JPH0358269B2 - - Google Patents
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- JPH0358269B2 JPH0358269B2 JP12880485A JP12880485A JPH0358269B2 JP H0358269 B2 JPH0358269 B2 JP H0358269B2 JP 12880485 A JP12880485 A JP 12880485A JP 12880485 A JP12880485 A JP 12880485A JP H0358269 B2 JPH0358269 B2 JP H0358269B2
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規なフエノールオキシダーゼおよび
その製造方法に関するものである。本発明の酵素
はリグニン作用して、これを低分子化または分解
する性質を有するため、木材等のリグノセルロー
ス材料を原料とする紙パルプ製造工程における
種々の工程で利用できる。すなわちパルプ化工
程、パルプ漂白工程、排水処理工程等におけるリ
グニンの低分子化または分解を行わせることに利
用できる。さらに木材の糖化において、糖化の前
段の処理としてリグニンを分解することによつ
て、セルラーゼ作用を高めるといういわゆるセル
ロース系バイオマス利用の分野にも適用できる。 〔従来技術〕 木材等のリグノセルロース物質に白色腐朽菌を
接種、培養することによつてリグニンを分解し、
セルロースパルプを製造する試みがなされている
（特開昭50−46903号公報参照）。しかし、この方
法の白色腐朽菌は共存する炭水化物をも分解して
しまい、またセルラーゼ欠損変異株を用いた場合
には、本来のリグニン分解力が弱まつてしまうこ
と等の問題点があり、実用化されるに至つていな
い。 一方、このような問題点を解決するため、白色
腐朽菌のリグニン分解酵素をリグノセルロース物
質に作用させ、リグニンのみを選択的に分解させ
ようとする試みがなされている（サイエンス第
221巻、第661〜第662頁、1983年12月）。この報告
は、主としてリグニンモデル化合物を基質とした
ものであるが、世界で最初にリグニン分解酵素を
単離、精製したものである。この酵素はフアネロ
ケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete
chrysosporium）が生産する菌体外酵素であり、
主な特徴は鉄含有酵素であること、分子量が
42000であること、酵素作用に過酸化水素が必要
であること、リグニンモデル化合物の４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物に
対して作用することが確認されていること等であ
る。 さらに、フアネロケーテ・クリソスポリウム
（Phanerochaete chrysosporium）が生産する菌
体外酵素としては、２つの酵素が報告されている
（フエデレーシヨン・オブ・ヨーロピアン バイ
オケミカル ソサイエテーズ レターズ 第169
巻、第２号第247〜第250頁、1984年）。これらの
酵素の１つは分子量が41000以下であること、も
う１つの酵素は分子量が46000以下であること、
さらにいずれの酵素も鉄含有酵素であると推定さ
れていること、酵素作用に過酸化水素が必要であ
ること、リグニンモデル化合物の４位のフエノー
ル性水酸基がエトキシル基になつた化合物に対し
て作用することが確認されていること等である。 本発明者は、さきにカワラタケ属の坦子菌が生
産するリグニン分解酵素を発明した。（特願昭59
−212888号）このリグニン分解酵素の主な特徴は
銅含有酵素であること、等電点が3.5付近である
こと、酵素作用に酸素が必要であること、分子量
が約53000±5000〔高速液体クロマトグラフイー
（カラム商品名TSK −3000SW東洋ソーダ製）
による〕であること、リグニンモデル化合物の４
位のフエノール性水酸基がメトキシル基になつた
化合物に対して作用しないこと等であり、前記の
フアネロケーテ・クリソスポリウム
（Phanerochaete chrysosporium）の生産する菌
体外酵素とは全く性質が異なる酵素である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明では白色腐朽菌をリグノセルロース物質
に作用させるときに生ずるリグニンの分解の他に
共存する炭水化物の分解を起こすという問題点を
解決するということを意図するものであり、又、
従来公知のリグニン分解酵素の酵素作用には過酸
化水素が必要であり、工業的適用においてはコス
ト高となる問題点があつたのを解決しようとする
ものである。 本発明の目的は新規なフエノールオキシダーゼ
およびその製造方法を提供することにあり、他の
目的は主としてグリノセルロース物質中のリグニ
ンを低分子化または分解する新規酵素およびその
製造方法を提供することにある。また他の目的は
過酸化水素依存性のない新規酵素およびその製造
方法を提案することである。また別の他の目的は
以下の記載から明らかになるであろう。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は新規なフエノールオキシダーゼおよび
その製造方法に関するものである。 リグニンは木材腐朽菌と呼ばれる坦子菌によつ
て良く分解されることが知られている。しかしな
がら、高分子化合物であるリグニンの化学構造は
複雑であり、現在でもその化学構造が決定されて
いないという障害もあつて、リグニンイ分解酵素
に関する知見は非常に少ないのが実情である。 本発明者らは、摩砕リグニン（MWL）および
リグニンモデル化合物を基質として鋭意研究を行
つた結果、微生物を増殖させ、その培養物から得
た菌体外粗酵素を、硫安分画、ゲル過、イオン
交換体等を使用し、高度に精製して評品を得て、
本発明に到達した。 すなわち、本発明は微生物から生産され、下記
性質を有する新規なフエノールオキシダーゼであ
る。 (1) 作用 () シリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテルに作用して、２，６−ジメトキシ
フエノールを生成する。 () グアイアコールに作用して、420nｍ付近
に最大吸収を有する着色物質を生成する。 (2) 基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
に対しては作用しない。 (3) 至適PHおよびPH安定性 PH4.0〜5.0付近で、グアイアコールを着色物
質に変化させる作用が至適であり、その安定PH
は7.0〜8.0である。 (4) 至適温度および熱安定性 50℃付近でグアイアコールを着色物質に変化
させる作用が至適であり、50℃までの熱に安定
である。 (5) 等電点は３付近である。 (6) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
を呈する。 (7) 本酵素の作用には酵素を必要とする。 (8) 分子量 高速液体クロマトグラフイーにより測定した
分子量は55000±5000である。 次に本酵素の作用機序を確認するために、リグ
ニンモデル化合物としてシリンギルグリセロール
−β−シリンギルエーテル（以下SOSと称する）
を用いて試験を行なつた。 少量のジオキサンを含有する20ｍＭリン酸緩衝
液（PH4.0）にSOSを溶解し、170ｍＭとしたSOS
溶液20mlに実施例１で得た本発明の酵素溶液４ml
を無菌的に加え、25℃で30秒間、８時間反応させ
た。 得られた酵素反応液をTLCガスクロマトグラ
フイー、マススペクトルグラフイーで分析した。 TLC分析 酵素添加後30秒でSOSのスポツトが消滅して
おりSOSは速やかに分解される。 ガスクロマトグラフイーおよびマススペクト
ルグラフイー分析 SOSと本発明酵素を８時間反応させた酵素反応
液をガスクロマトグラフイーにて分析したところ
第１図に示すようなピークが認められ、マススペ
クトルよりピークは２，６−ジメトキシフエノ
ールであることが判明した（第２図）。 以上の結果より、本発明の酵素によりシリンギ
ルグリセロール−β−シリンギルエーテルはβ−
アリルエーテル結合が切断されることが確認され
た。 なおSOSのフエノール性水酸基をメトキシル基
に変えた基質に対しては本発明の酵素は全く作用
を示さない。このことより本発明の酵素はフエノ
ール性水酸基を有する基質に対して特異的に作用
するものと考えられる。 これらの点より、本発明酵素が天然リグニンに
作用する機構は次のように考えられる。 リグニンのフエノール性水酸基を有する骨格に
対して本発明酵素が特異的に作用しβ−アリルエ
ーテル結合を切断する。その結果２，６−ジメト
キシフエノールに相当する構造を有しその４位に
更にリグニン基本骨格が結合したフエノール性水
酸基を有する化合物が生成する。このようにβ−
アリルエーテル結合の切断により新たにフエノー
ル性水酸基が生成するためリグニンは本発明酵素
により引き続き分解を受け反応が進行する。 なお、天然リグニン中ではβ−アリルエーテル
結合が約50％存在することから、本発明酵素がβ
−アリルエーテル結合を切断することは天然リグ
ニンの分解において極めて意義がある。 本発明酵素を主要成分とする実施例１（後出）
で得た精製酵素液をブナ摩砕木粉に35℃で３日間
反応させたところ、リグニン中の遊離フエノール
単位の約65％が分解しており、全芳香核の約15％
が芳香性を失なうような変化（分解）を受け、ア
ルキル−アリルエーテル結合も10％程度開裂して
いた。 本発明酵素は反応に際し、酵素を必要とする
が、反応は大気中より純酸素雰囲気中の方が望ま
しく振とう、撹拌することにより酵素反応速度を
更に高めることができる。 なお、本発明の酵素は特願昭59−212888の酵素
と比べ、以下の表に示すように等電点および分子
量〔高速液体クロマトグラフイー（カラム商品名
TSK −3000SW 東洋ソーダ製）による〕に差
異がある。
その製造方法に関するものである。本発明の酵素
はリグニン作用して、これを低分子化または分解
する性質を有するため、木材等のリグノセルロー
ス材料を原料とする紙パルプ製造工程における
種々の工程で利用できる。すなわちパルプ化工
程、パルプ漂白工程、排水処理工程等におけるリ
グニンの低分子化または分解を行わせることに利
用できる。さらに木材の糖化において、糖化の前
段の処理としてリグニンを分解することによつ
て、セルラーゼ作用を高めるといういわゆるセル
ロース系バイオマス利用の分野にも適用できる。 〔従来技術〕 木材等のリグノセルロース物質に白色腐朽菌を
接種、培養することによつてリグニンを分解し、
セルロースパルプを製造する試みがなされている
（特開昭50−46903号公報参照）。しかし、この方
法の白色腐朽菌は共存する炭水化物をも分解して
しまい、またセルラーゼ欠損変異株を用いた場合
には、本来のリグニン分解力が弱まつてしまうこ
と等の問題点があり、実用化されるに至つていな
い。 一方、このような問題点を解決するため、白色
腐朽菌のリグニン分解酵素をリグノセルロース物
質に作用させ、リグニンのみを選択的に分解させ
ようとする試みがなされている（サイエンス第
221巻、第661〜第662頁、1983年12月）。この報告
は、主としてリグニンモデル化合物を基質とした
ものであるが、世界で最初にリグニン分解酵素を
単離、精製したものである。この酵素はフアネロ
ケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete
chrysosporium）が生産する菌体外酵素であり、
主な特徴は鉄含有酵素であること、分子量が
42000であること、酵素作用に過酸化水素が必要
であること、リグニンモデル化合物の４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物に
対して作用することが確認されていること等であ
る。 さらに、フアネロケーテ・クリソスポリウム
（Phanerochaete chrysosporium）が生産する菌
体外酵素としては、２つの酵素が報告されている
（フエデレーシヨン・オブ・ヨーロピアン バイ
オケミカル ソサイエテーズ レターズ 第169
巻、第２号第247〜第250頁、1984年）。これらの
酵素の１つは分子量が41000以下であること、も
う１つの酵素は分子量が46000以下であること、
さらにいずれの酵素も鉄含有酵素であると推定さ
れていること、酵素作用に過酸化水素が必要であ
ること、リグニンモデル化合物の４位のフエノー
ル性水酸基がエトキシル基になつた化合物に対し
て作用することが確認されていること等である。 本発明者は、さきにカワラタケ属の坦子菌が生
産するリグニン分解酵素を発明した。（特願昭59
−212888号）このリグニン分解酵素の主な特徴は
銅含有酵素であること、等電点が3.5付近である
こと、酵素作用に酸素が必要であること、分子量
が約53000±5000〔高速液体クロマトグラフイー
（カラム商品名TSK −3000SW東洋ソーダ製）
による〕であること、リグニンモデル化合物の４
位のフエノール性水酸基がメトキシル基になつた
化合物に対して作用しないこと等であり、前記の
フアネロケーテ・クリソスポリウム
（Phanerochaete chrysosporium）の生産する菌
体外酵素とは全く性質が異なる酵素である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明では白色腐朽菌をリグノセルロース物質
に作用させるときに生ずるリグニンの分解の他に
共存する炭水化物の分解を起こすという問題点を
解決するということを意図するものであり、又、
従来公知のリグニン分解酵素の酵素作用には過酸
化水素が必要であり、工業的適用においてはコス
ト高となる問題点があつたのを解決しようとする
ものである。 本発明の目的は新規なフエノールオキシダーゼ
およびその製造方法を提供することにあり、他の
目的は主としてグリノセルロース物質中のリグニ
ンを低分子化または分解する新規酵素およびその
製造方法を提供することにある。また他の目的は
過酸化水素依存性のない新規酵素およびその製造
方法を提案することである。また別の他の目的は
以下の記載から明らかになるであろう。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は新規なフエノールオキシダーゼおよび
その製造方法に関するものである。 リグニンは木材腐朽菌と呼ばれる坦子菌によつ
て良く分解されることが知られている。しかしな
がら、高分子化合物であるリグニンの化学構造は
複雑であり、現在でもその化学構造が決定されて
いないという障害もあつて、リグニンイ分解酵素
に関する知見は非常に少ないのが実情である。 本発明者らは、摩砕リグニン（MWL）および
リグニンモデル化合物を基質として鋭意研究を行
つた結果、微生物を増殖させ、その培養物から得
た菌体外粗酵素を、硫安分画、ゲル過、イオン
交換体等を使用し、高度に精製して評品を得て、
本発明に到達した。 すなわち、本発明は微生物から生産され、下記
性質を有する新規なフエノールオキシダーゼであ
る。 (1) 作用 () シリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテルに作用して、２，６−ジメトキシ
フエノールを生成する。 () グアイアコールに作用して、420nｍ付近
に最大吸収を有する着色物質を生成する。 (2) 基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
に対しては作用しない。 (3) 至適PHおよびPH安定性 PH4.0〜5.0付近で、グアイアコールを着色物
質に変化させる作用が至適であり、その安定PH
は7.0〜8.0である。 (4) 至適温度および熱安定性 50℃付近でグアイアコールを着色物質に変化
させる作用が至適であり、50℃までの熱に安定
である。 (5) 等電点は３付近である。 (6) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
を呈する。 (7) 本酵素の作用には酵素を必要とする。 (8) 分子量 高速液体クロマトグラフイーにより測定した
分子量は55000±5000である。 次に本酵素の作用機序を確認するために、リグ
ニンモデル化合物としてシリンギルグリセロール
−β−シリンギルエーテル（以下SOSと称する）
を用いて試験を行なつた。 少量のジオキサンを含有する20ｍＭリン酸緩衝
液（PH4.0）にSOSを溶解し、170ｍＭとしたSOS
溶液20mlに実施例１で得た本発明の酵素溶液４ml
を無菌的に加え、25℃で30秒間、８時間反応させ
た。 得られた酵素反応液をTLCガスクロマトグラ
フイー、マススペクトルグラフイーで分析した。 TLC分析 酵素添加後30秒でSOSのスポツトが消滅して
おりSOSは速やかに分解される。 ガスクロマトグラフイーおよびマススペクト
ルグラフイー分析 SOSと本発明酵素を８時間反応させた酵素反応
液をガスクロマトグラフイーにて分析したところ
第１図に示すようなピークが認められ、マススペ
クトルよりピークは２，６−ジメトキシフエノ
ールであることが判明した（第２図）。 以上の結果より、本発明の酵素によりシリンギ
ルグリセロール−β−シリンギルエーテルはβ−
アリルエーテル結合が切断されることが確認され
た。 なおSOSのフエノール性水酸基をメトキシル基
に変えた基質に対しては本発明の酵素は全く作用
を示さない。このことより本発明の酵素はフエノ
ール性水酸基を有する基質に対して特異的に作用
するものと考えられる。 これらの点より、本発明酵素が天然リグニンに
作用する機構は次のように考えられる。 リグニンのフエノール性水酸基を有する骨格に
対して本発明酵素が特異的に作用しβ−アリルエ
ーテル結合を切断する。その結果２，６−ジメト
キシフエノールに相当する構造を有しその４位に
更にリグニン基本骨格が結合したフエノール性水
酸基を有する化合物が生成する。このようにβ−
アリルエーテル結合の切断により新たにフエノー
ル性水酸基が生成するためリグニンは本発明酵素
により引き続き分解を受け反応が進行する。 なお、天然リグニン中ではβ−アリルエーテル
結合が約50％存在することから、本発明酵素がβ
−アリルエーテル結合を切断することは天然リグ
ニンの分解において極めて意義がある。 本発明酵素を主要成分とする実施例１（後出）
で得た精製酵素液をブナ摩砕木粉に35℃で３日間
反応させたところ、リグニン中の遊離フエノール
単位の約65％が分解しており、全芳香核の約15％
が芳香性を失なうような変化（分解）を受け、ア
ルキル−アリルエーテル結合も10％程度開裂して
いた。 本発明酵素は反応に際し、酵素を必要とする
が、反応は大気中より純酸素雰囲気中の方が望ま
しく振とう、撹拌することにより酵素反応速度を
更に高めることができる。 なお、本発明の酵素は特願昭59−212888の酵素
と比べ、以下の表に示すように等電点および分子
量〔高速液体クロマトグラフイー（カラム商品名
TSK −3000SW 東洋ソーダ製）による〕に差
異がある。
以下本発明を実施例によつて説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。 実施例 １ グルコース３％、ペプトン１％、KH2PO40.15
％、MgSO4・7H2O0.05％、塩酸チアミン0.0002
％、CuSO4・5H2O0.0016％を含有する培地（PH
5.0）５を10容ジヤーフアーメンターに入れ、
120℃、20分間加熱殺菌した後、カワラタケ｛コ
リオラス・ブエルンカラー（Coriolus
Versicolor）FES1030（K.Aoshima；Ps−4a）、
IFO30340｝を接種し28℃、８日間、150rpm（撹
拌速度）。５／分（通気量）の条件下で培養を
行なつた。 培養終了後、遠心分離して得た培養液を0.9
飽和硫安にて塩析後、透析し粗酵素液を得た。 次にこの粗酵素液を限外過にて濃縮した後、
セフアクリルＳ−200を用いたカラムクロマトグ
ラフイーを行ない（カラム：2.4×100cm、溶出
液：50ｍＭトリス−塩酸−100ｍＭ食塩緩衝液PH
7.0、流速：20ml／ｈ、１フラクシヨン：４ml）、
活性画分を回収し、10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）
で緩衝化したDEAEセフアデツクスＡ−25カラム
（カラム：1.5×45cm、流速：10ml／ｈ、１フラク
シヨン：２ml）に通して酵素を吸着せしめた後、
PH6.0のリン酸緩衝液で０〜500ｍＭの食塩のイオ
ン強度勾配を用いて溶出せしめ、精製酵素を得
た。 次に本発明酵素の力価の測定法および性質など
について述べる。 (1) 力価の測定法 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH4.0）を用いて調製し
た１ｍＭグアイアコール溶液3.5mlから成る反
応液に本発明酵素200μを37℃で反応させ吸
光度420nｍにおける吸光度の増加を測定する。 酵素活性は１分間に0.01の吸光度増加を１単
位とする。 (2) 本酵素はシリンギルグリセロール−β−シリ
ンギルエーテルに作用して、２，６−ジメトキ
シフエノール を生成する。 (3) シリンガ酸に作用して、カルボキシル基の脱
離反応が起こり、２，６−ジメトキシ−ｐ−ベ
ンゾキノン、並びにシリンガ酸のフエノール性
水酸基の脱水素反応に伴うラジカルを生成し、
引続きラジカル重合による６−メトキシ−４−
（2′，6′−ジメトキシ−4′−カルボキシフエノキ
シ）ベンゾキノン（１，２）を生成する。 (4) グアイアコールに作用して、420nｍ付近に
最大吸収を有する着色物質を生成する。 (5) シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
に対しては作用しない。 (6) 至適PH 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、50ｍＭリン
酸緩衝液（PH５〜９）、50ｍＭグリシン緩衝液
（PH８〜11）を用いて本発明酵素に対する酵素
活性を測定した結果第３図に示す通りであつて
その至適PHは４〜5.0付近と認められる。 (7) PH安定性 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、50ｍＭリン
酸緩衝液（PH５〜９）50ｍＭグリシン緩衝液
（PH８〜11）中に本発明酵素を50℃で30分間放
置し酵素活性を測定した。 その結果は第４図に示す通りであつてそのPH
安定性はPH７〜８付近である。 (8) 至適温度 温度条件を変えて酵素反応を行ない本発明酵
素の活性を測定した結果、第５図に示す通りで
あつてその至適温度は50℃付近と認められる。 (9) 熱安定性 50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）中、30〜70℃
の各温度で本発明酵素を10分間放置し酵素活性
を測定した。 その結果は第６図に示す通りであつてその熱
安定性において本発明酵素は50℃まで安定であ
る。 (10) 種々の物質の影響 種々の物質を添加して本発明酵素の酵素活性
を測定した結果は次の通りである。なお添加濃
度は１ｍＭである。
明はこれらの実施例に限定されるものではない。 実施例 １ グルコース３％、ペプトン１％、KH2PO40.15
％、MgSO4・7H2O0.05％、塩酸チアミン0.0002
％、CuSO4・5H2O0.0016％を含有する培地（PH
5.0）５を10容ジヤーフアーメンターに入れ、
120℃、20分間加熱殺菌した後、カワラタケ｛コ
リオラス・ブエルンカラー（Coriolus
Versicolor）FES1030（K.Aoshima；Ps−4a）、
IFO30340｝を接種し28℃、８日間、150rpm（撹
拌速度）。５／分（通気量）の条件下で培養を
行なつた。 培養終了後、遠心分離して得た培養液を0.9
飽和硫安にて塩析後、透析し粗酵素液を得た。 次にこの粗酵素液を限外過にて濃縮した後、
セフアクリルＳ−200を用いたカラムクロマトグ
ラフイーを行ない（カラム：2.4×100cm、溶出
液：50ｍＭトリス−塩酸−100ｍＭ食塩緩衝液PH
7.0、流速：20ml／ｈ、１フラクシヨン：４ml）、
活性画分を回収し、10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）
で緩衝化したDEAEセフアデツクスＡ−25カラム
（カラム：1.5×45cm、流速：10ml／ｈ、１フラク
シヨン：２ml）に通して酵素を吸着せしめた後、
PH6.0のリン酸緩衝液で０〜500ｍＭの食塩のイオ
ン強度勾配を用いて溶出せしめ、精製酵素を得
た。 次に本発明酵素の力価の測定法および性質など
について述べる。 (1) 力価の測定法 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH4.0）を用いて調製し
た１ｍＭグアイアコール溶液3.5mlから成る反
応液に本発明酵素200μを37℃で反応させ吸
光度420nｍにおける吸光度の増加を測定する。 酵素活性は１分間に0.01の吸光度増加を１単
位とする。 (2) 本酵素はシリンギルグリセロール−β−シリ
ンギルエーテルに作用して、２，６−ジメトキ
シフエノール を生成する。 (3) シリンガ酸に作用して、カルボキシル基の脱
離反応が起こり、２，６−ジメトキシ−ｐ−ベ
ンゾキノン、並びにシリンガ酸のフエノール性
水酸基の脱水素反応に伴うラジカルを生成し、
引続きラジカル重合による６−メトキシ−４−
（2′，6′−ジメトキシ−4′−カルボキシフエノキ
シ）ベンゾキノン（１，２）を生成する。 (4) グアイアコールに作用して、420nｍ付近に
最大吸収を有する着色物質を生成する。 (5) シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
に対しては作用しない。 (6) 至適PH 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、50ｍＭリン
酸緩衝液（PH５〜９）、50ｍＭグリシン緩衝液
（PH８〜11）を用いて本発明酵素に対する酵素
活性を測定した結果第３図に示す通りであつて
その至適PHは４〜5.0付近と認められる。 (7) PH安定性 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、50ｍＭリン
酸緩衝液（PH５〜９）50ｍＭグリシン緩衝液
（PH８〜11）中に本発明酵素を50℃で30分間放
置し酵素活性を測定した。 その結果は第４図に示す通りであつてそのPH
安定性はPH７〜８付近である。 (8) 至適温度 温度条件を変えて酵素反応を行ない本発明酵
素の活性を測定した結果、第５図に示す通りで
あつてその至適温度は50℃付近と認められる。 (9) 熱安定性 50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）中、30〜70℃
の各温度で本発明酵素を10分間放置し酵素活性
を測定した。 その結果は第６図に示す通りであつてその熱
安定性において本発明酵素は50℃まで安定であ
る。 (10) 種々の物質の影響 種々の物質を添加して本発明酵素の酵素活性
を測定した結果は次の通りである。なお添加濃
度は１ｍＭである。
【表】
(11) 分子量
() 約55000±5000〔高速液体クロマトグラフ
イー（カラムTSK 3000SW東洋ソーダ製）
にて測定 () 約63000±5000〔SDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法（分子量マーカー；LKB社製、
分子量範囲12300〜78000）にて測定〕 () 約62000±10000〔セフアクリルＳ−200
（フマルマシア社製）によるゲル過法にて
測定〕 (12) 等電点は３付近である（セルバライトを用
いる電気泳動法により測定） (13) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青
色を呈する。 (14) 本酵素の作用には酸素を必要とする。 (15) アミノ酸組成 一定量の酵素（約５mg）を6Nの塩酸２mlに
溶かし、真空の封管中で24時間110℃で加熱し
て酵素を加水分解したのち、高速アミノ酸分析
形（日立製作所製、835型）を用いて分析した。
結果は次の通りである。
イー（カラムTSK 3000SW東洋ソーダ製）
にて測定 () 約63000±5000〔SDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法（分子量マーカー；LKB社製、
分子量範囲12300〜78000）にて測定〕 () 約62000±10000〔セフアクリルＳ−200
（フマルマシア社製）によるゲル過法にて
測定〕 (12) 等電点は３付近である（セルバライトを用
いる電気泳動法により測定） (13) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青
色を呈する。 (14) 本酵素の作用には酸素を必要とする。 (15) アミノ酸組成 一定量の酵素（約５mg）を6Nの塩酸２mlに
溶かし、真空の封管中で24時間110℃で加熱し
て酵素を加水分解したのち、高速アミノ酸分析
形（日立製作所製、835型）を用いて分析した。
結果は次の通りである。
第１図は酵素反応液のガスクロマトグラム、第
２図はピークと既存標品のマススペクトルであ
り、第３図は至適PH、第４図はPH安定性、第５図
は至適温度、第６図は熱安定性を示すグラフであ
る。
２図はピークと既存標品のマススペクトルであ
り、第３図は至適PH、第４図はPH安定性、第５図
は至適温度、第６図は熱安定性を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 微生物から生産され、下記性質を有するフエ
ノールオキシダーゼ (1) 作用 () シリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテルに作用して、２，６−ジメトキシ
フエノールを生成する。 () グアイアコールに作用して、420nｍ付近
に最大吸収を有する着色物質を生成する。 (2) 基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
に対しては作用しない。 (3) 至適PHおよびPH安定性 PH4.0〜5.0付近で、グアイアコールを着色物
質に変化させる作用が至適であり、その安定PH
は7.0〜8.0である。 (4) 至適温度および熱安定性 50℃付近でグアイアコールを着色物質に変化
させる作用が至適であり、50℃までの熱に安定
である。 (5) 等電点は３付近である。 (6) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
を呈する。 (7) 本酵素の作用には酵素を必要とする。 (8) 分子量 高速液体クロマトグラフイーにより測定した
分子量は55000±5000である。 ２ カワラタケ属に属するフエノールオキシダー
ゼ生産菌を培地に培養し、培養物から下記の性質
を有するフエノールオキシダーゼを採取すること
を特徴とするフエノールオキシダーゼの製造方
法。 (1) 作用 () シリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテルに作用して、２，６−ジメトキシ
フエノールを生成する。 () グアイアコールに作用して、420nｍ付近
に最大吸収を有する着色物質を生成する。 (2) 基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
に対しては作用しない。 (3) 至適PHおよびPH安定性 PH4.0〜5.0付近で、グアイアコールを着色物
質に変化させる作用が至適であり、その安定PH
は7.0〜8.0である。 (4) 至適温度および熱安定性 50℃付近でグアイアコールを着色物質に変化
させる作用が至適であり、50℃までの熱に安定
である。 (5) 等電点は３付近である。 (6) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
を呈する。 (7) 本酵素の作用には酵素を必要とする。 (8) 分子量 高速液体クロマトグラフイーにより測定した
分子量は55000±5000である。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12880485A JPS61285989A (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | フエノ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12880485A JPS61285989A (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | フエノ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61285989A JPS61285989A (ja) | 1986-12-16 |
| JPH0358269B2 true JPH0358269B2 (ja) | 1991-09-04 |
Family
ID=14993834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12880485A Granted JPS61285989A (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | フエノ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61285989A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0685717B2 (ja) * | 1988-06-16 | 1994-11-02 | 新王子製紙株式会社 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（▲ｉｉ▼） |
| CA2012025C (en) * | 1989-03-14 | 1999-09-07 | Yukiko Tsukuda | Dna for expression and secretion |
| JP4682982B2 (ja) * | 2004-08-12 | 2011-05-11 | 王子製紙株式会社 | リグノセルロース材料からの繊維成分の製造およびその利用 |
-
1985
- 1985-06-13 JP JP12880485A patent/JPS61285989A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61285989A (ja) | 1986-12-16 |
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