JPH02128696A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物ｉｔ胞を用いた
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−１ｔＪＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

ＡｌａＬ−アラニン Ａｒｇ　Ｌ−アルギニン ＡＳｎ　Ｌ−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 ＣＶＳ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨＩＳ　　ｌ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン Ｌｅｕ　　Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　１−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン Ｐｒｏｌ−プロリン ３ｅｒｌ−−セリン Ｔｈｒ　　１−スレオニン Ｔｒｌ）　　Ｌ−ｔ−リブトフ７ン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン〈デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。〉さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｉ−（＞はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカ
ルボキシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（
３′）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端
側を示すものである。

（ａ　発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、１３ａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅＱｕｅｒｉｎ　（ＢＣＧ）などで前もって刺
激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に採取
した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を出血
壊死させる物質が含まれていることを見出し、この物質
を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓｉｓ
Ｆａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもある）と
名づけた［Ｅ、Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、　Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３
６６６　＜　１９７５）コ。このＴＮＦはマウス、ウサ
ギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に
、しかも種を越えて動くことから、制癌剤としての利用
が期待されてきた。

最近になって、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒト丁Ｎ「のＣ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ蛋
白質の一次構造を明らかに−すると共に、大腸菌（おけ
るヒｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子の発現について報告した［　
Ｄ　、　　Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、
　　３１２．　７２４（１９８４）　］　、その後、白
ＬｔらＩＴ、　３ｈｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ１３．　８０３（１９８５）　］　
、宗村ら［木材ら、癌と化学療法、　１２．　１６０（
１９８５）　］　、　ＷａｎＱら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇら
、　３ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８５
）］　及びＭ　ａｒＩＩｌｅｎｏｕｔら［Δ、　　Ｍ　
ａｒｍｅｎｏｕｔら。

［二　ｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｉｎ、、　　１
５２．　　５１５（１９８５）　　１　　が　、ヒｌ−
Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子の大腸菌における発現について相つい
ｒ−報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによっＣ，純粋
（【ヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手でさるＪ、うになる
に及び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明
らかになりつつある。たとえば、癌未期や重症感染症患
省に見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケ
クチンが１ＮＦに非常に類似しており［Ｂ、Ｂｅｕ１℃
ｅ「ら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有すること力日ら
、丁ＮＦの投与により血中のトリグリセリド値が増大し
、その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす
可能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、
血管内皮細胞への影’Ｗ［Ｊ、Ｒ。

Ｇａ１ｌｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　　
１６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用ＩＩ
　Ｄ　、　Ｒ、Ｂ　ｅｌｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ
　、　　３１９．　５１６（１９８６）　１等が報告さ
れている。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在ターる蛋白質を改変して、
特定の目的にかなった新しい蛋白質をｆｌｌ製する研究
が、数多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ蛋白質のア
ミノ酸配列において、Ｃｙ　ｓ　’及びＣｙ３／ｐ／の
いずれか又は両方のアミノ酸残塁の他のアミノ酸残基へ
の置換（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特
願昭６１−１０６７７２号）、Ｇｌｙ　　の他のアミノ
酸残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭
６ｌ−２３８０４８Ｑ　）　、　Ａ　Ｉａ　　の他のア
ミノ酸残基への置換（特願昭６１．−２３３３３７号）
が報告されている。

また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失につい′Ｃも
、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性をｈしているこ
とく特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮ
Ｆが細胞障害活性を有していること（特願昭６１−９０
０８７号）、１＝１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活
性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮ
Ｆにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／
　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ｒＮＦが細胞障害
活性を有していること（特願昭６１−１１４７５４号）
、及び１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性をｈして
いること（特願昭６１１７３８２２号）が報告されてい
る。

−てこで、本発明者らは比活性の向−ト、安定性の向上
２反応スペクｌ−ルの広域化、副作用の低減化等を目的
どして、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行
ない、本発明を完成するに至った。

（３）　　発明の目的 本発明の目的は、新規抗胚瘍活性ポリベブＪドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍粘性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにｄりる。

本発明の更に他の目的は、以■の説明から一層明らかと
なるＣあろう。

（４）　　発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、第１
図に示した１番目のＶａｌかう　１５７番目のＬｅｕま
でで表わされるアミノ酸配列にＪ３い−（、アミノ末端
側の１コ、２］、３コ、４Ｘコ、　５］、　６コ、７コ
、８コ、９コ、１０コ、１１コ、１１コのアミノ酸残基
を欠失させ、かつ　１５７番目のＬｅｕのＰｈｅへの置
換を含むような配列を有する新規生理活性ポリペプチド
またはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプ
チド、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供することに
よって達成され、更にかくして得られた組換えプラスミ
ドによって形質転換された組換え微生物細胞、その微生
物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチド
を産生する方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを
含有する医薬組成物を提供することによって達成される
ことがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ＞ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦｍ伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦｉ伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましり、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴ　Ｎ　Ｆ　ｉＭ伝子は、その上流及
び下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることによ
り、適当なベクターへのクローン化が可能になる。この
ようなヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に小
した。

上記のように設計したヒトＴＮ　Ｆｍ仏子の取得は、上
側の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図
に示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、
それらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結
する方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの
合成法としテハシエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎ
ａ。

”　Ｓ　Ｏｌｅ　　ＲｅＣｅｎｔ　　Ｄ　ｅＶｅｌｏｌ
）ｌｌｅｎｔｓ　　ＩｎＣｈｅｉｉｓｔｒｙ　　ｏｒ　
　Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ
　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　ｌ　ｎｔｅｒｅｓｔ”、　
Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　　Ｉ
ｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌ　ｅｔｓ＋ｎｇｅｒら、
Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｔら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全白１［１］ＤＮＡ合成機を用い
たホスファイト法による合成が好ましい。合成したオリ
ゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液
体クロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて
用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　’ｌ、　　
９５（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン
化した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する
方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成す
るブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ま
しくはｐＴＮＦｌＢＲ。

１）ＴＮＦ２ＮまたはｐＴ　Ｎ　Ｆ　３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可闇なブ【」［−ターとして、１−リブ１へ
ファン・オペ〔］ン・ブ［］モーターＢｒｐプロモータ
ー）。

シフ１−−ス・Ａベロン・プロモーター（ＩａｃブＤ　
を−ター）　、　ｔａｃプロを一ター、　Ｐ＋−、プロ
モーター　１ｐｐプロを一ター等があげられるが、とり
わけｔｒｐプロモーターが好適である。ｔｒｐゾ目し一
ターをイ１するプラスミドとしで、好ましくはｐｙ　Ｓ
　３ＩＮ、又はＩＩＩＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向−［を目的として、ヒｈ　１’　Ｎ
１−遺伝ｒ下流に大腸菌′Ｃ−効室良く機能するターミ
ネータ−を付与することかぐきる。このようなターミネ
ータ−として、１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネー
タ−等があげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネー
タ−が好適であり、ｔｒ［ｌ　Ａターミネータ−を口す
るプラスミドとして、好ましくはｐへＡ４１が用いられ
る。この発現型ヒ１−　”’Ｉ’−’　Ｎト遺伝子を、
たとえば１）Ｆ３Ｒ３２２由来のベクターにり［］−ン
化することにより、発現望１ラスミドが作成できる。ヒ
トＴ　Ｎ　Ｆ遺伝子発現望プラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＤＴＮＦ４０１八が用いられ
る。

（Ｂ）新規抗肝癌活性ポリベブブド遺伝子のクローン化
； こうして１１られたヒトＴＮＦｍ包子発現型プラスミド
を適当くべ制限酵素′ｃ′切断し、ヒトＴＮ［遺伝子内
の特定な領域を除ムした後、適当な塩基配列をｈする合
成オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。

かかる手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の
４■息のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加し
たり、または欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含む介埠型ブシスミドの作成が
可能になる。このような新規抗誇瘍活性ポリベブヂド遺
伝了Ｒ現型プラスミドとして、好ましくはｐＴ　Ｎ　Ｆ
　６２１．　　ｐＴ　Ｎ　Ｆｅ１２、　　ｐ”ｒＮＦ６
２３、　［）Ｔ　Ｎ　Ｆ　６２４．　　ｌ）’Ｔ　Ｎ　
Ｆｅ１２、　　ｐＴＮＦ　６２６．　　ＤＴＮＦ　６２
７．　　ｐＴＮＦ６２８、　　ｐＴＮＦ　６２９．　　
ｐＴＮＦ　６３０゜ｐＴＮＦ６３１又はＩ）ＴＮＦ６３
２が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ−遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペグ
ートド遺伝ＦＧ発現さぜるための微生物宿主としＣは、
大腸菌、枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸
菌「ニジ丁すヒ７・」す（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ）　］が好ましい。前記ヒ１−ＦＮＦ遺伝子発
現望プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリベプヂド遺伝子
発現型プラスミドは、たとえば公知のｌｙ法［４，Ｖ、
　Ｎｏｒｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物値−Ｆ、たとえばニジ［リヒア・〕すＣ６００
ｒ−ｍ株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３５２５）に導入することが
できる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
］−スとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ　、　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら編、“Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｔｏｎｉｎｇ
”、　　Ｐ　　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓ　ｐｒｏｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　’１０ｒｋ　　（１９８２）参照１があげられ、必ガ
に応じて、たとえば７ンビシリン等を添加するのが望ま
しい。培養はＬｊ的の組換え微生物に適しＬ：条件、た
とえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で
２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−
インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物線＋ａを
集め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば
超ａ波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離
により組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られた
ライゼー１〜中の蛋白質を、ラウリル＠酸ナトリウム（
以下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋
白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼー１−
を対照として泳動パターンを比較することにより、ヒト
ＴＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定払（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、前出）、マウ
スし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　ＶｉｔｒＯ
活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ、　　Ｉ　ｍ５ｕｎｏｌ
、、　１２６．　２３５（１９８１）　］等により行な
える。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知らて
いる蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮＦ
蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラム
・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒトＴ
ＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を用
いたアフィニティー・カラム・りＯマドグラフィーがと
りわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白質
及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いることに
より、ｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作用に関す
る検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、ｈヶクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ｖｉｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
テや血圧の降下程度等をヨ１１定するｉｎ　ｖｉｖｏ法
等により行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮ　Ｆｌ伝子を設計し
た、設計に際しては、Ｐｅｎｎ１ｃａら［Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ遺
伝子体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当（【位置
に設け７．５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そし
て３′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）
をそれぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流
には制限酵素ＣｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列
と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモ
ーターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コ
ドン下流には制限ＩＩＪ素Ｈｉｎｄｌ［による切断部位
を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるよう
にした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ３ｍ仏子は、第２図に示したように
１７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴ
ヌクレオブトの合成は仝自１．１１　Ｄ　Ｎ　Ａ合成機
（アプライド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　”）を用いて、ホスファイト法により
行なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライ
ド・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった
。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア
水溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保
護基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル
（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量
の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７
Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
、破砕した後、２〜５＃Ｉｉ！の溶出用ハラ７Ｆ　−［
５００ｍＭ　　ＮＨ４０ＡＣ−１ｆｆｉＭＥＤＴＡ−０
，１％ＳＤＳ　（１）Ｈ７，５）コを加え、３７℃で一
晩振とうした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水
相の回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを
含む溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）
にかけることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品
を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の
向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒＩ−ＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒ１−ｒ　Ｎ　
Ｆ　ｍ伝了を３つのブロックに分け−Ｃクローン化しノ
Ｊ。

０．１＝　１．０μＪの合成ＡリゴメクレオヂドＴＮＦ
−２〜ＴＮ［−６の５′末端側を、５〜１５ユニツＩ〜
の１−４−ポリヌクレオチドキノ−一ぜ（［。

ｃｏｔ：ｓタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０Ｉｌｆｉの５
０ＩＢＭ　　王　ｒｌＳ−ト１（Ｊ　　　（ＤＨ９，５
）　　　、　　　１０　　　ｍＭ　　　　　Ｍ！ｊ　　
　Ｃｊ　　２　　。

５　ｍＭジチＡスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶
液中ぐ、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、リ
ベての合成Ａ−リーＩヌクレオヂド水溶液をすへて混合
し、フェノール抽出、■−チル抽出によりＴ４−ボリヌ
クレＡ−ブトキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たにｏ、（−
ｉ、ｏμＪの合成オリゴヌクレオチドＴ　Ｎ　Ｆｌ及び
ＴＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した侵室温まで
徐冷して、７二−リングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μρの６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐｉ−１７，６）　、　　６．６
１ＭＭ　　Ｍｇ（Ｊ２゜１０−ＭジヂＡスレイトール、
　１　　ｍＭ　　Ａｌ−Ｐ水溶液に溶解させ、３００ユ
ニツトのＴｌ−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１
１℃で１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない
、エヂジウムブロマイド染色法により泳動パターンの観
察を行なう。目的とする大きさ（約２２０ｂｐ　）のバ
ンド部分を切出して、実施例２の方法に従ってポリアク
リルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

方、３μ９の大賜菌用プラスミドｌ１ｌＢＲ３２２（約
４．４Ｋｂｌ））を３０／ｌｆｉの１０　ｍＭ　　Ｔ　
ｒｉｓ・−ｔ−１Ｃ１（ｐＨ７，５＞　　、　　６０　
　ｍＭ　　　　Ｎａ　　Ｃコ、７ｍＭＭ！Ｊ（Ｊ２水溶
液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素（ＪａＩにュー
イングランド・パイ４ラブズ）を添加して、３７℃で１
時間切断反応を行なった。

制限酵素（ＪａＩによる切断の後、）１ノール抽出。

エーテル抽出を行ない、Ｔタノール沈澱によりＤＮＡ庖
回収４る。このＤ　ＮＡを３０μ９の５０１ＭＭｒｒｉ
ｓ−）１ｃＪ　　　（１）Ｈ７，４）　　　、　　　　
１００　　　ｍＭ　　　　　Ｎａ　　　（Ｊ、　　　１
０…ＭＭ！１ＪｓＯｎ水溶液に溶解させ、１０ユニツ１
−の制限酵素５ａｆｅ（宝酒造）を添加して、３７℃で
１時聞切胃反応を行なった。反応終了後、アガロースゲ
ル電気原初（ゲル濃度０．８％）を行ない、］−ブジウ
ムゾ１マイト染色法により切断パターンの観察を行なう
。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部分を含む約３，７Ｋ
ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出し、そのア
ガロースゲル断片を３倍ａ（ｖｏ！　　′Ｗｔ）の８Ｍ
　　Ｎａ（Ｊｏ４水溶液に溶解さυ−た。Ｃｂｅｎらの
グラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　［３ｉｏｅｈｅ３　１０
１．３３９（１９８０）　］により、約３，７Ｋ　ｂｐ
のＤＮＡ断片（（Ｊ　ａ　丁Ｈ３ａ１丁）を７万し１−
スゲルより回収した。

先に得られＩこヒト１Ｎ［遺伝子の一部を含む約２２０
ｂｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドＤＢＲ３２２の
大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合す
る。１タノール沈澱の後、前記の方法に準じて両［）Ｎ
Ａ１ｇｉ片の連結反応を（ｊなった。

１シエリヒア・］すＱ　６００ｒ−ｍ−株の形質転換は
、通常のＣａ（Ｊ２法（Ｍ。Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５Ｒコ、のし培
地（１％ヒトブ１ヘン、０．５％酵母１キス、０．５％
ＮａＣコ、ｐＨ７，２）にニジＩリヒア・コリＣ６００
ｒ１−株の１８Ｆｇｆ間培Ｍ基を接種し、菌体を含む培
養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ　１ｔｏｐ　）が
０．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシ
ウム・バッフ７’　−［０，ＩＭ　　Ｎａ　ｃｌ、　５
１１１Ｍ　　Ｍｏ　Ｃ１２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ　（ｐＨ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｄの冷
したカルシウム・バッファー［１００１Ｍｃａ　　Ｃ１
２、２５０ｓＭ　　　Ｋ（Ｊ、　　５　１ＭＭ（ｌ　　
Ｃｊｚ　　、　　５　　１Ｍ　　　　Ｔｒｉｓ　−Ｆｌ
Ｃオ　（ｐ）ｌ　　　７．６゜０℃）］中に再懸濁させ
、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１（ｖｏ
ｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地〈１％トリブトン、
０．５％酵母エキス、１％Ｎａ（Ｊ、０．０８％グルコ
ース、　　ｌ）８７．２）を添加し、３７℃で１時間振
とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シ
グマ）３０゜μ９／ｄを含むし培地プレート］に　１０
０μＪ２／プレートの割合で接種する。プレートを３７
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られた
アンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いて
ＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的
のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．０Ｋ　ｂｐ＞の取
得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの
作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオヂドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｌｌ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
作成方法を、それぞれボす。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、ｌ
ｙｌａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、
６５．　４９９（１９８０）　１によっで確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦｉ転子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素（ＪａＩ及び３ａｌ
工で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じで、ヒトＴＮＦｍ
転子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ９ａ　
Ｉ　Ｈ８ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｇを１００μＮの１０１Ｍ　　Ｔｒｌｓ−１１（Ｊ（
ｐＨ７，５＞　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　Ｃコ、７ｍＭ
Ｍ　ｇＣｌ　２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限
酵素ＰＶＬ１ｍ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切
断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じてυ
１限ＩＷ＠ｓａｌ工による切断、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準
じて、ヒトＴＮＦｍ転子の一部を含む約１７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩ［）をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μ９もｉｏｏμＮの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−１１Ｃ
Ｉ（ＤＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＬ　７
　　ｍＭＭ　ＯＣ７２水溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ｐｖｕｌｌ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉ
ｎｄｌ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１ｉｏｂｐのＤＮＡ断片（
Ｐｖｕ［”Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　）　ラボ’Ｊ　７　りＩ
Ｊ　／Ｌ／　７　ミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ＞　５μ９を、上記と同様
に１．ＩＩ限酵素Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｌｌＩｔ’切断
し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後
、実施例３の方法に準じて、プラスミドｌ）Ｙ　Ｓ　３
１Ｎの大部分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ
ｊａＩ＋Ｈｉｎｄｌ［［）をアガロースゲルより回収し
た。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ）ｉ！ｍ転子一部を含む
約２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つの
ＤＮＡ断片とプラスミドＩ）ＹＳ３１Ｎの大部分を含む
約４．７）（ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔｌ−ＤＮＡリガ
ーぜによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・］す］ＣＣ６００ｒ−＋
−に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　
ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプ
ラスミドｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１ＮＮの作成方法を示し
た。

また、上記プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎ　５μ９を、上
記の方法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、
さらに制限酵素１−（ｉｎｄｎｌで切断し、アガロース
ゲル電気法ｖＪ（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰＶｕＩＩ（２１４−４Ｈｉｎｄ　ｍ
　］をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載のｆｉ基配列を有するオリゴヌクレオヂ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得ら
れた２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９
について、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を
行ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　
ｂｐのＤＮＡ１１６片［ＰｖｕＩ［（２）”Ｈｉｎｄ　
ｍ　］と混合【ノ、エタノール沈澱の侵、実施例３の方
法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行
なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリ
ヒア・コリＣ６００ｒ−ｔａ株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミドｐ△△４１（約２．７Ｋ　ｂｐ
＞を有するクローンを選択した。このようなプラスミド
は、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎから］ビー数＆１ｌｔ
ｌＤ領域を除去し、ｔｒｐプロを一ター下流に存在する
クローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミ
ネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクタ
ーであり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミド１１ＡＡ４１　２μ７を、上記と同様に
ｔｉｌｌ限解素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄＩ［［ｒ切断し、
７１１０−スゲルミ気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
実施例３の方法に準じて、プラスミド１１Ａ　Ａ　４１
の大部分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ
Ｉ−１−１ｉｎｄＩｌりをアガロースゲルより回収した
。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ　５μすを、上記と同様に
ｉｌｌ限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌｌ［で切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、
実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む
約４９０ｂｐのＤＮＡｌｌｉ片（（Ｊａ　Ｔ　”Ｈｉｎ
ｄ　ｍ　）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐΔＡ４１の大部分を含
む約２．７Ｋｂｌ）のＤＮＡ断片とヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ｐ）を口するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒト］“ＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を小した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリベブヂド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子発現型プラ
スミドｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μシを、実施例４の方法
に準じてｔ、ｌＩ限酵素（ＪａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌｌ
ＩＴ”切断し、ポリアクリルアミドゲル電気法ｖＪ（ゲ
ル濃度５％）及びアガロースゲル電気泳動くゲル濃度０
．８％）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて
、生成１６２つのＤＮＡ断ハ（約４９０ｂ［）及び約２
．７Ｋ　ｂｐ、両方銭（Ｊａ　ＩＨＨｉｎｄ　ＩＩＩ）
をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μｌの１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　
−ＨＣｊ　（ｐ）−１７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃコ、７ｍＭＭｇＣｊ２水溶液に溶解させ、１ｏユ
ニツトの１１限酵素ＡＶａ丁（宝酒造）を添加して、３
１℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃瓜５％）を行ない、
実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を
含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断片（ＡｖａＩ＋Ｈｉｎｄ■
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチドを、実施例２の方法に準じて、上の鎖と下の鎖
とに分けて合成、精製（）た、得られた４本の合成オリ
ゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９について、実施例３
の方法に準じて、末端のリン酸化を行ない、アニーリン
グさぜた。

アニーリング後の２本鎖オリゴヌクレオチドを、先にａ
られた約２．７Ｋ　ｂｐ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ｃＩ
ａｌｌ−→Ｈｉｎｄ［）及びヒトＴＮＦＷ伝子の大部分
を含む約４６０ｂＥｌノＤ　Ｎ　Ａ断片（ＡｖａＩＩ”
Ｈｉｎｄ　■）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例
３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反
応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じて工
シェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−■−株に導入し、
形質転換株の中より目的のプラスミドＩ）ＴＮＦ　４１
６Ａ（約３，２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した
。このプラスミドはＴ−ＮＦのアミノ末端の７アミノ酸
を欠失させた形の抗ｉ！瘍活性ポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

一方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド１）ＴＮＦ　４１６Ａ２０μ９を、実施例４の方法に
準じて制限酵素）１ｉｎｄｌ［Ｉで切断した後、５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｆ　（＋）Ｈ７，４）　、　　
１００　ｍＭＮａ　Ｃコ、１０１Ｍ　　Ｍｇ８０４水溶
液中で制限酵素ＮＣ０Ｉ（宝酒造）による切断反応を３
７℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度０．７％）及びポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１４０ｂｐの
ＤＮＡ断片（ＮＣｏＩ４−＋Ｈｉｎｄ　ｉｒ）をポリア
クリルアミドゲルより、そし実施例３の方法に準じて、
ＤＴＮＦ　４１６Ａの大部分を含む約３．０ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片（ＮｃｏＩ　ＨＨｉｎｄ　［１）をアガロース
ゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ４−Ｉｌ−１ｉｎｄ　ｍ　＞を５０μ文の１０１Ｍ
　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ７，４）　、　１０　
＋１Ｍ　　Ｍ（］　ＳＯ４、ＩＲＩＭジヂオスレイトー
ル水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＡＣＣＩ
（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行な
った。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃度８％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒ
トＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片
（Ｎ　ｃ。

ＩＭＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２木の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０，５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．０Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の部を
含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ４−＋ＡＣＣ
Ｉ）と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に
準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア
・コリ（：、　６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ６２１（約３，２Ｋ
ｂＤ）を有するクローンを選択した。

このプラスミドは、次のアミノ酸配列 （８２Ｎ）　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＡＳＩ）　−Ｌｙｓ−
Ｐ　ｒｏ−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ
　−Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｌａ　−Ａｓｎ’−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｔ　ｒＤ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　
ｒｇ−Ａ　ｒｏ　−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌ　ｅｕ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＡｓｎＧ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｑ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　
ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖａｔ　−Ｖａｔ　
−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ＩＶ−Ｌ１３
１Ｊ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−
Ｇ　ｌｎ−Ｖ　ａｌ−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ−Ｌ　ｙｓ−
Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ
　−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−Ｌ　ｅ
ｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−１ｌｅ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌ　ｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｌ　ｅｕ−５ｅｒ−Ａ　Ｉａ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌｙｓ
　−Ｓｅｒ　−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　
ｒｑ−Ｇ　ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉ
ｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　ＩＬＩ−Ａ　Ｉａ−１ｙＳ−Ｐ　ｒ
Ｏ−Ｔ　ｒｌ）−Ｔ　Ｖｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ　−Ｉ　
１ｅ−Ｔｙｒ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　
−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｙｓ
　−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　ｓ。

Ａｒａ−Ｌ　ｅｕ−８ｅｒ　−Ａｌａ−Ｇｌｕ　−１１
ｅ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒ（＋−Ｐ　ｒＯ−ＡＳｌｌ−ＴＶ
ｒ−Ｌ　ｅＵ−Ａ　Ｓｐ＝　Ｐｈｅ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　
ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａ
ｌ−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−１１ｅ　−Ｉ　Ｉ
ｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　−（ＣＯＯＨ＞ で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

また、第９図記載の塩基配列を有する合成りＮへのかわ
りに第１１図記載の合成りＮＡを用いることにより、第
１図に示した１番目のＶａｌから　１５７番目のＬｅｕ
までで表わされるアミノ酸配列において、アミノ末端側
の１．２，３，４．５または６残基のアミノ酸を欠失さ
せた形の配列を有する欠失ＴＮＦをコードするＤＮＡ領
域を含むプラスミドを作成（）た。一方、第１２図記載
の方法により、第１図に示した１番目のＶａｌから　１
５７番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列におい
て、アミノ末端側の８．９．１０．１１、１１残基のア
ミノ酸を欠失させた形の配列を有する欠失ＴＮＦを」−
卜するＤＮＡ領域を含むプラスミドを作成した。

第１０図においで、１ラスミドＤＴＮＦ　４１６Ａのか
わりに、こうして得られた欠失ＴＮＦをコードするＤ　
Ｎ　Ａ配列を含むプラスミドを出発材料として用いるこ
とにより、第１図に示した１番目のＶａｌから　１５７
番目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、
アミノ末端側の１．２．３．４，５゜６、８．９．１０
．１１、１１残基のアミノ酸を欠失させ、かつ１５７番
目のＬｅｕのＰｈｅへの置換を含むような配列を有する
新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅ
ｔが結合しているポリベブヂドをコードするＤＮＡ領域
を含むプラスミドｐＴＮＦ　６２２．　ＤＴＮＦ　６２
３．　ｐＴＮＦ　６２４゜ｐＴＮＦ　６２５．　１）Ｔ
ＮＦ　６２６．　１）ＴＮＦ　６２７゜ＤＴＮＦ　６２
８．　　Ｉ）ＴＮＦ　６２９．　　Ｉ）ＴＮＦ　６３０
゜＋）ＴＮＦ６３１またはｐＴＮＦ６３２を得ることが
できた。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られた発現ベクターｐＡ　Ａ　４１゜
ヒ１〜ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドＤＴＮＦ４０１Ｎ
Ｎ又はＤＴＮＦ　４０１Ａ、又は実施例５で得られた、
各新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ１−株を、３０
〜５０μｇ　／　、２のアンピシリン、０．２％のグル
ツース及び４　Ｑ／ｌｅのカザミノ酸を含むＭ９培地［
０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％に２ト（ＰＯ４
−０，０５％Ｎａ（Ｊ−０，１％ＮＨｉ（Ｊ水溶液（ｔ
）Ｈ７，４）をオートクレーブ滅菌した後に、別途にＡ
−１−クレープ滅菌したＭ！３８０４水溶液及びＧ　ａ
　Ｃ１２水溶液をそれぞれ最１１ｉ１１１度２　ｗＭ及
び０．１　ｍＭになるように加える。］　　２５０ｊ１
１！に接種し、０［）メ、ρが０．７に達するまで、３
７℃で振どう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μ
ｇ／ｄ、の３−βインドールアクリル酸を培養液中に添
加し、さらに３７℃で１２時間振どう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｐ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　（Ｊを含む２０１Ｍリン酸
バッファー、　　Ｉ）Ｈ７゜４）を用い【菌体の洗浄を
行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッフ？−に
懸濁させ、超音波発生ｇ、置（久保田、　　２００Ｍ型
）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣
の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、ＴｒｉＳ−
１１（Ｊバッフ−ｙ　−（１）Ｈ６，８）　、　ＳＤＳ
、　２メルカプトエタノール ぞれ最終＋１１ｒ！１６０　ｍＭ，　２％２４％，　１
０％　ニ’Ｊ　ルヨうに加え、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気法ｌｌ］［鈴木，遺伝．３１。４３（１９
７７）］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＣ２
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ．　Ｋ．　ＬａｅｍｍｌＮ
ａｔｕｒｅ　、　　２２７。６８０　（　１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーン
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ラット）で染色し、ヒ
ト丁Ｎト遺伝子及び新規抗ｌＩＮ瘍活性ポリベプヂド遺
伝子の発現の確認を行なった。

実施例７（ｉｎｖ目「０抗癌活性の評価）１ｉ規抗腫瘍
活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活性測定は、
前記Ｒ　ｕｆｆの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリベブ
ヂドを含む大腸菌ライぜー１−を順次培地で希釈した試
料１００μすと、４　ｘ　ｉｏ５個／Ｉｄのａ度のマウ
スコ、９２９繊維芽Ｉｌｌ胞（ＡＴＣＣ　　ＣＣＬ９２
９）懸濁液１００μすを、９Ｇ穴の組織培養用マイクロ
プレーＩ・（］−スター）内で混合した。なおこの際に
、最終濃度１μｇ／〆のアクチノマイシンＤく」スメゲ
ン．萬有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたもの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μ磨の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５ｎｌにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザ
ー（東洋測温。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た１Ｉｌｒｆ＆数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値に
相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグラフによって
求め、その希釈倍率をユニットと定義する。発現型プラ
スミドＩ）ＴＮＦ６２１にコードされる新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート　１００μ文は１
０８ユニツト程度の活性を有しており、ヒトＴＮＦ蛋白
質を含む大腸菌ライゼートよりも高活性を有していた。

また、他の新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドを有する人ｌ＆！菌のライゼートにも、それぞ
れ著量の抗癌活性が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の部を有するプラスミド９丁Ｎ
ＦＩＢＲ，ｐ丁ＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を、
それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの作成方
法を、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作成方法
を、そして第８図はヒトＴＮＦＭ転子発現型プラスミド
＋１ＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したも
のである。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドＩ）ＴＮＦ　４１６Ａの作成方法を示した
ものである。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミド１ｌＴＮＦ６２１の作成方法を示
したものである。第１１図は欠失ＴＮＥをコードするＤ
ＮＡ領域を含むプラスミドを作成する際に用いた合成り
ＮＡの塩基配列を示したちの°であり、第１２図は欠失
ＴＮＦをコードするＤＮＡ領域を含むプラスミドの作成
方法を示したものである。 ＠４図 ＴＮＦ−８ ＴＮＦ−１０ ＴＮＦ−１２ 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 ｖｕｌｌ 第 図 第 ７図のＡ （１１−一−−−−−−→ ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣ
ＴＴＴＴＴＴＴＴ−（３”）（３−）−ＡＴＣＧＧＧＣ
ＧＧＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡ−（５
−）（２１−−→ 第 図 １ｎｄＤＩ Ｐｖｕ　ＩＩ（１） 韻 口 の ハ □ω （デンー（ＴＡＣ７７丁％ＧＡ’ＴＴ、ＡＴＴ４ＣＣＴ
ＴＣ丁θ＾ＴＡ−ｔｙ）Ｃ３）−Ｔ６ＡＡＡＣＣＣ”Ｔ
Ａ／’Ｉ丁八ＡＣＧへｘハΔ６ハＣＴＡＴ７Ｃｅ八−σ
′）０２ノ　　□ 聞ｌｌ夙０Ａ ｄ） （乙ｌ） 第　ｌノ　咽　の　Ｂ 的 ５′ （ハＺ） 聞 ｔｌ　（３／’Ｉ　Ｃ （Ｊ） ｖｒ／が１１０ Ｌ／ン １／后／ｌＥ １晃 ｉ ’４ｕ＠ｎＦ Ｃ２ノ ０６ノ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、アミノ
   末端側の１コ、２コ、３コ、４コ、５コ、６コ、７コ、
   ８コ、９コ、１０コ、１１コまたは１２コのアミノ酸残
   基を欠失させ、かつ１５７番目のＬｅｕのＰｈｅへの置
   換を含むような配列を有する新規生理活性ポリペプチド
   またはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプ
   チド。
2. （２）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、アミノ
   末端側の１コ、２コ、３コ、４コ、５コ、６コ、７コ、
   ８コ、９コ、１０コ、１１コまたは１２コのアミノ酸残
   基を欠失させ、かつ１５７番目のＬｅｕのＰｈｅへの置
   換を含むような配列を有する新規生理活性ポリペプチド
   またはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
3. （３）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、アミノ
   末端側の１コ、２コ、３コ、４コ、５コ、６コ、７コ、
   ８コ、９コ、１０コ、１１コまたは１２コのアミノ酸残
   基を欠失させ、かつ１５７番目のＬｅｕのＰｈｅへの置
   換を含むような配列を有する新規生理活性ポリペプチド
   またはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドに
   より形質転換された組換え微生物細胞。
4. （４）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴
   とする請求項３記載微生物細胞。
5. （５）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、アミノ
   末端側の１コ、２コ、３コ、４コ、５コ、６コ、７コ、
   ８コ、９コ、１０コ、１１コまたは１２コのアミノ酸残
   基を欠失させ、かつ１５７番目のＬｅｕのＰｈｅへの置
   換を含むような配列を有する新規生理活性ポリペプチド
   またはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドに
   より形質転換された組換え微生物細胞を培養し、培養物
   中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得ら
   れた培養物から新規生理活性ポリペプチドを分離するこ
   とを特徴とする、新規生理活性ポリペプチドの製造方法
   。
6. （６）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、アミノ
   末端側の１コ、２コ、３コ、４コ、５コ、６コ、７コ、
   ８コ、９コ、１０コ、１１コまたは１２コのアミノ酸残
   基を欠失させ、かつ１５７番目のＬｅｕのＰｈｅへの置
   換を含むような配列を有する新規生理活性ポリペプチド
   またはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプ
   チドを含有する医薬組成物。