、１２１
．ｐ、３５４（１９７５）］に従ってプラスミドを調製
した。得られたプラスミドをｐＢＢＫｌｏＭＭと命名し
た。ｐＢＢＫｌｏＭＭは、ｐＭＥＫ２のＢａＷＩＨＩと
Ｘｈｏ　１部位の間の配列が合成りＮＡと置き換わった
構造を有するはずである。合成り　Ｎ　Ａには、制限酵
素Ｘｈｏ　Ｔで認識切断される配列、５’　−ＣＴＣＧ
ＡＧ−３゛、が含まれているので、Ｘｈｏ　ＩでｐＢＢ
ＫｌｏＭＭの切断を試みたところ、確かに切断された。

また、ｐＢＢＫｌｏＭＭのＥｃｏＲＩ（第１図の４７１
−４７６番目の配列）と５ａｌｌ（第１図の８５９−８
６５番目の配列）による切断によって得られる約４００
ヌクレオチド長のＤＮＡについて、Ｍ１３ファージを用
いたジデオキシ法［Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ；Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　ｖｏｌ、１０１゜
ｐ２０　（１９８３）］に従って、ＥｃｏＲＩから５ａ
ｉｌの方向に塩基配列を決定した。その結果、第１図に
示すｐＢＢＫｌｏＭＭの全塩基配列の４７１番目から８
５９番目までの配列が確かめられた。

また、ｐＢＢＫｌｏＭＭのＢａｍｔ（Ｉ　−Ｘｈｏ　ｌ
切断によって得られる約４．６キロ塩基対のＤＮＡは、
ＥｃｏＲＩＰｓｔｌ、　Ｈｔｎｄｌｌｌ、　ＨｐａＩ、
　Ｐｖｕｎ＋　Ｂｇｌｌｌ＋　Ｃ１ａｌ（いずれも宝酒
造社製）及びＡａｔＩＩ　（東洋紡社製）を用いた制限
酵素による切断実験の結果、ｐＭＥＫ２のＢａｍＨＩ　
−Ｘｈｏ　ｌ切断によって得られる約４．６キロ塩基対
のものと全く同一であることが示された。

以上の結果から、ρＢＢＫＩＯ間の全塩基配列は第１図
に示す配列であることを決定した。

（実施例２） ｐＢＢＫｌｏＭＭを含有する大腸菌が作るＤＨＦＲ−Ｄ
ＳＤＧＫ融合タン融合タ ンパ液質１０問を含有する大腸菌が作るＤＨＰＲ−ＤＳ
ＤＧＫ融合タン融合タンパ液質酸配列は、Ｄ）ＩＦＲ−
ＤＳＤＧＫ融合タンパク質遺伝子の配列から予想するこ
とができる。第１図の５７番目から５５７５７番目の配
列がＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ液質化し
ていることから、トリブレット暗号表を用いてアミノ酸
配列を推定した。その結果、第２図に示すアミノ酸配列
が得られた。そして、ｐＢＢＫｌｏＭＭを含有する大腸
菌を用い、以下のようにしてＤ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧＫ融
合タン融合タンパ液質製及びその同定を行った。

ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧに融合タンパク質の精製Ａ、用いた
菌体量：湿重量１３．４ｇ／　３　ＬｃｕｌｔｕｒｅＢ
、酵素精製工程：下記表１に示す。この表において■は
無細胞抽出液、■はストレプトマイシン処理、■は硫安
沈澱、及び■はメソトリキセート結合アフィニティカラ
ムクロマトグラフィーを意味し、酵素精製は、■の無細
胞抽出液を順次■、■、■の精製工程に付すことにより
行った。

表　　１ ■　　　３１　　　　１，１３０　　　　３７０　　　
　　１００■　　　２９　　　　　　８５０　　　　３
００　　　　　　８１■　　　５２　　　　　　５５０
　　　　２９０　　　　　　７８■　　　５７　　　　
　１９９　　　　１６０　　　　　４３ＤＨＦＲ酵素活
性の測定は、反応液［０，０５ｍＭのジヒドロ葉酸、０
．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ、１２ｍＭの２−メルカプトエ
タノール、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐｉ（７
，０）］　１　ｍｆｆ１をキュベツトに取り、これに試
料を加え、２５°Ｃで３４０ｎｍの吸光度の時間変化を
測定することにより行った。酵素活性はユニットで表わ
し、上記反応条件において、１分間に１マイクロモルの
ジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量を１ユニツト
として定義した。

得られたＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ液質
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（上記実施例１に
記載の方法）により分析したところ、約２１，０００の
単一なタンパク質ハンドが示され、得られたＤ）ＩＦＲ
−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質標品が均一であることが示
された。

（実施例３） 分離精製したＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ
液質ＳＤＧにの分離 実施例２で得られた５７ｍ１の精製均一化したＤ）ＩＦ
Ｒ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ液質限外濾過膜（ア
ミコン社製、ＹＭ５　φ２５問）で濃縮し、緩衝液１に
対して透析し、６−のＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融
合タンパ液質濃縮液これは、３０．６■／ｄの濃度でＤ
ＨＦＲＤＳＤＧＫ融合タンパク質を含んでいた。このＤ
ＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ液質濃縮液１０
０μｌ１Ｎ　ＨＣＩに溶解したブロムシアン（５０ｍｇ
／＋１１２）を１９０ｕｊ２、蟻酸７１０μｌを加え、
密栓して室温で一晩攪拌した。

反応後、９緘の水を加えた後凍結乾燥した。得られた標
品を０．５ｄの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した。

そのうちの４０μｌを取り、高速液体クロマトグラフィ
ー装置（日立６５５形）を用い、ＹＭＣＯＤＳ−５カラ
ム（山村化学社製　径４．６　Ｘ　２５０ｍｍ）で分離
した。を８出は、０．１％トリフルオロ酢酸中で、アセ
トニトリルの濃度勾配（０％から１０％）をかけること
によって行った。０分から５分までは０％のアセトニト
リルを用い、５分から３５分までは０％から１０％のア
セトニトリルの直線濃度勾配をかけた。その結果、第３
図に示す溶出曲線が得られた。試料注入後約７分後のピ
ーク画分を分離し、分離した溶出液に少量の水を加え、
凍結乾燥して溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペ
プチドを酸加水分解後、その１．４分の１をアミノ酸分
析に用いた。その結果、アスパラギン酸が８ｎｍｏｌｅ
、セリン、グリシン及びリジンがそれぞれＪ　ｎ　ｍｏ
ｌｅずつ検出された。アミノ酸組成は、ＤＳＤＧＫのそ
れと一致した。この結果から、精製したＤＨＦＲ−ＤＳ
ＤＧＫ融合タン融合タンパ液質シアン処理し、次いでＨ
ＰＬＣを用いて分離することにより、収率約４４％でＤ
ＳＤＧＫを回収できることが明らかになった。

Ｄ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ調質収率が
約４３％であり、叶ＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タンパク質か
らのＤＳＤＧＫの分離の収率が約４４χであることから
、無細胞抽出液からのＤＳＤＧＫの単離収率は約１９％
であると計算される。

〔発明の効果〕

上記のように、本発明の新規組換えプラスミドｐＢＢＫ
１０ＭＭは、ＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ
調質化しているため、ｐＢＢＫｌｏＭＭを有する大腸菌
はＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ調質の状態
で大量に産生蓄積する。さらに、産生されるＤＨＦＲ−
ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ調質Ｒ酵素活性を保持し
ているため、精製を容易に行うことができる。本発明の
精製法に従うことにより、ＤＨＦＲ−ＤＳＤＧＫ融合タ
ン融合タンパ調質迅速に効率よく行うことができる。ま
た、このようにして得られたＤ）ＩＦＲ−ＤＳＤＧＫ融
合タン融合タンパ調質れをブロムシアンによってＤＨＰ
ＲとＤＳＤＧＫの間を切断した後、高速液体クロマトグ
ラフィーによってＤＳＤＧＫを単離精製することができ
る。

そして精製されたＤＳＤＧＫはアレルギー性疾患の治療
薬として有用である。従って、本発明は、アレルギー性
疾患の治療薬として有用なり５ＤＧＫを遺伝子操作技術
によって製造するだめの有利な手段を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＢＢＫ１０間の全塩基配列を示す図であり
、２末鎖Ｄ　Ｎ　Ａのうち遺伝情報をコードしている片
方のＤＮＡ鎖配列配列を、５′末端から３゛末端の方向
に記述している。図中符号は、核酸塩基を表わし、Ａは
アデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチ
ミンを示す。図中の番号は、ｐＢＢＫｌｏＭＭに１箇所
存在する制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ認識切断部位、５’−ＡＴ
ＣＧＡＴ−３’、の最初の“Ａ２を１番として数えた番
号である。 第２図は、ｐＢＢＫ１０間中に存在するＤＨＦＲ−ＤＳ
ＤＧＫ融合タン融合タンパ調質化する部分の塩基配列及
びタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。図中の符
号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａはアデニンを
、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、ｃ
ｔｙはグリシンを、Ａｌａはアラニンを、Ｖａｌはバリ
ンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｈｅはイソロイシンを、Ｓ
ｅｒはセリンを、Ｔｈｒはトレオニンを、Ｃｙｓはシス
ティンを、Ｍｅｔはメチオニンを、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸を、Ａｓｎはアスパラギンを、Ｇｌｕはグルタミン
酸を、Ｇｌｎはグルタミンを、Ａｒｇはアルギニンを、
Ｌｙｓはリジンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｐｈｅはフ
ェニルアラニンを、Ｔｙｒは千ロジンを、Ｔｒρはトリ
プトファンを、Ｐｒｏはプロリンを示す。図中の番号は
、ＤＨＰＲ−ＤＳＤＧＫ融合タン融合タンパ調質末端の
アミノ酸であるメチオニンを１番として数えた番号であ
る。 第３図は、ＤＨＦＲ−ＤＳＤ（Ｊ融合タンパク質をブロ
ムシアン処理し、逆相カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー装置で分離したときのクロマトグラムを示す
。横軸は時間を分単位で、継軸は２２ＯｎＩＩｌの吸光
度を任意単位で表わす。図中の矢印は、抗アレルギー性
ペンタペプチドＤＳＤ（Ｊの溶出された位置を示す。 Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　＊＊ネ 第２図 第１図（その１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵素
   −抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質をコー
   ドする塩基配列を含む組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 ２、ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプ
   チド融合タンパク質をコードする塩基配列が下記の塩基
   配列である請求項１記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 ３、組換えプラスミドが、大腸菌において安定に複製さ
   れ、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピ
   シリン耐性を与え、かつ４６４３塩基対の大きさを有す
   るものである請求項１記載の組換えプラスミド。 ４、組換えプラスミドが第１図の塩基配列を有する組換
   えプラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭである請求項１記載の組
   換えプラスミド。 ５、請求項１記載の組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた大腸菌。 ６、下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵素
   −抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質。 【遺伝子配列があります。】 ７、請求項５記載の大腸菌を培養し、該培養菌体からジ
   ヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融
   合タンパク質を採取することを特徴とする、ジヒドロ葉
   酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパ
   ク質の製造方法。 ８、ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプ
   チド融合タンパク質の採取工程が、培養菌体の無細胞抽
   出液から、ストレプトマイシン処理、硫安沈澱、及びメ
   ソトリキセート結合アフィニティカラムクロマトグラフ
   ィーを順次用いて精製する工程を含むものである請求項
   ７記載の製造方法。 ９、請求項６記載のジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギ
   ー性ペンタペプチド融合タンパク質にブロムシアンを作
   用せしめることを特徴とするアスパラギン酸−セリン−
   アスパラギン酸−グリシン−リジンのアミノ酸配列から
   なる抗アレルギー性ペンタペプチドの製造方法。