JPH0358067B2 - - Google Patents

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JPH0358067B2
JPH0358067B2 JP56085861A JP8586181A JPH0358067B2 JP H0358067 B2 JPH0358067 B2 JP H0358067B2 JP 56085861 A JP56085861 A JP 56085861A JP 8586181 A JP8586181 A JP 8586181A JP H0358067 B2 JPH0358067 B2 JP H0358067B2
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quaternary ammonium
blood
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JP56085861A
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JPS5713356A (en
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Harison Kaataa Sekando Jeemusu
Roorensu Redeisu Sutefuan
Richaadoson Kuruuzu Harorudo
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Coulter Electronics Inc
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は希釈全血試料に用いる溶解剤および希
釈全血試料の溶解方法に関するものであり、特に
適当な電子機器による血球の電子的計算と分粒、
ヘモグロビンの定量、および単一の血球細胞にお
ける集合指数と血小板パラメータの測定に使用す
るのに適した血液溶解剤に関するものである。特
に、クールターカウンター（Coulter Counter、
米国登録商標、以下同じ）モデルＳプラス
（PLUS）自動血球カウンター（米国フロリダ州、
ハイアリー所在のクールター・エレクトロニクス
社製）と共に使用し、クールター・チヤンネライ
ザ（Coulter Channelyzer、米国登録商標）に畜
積されたデータによつて２つの白血球母集団：(1)
リンパ（リンパ球）母集団および(2)骨髄（好中
球、単核細胞、好酸球、および塩基球）母集団の
識別を可能にする試薬および方法の開発が望まれ
ている。この種のデーターは異常な白血球の割合
を見つけ出す選別手段として有用である。この方
法によつて知らされる異常な状態は診断上重要な
情報およびさらに研究を進めるための情報を与え
る。 ウオレス・エイチ・クールター（Wallace H.
Coulter）により改良されたクールターカウンタ
ー（COulter Counter、米国登録商標、以下同
じ）機器に使われている計算および分粒の原理を
用いる容量分布による正常人の白血球の分離は現
在臨床診断法として応用されている。この方法は
遺伝暗号情報により細胞容量を調整する生きてい
る全細胞の基本的性質に基づくものである。循環
血液中の各タイプの細胞は血小板の場合の３立方
ミクロンから多形核細胞の場合の450立方ミクロ
ンまでの範囲の容積に特徴がある。新しいクール
ターカウンター機器は血小板および赤血球の粒度
分布を計算して求めるためにこの容量差を使用し
て病理学的状態の検出および監視を行うように設
計されている。 赤血球およびリンパ白血球は残念なことに細胞
の大きさがかなり重なつており、従つて大きさの
識別のみによつて一方を他方の存在下に計算する
ことはできない。従来方法では赤血球を間質溶解
する強溶解性界面活性剤を使用して赤血球を極め
て小さい粒子にするかまたは膜を可溶化し、リン
パおよび骨髄の白血球から細胞質を剥離して耐溶
解性核のみを数えられる状態にしている。当初の
細胞容量が著しく影響を受けて最小まで減少する
ので、単一の母集団のみが粒度分布分析により肉
眼で見える。 クールターカウンターモデルＳプラス自動化血
球カウンターは全血試料を等張性希釈剤中に希釈
し、溶解剤およびアルカリ金属シアン化物水溶液
を添加し、次いで7.5秒後に計算を開始するよう
に設計されている。４秒間に赤血球および白血球
のデータを収集し、20秒までに血小板のデータを
収集する。従つて、希釈溶解システムは容解期間
中に完全なストロマチゼイシヨン
（Stromatization）が行なわれるがこの間に白血
球を完全には剥離しないように十分に速い赤血球
溶解速度を提供する必要がある。さらに、白血球
容量の変化はデータ収集工程中では最小である必
要があり、理想的には数分間安定である必要があ
る。また試薬システムは赤血球と血小板の数およ
び粒度分布、ヘモグロビン吸収曲線および全白血
球数を完全に保持する必要がある。血液は等張性
希釈剤であらかじめ希釈した場合に少なくとも２
時間安定でなければならない。 血液中のンパ球および骨髄球の相対的母集団の
分析を行うには、白血球容量ヒストグラムは、リ
ンパ球ピークと骨髄球ピークとが完全に分離さ
れ、かつ小さい赤血球片によつて基線に極めて近
い谷が形成されていることを示す必要がある。各
ピークの積分はリンパ球および骨髄球の相対的母
集団を与える。リンパピークはリンパ球および小
さい異常なリンパ球を含み、骨髄ピークは多形核
細胞、バンド、単核細胞、好酸球、好塩基球およ
び大きい異常なリンパ球を含むことを示した。 米国特許第3874852号明細書（1975）には、ク
ールターカウンターモデルＳにおいて単一容量の
白血球数およびヘモグロビン測定値を得るために
それぞれ溶解剤およびクロマゲン形成剤として用
いられる第四級アンモニウム塩洗浄剤およびシア
ン化物を含有する組成物の配合が示されている。
第四級アンモニウム塩を２母集団の白血球数を得
るための溶解剤として用いるには、さらに研究を
行う必要があつた。 1981年９月１日付けにて特許された米国特許第
4286963号明細書に示されているように、白血球
のリンパ母集団／骨髄母集団の示差定量を行い、
またクロマゲン形成によりヘモグロビンを測定す
るために、全血中の赤血球を迅速に溶解する溶解
希釈剤（lytic diluent）は、表面活性の性質を有
する少なくとも１種の第四級アンモニウム塩およ
び２−フエノキシエタノールのようなある添加剤
の食塩水溶液の混合物を含有する。 ２容量分布分析は困難である。その理由は、多
数の希釈剤の場合に、２つの母集団が迅速に一方
に移動するので、分析のための十分な計算時間が
ないからである。 本発明は血液溶解剤、この血液希釈と等張性希
釈剤とを組合せてなる血液溶解剤およびこの血液
溶解剤と等張性希釈剤とを併用して希釈全血試料
を溶解する方法に関するものである。本発明の血
液溶解剤を使用することにより、従来の血液像値
の日常計算を行うことができ、特に自動計算シス
テム、例えば未変更プログラミングおよび外部ま
たは内部白血球チヤネライザー機器の能力を具え
た自動クールターカウンター装置において白血球
のリンパ／骨髄のヒストグラムおよび相対的濃度
の表示と計算を行うことができる。 本発明で使用する等張性血液希釈剤は麻酔剤化
合物、有機緩衝剤、細胞膜安定剤、および殺菌剤
を浸透圧がバランスしていて実質的に中性である
溶液に溶解した混合物からなり、細胞質が白血球
から剥離される速度を遅くしかつ従来の血液像パ
ラメータを安定させるのに役立つ。 溶解剤は界面活性の性質を有する少なくとも１
種の第四級アンモニウム塩を含有する水溶液であ
り、溶解剤は少くとも１個の２容量白血球ヒスト
グラムを与えるのに有効な濃度範囲で存在させ、
これを少なくとも１個の２容量白血球ヒストグラ
ムを与えるのに有効な濃度範囲のアルカリ金属シ
アン化物水溶液と一緒に使用する。データの表示
はチヤネライザーとＸ−Ｙプロツターとを連結し
た標準クールターカウンターを用いて達成するこ
とができる。補助的な計算およびデータ取扱い装
置を完全に自動化することが好ましいが、測定の
実施に必須ではない。 本発明によれば、白血球のリンパおよび骨髄の
母集団を示差定量する方法、また血液像値を特に
自動計算装置で測定する方法が提供される。この
方法では、 Ａ １ ４−アミノ安息香酸エステル誘導体を包
含する麻酔剤化合物、 ２ 有機緩衝剤、 ３ 細胞膜安定剤、および ４ 殺菌剤 を混合し、水酸化ナトリウムまたは塩酸溶液で
PH7.0±0.1に調整し、所要に応じて、硫酸ナト
リウムおよび塩化ナトリウムを用いて１Kg当り
320±５ミリオスモルのオスモル濃度に調整し
た水溶液混合物からなる等張性希釈剤、 Ｂ 界面活性の性質を有する少なくとも１種の第
四級アンモニウム塩の水溶液を、少くとも１個
の２容量白血球ヒストグラムを与えるのに有効
な濃度範囲を有する水溶液混合物からなる溶解
剤、および Ｃ 少くとも１個の２容量白血球ヒストグラムを
与えるのに有効な濃度範囲を有するアルカリ金
属シアン化物水溶液 を組み合わせて使用する。 血液中の白血球およびヘモグロビンを定量する
方法では、界面活性の性質を有するほぼ純粋な少
くとも２種の第四級アンモニウム塩を混合するこ
とにより生成する水溶液混合物から成る溶解剤を
使用して赤血球と血小板を間質溶解し、アルカリ
金属シアン化物の水溶液を使用してヘモグロビン
をクロマゲンに転化する。前記第４級アンモニウ
ム塩は窒素原子に３個の短鎖アルキル基および１
個の長鎖アルキル基が結合したものである。この
方法では前記第四級アンモニウム塩と前記アルカ
リ金属塩とが２容量白血球ヒストグラムを与え、
白血球のリンパ／骨髄ヒストグラムおよび相対的
濃度を特に自動計算装置において機械的に計算す
るのに有効な濃度範囲にある。 本発明で使用する全血を希釈するための等張性
希釈剤は、次の成分： イ 血液試料の細胞成分を安定化するための４−
アミノ安息香酸エステル誘導体を包含する１種
以上の麻酔剤化合物、 ロ 白血球の示差定量を防害する赤血球の干渉作
用を阻止するための１種以上の有機緩衝剤、お
よび ハ 白血球膜に一層の安定性を付与する１種以上
の細胞膜安定剤 ニ 殺菌剤 からなる血球安定化作用を有する混合物の水溶液
である。 本発明で使用する等張性希釈剤の好適例は次の
組合せである。 (1) 塩酸プロカイン (2) Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、 (3) ジメチロール尿素、ヘキサメチレンテトラミ
ン、およびＮ−ヒドロキシメチルアセトアミド
からなる群から選定した１種以上の細胞膜安定
剤、および (4) クロロヘキシデン二酢酸、ジメチロール尿素
および１−ヒドロキシピリジン−２−チオンナ
トリウムからなる群から選定した１種以上の殺
菌剤。 塩酸プロカインの濃度は75〜250mg／である
のが好ましく、Ｎ−（２−アセトアミド）イミド
二酢酸の濃度は1.2〜2.0ｇ／であるのが好まし
い。 本発明の等張性希釈剤の好ましい配合は次の通
りである。成 分 有効濃度範囲 塩酸プロカイン 0.11 ｇ／ Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸
（ADA） 1.40 ｇ／ クロロヘキシデン二酢酸 0.02 ｇ／ ジメチロール尿素 1.00 ｇ／ １−ヒドロキシピリジン−２−チオンナトリウ
ム 0.50 ｇ／ 水酸化ナトリウム 0.50 ｇ／ 硫酸ナトリウム，無水物 9.72 ｇ／ 塩化ナトリウム 4.50 ｇ／ 水 全量を１にする量 この希釈剤を所要に応じて水酸化ナトリウムま
たは塩酸溶液でPH7.0±0.1に調整する。塩化ナト
リウムでオスモル濃度を１Kg当り320±５ミリオ
スモルに調整する。 血球はアデノシントリホスフアイターゼ酵素を
含むことが知られている。この酵素は、浸透圧バ
ランス、血球濁度および固有の膜ポテンシヤルを
維持するために、小さいアニオン（例えば塩素イ
オン）と結合したアルカリ金属カチオンを、エネ
ルギー要求機構により血球の中または外に運ぶ。
著しく大きい硫酸イオンと結合したナトリウムイ
オンは、硫酸イオンと塩素イオンとの間の電荷密
度およびイオンが細胞の中または外に運ばれる際
の膜電荷のポテンシヤ変化に比較的大きな差異が
あるため、明らかに容易には運ばれない。セル内
の内部滲透圧バランスは約30ミリモルの塩化ナト
リウムを含ませることにより維持する。硫酸ナト
リウムには、正常でないプラズマグロブリンを溶
解し、白血球総数が多いことによるヘモグロビン
溶液の濁度を減らすかあるいは無くすことができ
ることが知られている。 塩酸プロカインは、４−アミノ安息香酸エステ
ル誘導体およびその塩を包含する麻酔剤の種類の
１種として、赤血球膜を安定させる影響力を有す
ることが報告されているが、作用の仕方は明らか
ではない。 本発明で使用する希釈剤における有機緩衝剤Ｎ
−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ADA）の
使用は、溶解した赤血球片を電気的に45立方ミク
ロンより小さい粒径にして赤血球が２種の別個の
母集団（リンパおよび骨髄）への白血球の算出お
よび分布を妨害するのを防止する点で、溶解剤で
ある弱い第四級アンモニウム塩を助けることがで
きることに基づく。 ADAの作用機構は精密には研究されていない
が、族のアルカリ金属およびＢ族の遷移金
属、ならびにかなり有効な緩衝液に対し中程度に
強いリガンドであることが知られている。アミノ
酸に非常に似ているADAは細胞膜蛋白質に引き
つけられ、この蛋白質と相互に影響し合うことは
明らかである。ADAは周囲溶液に対する一層大
きい正の電荷の「出現（appearance）」を外側の
膜表面に与える金属カチオンに配位し、従つて外
側の膜の周囲における溶媒和およびアニオンの引
付けを助長する。溶媒分子およびアニオンによる
このようなコーテイングは懸濁している他の細胞
への接近および他の細胞との凝集相互作用を効果
的に妨げる。ADAの緩衝作用は非溶媒和および
安定性の喪失を排除する「局所的」環境の変化を
妨げる。 塩酸プロカインのような局所的麻酔剤および硫
酸ナトリウムの作用と結び付いたこの機構は、血
液試料の細胞成分の安定化を助け、血液試料を
数、粒度分布および形状の点において当初の状態
から本質的に変化させない。この因子は従来の血
液像パラメータの解釈において診断上極めて重要
である。 殺ウイルス剤および殺菌剤として通常使用され
るクロロヘキシデン二酢酸は単独では使用濃度に
おいて有効性が最低に近いが、白血球の粒度分布
算出を妨げる遠因となる破片を減らす際にADA
を有意に助けるので重要である。またクロロヘキ
シデンはアルギニンおよびグアニジンのアミンに
若干似ており、配位と水素結合とにより膜蛋白質
と相互に作用することが予想される。従つて、ク
ロロヘキシデンは明らかに溶解剤を助けて赤血球
膜を完全に間質溶解する。 ホルムアルデヒドと尿素との縮合物であるジメ
チロール尿素はPHが中性の溶液中で白血球膜と極
めてゆつくりと反応してある程度の静止時安定性
を与える。この安定性はこの化合物を除去すると
明らかでなくなる。ジメチロール尿素は中位の濃
度において微生物の生長を防げる制菌性殺菌剤化
合物として知られている。白血球を安定させるた
めに併用される他の化合物はヘキサメチレンテト
ラミン、およびＮ−ヒドロキシメチルアセトアミ
ドである。 １−ヒドロキシピリジン−２−チオンナトリウ
ムはふけ取り用シヤンプー中の殺真菌剤および殺
細菌剤としての使用が知られている。この化合物
は人の全血中の細胞成分の形状、粒度分布または
数にはつきりした有害な影響を示さない殺真菌剤
および殺細菌剤として希釈剤中に使用用される。 ジメチロール尿素と１−ヒドロキシピリジン−
２−チオンナトリウムとの組合せを使用する場合
には、これらの物質を単独使用する場合よりも極
めて優れた殺菌性生成物を与える。この組合せは
正常および異常な両方の試料に対して安定な血液
像を与え、同時に自動機器システムによつて収集
される白血球に関する容量分布情報を与える。 この希釈剤システムの第１の目的は、自動容量
分布分析および計算から得られる血液像の診断上
の精度を上げるために、従来達成されていない程
度まで全血の細胞成分の細胞の大きさ、形状およ
びインテグリテイ（integrity）を安定化するこ
とにある。本発明の希釈剤を使用する場合には、
自動血球計算および分粒を行うために希釈および
調製を行う際に、細胞の血流状態を比較的変化さ
せないことにより、従来技術を改良拡張すること
ができる。適当な溶解剤と併用する場合には、従
来技術を拡張して白血球に関する２容量分布情報
を与えることができる。 前記希釈剤は、半自動または自動クールター血
球カウンターを使用する場合には正確な血液像を
再現するが、溶解剤と併用した場合には２容量白
血球ヒストグラムのみを生成する。 単一容量白血球計算のみを行う場合には、米国
特許第3874852号明細書に記載されているように、
溶解剤は表面活性の性質を有する少なくとも１種
の第四級アンモニウム塩の水溶液であり、これに
クロマゲン形成剤としてアルカリ金属シアン化物
を含有させる。ここに示した成分の有効範囲およ
び濃度を、本発明に係る２母集団白血球計算を行
うために特に追求する必要がある。 溶解剤として使用される第四級アンモニウム塩
は、次式の長鎖アルキル基が12〜〜16個の炭素原
子を有し、短鎖がトリメチル基であり、X-が塩
素または臭素原子である。 第四級アンモニウム塩洗浄剤は次式： （式中のR1は10〜18個の炭素原子を有する長
鎖アルキル基であり、R2，R3およびR4は１〜６
個の炭素原子を有する短鎖アルキル基であり、
X-はCl，Br，Ｉ，PO4およびCH3SO4のような
塩形成基を示す）で表わされる。 本発明の好適例では、希釈全血試料に用いる溶
解剤は、ほぼ純粋な少なくとも２種の第四級アン
モニウム塩を混合することにより生成する水溶液
混合物であり、 前記第四級アンモニウム塩は、自動計算装置を
使用した場合に、前記溶解剤が少なくとも２個の
白血球母集団に分離された少なくとも１個の２容
量白血球ヒストグラムを生成するのに有効な界面
活性を示す分量で組み合わせられており、 前記第四級アンモニウム塩は、次式（ａ）： （式中のRa 1は12個の炭素原子を有する長鎖ア
ルキル基、R2，R3およびR4は１〜６個の炭素原
子を有する短鎖アルキル基；X-はCl-，Br-，I-，
PO4 -3，HSO4 -およびCH3SO4 -からなる群から
選定した塩形成基を示す）で表される１種の化合
物と、次式（ｂ）： （式中のRb 1は14個または16個の炭素原子を有
する長鎖アルキル基、R2，R3，R4およびX-は上
述のものと同一のものを示す）で表される１種以
上の化合物との組合せからなることを特徴とす
る。 好ましい溶解剤の配合を次に示す。
【表】 上記溶解剤は反応速度が従来のライスエス
（Lyse Ｓ，米国登録商標；組成：第四級アン
モニウム塩35ｇ／、塩化ナトリウム9.0ｇ／，
シアン化カリ0.250ｇ／，残部水）よりも極め
て著しく弱く遅い。代りの有効な第四級アンモニ
ウム塩には、ヘキサデシルトリメチル臭化アンモ
ニウムおよびセチルジメチル臭化アンモニウムが
あり、これをドデシルトリメチル塩化アンモニウ
ムと組み合わせて使用する。希釈剤は明らかに、
小容量のリンパ球を大容量の骨髄シリーズ（好中
球、単球、好酸球、好塩基球）から区別すること
のできる点まで、溶解剤反応の速度を十分に遅く
するように白血球膜を安定化することができる。
白血球径分布を繰返し測定すると、ヒストグラム
は変性前30秒まで安定であことが分かつた。実験
結果はリンパ球を溶解時間7.5秒内に本質的に最
小細胞容量まで減らすことを示した。骨髄球は溶
解剤の添加後30秒までの間に最終容量の２〜３倍
になり、その後容量は骨髄部分がリンパ部分と混
合するまでゆつくりと減少する。 赤血球について較正したクールターモデルＳプ
ラスおよびクールターモデルＣ−1000チヤネライ
ザーを使用して測定した結果、試薬系による処理
後のリンパピークおよび骨髄ピークの容量はそれ
ぞれ60〜85立方ミクロンおよび260〜320立方ミク
ロンの付近にあり、分布幅は狭いことが分つた。
フイコルーパク（Ficoll−Paque，米国登録商
標）勾配に基づく簡単な沈降作用により新鮮な全
血から得た白血球では、リンパピークおよび骨髄
ピークの容量はそれぞれリンパが約260立方ミク
ロンおよび約500立方ミクロンであり、分布幅は
著しく広いことが分かつた。標準技術を使用して
フイコルーパク勾配に基づく遠心分離により分離
された新鮮血の試料は、顆粒球（好中球、好酸球
および好塩基球）から分離された単核球細胞（リ
ンパ球および単球）を生成した。リンパ球は260
立方ミクロンにおいて骨髄ピークと一致している
ことが分り、単球は550立方ミクロン付近に集中
していることが分つた。顆粒球部分は500立方ミ
クロン付近に集中したかなり広いピークを形成し
た。２母集団の分離は、フイコルーパク法で得た
生存できる白血球の場合より、クールターカウン
ターモデルＳプラスによる実験からの化学的に溶
解した血液の場合の方が、著しく一層はつきりし
ている。従つて、同じ血液試料のフイコルーパク
分離により得られた白血球と比較して容量が1/2
〜1/3減少するから、溶解剤が実質的に白血球を
損傷することは明らかである。 本発明ではドデシルトリメチル塩化アンモニウ
ムを混入するとリンパ球容量を選択的に減らし
（即ち、260立方ミクロンから60〜85立方ミクロン
に約1/3の容量減少）、骨髄球の容量に対しては一
層小さい程度まで影響を及ぼす（即ち、500立方
ミクロンから260〜320立方ミクロンに約1/2の減
少）。実際にはドデシルトリメチル塩化アンモニ
ウムはそれ自体では不十分な溶解剤である。これ
はマイタブの強力な溶解作用を和らげ、別の細胞
核容量の測定を許す程度まで溶解速度を遅くす
る。また、低濃度のマイタブを使用した場合に
は、ドデシルトリメチル臭化アンモニウムの混入
は赤血球を著しく一層迅速かつ鮮やかに溶解し、
ヘモグロビンの転化を早めるので、白血球母集団
に対する安定性を良好にする。 中央および地方の病院の献血者から得られた百
以上の正常および異常な新鮮血液試料についての
予備データは、クールターカウンターモデルＳプ
ラスーチヤネライザーシステムからの白血球母集
団のデータと手動の100の細胞分離との間に高い
相関関係があることを示した。骨髄部分およびリ
ンパ部分には僅かな変化が認められたが、相互関
係には大きいずれはなかつた。 本発明の溶解剤と希釈剤との組合せを用いる
と、クールターカウンターモデルＳプラスの白血
球浴から得られた溶解血の分光光度走査（波長対
吸光度）は、ライスエスによつて生成したもの
と本質的に同一のヘモグロビン曲線を示した。し
かし、540nmにおける吸光度および得られたヘモ
グロビン計算値はアイソトン（Isoton，米国
登録商標；組成：塩化ナトリウム7.93ｇ／，エ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム0.38ｇ／、
塩化カリウム0.40ｇ／、リン酸二水素ナトリウ
ム0.19ｇ／，リン酸水素二ナトリウム1.95ｇ／
、フツ化ナトリウム0.30ｇ／、残部水）およ
びライエンスの組合せよりも約0.2ｇ／大き
い。細胞容量平均値は特に新しい２試薬系では
1.0〜1.5立方ミクロンである。他のパラメーター
はすべてアイソトンおよびライスエスの組合
せで生成したものと実質的に一致した。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 希釈全血試料に用いる溶解剤において、ほぼ
    純粋な少なくとも２種の第四級アンモニウム塩を
    混合することにより生成する水溶液混合物であ
    り、 前記第四級アンモニウム塩は、自動計算装置を
    使用した場合に、前記溶解剤が少なくとも２個の
    白血球母集団に分離された少なくとも１個の２容
    量白血球ヒストグラムを生成するのに有効な界面
    活性を示す分量で組み合わせられており、 前記第四級アンモニウム塩は、次式（ａ）： （式中のRa 1は12個の炭素原子を有する長鎖ア
    ルキル基、R2，R3およびR4は１〜６個の炭素原
    子を有する短鎖アルキル基；X-は Cl-，Br-，I-，PO4 -3，HSO4 -および
    CH3SO4 -からなる群から選定した塩形成基を示
    す）で表される１種の化合物と、次式（ｂ）： （式中のRb 1は14個または16個の炭素原子を有
    する長鎖アルキル基、R2，R3.R4およびX-は上述
    のものと同一のものを示す）で表わされる１種以
    上の化合物との組合せからなる ことを特徴とする血液溶解剤。 ２ 前記第四級アンモニウム塩は塩化ドデシルト
    リメチルアンモニウムと臭化テトラデシルトリメ
    チルアンモニウムとの混合物である特許請求の範
    囲第１項記載の溶解剤。 ３ 次の成分濃度： 【表】 る量
    を有する特許請求の範囲第２項記載の溶解剤。 ４ 前記第四級アンモニウム塩の前記組合せは、
    自動計算装置の白血球データ収集時間の間に使用
    するために、リンパ細胞の容量を260立方ミクロ
    ンから60〜85立方ミクロンに優先的に減少し、か
    つ骨髄細胞の容量をこれより小さい程度である
    500立方ミクロンから260〜320立方ミクロンに減
    少するのに有効な界面活性を示す特許請求の範囲
    第１〜３項のいずれか一つの項に記載の溶解剤。 ５ 希釈全血試料に用いる溶解剤において、ほぼ
    純粋な少なくとも２種の第四級アンモニウム塩を
    混合することにより生成する水溶液混合物である
    血液溶解剤と等張性血液希釈剤とを組み合わせて
    なり、 前記第四級アンモニウム塩は、自動計算装置を
    使用した場合に、前記溶解剤が少なくとも２個の
    白血球母集団に分離された少なくとも１個の２容
    量白血球ヒストグラムを生成するのに有効な界面
    活性を示す分量で組み合わせられており、 前記第四級アンモニウム塩は、次式（ａ）： （式中のRa 1は12個の炭素原子を有する長鎖ア
    ルキル基、R2，R3およびR4は１〜６個の炭素原
    子を有する短鎖アルキル基；X-はCl-，Br-，I-，
    PO4 -3，HSO4 -およびCH3SO4 -からなる群から
    選定した塩形成基を示す）で表される１種の化合
    物と、次式（ｂ）： （式中のRb 1は14個または16個の炭素原子を有
    する長鎖アルキル基、R2，R3.R4およびX-は上述
    のものと同一のものを示す）で表わされる１種以
    上の化合物との組合せからなり、 前記希釈剤は血球安定化作用を有する混合物の
    水溶液であり、前記混合物は前記溶解剤によつて
    生じる白血球からの細胞質剥離速度を遅らせかつ
    従来の血液像パラーメーターを安定化するのに適
    当な濃度であり、前記希釈剤はほぼ中性である ことを特徴とする血液溶解剤。 ６ 前記第四級アンモニウム塩は塩化ドデシルト
    リメチルアンモニウムと臭化テトラデシルトリメ
    チルアンモニウムとの混合物である特許請求の範
    囲第５項記載の溶解剤。 ７ 前記血液希釈剤と組み合わせられる前記血液
    溶解剤は次の成分濃度： 【表】 る量
    を有する特許請求の範囲第６項記載の溶解剤。 ８ 前記第四級アンモニウム塩の前記組合せは、
    自動計算装置の白血球データ収集時間の間に使用
    するために、リンパ細胞の容量を260立方ミクロ
    ンから60〜85立方ミクロンに優先的に減少し、か
    つ骨髄細胞の容量をこれより小さい程度である
    500立方ミクロンから260〜320立方ミクロンに減
    少するのに有効な界面活性を示す特許請求の範囲
    第５〜７項のいずれか一つの項に記載の溶解剤。 ９ 前記等張性血液希釈剤は次の成分： イ Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、 ロ 塩酸プロカイン、 ハ ジメチロール尿素、ヘキサメチレンテトラミ
    ン、およびＮ−ヒドロキシメチルアセトアミド
    からなる群から選定した１種以上の細胞膜安定
    剤、および ニ クロロヘキシデン二酢酸、ジメチロール尿素
    および１−ヒドロキシピリジン−２−チオンナ
    トリウムからなる群から選定した１種以上殺菌
    剤 の組合せである特許請求の範囲第５〜８項のいず
    れか一つの項に記載の溶解剤。 １０ 希釈全血試料を溶解するに当り、 ほぼ純粋な少なくとも２種の第四級アンモニウム
    塩を混合することにより生成する水溶液混合物で
    あり、前記第四級アンモニウム塩は、自動計算装
    置を使用した場合に、前記溶解剤が少なくとも２
    個の白血球母集団に分離された少なくとも１個の
    ２容量白血球ヒストグラムを生成するのよ有効な
    界面活性を示す分量で組み合わせられており、前
    記第四級アンモニウム塩は、次式（ａ）： （式中のRa 1は12個の炭素原子を有する長鎖ア
    ルキル基、R2，R3およびR4は１〜６個の炭素原
    子を有する短鎖アルキル基；X-はCl-，Br-，I-，
    PO4 -3，HSO4 -およびCH3SO4 -からなる群から
    選定した塩形成基を示す）で表される１種の化合
    物と、次式（＋ｂ）： （式中のRb 1は14個または16個の炭素原子を有
    する長鎖アルキル基、R2，R3.R4およびX-は上述
    のものと同一のものを示す）で表される１種以上
    の化合物との組合せからなる血液溶解剤を使用し
    て、前記希釈全血試料を処理する ことを特徴とする希釈全血試料の溶解方法。 １１ 前記第四級アンモニウム塩は塩化ドデシル
    トリメチルアンモニウムと臭化テトラデシルトリ
    メチルアンモニウムとの混合物である特許請求の
    範囲第１０項記載の方法。 １２ 溶解剤は次の成分濃度： 【表】 る量
    を有する特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 前記第四級アンモニウム塩の前記組合せ
    は、前記自動計算装置の白血球データ収集時間の
    間に使用するために、リンパ細胞の容量を260立
    方ミクロンから60〜85立方ミクロンに優先的に減
    少し、かつ骨髄細胞の容量をこれより小さい程度
    である500立方ミクロンから260〜320立方ミクロ
    ンに減少するのに有効な界面活性を示す特許請求
    の範囲第１０〜１２項のいずれか一つの項に記載
    の方法。 １４ 前記希釈全血液試料は次の成分： イ 血液試料の細胞成分を安定化するための４−
    アミノ安息香酸エステル誘導体を包含する１種
    以上の麻酔剤化合物、 ロ 白血球の示差定量を防害する赤血球の干渉作
    用を阻止するための１種以上の有機緩衝剤、お
    よび ハ 白血球膜に一層の安定性を付与する１種以上
    の細胞膜安定剤 ニ 殺菌剤 からなる血球安定化作用を有する混合物の水溶液
    である等張性希釈剤を使用して希釈した全血液試
    料である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １５ 前記水溶液が (1) 塩酸プロカイン (2) Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、 (3) ジメチロール尿素、ヘキサメチレンテトラミ
    ン、およびＮ−ヒドロキシメチルアセトアミド
    からなる群から選定した１種以上の細胞膜安定
    剤、および (4) クロロヘキシデン二酢酸、ジメチロール尿素
    および１−ヒドロキシピリジン−２−チオンナ
    トリウムからなる群から選定した１種以上の殺
    菌剤 の組合せである特許請求の範囲第１４項記載の方
    法。 １６ 前記水溶液は細胞膜安定剤および殺菌剤と
    してジメチロール尿素を含有する特許請求の範囲
    第１４項または第１５項記載の方法。 １７ 前記塩酸プロカインの濃度が75〜250mg／
    である特許請求の範囲第１５項または第１６項
    記載の方法。 １８ 前記Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢
    酸の濃度が1.2〜2.0ｇ／である特許請求の範囲
    第１５〜１７項のいずれか一つの項に記載の方
    法。
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