JPH0358793A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は新規生理活性ポリペブチド，該ポリペブチドを
］一ドするＤＮＡ領域を含む組換えブラスミド，該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプヂドの製造方
法に関する。更に詳＝１　１　− しくは、抗ｌｌｌｔｉ瘍活性を右ずる新規ポリベブヂド
（以下、新規抗肘瘍活竹ボリペブチドと略り−こともあ
る），該ポリペブチドをコードするＤＮＡ領域を含む組
換えプラスミド，該ゾラスミドによ・〕て形質転換され
た組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新規抗腫
瘍活性ポリペプブドの！Ｆ８Ｉ造方法及び医薬組成物に
関する、， 本明細害に４３いて、アミノ酸，ポリペゾヂド（まＩＵ
ＰＡＣ−Ｉ一Ｂ生化学委員会（　Ｃ　Ｂ　Ｎ　）で採用
された方法により略記づ−るものどじ、たとえばＦ記の
略０を用いる。

Ａｌａｌ−アノニン Ａｒ（Ｉｌ−−アルギニン Ａ　ｓｎ　　ｌ．−−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 ＣＶＳ　　ｌ−−システイン Ｇｌｎｌ−グルタミン ｃｄｕｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン Ｈ＋ｓｌ−−ヒスヂジン １　つ 丁１ｅ　　ｌ−−−イソロイシン ｌｅｕｌ−一ロイシン ｌｙｓｌ−−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メヂオニン ｐｈｅ　　ｌ．．−−フエニルアラニンｐｒｏＬ−プロ
リン ３ｅｒｌ−−セリン ｉｈｒｌ．−スレＡニン １−ｒｐ　　Ｌ．．−．−ｌ〜リブ１〜ファン１−ｙｒ
　　ｌ−−ヂロシン Ｖａ１　］−−バリン また、ＤＮ八の配列はそれを構或する各デＡキシリボメ
クレオヂドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアア゛ニル酸を示づ。）Ｃ　シ
１−シン（デＡキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン
（デオキシグアニル酸を示づ−。）Ｔ　ヂミン　（デオ
キシヂミジル酸を示す。）さらに、（ｔ−１２Ｎ）−及
び−　（ＣＯＯＩ＋＞はそれぞれアミノ酸配列のアミノ
末端側及びカルボギシ末端側を示すものであり、（５′
　）一及び（３′　〉はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端
側及び３′末端側を示すものである。

〈発明の背崇〉 ＣａｒＳＷｅｌｌ　らは、Ｂ　ａｃｉ　ｌ　ＩＩｓ　　
Ｃ　ａｌｍｅｔｔｅＧ　ｕｅｒｉｎ　　（　Ｂ　Ｃ　Ｇ
　）などで前もっで刺激をう【プたマウスにエンド１〜
ギシンを投！ゴした後に採取した血清中に、移植したＭ
　ｅｔｈ八肉胛による痛を出血壊死させる物質が含まれ
−（いることを見出し、この物質を腫瘍壊死因子（　Ｔ
　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｃｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ，以下
ＴＮＦと略記することちある）ど名づけだ［Ｅ．　Ａ．
　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら，　Ｐ　ｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａ
　ｃａｄ．ｓ　ｃｉ．．りＳ　Ａ　，　７２．　３６６
６　（１９７５）　］　。この１゛Ｎ「はマウス，ウザ
ニ１゛，じ１〜′８−多くの動物中に見られ、腫瘍細胞
に特異的に、しかも種を越えて働くことから、制癌剤と
しての利用が期持ざれＣき　ｌこ　。

最近になって、Ｐｅｎｎｉｃａらは、ヒｌ−　Ｔ　Ｎ　
ｌ二のＣＤ　Ｎ　Ａク目一ニングを行ない、ヒｌ−　１
−　Ｎ　Ｆ蛋白質の−次構造を明らかに１−ると共に、
大腸菌におけるヒトＴＮＦ遺伝子の発現について報告し
た［　Ｄ　，　　ｐ　ｅｎｎｉｃａら，　　Ｎａｔｕｒ
ｅ　，　　３１２，　　７２４（１９８４）　］　。そ
の後、白井ら［　Ｔ　，　３　ｈｉｒａｉ　ら，Ｎ　ａ
ｔｕｒｅ　，　　３１３，　　８０３　（１９８５）コ
、宗村ら［宗村ら，癌と化学療法，　１２，　　１６０
（１９８５）　］　、Ｗａｎｇら［Δ．　Ｍ．　Ｗａｎ
！Ｉｔら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　　２２８，　　１４９
（１９８５）　　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［　Ａ
　．　　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら，Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，，　１５２，　　５１５（１９８５）　
］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌における発現について
相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［　［３　，　Ｂｅｕ
ｌｔｅｒら，　Ｎａｔｕｒｅ　，３１６，　　５５２（
１９８５）　］　、カケクヂンがリボプロテイン・リパ
ーゼ阻害活性を有することから、ＴＮＦの投与により血
中のトリグリセリド量が増大し、１　５ー その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［Ｊ．Ｒ．Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ．　
ＥＸｐ．　Ｍｅｄ，　，　　１６２．　２１６３（１９
８５）　］　，骨吸収作用［Ｄ．　Ｒ，　Ｂｅｌｔｏｌ
ｉｎｉら、Ｎ　ａｔｕｒｅ　，　　３１９，　　５１６
　（　１９８６）　］等が報告されている。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く威されている。

ヒ１〜ＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が
成されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ
酸配列において、Ｃ　ｖ　ｓ　′Ｆ及びＣｙ　ｓ　／Ｊ
／のいずれか又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残
基への置換（ＰＣＴ出願公開Ｗ０８６／　０４６０６号
，特願昭６１−１０６７７２）　、Ｇ　ＩＶ／Ｌ１の他
のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号
，特願昭６１１　６ ２３８０４８号）　，　Ａ　１８１８の他のアミノ酸残
基への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告され
ている。また、アミン末端側のアミノ酸残基の欠失につ
いても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有して
いること（特開昭６１−５０９２３号〉、７アミノ酸欠
失ＴＮ「が細胞障害活性を有していること（特願昭６１
９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失
ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ８
６／　０２３８１号〉、１０アミノ酸欠失ＴＮ「が細胞
障害活性を有していること（特願昭６１１１４７５４号
）、及び１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有し
ていること（特願昭６１−１７３８２２号）が報告され
ている。

そこで、本発明者らは比活性の向上，安定性の向上，反
応スペクトルの広域化，副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完或するに至った。

〈発明の目的〉 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペブチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

く発明の構或〉 本発明は、次のアミノ酸配列 （口２　Ｎ）　　　ＡＳｆｌ　　Ａｓｐ　　ＡＳＩ）　
　ＬＶＳＰ　ｒｏ−Ｖ　ａｌ　−　Ａ　ｌａ−口ｉＳ−
Ｖ　ａｌ−Ｖａｌ　−　Ａ　ｌａＡ　ｓｎ　−　Ｐ　ｒ
ｏ　−　Ｇ　Ｉｎ　−　Ａ　ｌａ　−　Ｇ　ｌｕ−Ｇ　
ＩＶ−Ｇ　ＩｎＬｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−ΔｒｇＡｌａ−ＡＳｎ−八ｌａ　−　Ｌ　
ｅｕ　−　Ｌ　ｅｕ　−　Ａ　ｌａ　−　Ａ　ｓｎＧ　
ＩＶ−Ｖ　ａｔ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ　−　Ａ　ｒ（］
　−　Ａ　Ｓｐ−Ａ　ＳｎＱ　Ｉｎ−１　ｅｕ　−　Ｖ
ａｔ−Ｖａｌ−Ｐ　ｒｏ　−　Ｓｅｒ　−　Ｇ　ｌｕ　
一Ｑ　ｌｙ　−　Ｌ　ｅｕ　−　Ｔｙｒ　−　１　ｅｕ
　−　１　ｌｅ−Ｔｙｒ　−　３ｅｒＧ１ｎ−Ｖａ１−
１−ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ１ｙ−　Ｇ１ｎＧ　ＩＶ
−　Ｃ　ＶＳ−Ｐ　ｒｏ　−　Ｓ　ｅｐ−　Ｔ　ｈｒ一
目ｉｓ−ＶａＬ　ｅｕ　−　Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ｔ｛　ｉ
ｓ−Ｔｈｒ−１　ｌｅ−ＳｅｒＡｒｇ　　Ｉｌｅ　　Ａ
ｌａ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ１−ｈｒ−Ｉ　
ＶＳ−Ｖａｔ−Ａｓｎ　−　ｌ．−，ｅｕ　−　１ｅｕ
−ＳｅｒＡｌａ−　■　ｌｅ−１　　ｙｓ−Ｓｅｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｃｙｓ−ＱｌｎＡｒ（＋−Ｇｌｃ＋−Ｔ”ｈｒ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｌａＧ　ｌｕ　−　Ａ　ｌ
ａ−Ｌ　ｖｓ−　Ｐ　ｒｏ−　Ｔ　ｒｐ　−　Ｔ　ｙｒ
−Ｇ　ｌｕＰｒｏ　−　Ｔ　ｌｅ　−　Ｔｙｒ　一Ｌ　
ｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ＩＶ　−　Ｖａｐｉ１ｅ−Ｑｌｎ
−ｌｅｕ−Ｑｌｕ−１．．．．ｌｓ−ＧＩＶ−Ａｓｌ）
Ａ　ｒｇ　−　１　ｅｕ　−　Ｓ　ｅｒ−八ｌａ　＝Ｇ
　ｌｕ　−　１　ｌｅ　−　Ａ　ｓｎＡ　ｒｇ−　Ｐ　
ｒｏ−　Ａ　ｓｐ−　Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐ−　
Ｐ　ｈｅＡ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−　Ｓ　ｅｒ−　Ｇ　１ｙ
−Ｇ　ｌｎ−　Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒＰｈｅ−Ｇｌｙ−１
ｌｅ−１ｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（　Ｃ　Ｏ　Ｏ　Ｈ　） で表わされる新規生理活性ポリペプヂドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを包含する
。また上記新規抗腫瘍活性ポリベプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換え１９ ブラスミドを包含する。

上記の新規抗腫瘍活性ポリベブヂドをコード１るＤＮＡ
領域を包む組換えプラスミドどして下記のものが挙げら
れる。

次の塩基配列 （５’　　）−ＧＡＴＧＡＣＧＡｒ ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡ　Ｇ　Ｃ
　Ａ　Ａ　Ａ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ八ＡＧＣＴＧＡＧＧ
ＧＧＣＡＧＣ　ｒｃｃＡＧＴＧＧｃＴＧＡＡｃＣ　Ｇ　
Ｃ　Ｃ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ｃ
　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　−丁ＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧ
ＡＧＣＴＧＡＧ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｃ　Ｃ　Ａ
　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　−１−　Ｇ　Ｇ　Ｔ−　ＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣ丁ＧＴＡＣＣＩＣ　Ａ　’Ｔ　
Ｃ　Ｔ　Ａ　Ｃ　’Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　
Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　ＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧ
ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡ丁Ｇ　ｌ　Ｇ　Ｃ丁Ｃ　Ｃ　
Ｔ　Ｃ　Ａ　ＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣ八Ｔ
ＣＧＣ　Ｃ　Ｇ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　ｌ”’　Ａ　Ｃ
　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ａ　ＧＧ　Ｔ　Ｃ　Ａ
　Ａ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　
Ｃ　Ｇ　Ａ　ＴＣ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　
Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＧＡＧＡＣ
ＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧΔＧＧＣＣＡＡＧＣＣＡ
ＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＧＡＧ
ＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧΔＧＡＡＧＧＧＴＧＡ
ＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧ
ＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴ
ＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＴΔＴ
ＴＧＣＣＣＴＧ−（３’） で表わされる−本鎖ＤＮＡとそれに相補的な−本鎖ＤＮ
Ａとから或る二本＠ＤＮＡを含むプラスミド。

又は−１二記ＤＮＡ配列にプロモーター機能を有する配
列をイ１加した次の塩基配列 （５’　　）−ＣＡＴＣＡＴΔΔＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣ
ＡＡＡＴ八ＴＴＣＴＧＡΔＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧΔＣ
八ＡＴＴＡΔＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＡ
ＧＴＡＣＧＣＡＡＧ丁１−　Ｃ　Ａ　Ｃ　Ｇ　Ｔ　Ａ　
Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＧＴ　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｇ　Ａ　
Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｃ　Ｇ　Ａ
　ＴＡ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｃ
　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　ＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣ
ＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧ　Ｇ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ｃ　ｌ−
　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｇ丁Ｇ　Ｇ　Ｃ　−Ｔ’　Ｇ　Ａ　Ａ　
ＣＣ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ａ　ｌ−
　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｃ丁ＧＣＴＧ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ａ　Ｔ
　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｇ　ｌ−　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ｇ
ΔＧ　　Ａ　　Ｇ　　Ａ　　Ｔ　　Ａ　　Ａ　　Ｃ　　
Ｃ　　Ａ　　Ｇ　　Ｃ　　Ｔ　　Ｇ　　Ｇ　　Ｔ　　Ｇ
　　Ｇ　　−丁　ＡＣＣΔＴＣＡＧ八Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　
Ｃ　Ｔ’　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｃ　Ｃ　ＴＣ　Ａ　Ｔ　Ｃ　’
Ｔ　Ａ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｃ　Ｃ
　Ｔ　Ｃ　ＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣ
ＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣ八Ｃ
　Ａ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｇ　Ｃ　
Ａ　Ｔ　Ｃ　ＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧΔＣＣＡ
ＡＧＧ　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ａ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ
　Ｔ　Ｃ　Ｔ’　Ｇ　Ｃ　Ｇ　Ａ　ＴＣ　Ａ　Ａ　Ｇ　
Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ
　Ｇ　Ｇ　Ｇ八ＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡ
ＧＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣ　Ａ　
Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ａ　Ｔ”　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　
Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｃ　ＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧΔＡＧ
ＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡ
ＡＴ　Ｃ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ｇ　Ａ　Ｃ　１−　Ａ
　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｇ八〇ＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧ
ＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣ
ＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴ一　（３’　　）で表わ
される一本領ＤＮＡとそれに相補的な一本領ＤＮＡとか
ら成る二本鎖ＤＮＡを含むプラスミド。

さらに具体的にはｐＴＮＦ６０９が挙げられる。

本発明は上記新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞を包含する。ここで微生物細胞は
エシエリヒア・コリ（　Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌ　ｉ　）であることが好適である。

本発明は上記新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペブチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活
性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から
新規生理活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた
培養物から新規生２３ 理活性ポリペプチドの製造方法を包含する。

本発明は抗腫瘍に有効な量の上記新規生理活性ポリペプ
チドまたはそのアミノ末端にｌｙｌｅｔが結合している
ポリペプチドを含有する医薬組成物を包含する。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ′Ｘ
！１伝子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構或するアミノ酸［　
０　．ｐ　ｅｎｎｉｃａら，前出コを指定するいくつか
のコドンの中から適当なものを選び、それを化学合戒す
ることによって取得できる。ヒトＴＮＦ”３ｍ伝子の設
δ１に際しては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを
選択することが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改
変を容易に行なえるように適当な位置に適当な制限酵素
による切断部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレ−＝２４ ムを一致させた形での翻訳終止コドン（ＴＧＡ．ＴＡＧ
またはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖，下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
或法としてはジエステル法［口．Ｑ，　ｌ（ｈｏｒａｎ
ａ，“３　ｏｍｅ　　Ｒ　ｅｃｅｎｔ　　ｏ　ｅＶｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　
　ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅｓｔｅｒｓ　　ｏｆＢＩ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ”，　Ｊｏ
ｈｎ　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　　３ｏｎｓ　　．　　Ｉ
ｎｃ，，Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）］，トリ
エステル法［　Ｒ　．　Ｌ　．　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら，Ｊ．Ａｍ．　　Ｃｈｅｍ．　　Ｓｏｃ．，８９．　
４８０１（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ．　
Ｄ．　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｔｅｔｒａｈｃｄｒｏｎ
　　Ｌｅｔｔ．，　２１，　　７１９（１９８０）　］
があるが、合成時間，収率，操作の簡便さ等の点から、
全自動ＤＮＡ合或機を用いたホスファイト法による合成
が好ましい。合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲ
ル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル電気泳動
，逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー等を、
適宜単独もしくは組含ぜて用いることができる。

こうして得られた合戒オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ　４　−　Ｄ　Ｎ　Ａ　！Ｊ　カゼを用いて連結する
。合或オリゴヌクレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子
を作戒する方法としては、合或オリゴヌクレオチドをい
くつかのブロックに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２
２　［　Ｆ　，　　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら，　　Ｑｅｎｅ
　，　　２．　　９５（１９７７）　］のようなベクタ
ーに一度クローン化した後、それらの各ブロックのＤＮ
Ａ断片を連結する方法が好ましい。このようなヒトＴＮ
Ｆ遺伝子を構戒１るブ「コックのＤＮＡ断片を含むブラ
スミドとして、好ましくはｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２
ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴ　Ｎ　＋＝遺伝
子を構或する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適
当なプロモーター．　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）
配列の下流につなぐことにより、発現型遺伝子とするこ
とができる。使用可能なプロモーターとして、トリプト
ファン・Ａペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター
〉，ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロ
モーター）　，　ｔａｃプロモーター，Ｐヒプロモータ
ー．　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけ
ｔｒｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーター
を有するブラスミドとして、好ましくはｐＹ　Ｓ　３１
Ｎ、又はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

９　７　一 さらに、発現効率向上を目的として、ヒｌ−　Ｔ　Ｎ「
遺伝子下流に大腸菌で効率良く機能するタミネーターを
付与することが′Ｃｆ′きる。このようなターミネータ
ーとして、ｌｐｐターミネータｔｒｐターミネーター等
があげられるが、とりわけｔｒｌ］　Ａターミネーター
が好適であり、ｔｒｐ　Ａターミネーターを右リるプラ
スミドどして、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる
。この発現型ヒ［〜１Ｎ［−遺伝子を、たどえばＩ）Ｂ
Ｒ３２２由来のベクターにクローン化づ−ることにより
、発現型ブラスミドが作成できる。ヒｌ−　Ｔ　Ｎ　Ｆ
　”ＩＩ伝子発現型プラスミドとして、好ましくはｐＴ
Ｎｌ一４０１ＮＮ又はｐ丁ＮＦ４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活竹ボリペブチドｉｆｆ｛五子のク口
ーン化： こうして得られたヒトＴＮＦＩ伝子発現型ブラスミドを
適当な制限醇索で切断し、ヒｌ−　Ｔ　Ｎ「遺伝子内の
特定な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成
オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。か
かる手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任
意のア成ノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり
、または欠失さぜた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドを
コードする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能
になる。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミドとして、好ましくはａＴＮＥ　６ｏ９
が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒ１〜ｒＮＦ３ｆｆ伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプヂ
ド遺伝了を発現させるための微生物宿主としては、大腸
菌，枯草菌，酵母等があげられるが、とりわ（プ大腸菌
「エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ）　］が好ましい。前記ヒ１−　−ｒ　Ｎ　Ｆ遺
伝了発現型プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプヂド
遺伝子発現型プラスミドは、たとえば公知の方法［　Ｍ
　．　Ｖ　，　Ｎ　ｏｒｏａｒｄら，Ｇｅｎｅ　，　３
，　　２７９（１９７８）コを用いて、微生物宿主、た
とえばエシエリヒア・コリＣ　６００ｒ−ｍ株（　Ａ　
Ｔ　Ｃ　Ｃ　３３５２５）に導入することができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、ぞれ自体
は公知の方法で培養する。培地どしては、１ことえばグ
ノレコースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ．　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編，　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣ　ｌ
ｏｎｉｎｇ”　　Ｐ　４４０　　Ｃ　ｏｌｄ　　３　ｐ
ｒｉｎｇＩ−１ａｒｂｏｒ　　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
．　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげ
られ、必要に応じて、たとえばアンビシリン等を添加す
るのが望ましい。培養（ま目的の組換え微生物に適した
条ｆ１、たとえば振とうによる通気，撹拌を加えながら
、３７℃で２ヘ−３６時間行なう。また、培養開始時ま
たはｊ８養中に、プロモーターを効率良く機能させる１
１的で、３−β−インドールアクリル酸等の薬剤を加え
ることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッフ？一に懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物１［１胞を破砕し、遠心分
離により組換え微生物細胞のライゼー１・を得る。得ら
れたライゼー１へ中の乾白質を、ラウリル硫酸ナｌ〜リ
ウム（以下、ＳＤＳと略づ−こともある〉を含むポリア
クリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲ
ル中の蛋白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒ１〜
ＴＮＦ３１伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（　Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌ　ら，前出），マ
ウスＬｌｌｌｌ胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　Ｖ
ｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，　１２６，　　２３５（１９８１）　］等により
行なえるが、測定時間，定量性，測定の簡便さ等の点か
ら、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評価が好まし
い。

く発明の効果〉 かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ボリ一３　１　一 ペプチドを用いることによって抗腫瘍のためのすぐれた
医薬組成物を提供することが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設訓した
、設計に際しては、ｐｅｎｎ：ｃａら［Ｄ．ｐｅｎｎｉ
ｃａら．　　Ｎａｔｕｒｅ　，　　３１２，　　７２４
（１９８４）　　］の報告したヒトＴＮＦ前駆体ＣＤ　
Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、適当
な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、５′側
に翻訳開始コドン〈ΔＴＧ）を、そして３′側に２個の
翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ’Ｉをそれぞれ付与
した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限酵素Ｃ
ｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開始コド
ン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの連結
を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下流には制
限酵素口ｉｎｄｎｌによ３　２一 る切断部位を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結
できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＩ”３ｍ１伝子は、第２図に示したよ
うに１７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オ
リゴヌクレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合或機（アプラ
イド・バイオシステムズ，モデル３８０Ａ　＞を用いて
、ホスファイト法により行なった。合成オリゴヌクレオ
チドの精製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニ
ュアルに準じて行なった。すなわち、合戒オリゴヌクレ
オチドを含むアンモニア水溶液を５５℃で一晩保つこと
により、ＤＮＡ塩基の保護基をはずし、セファデックス
Ｇ−５０ファイン・ゲル（ファルマシア〉を用いたゲル
濾過によって、高分子量の合或オリゴヌクレオチド画分
を分取する。ついで、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動くゲル濃度２０％）の後、紫外線シャド
ウイング法により泳動パターンの観察を行なう。目的と
する大きさのバンド部分を切出して、そのポリアクリル
アミドゲル断片を細かく破砕した後、２〜５ｍの溶出用
バッ７Ｆ　　［　　５００ｍｌｙｌ　　Ｎ口４０ＡＣ−
１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ　（　　１）ｌ−１　
７．５）　］を加え、３７゜Ｃで一晩振とうした。遠心
分離により、目的のＤＮ八を含む水相の回収を行なった
。最後に含或オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル濾過
力ラム（セファデツクスＧ，−５０）にかけることによ
り、合戒オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお、必
要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰り返
し、合或オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかった。

実施例３〈化学合成ヒトＴＮＦＩ伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合或オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μｑの含或オ−リゴヌクレオチドＴＮ「
−２へ．ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニット
の千４−ポリヌクレオヂドキナーゼ（ＥＣＯｌｉＢタイ
プ，宝酒造）を用いて、それぞれ別々にリン酸化する。

リン酸化反応は１０〜２０Ｉｉｌの５０ｌｎＭＴｒ＋ｓ
　川−１ｃ９　＜　　　１）ｌ−１　　　９．５）　　
，　　１０　　ｍＭ　　　　Ｍ　ｇ　Ｃ９　２　　．５
　ｍＭジチオスレイ１〜−ル，　１０　１１１Ｍ　　Δ
ＴＰ水溶液中で、３７℃で，３０分間行なった。反応終
了後、すべでの合成Ａリゴヌクレオヂド水溶液をづべて
混合し、フェノール抽出，エーテル抽出にまりＴ４−ポ
リヌクレオチドキナーゼを失活，除去する。

この合成オリゴヌクレオヂド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオヂド丁Ｎ「１及び−ｒ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ上の６６　１Ｒ
ＭＴｒｉｓ−ｌ−１（Ｊ　（　　ｐＨ　７．６）　，　
　６．６　ｍＭ　　ＭｇＣｆ２．１０　ｍＭジチオスレ
イトール．ＩｍＭＡ丁Ｐ水溶液に溶解させ、３００ユニ
ットの丁＝１−　−−　Ｄ　Ｎ　Ａリガゼ（宝酒造）を
加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった。反応終
了後、ポリアクリルアミドゲＱｌコ　ー ル電気泳動（ゲル濃度５％〉を行ない、工ヂジウムブロ
マイド染色法により泳動パターンの観察を行なう。目的
とする大ぎざ〈約２２０ｂｐ　）のバンド部分を切出し
て、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミ１：ゲル
よりＤＮＡを回収１−る。

一方、３μ９の人腸菌川ブラスミドｌ）ＢＲ３２２〈約
４．４Ｋｌ）Ｉ））を３０μ夏の１０ｍＭ　　ｌ”’ｒ
１ｓ−Ｉ−１（１（　　ｐｌ−１　７．５）　，　６０
　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＲ，　７　ｍＭＩＶＩＯ（１２水溶
液に溶解させ、１０ユニツ１〜の制限酵素ＣｌａＩ（ニ
コーイングランド・バイＡラブズ）を添加して、３７゜
Ｃで゛１時間切断反応を行なった。

制限酵素ＣｆａＩにＪ：る切断の後、フェノール抽出，
工−テル抽出を行ない、１−タノール沈澱によりＤＮＡ
を回収−４る。このＤＮＡを３０μ女の５０　ｍＭＴｒ
ｉｓ−口Ｃｆ　　（　　＋〕１−１　　７．４）　　，
　　１００　ｍＭ　　　Ｎａ　ｃｐ，　　１０ｍＭ　　
ＭｇＳＯａ水溶液に溶解サ４４、ＩＯＺＩ−　ニツｌ−
の制限酵素ＳａｌＩ　（宝酒造）を添加して、３７゜Ｃ
で１　１１５間切断反応を行なった。反応終了後、アガ
１」スゲル電気泳動くゲルｍ度０．８％）を行ない、−
［チジウムブ１］マイド染色法により切断パターンの観
察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部分を含む
約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当ずるバンドを切
出し、そのアガロースグル断片を３倍吊（ｖｏｌ　／ｗ
ｔ）のＱＭ　　ＮａＣ９０４水溶液に溶解させた。Ｃｈ
ｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ．Ｗ．（：，ｈｅｎら
，　Ａｎａｌ　，　ＢｉＯｃｈｅｍ，　　１０１，　　
３３９（１９８０）　］により、約３．７ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片（ＣＪａＩ←◆ＳａｌＩ）をアガロースゲルより
回収しｌこ　。

先に得られたビ１一丁ＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０
ｂｐのｌ）　Ｎ八断片について、前記の方法に準じ−Ｃ
末端のリン酸化反応を行なった後，プラスミドｐＢＲ３
２２の入部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡ水溶液と混
合する。］−タノール沈澱の後、前記の方法に準じて両
ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。

Ｔシエリヒア・コリＣ　６００ｒ−ｍ一株の形質転換は
、通常のＣａＣ９２法（Ｍ．　Ｖ．　Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｍｌの１培
地（１％１〜リブトン，０．５％酵母エキス，０．５％
Ｎ　ａ　ＣＲ　，　　Ｉ）ｌ−１　　７．２）　ニ．ｒ
シ”Ｊヒ７・＝．ｌ）Ｃ　６００ｒ−ｍ一株の１８時間
培養基を接秤し、菌体を含む培養液の６　０　０　ｎ　
ｍにお１ノる濁度（○Ｄ６θθ）が０．３に達ずるまで
生育ざせる。菌体を冷たいマグネシウム・バッツ７　　
［　　０．ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ９，　５　　ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃ９２．５　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ｌ−１ｃＲ　（　　
ｐｌ１　　７．６，　Ｏ’Ｃ）　］中ぐ２回洗い、２一
の冷したカルシウム・バッファ一［　　　＋００　　ｍ
ＭＣａ　　Ｃ９　　２　　，　　　２！ｉｏ　　　　ｍ
Ｍ　　　　ｔ＜ｃｉ，　　　５　　　１１１ＭＭｇＣＲ
２，　　５　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　＋−１ｃｒ　（　
　Ｉ’ｌｌ　　７．６，Ｏ℃）］中に再懸濁させ、０℃
で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤ　Ｎ　Ａ水溶液と２：１　
（ｖｏｌ，　：　ｖｏｌ．）混合する。この混合物を６
０分間，Ｏ℃で保った後、１ｍｆｌの１１３Ｇ培地（１
％トリブトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｆ，　
　０．０８％グルコース，　　ｌ）ｌ−１　７．２）を
添加し、３７℃で１時間振とう培養する。培養液を、選
択培地［アンピシリン（シグマ）３０μＳ？／ｍｌを含
む１−培地プレートコに　１００μ！ｌ／プレ−１への
割合で接秤する。プレートを３７℃で１晩培養して、形
質転換株を生育させる。冑られたアンビシリン耐性のコ
ロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡを調製し、アガ
ロースゲル電気泳動により、目的のプラス呉ドｐＴＮＦ
ＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の取得を確認した。第３図
に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂＤ）を、合或オリゴヌクレオヂドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてブラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作或した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
或方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｌ１ＴＮＦ１ＢＲ，　　ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ
　Ｆ　３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配
列が設計通りであることは、マキザム・ギルバート法［
Ａ．　Ｍ．　Ｍａｘａｍら，　ＭｅｔｈｏｄｓＥ　ｎｚ
ｙｍｏｌ．，６５，　　４９９　（　１９８０）　］に
よッテ確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ３ｍ１伝子発現型プラスミドの作
成） ３９ー 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μｑ
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及び３ａｌ
Ｊで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦｌ
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ　
Ｉ−ＳａｌＩ　）をポ’Ｊ　７　ク！Ｊ　）Ｌｔアニド
ゲルより回収した。

次に、実施例３で１ｑられたプラスミドｐＴＮＦ２　　
１０μ９を１００μｕの１０ｍＭ　　Ｔｒｙｓ一口Ｃ１
（　ｐ口　７．５），６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　ＣＬ　　７
　　ｍＭＭ（］Ｃｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニット
の制限酵素ＰＶｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１
時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準
じて制限酵素Ｓａ１■による切断，ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動〈ゲル濃度５％〉の後、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐの
ＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋Ｐｖｕｌ［をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　　１
０μ９も１００μＵの１０　ｍＭＴｒ＋ｓ一口（Ｊ４　
０ （　ｐ口　７．５），６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ９．７　
　ｍＭＭ（ＩＣｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニットの
制限酵素ｐｖｕｌ及び４０ユニットの制限酵素口ｉｎｄ
　ｍ　（宝酒造〉を添加し、３７℃で１時間切断反応を
行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動く
ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴ
ＮＦ３ｌｉ伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片
（ＰｖｕＩＩ＋ｌ−ｆｉｎｄ　ｍ＞をポｌ）　７クリル
アミトゲルより回収した。

方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｌｌ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μグを、上記と同様
に制限酵素ＣＲａＩ及び口ｉｎｄ　ｍで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドｌｌｌＹｓ３１Ｎの大部分
を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ＋ｌ−
１ｉｎｄ［［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ，約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドｌ）ＹＳ３ＩＮの大部分を含む約４
．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈澱
の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシエリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ一株に導
入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦｌ伝子発現
型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂｌ）
）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミドｌ）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹ　Ｓ　３ＩＮ　５μグを、上
記の方法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、
さらに制限酵素口ｉｎｄ　ｍで切断し、アガロスゲル電
気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準
じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤ
ＮＡ断片［　Ｐ　ＶＵ　■（２１　４−１口ｉｎｄｌ［
［］ヲアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合或・精製した。得られ
た２本の合或オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に４ＥＪられだ約２．７Ｋ
ｂｐのＤ　ＮＡ断片［Ｐｖｕ■（２）←’　Ｉ−１：ｎ
ｄＩＩＩ　］と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３
の方法に準じで、丁４−ＤＮＡリガーピによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
エリヒア・コリＣ　６００ｒ−ｍ株に導入し、形質転換
株の中より目的のブラス坂ドＩ）ＡＡ４１（約２．７Ｋ
　ｂｐ）を右するクローンを選択した。このようなプラ
スミドは、プラスミド１）ＹＳ３１Ｎからコピー数制御
領域を除ムし、ｔｒｐプ１−１モーター下流に存在する
クローニング・ザイ［・の下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａター
ミネーターをイ１！−：ｊした形の、多コピー・高効率
発現ベクターであり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドＩ）ＡＡ４１　　２μｑを、上記と同様
に制限醇素Ｃ９ａＩ及びＨｉｎｄｌｌＪで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、ブラスミドＩＩＩＡ　Ａ　４１の大
部分を含む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断Ｅ’　（　ＣＲ
　ａ　王＊→Ｈ　＋ｎｄ　■）をアガロースゲルより回
収した。

また、先に得られたヒ１〜ＴＮＦ遺伝子発現型ブー／Ｉ
　３ ラスミドｐ丁ＮＦ４０１ＮＮ５μ９を、↓記と同様に制
限酵素Ｃ９ａ１及びＨｉｎｄｌＩＩ′Ｃ−切断し、ボリ
ノノクリルアミドゲル電気泳動（ゲル′ｓ１度５％）の
後、実施例２の方法にｉ（じて、ｅ　ｌ〜Ｔ”’　Ｎ　
ｒ”　ｉｆｆ伝子全域を含む約４９０ｂｐ　ノＤ　Ｎ　
Ａ断片（ＣＮａ　王”ｆ−１ｉｎｄ　ＩＩＩ　）をポリ
アクリルアミドグルより回収した。

こうしＣ得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片どじ１へＴＮＦ渭
伝子全域を含む約／１９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し
、Ｔタノール沈澱の後、実施例３の方法にハ（じで、Ｔ
ＩＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、］−シエリ（こ
ア・コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のブラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　＜約３．
２Ｋｌ）＋１）を右リるク「」一ンを選択した。このブ
ラスミドは、ヒ１〜ＴＮＦ遺伝了をより効率良く発現さ
せる能力をイイしてａ３り、第８図にその作或方法を小
した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリベプヂド遺伝子発現型ブ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒｌ−　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子発現型プ
ラスミドＩＩＩＴＮＦ　４０１Ａ２０μグを、実施例４
の方法に準じて制限酵素ＣＲａ工及び口ｉｎｄ　ＩＩＩ
で切断し、ポリアクリルアミドグル電気泳動くゲル濃度
５％）及びアガ目一スゲル電気泳動くゲル濃度０．８％
）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に壓じで、生成
する２つのＤＮＡＩ！ｉ片（約４　９　０　ｂ　ｐ及び
約２．７Ｋｂｐ，両方共ＣＪａ　Ｉ　←１ｔ−１　ｉｎ
ｄ　ＩＩＩ　）をゲルより回収し　ｌこ　。

ここで得られたヒト−ｒＮＦ遺伝子全域を含む約４９０
ｂｎのＤＮＡ断片を５０μ文の１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ１
−ＩＣｆ　（　　ｐｌ−１　　７．４）　，　１０ｍＭ
　　ＭｇＳＯ４　．　１　　ｍＭジチオスレイトール水
溶液に溶解さぜ、１ｏユニツ１〜の制限酵素ＨａｐｌＴ
（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行な
った。反応終了後、ポリアクリルアミドグル電気泳動く
ゲル濶度５％〉を行ない、実施例２の１ノ法に準じて、
ヒトＴ’　Ｎ　Ｆ　Ｍ伝子の入部分を含む約３９０ｂｐ
のＤ　Ｎ　Ａ断片（日ａｐＩレ→ｌ−１ｉｎｄｌｌｌ）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩星配列を右するオリゴメクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成，精製した。１！
１られた４本の合成オリ丁ヌクレオヂドそれぞれ０．５
μｑについて、尖施例３の方法に準じて、末端のリン酸
化を行ない、アニーリングの後、Ｔ　４　−．　Ｄ　Ｎ
　Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終Ｙ後、得られた２本鎖オリゴヌクレオヂドを、先
に１９られた約２．７ＫｂｐのＤＮＡＩＩｉ片（（Ｊａ
　Ｉ←→ｌ−ｌ　ｉｎｄ　■）及びヒｈ　−ｒ　Ｎ　「
遺伝ｆの人部分を含む約３９ｏｂｐノＤ　Ｎ　Ａ断片（
　ｌ−１　ａ　ｐ　Ｈ　←ト１１ｉｎｄｌｌ）と混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ　
／Ｉ．−Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼによる連結反応を行なった
１，反応終了後、実施例３の方法に準じてエシエリヒア
・コリｃ　６００ｒ−ｍ一株に導入し、形質転換株の中
Ｊ：り目的のプラスミド１）１”　Ｎ　Ｆ　ＧＯ９　（
約３．２Ｋｂｐ）を右づるク［１−ンを選択した。この
ブラスミドは、次のアミノ酸配列（ｌ−１２Ｎ　）−Ａ
Ｓｌ’ｌ−八Ｓｐ−　Ａ　３１１−１．−　ｙＳｐｒｏ ＡＳｎ １−ｅｕ Ａ１ａ ＧＩＶ Ｑｌｎ Ｇ１ｙ Ｑｌｎ Ｇｌｙ １−ｅｕ Ａｒ（Ｉ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｑｌｕ Ｐｒｏ ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ ｐｒｏ Ｑｌｎ ／１，ｓｎ Ｖａ＋ １，，，ｅｕ １−ｅｕ Ｖａ ＣｙＳ ｌｅｕ Ｉ１ｅ ＬｙＳ ■　Ｉｅ Ｑｌｕ Ａｈａ １＋ｅ Ｇｌｎ ｌｅｕ ｐｒｏ ＧＩＩＪ Ａｌａ Ｑｌｎ Ｔｒｐ ＡＩａ Ｇｌｔｌ Ｖａ Ｔｙｒ １−ｅｕ ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａ しｙｓ Ｔｈｒ ｌｊｌｓ Ｔｙｒ ｌｅｕ ３ｅｒ Ａｓｐ ３ｅｒ 口Ｉｓ Ａ１ａ １−ｅｕ １−ｅｕ ｌｅｕ Ｖａ １−ｅｕ ｐｈｅ ３ｅｒ １１１Ｓ Ｖａ Ａｓｎ Ｓｅｒ ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌ　ｅｕ Ｇｌｕ Ａ１ａ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖ　ａｌ　−　Ｖ　ａｌ−　Ａ　ｌａ Ｇ　ｌｕ−　Ｇ　ｌｙ−　Ｇ　Ｉｎ ＡＳｎ−Δｒ（］−　Ａ　ｒｏ しｅｕ　−　Ａ　ｌａ　−　Ａ　ｓｎ Ａ　ｒ（Ｊ−　Ａ　Ｓｒｌ−　Ａ　ＳｎＰｒＯ−Ｓｅｒ
−Ｇ１ｕ ■　ｌｅ−　Ｔ　ｙｒ−３　ｅｒ Ｌ　ＶＳ−　Ｇ　ＩＶ−　Ｇ　Ｉｎ Ｔｈｒ−口ｉｓ−Ｖａ Ｔ　ｈｒ−　　Ｉ　　Ｉｅ−Ｓ　ｅｒ Ｓ　ｅｒ−Ｔ　Ｖｒ−Ｇ　Ｉｎ　一 Ｌ　ｅｕ　−　Ｌ　ｅｕ　−　Ｓｅｒ Ｐ　ｒｏ−　Ｃ　ｙｓ−Ｇ　Ｉｎ Ｇ　ｌｕ−　Ｇ　ｌｙ−Ａ　ｌａ− Ｔ　ｒｐ−Ｔ　Ｖｒ−　Ｇ　ｌｕ Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ｌｙ−　Ｖａｌ しｌ／Ｓ−　Ｇ　＋ｙ−　Ａ　Ｓｔ） Ｑ　ｌｕ　−　ｌ　　ｌｃ−　Ａ　ｓｎＬ　ｅｕ−Ａ　
ｓｐ−　Ｐ　ｈｅ Ｇ　Ｉｎ−　Ｖａｌ−　Ｔｙｒ −４７ Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｙ−　Ｉ　　ｌｅ−　Ｉ　　ｌｅ−Ａ　
ｌａ−　Ｌｅｕ（　Ｇ　Ｏ　Ｏ　Ｎ　＞ で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にｌｙｌｅｔが結合しているポリペプチドをコー
ドする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドであり、第９図にその作或方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られた発現ベクター１１ＡＡ４１，ヒ
トＴＮＦＭ伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４ｏＩＮＮ又
はＩＩＴＮＦ　４０１Ａ，又は実施例５で得られた、新
規抗腫瘍活性ポリペブチド遺伝子発現型プラスミドＦＩ
ＴＮＦ６０９を有するエシエリヒア・コリＣ　６００ｒ
−ｍ一株を、３０　〜５０μｇ　／ｍａｌのアンビシリ
ン，０．２％のグルコース及び４　ｍ９　／　ｄのカザ
ミノ酸を含むＭ９培地［０．６％Ｎａ　２　ｌ−ＩＰＯ
４−０．３％Ｋ２　ＨＰＯ４−　０，０５％ＮａＣＲ−
０．１％Ｎ］］４Ｃ２水溶液（　　＋１＋−１　７．４
）をオートクレープ滅菌した後に、別途にオートクレー
プ滅菌したＭ（＋８０４４　８＝ 水溶液及びＣａ（Ｊ２水溶液をそれぞれ最終濃度２ｍＭ
及び０．１　ｍＭになるように加える。］　　２５０ｄ
に接種し、○Ｄ６ｏｏが０．７に達するまで、３７℃で
振とう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ／一
の３一β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し、
さらに３７℃で１２時間振とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッ７Ｆ
　　（　　１５０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＲを含む２０　ｍ
Ｍリン酸バッファ一，ｐ目７．４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０一のＰＢＳバッファー
に懸濁させ、超音波発生装置（久保田，　　２００Ｍ型
）を用いて菌休を破壊した後、遠心分離により菌体残漬
の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ一
口ＣＲバッフ７　　（　１）Ｈ　６．８＞　．　ＳＤＳ
．　２メルカプトエタノール，グリセロールを、それぞ
れ最終濃度６０ｍＭ，２％，４％，１０％になるように
加え、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木
，３！！伝，　３１．　４３（１９７７）コを行なった
。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファ−はＳＤＳ
，Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ．　Ｋ．　ｌ　ａｅｍｍｌ
ｉ，Ｎａｔｕ．ｒｅ　，　　２２７，　　６８０（１９
７０）　］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質
をクーマシーブルＲ−２５０（バイオ・ラッド〉で染色
し、ヒトＴＮ「遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子の発現の確認を行なった。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒ　ｕ
ｆｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得
られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ートを順次培地で希釈した試料１００μ１と、４　ｘ　
ｉｏ５個／一の濃度のマウスＬ９２９繊維芽細胞（ＡＴ
ＣＣ　　ＣＣＬ−　９２９）懸濁液１００μ文を、９６
穴の組織培養用マイクロプレート（コースター〉内で混
合した。なおこの際に、最終濃度１μｇ／一のアクチノ
マイシンＤ（−１スメゲン，萬有製薬）を添加しておく
。培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎
児血清を含むイグルのミニマム・エッセンシャル培地（
日水製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中，３７℃で１８〜２００；￥間培養
した後、クリスタル・バイオレッ１〜溶液［５％（　Ｖ
Ｏ／ｖｏｌ）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ　）のクリスタル・バイオレッｌ−を溶解さ巳たも
の］を用いて生細胞を染色した。余分なクリスタル・バ
イオレットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・
バイオレットを１００μ夏の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽
出し、その５９５ｎｍにお【ノる吸光度を［Ｌ　Ｉ　Ｓ
　Ａアナライザー（東洋測器．ＥＴＹ−９６型）で測定
する。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。そ
こで、ヒトＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプヂ
ドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼー１一の希
釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって求め、そ
の希釈イ８率をユットと定義する。第１０図より、発現
型プラスミドｌｌｌＴＮＦ６０９にコードされる新規抗
１ｂｌｉ瘍活性ポリペブチドを含む大腸菌ライゼート　
１００μ夏は１，Ｏｘ　１０６ユニット程度の活性を有
していることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒ１〜丁Ｎ　Ｆ蛋白質又は発現型ブラス
ミドｎ丁ＮＦＧＯ９に］一ドされる新規抗腫瘍活性ポリ
ペブブドを含む人腸菌ライゼー１〜中に含まれ総蛋白質
吊は、プ口ナイン・アッヒイ・ギッ１−（バイオ・ラン
ド）を用いて定損し、ウシ血清アルブミンを用いた検損
線より４粋した。−ｌ−記で得られた発現量，活性の値
及び蛋白質定量結果Ｊ、リヒｌ−　’Ｔ−　Ｎ　ｆ　？
Ｊｉ自質及び新規抗腫瘍活性ポリベプヂドの比活性を計
算しＩ、：どころ、新規抗腫瘍活性ポリペブヂドはヒ１
〜丁−Ｎ「蛋白質とほぼ同等の比活性を右しでいること
がわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設３１シたヒ１〜ＴＮＦ−遺伝了の塩基配列を
、第２図は化学合成ｌノた合成オリゴヌクレオヂドの塩
基配列を、それぞれ示したものである。第３図，第４図
及び第５図は、ヒ１〜下Ｎ　Ｆ遺伝了の部を有するプラ
スミドｐＴＮＦＩＢＲ，　　Ｉ）ＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮ
ｌ二３の作成方法を、それぞれ示５　１　一 したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラ
スミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作或方法を、第７図は発
現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作成方法を、そして第８図
はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１）Ｔ　Ｎ　Ｆ　
４０１Ａの作或方法を、それぞれ示したもので゛ある。 第９図は新規抗Ｉｌ！瘍活性ポリペブチド遺伝子発現型
ブラスミドｌ）ＴＮＦ６０９の作或方法を示したもので
ある。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプヂドの活性測
定結果を示したものである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （ＣＯＯＨ）で表わされる、新規生理活性ポリペプチド
   。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する請求項１記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 （ＣＯＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります。】 Ｇ−（３′） で表わされる一本領ＤＮＡとそれに相補的なー本領ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります。】 で表わされる一本領ＤＮＡとそれに相補的な一本領ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６０９である
   請求項３記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （ＣＯＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴
   とする請求項７記載の微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （ＣＯＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活
   性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から
   新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする
   、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
    配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 （ＣＯＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。