JPH0440987B2 - - Google Patents
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- JPH0440987B2 JPH0440987B2 JP58075587A JP7558783A JPH0440987B2 JP H0440987 B2 JPH0440987 B2 JP H0440987B2 JP 58075587 A JP58075587 A JP 58075587A JP 7558783 A JP7558783 A JP 7558783A JP H0440987 B2 JPH0440987 B2 JP H0440987B2
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- Japan
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- enzyme
- bilirubin
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- oxidase
- bilirubin oxidase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
- C12Y103/03005—Bilirubin oxidase (1.3.3.5)
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼの製造法に
関する。さらに詳しくは本発明はコプリナス属，
トラメテス属，コリオラス属，フオリオタ属，プ
ロイロタス属，レンヂテス属又は、フミトプシス
属に属し、ビリルビンオキシダーゼを生産する能
力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にビ
リルビンオキシダーゼを生成蓄積せしめ、該培養
物から該酵素を採取することを特徴とするビニル
ビンオキシダーゼの製造法に関する。 ビリルビンオキシダーゼは血清中のビリルビン
の定量，脱色，及び生化学分析に於けるビリルビ
ンによる干渉作用の除去等を目的として臨床化学
の分野で注目されている酵素である。 従来、微生物を用いるビリルビンオキシダーゼ
の製法としては、アグリカス属に属する微生物を
用いる方法（特開昭54−151193号公報），ミロセ
シウム属に属する微生物を用いる方法（特開昭57
−159487号公報）及び、その酵素的性質が報告さ
れている〔N.Tanaka and S.Murao，Agric.
Biol.Chem.，46，2499−2503（1982）〕。ビニルビ
ンオキシダーゼの製造法について、種々検討した
結果、広範囲の担子菌がビニルビンオキシダーゼ
を生産することが見い出された。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明に使用される微生物としては、コプリナ
ス属，トラメテス属，コリオラス属，フオリオタ
属，プロイロタス属，レンヂテス属又は、フミト
プシス属に属し、ビリルビンオキシダーゼを生産
する能力を有するものであればいずれの菌株でも
よい。 好適な菌株の例としては、コプリナス・シネレ
ウスHU8301（NRRL 15399），コプリナス・ミカ
セウスHU8302（NRRL 15400），トラメテス・ヒ
ルサタHU8311（NRRL 15401），トラメテス・ベ
ルシコラーHU8312（NRRL15402），コリオラ
ス・コンソルスHU8313（NRRL15403），フオリ
オタ・ナメコHU8321（NRRL15404），プロイロ
タス・オステアタスHU8331（NRRL15405），レ
ンヂテス・ステラシナHU8341（NRRL15406），
フミトプシス・カスタネアHU8351
（NRRL15407）等があげられる。これらの微生
物の菌学的性質は、今関六也，本郷次雄 共著
「原色日本菌類図鑑」保育社，1965年版に記載さ
れている。 本発明で使用する培地としては、炭素源，無機
物その他栄養を程よく含有すれば、合成培地，天
然培地のいずれも使用可能である。炭素源として
は、グルコース，シユークロース，廃糖蜜などの
糖類、グリセロール，ソルビトール，マンニトー
ル等の糖アルコール類が使用できる。窒素源とし
ては、アンモニア水，塩化アンモニウム，硫酸ア
ンモニウム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウ
ム，燐酸アンモニウム等の各種無機及び有機のア
ンモニウム化合物，尿素などの窒素化合物、ペプ
トン，酵母エキス，カゼイン加水分解物，脱脂大
豆あるいはその消化物等の窒素性有機物質等が使
用できる。無機物としては、ナトリウム，カリウ
ム，マンガン，マグネシウム，カルシウム，銅等
の金属の塩類や燐酸，硫酸，硝酸，塩酸等の塩類
が使用できる。 培養温度は、通常20〜40℃の範囲で、好適には
25〜30℃の範囲で行なわれる。培養開始時のPHは
通常5.5〜7.5の範囲で、好適には６附近で行われ
る。この様な条件下で４〜６日間振とう培養もし
くは深部撹拌培養すれば培養物中にビリルビンオ
キシダーゼが著量生成する。 培養終了後、該培養物より本酵素を採取するに
は通常の酵素採取手段を用いて得ることができ
る。なお、本酵素は菌体内及び培養濾液の両方に
存在するが、量的には培養濾液の方が多いので、
通常は、該培養物より菌体を分別除去した培養濾
液より得る。こうして得られた粗酵素液を精製す
るには次のごとき方法が行われる。粗酵素液に80
％飽和まで硫酸アンモニウムを加え４℃で一晩放
置後、濾過助剤を加えて沈殿区分を集める。
0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）で十分透析後、透析
内液を遠心分離し、上清液を得る。これをDEAE
−セルロース，QAE−セフアデツクス等を用い
るイオン交換クロマトグラフイー法やセフアデツ
クスＧ−200，セフアロース6B等を用いるゲル濾
過法、及びハイドロキシアパタイトを用いる吸着
溶出法などを組合わせて実施することにより高度
に精製された本酵素標品を得ることができる。 次に上記精製手段により得られた本酵素の理化
学的性質を以下に記載する。 １ 作用及び基質特異性 本酵素は、分子状酸素の存在下、ビリルビンを
酸化分解する。第１図に本酵素を作用させた時
の、可視部に於けるビリルビンの吸収の経時的減
少を示す。その際、過酸化水素は発生せず水を生
成する。またビリルベンジンをも酸化するが、酸
化速度はビリルビンの場合に比べ遅い。第２図に
ビリルビン及びビリベンジルを基質とした時の反
応初期の酵素消費量を示す。 ２ 至適PH，安定PH範囲 本酵素の至適PHは菌によつて多少異なるが、６
から９付近にある。また37℃，60分処理でPH５か
らPH11まで安定である。 ３ 至適温度，安定温度範囲 本酵素の至適温度は、50℃から60℃にあり、
0.1M TES緩衝液（PH8.0）で60℃15分処理でも
90〜95％の残存活性を示す。 ４ 分子量 セフアデツクスＧ−100を用いたゲル濾過法に
より測定した本酵素の分子量は44000であつた。 ５ 等電点 焦点電気泳動法により本酵素の等電点を測定し
た結果、3.98であつた。 ６ 吸収スペクトル 精製酵素は、280nm及び600nmに極大吸収を示
し、銅蛋白であることが明らかになつた（第３
図）。 本酵素活性の測定は次の如く行う。 0.01％ビリルビン溶液0.5mlに0.1M TES緩衝液
（PH7.0）0.5ml，H2O1.9ml及び本酵素液0.1mlを加
え、37℃で５分間、振とうして反応させる。反応
液中のビリルビンの440nmにおける吸光度の減少
を測定することにより酵素活性を求めた。酵素単
位は、ビリルビンの分子吸光係数56.3を用いて、
37℃で１分間に1μmolのビリルビンを酸化させる
量を１単位とした。 又、酵素蛋白量は銅−フオーリン（Folin）試
薬を用いるロウリイ（Lowry）の方法〔O.H.
Lowry，N.J.Rosebrough，A.L.Fav and R.J.
Randall，J.Biol.Chem，193，265（1951）〕によ
つて測定した。 以下に実施例を示す。 実施例 １ コプリナス・シネレウスHU8301をグルコース
３％，シユークロース２％，大豆蛋白粉1.5％，
CSL（corn steep liquor）0.5％，K2HPO4 0.1
％，MgSO4・7H2O0.05％，FeCl3・6H2O 10
mg／，ビタミンB2 ２mg／の組成（PH6.5）を
有する培地0.3を含む２容ひだ付三角フラス
コ３本に接種し、28℃４日振とう培養し、得られ
た種培養物をあらかじめ30容量のジヤーフアー
メンターに殺菌した上記培地15中に接種する。
28℃で４日間，通気量15／分，撹拌250rpmで
培養する。培養後、ブフナー漏斗を用いて菌体を
除去し、培養濾液10.5（2.35単位／ml）を得
る。得られた粗酵素液の硫酸アンモニウム０〜80
％飽和沈殿区分を0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）に
溶解し、透析膜としてセルロースチユーブを使
い、同緩衝液で一晩透析する。次いで本透析液に
生じた沈殿を遠心分離法により除去する。得られ
た上清液に硫酸アンモニウムを加え、50〜70％飽
和で沈殿する区分を上記緩衝液で十分透析後、
0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）で平衝化した、DEAE
−セルロース（Serva社製，西独）のカラム（5.5
×40cm）に通す。 同緩衝液で吸着されない不純蛋白を洗浄した後
に、0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）１と0.2M
NaClを含む同緩衝液１とを用いて、濃度勾配
法で溶出すると、ビリルビンオキシダーゼが溶出
される。この活性区分を合わせ硫酸アンモニウム
が70％飽和になるように添加し、酵素を沈殿させ
る。次に生ずる沈殿を遠心分離（20000×ｇ，20
分）で集め、0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）５mlに
溶解する。これを0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）で
平衡化しておいた。セフアデツクスＧ−100
（Pharmacia Fine Chemicals社製，スウエーデ
ン）のカラム（5.5×80cm）に通す。0.01M燐酸
緩衝液（PH7.0）１を流し、活性区分を集め、
硫酸アンモニウム70％飽和まで添加し、酵素を沈
殿させる。次に沈殿を遠心分離（20000×ｇ，20
分）で集め、0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）10mlで
溶解し、同緩衝液５で24時間透析する。透析終
了後、凍結乾燥し、ビリルビンオキシダーゼの粉
末精製標品24mgを得る。 実施例 ２ 実施例１において、コプリナス・シネレウス
HU8301の代わりにトラメテス・ヒルサタ
HU8311を用いる以外は実施例１と同様に培養
し、15の培地よりビリルビンオキシダーゼ活性
0.24単位／mlを含む培養液10.2を得る。このも
のをさらに実施例１と同様に精製し、粉末精製標
品13mgを得る。 実施例 ３ 実施例１において、コプリナス・シネレウス
HU8301の代わりに第１表の菌株を用いる以外は
実施例１と同様に実施して第１表の結果をうる。 【表】
関する。さらに詳しくは本発明はコプリナス属，
トラメテス属，コリオラス属，フオリオタ属，プ
ロイロタス属，レンヂテス属又は、フミトプシス
属に属し、ビリルビンオキシダーゼを生産する能
力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にビ
リルビンオキシダーゼを生成蓄積せしめ、該培養
物から該酵素を採取することを特徴とするビニル
ビンオキシダーゼの製造法に関する。 ビリルビンオキシダーゼは血清中のビリルビン
の定量，脱色，及び生化学分析に於けるビリルビ
ンによる干渉作用の除去等を目的として臨床化学
の分野で注目されている酵素である。 従来、微生物を用いるビリルビンオキシダーゼ
の製法としては、アグリカス属に属する微生物を
用いる方法（特開昭54−151193号公報），ミロセ
シウム属に属する微生物を用いる方法（特開昭57
−159487号公報）及び、その酵素的性質が報告さ
れている〔N.Tanaka and S.Murao，Agric.
Biol.Chem.，46，2499−2503（1982）〕。ビニルビ
ンオキシダーゼの製造法について、種々検討した
結果、広範囲の担子菌がビニルビンオキシダーゼ
を生産することが見い出された。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明に使用される微生物としては、コプリナ
ス属，トラメテス属，コリオラス属，フオリオタ
属，プロイロタス属，レンヂテス属又は、フミト
プシス属に属し、ビリルビンオキシダーゼを生産
する能力を有するものであればいずれの菌株でも
よい。 好適な菌株の例としては、コプリナス・シネレ
ウスHU8301（NRRL 15399），コプリナス・ミカ
セウスHU8302（NRRL 15400），トラメテス・ヒ
ルサタHU8311（NRRL 15401），トラメテス・ベ
ルシコラーHU8312（NRRL15402），コリオラ
ス・コンソルスHU8313（NRRL15403），フオリ
オタ・ナメコHU8321（NRRL15404），プロイロ
タス・オステアタスHU8331（NRRL15405），レ
ンヂテス・ステラシナHU8341（NRRL15406），
フミトプシス・カスタネアHU8351
（NRRL15407）等があげられる。これらの微生
物の菌学的性質は、今関六也，本郷次雄 共著
「原色日本菌類図鑑」保育社，1965年版に記載さ
れている。 本発明で使用する培地としては、炭素源，無機
物その他栄養を程よく含有すれば、合成培地，天
然培地のいずれも使用可能である。炭素源として
は、グルコース，シユークロース，廃糖蜜などの
糖類、グリセロール，ソルビトール，マンニトー
ル等の糖アルコール類が使用できる。窒素源とし
ては、アンモニア水，塩化アンモニウム，硫酸ア
ンモニウム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウ
ム，燐酸アンモニウム等の各種無機及び有機のア
ンモニウム化合物，尿素などの窒素化合物、ペプ
トン，酵母エキス，カゼイン加水分解物，脱脂大
豆あるいはその消化物等の窒素性有機物質等が使
用できる。無機物としては、ナトリウム，カリウ
ム，マンガン，マグネシウム，カルシウム，銅等
の金属の塩類や燐酸，硫酸，硝酸，塩酸等の塩類
が使用できる。 培養温度は、通常20〜40℃の範囲で、好適には
25〜30℃の範囲で行なわれる。培養開始時のPHは
通常5.5〜7.5の範囲で、好適には６附近で行われ
る。この様な条件下で４〜６日間振とう培養もし
くは深部撹拌培養すれば培養物中にビリルビンオ
キシダーゼが著量生成する。 培養終了後、該培養物より本酵素を採取するに
は通常の酵素採取手段を用いて得ることができ
る。なお、本酵素は菌体内及び培養濾液の両方に
存在するが、量的には培養濾液の方が多いので、
通常は、該培養物より菌体を分別除去した培養濾
液より得る。こうして得られた粗酵素液を精製す
るには次のごとき方法が行われる。粗酵素液に80
％飽和まで硫酸アンモニウムを加え４℃で一晩放
置後、濾過助剤を加えて沈殿区分を集める。
0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）で十分透析後、透析
内液を遠心分離し、上清液を得る。これをDEAE
−セルロース，QAE−セフアデツクス等を用い
るイオン交換クロマトグラフイー法やセフアデツ
クスＧ−200，セフアロース6B等を用いるゲル濾
過法、及びハイドロキシアパタイトを用いる吸着
溶出法などを組合わせて実施することにより高度
に精製された本酵素標品を得ることができる。 次に上記精製手段により得られた本酵素の理化
学的性質を以下に記載する。 １ 作用及び基質特異性 本酵素は、分子状酸素の存在下、ビリルビンを
酸化分解する。第１図に本酵素を作用させた時
の、可視部に於けるビリルビンの吸収の経時的減
少を示す。その際、過酸化水素は発生せず水を生
成する。またビリルベンジンをも酸化するが、酸
化速度はビリルビンの場合に比べ遅い。第２図に
ビリルビン及びビリベンジルを基質とした時の反
応初期の酵素消費量を示す。 ２ 至適PH，安定PH範囲 本酵素の至適PHは菌によつて多少異なるが、６
から９付近にある。また37℃，60分処理でPH５か
らPH11まで安定である。 ３ 至適温度，安定温度範囲 本酵素の至適温度は、50℃から60℃にあり、
0.1M TES緩衝液（PH8.0）で60℃15分処理でも
90〜95％の残存活性を示す。 ４ 分子量 セフアデツクスＧ−100を用いたゲル濾過法に
より測定した本酵素の分子量は44000であつた。 ５ 等電点 焦点電気泳動法により本酵素の等電点を測定し
た結果、3.98であつた。 ６ 吸収スペクトル 精製酵素は、280nm及び600nmに極大吸収を示
し、銅蛋白であることが明らかになつた（第３
図）。 本酵素活性の測定は次の如く行う。 0.01％ビリルビン溶液0.5mlに0.1M TES緩衝液
（PH7.0）0.5ml，H2O1.9ml及び本酵素液0.1mlを加
え、37℃で５分間、振とうして反応させる。反応
液中のビリルビンの440nmにおける吸光度の減少
を測定することにより酵素活性を求めた。酵素単
位は、ビリルビンの分子吸光係数56.3を用いて、
37℃で１分間に1μmolのビリルビンを酸化させる
量を１単位とした。 又、酵素蛋白量は銅−フオーリン（Folin）試
薬を用いるロウリイ（Lowry）の方法〔O.H.
Lowry，N.J.Rosebrough，A.L.Fav and R.J.
Randall，J.Biol.Chem，193，265（1951）〕によ
つて測定した。 以下に実施例を示す。 実施例 １ コプリナス・シネレウスHU8301をグルコース
３％，シユークロース２％，大豆蛋白粉1.5％，
CSL（corn steep liquor）0.5％，K2HPO4 0.1
％，MgSO4・7H2O0.05％，FeCl3・6H2O 10
mg／，ビタミンB2 ２mg／の組成（PH6.5）を
有する培地0.3を含む２容ひだ付三角フラス
コ３本に接種し、28℃４日振とう培養し、得られ
た種培養物をあらかじめ30容量のジヤーフアー
メンターに殺菌した上記培地15中に接種する。
28℃で４日間，通気量15／分，撹拌250rpmで
培養する。培養後、ブフナー漏斗を用いて菌体を
除去し、培養濾液10.5（2.35単位／ml）を得
る。得られた粗酵素液の硫酸アンモニウム０〜80
％飽和沈殿区分を0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）に
溶解し、透析膜としてセルロースチユーブを使
い、同緩衝液で一晩透析する。次いで本透析液に
生じた沈殿を遠心分離法により除去する。得られ
た上清液に硫酸アンモニウムを加え、50〜70％飽
和で沈殿する区分を上記緩衝液で十分透析後、
0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）で平衝化した、DEAE
−セルロース（Serva社製，西独）のカラム（5.5
×40cm）に通す。 同緩衝液で吸着されない不純蛋白を洗浄した後
に、0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）１と0.2M
NaClを含む同緩衝液１とを用いて、濃度勾配
法で溶出すると、ビリルビンオキシダーゼが溶出
される。この活性区分を合わせ硫酸アンモニウム
が70％飽和になるように添加し、酵素を沈殿させ
る。次に生ずる沈殿を遠心分離（20000×ｇ，20
分）で集め、0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）５mlに
溶解する。これを0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）で
平衡化しておいた。セフアデツクスＧ−100
（Pharmacia Fine Chemicals社製，スウエーデ
ン）のカラム（5.5×80cm）に通す。0.01M燐酸
緩衝液（PH7.0）１を流し、活性区分を集め、
硫酸アンモニウム70％飽和まで添加し、酵素を沈
殿させる。次に沈殿を遠心分離（20000×ｇ，20
分）で集め、0.01M燐酸緩衝液（PH7.0）10mlで
溶解し、同緩衝液５で24時間透析する。透析終
了後、凍結乾燥し、ビリルビンオキシダーゼの粉
末精製標品24mgを得る。 実施例 ２ 実施例１において、コプリナス・シネレウス
HU8301の代わりにトラメテス・ヒルサタ
HU8311を用いる以外は実施例１と同様に培養
し、15の培地よりビリルビンオキシダーゼ活性
0.24単位／mlを含む培養液10.2を得る。このも
のをさらに実施例１と同様に精製し、粉末精製標
品13mgを得る。 実施例 ３ 実施例１において、コプリナス・シネレウス
HU8301の代わりに第１表の菌株を用いる以外は
実施例１と同様に実施して第１表の結果をうる。 【表】
第１図は本酵素をビリルビンに作用した時のビ
リルビンの吸収の経時的減少を示す。第２図はビ
リルビン及びビリベルジンを基質とした時の本酵
素の酸素吸収量を示す。Γ――Γ ： ビリルビ
ン、●――● ： ビリベルジン、第３図は本酵
素の吸収スペクトルを示す。
リルビンの吸収の経時的減少を示す。第２図はビ
リルビン及びビリベルジンを基質とした時の本酵
素の酸素吸収量を示す。Γ――Γ ： ビリルビ
ン、●――● ： ビリベルジン、第３図は本酵
素の吸収スペクトルを示す。
Claims (1)
- １ コプリナス属，トラメテス属，コリオラス
属，フオリオタ属，プロイロタス属，レンヂテス
属又は、フミトプシス属に属し、ビリルビンオキ
シダーゼを生産する能力を有する微生物を培地に
培養し、培養物中にビリルビンオキシダーゼを生
成蓄積せしめ、該培養物から該酵素を採取するこ
とを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58075587A JPS59198971A (ja) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | ビリルビンオキシダ−ゼの製造法 |
| DE8484901804T DE3479519D1 (en) | 1983-04-28 | 1984-04-27 | Process for preparing bilirubin oxidase |
| US06/885,391 US4677062A (en) | 1983-04-28 | 1984-04-27 | Process for producing bilirubin oxidase |
| PCT/JP1984/000223 WO1984004328A1 (fr) | 1983-04-28 | 1984-04-27 | Procede de preparation d'oxydase de bilirubine |
| EP84901804A EP0148950B1 (en) | 1983-04-28 | 1984-04-27 | Process for preparing bilirubin oxidase |
Applications Claiming Priority (1)
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