JPH0359914B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 式： ［式中、R′は水素またはヒドロキシ、 Ｂはピリミジン塩基またはプリン塩基、 Ｒは、着色、蛍光、発光もしくは放射活性グル
ープまたはリガンド認識グループとして機能する
少なくとも１個のリポーターグループまたは固形
担体と既に結合しているかまたはそれらと結合し
得るリンカーアームである］ で示されるヌクレオチド残基を少なくとも１つ予
め選択された位置に有する、基本的に200ヌクレ
オチドを越えない予め選択された配列からなる実
質上純粋な一本鎖オリゴヌクレオチド。 ２ 該リンカーアームが立体的に耐容し得る部位
に結合している特許請求の範囲第１項記載の実質
上純粋な一本鎖オリゴヌクレオチド。 ３ 式中、Ｂがピリミジン塩基であり、そのC5
位に該リンカーアームが結合している特許請求の
範囲第１項記載の実質上純粋な一本鎖オリゴヌク
レオチド。 ４ 式中、Ｂがプリン塩基であり、そのC8位に
該リンカーアームが結合している特許請求の範囲
第１項記載の実質上純粋な一本鎖オリゴヌクレオ
チド。 ５ 該予め選択された配列の長さが、約10〜約40
ヌクレオチドである特許請求の範囲第１項記載の
実質上純粋な一本鎖オリゴヌクレオチド。 ６ 式： ［C2B式中、R′は水素またはヒドロキシ、 Ｂはピリミジン塩基またはプリン塩基、 Ｒは、着色、蛍光、発光もしくは放射活性グル
ープまたはリガンド認識グループとして機能する
少なくとも１個のリポーターグループまたは固形
担体と既に結合しているかまたはそれらと結合し
得るリンカーアームである］ で示されるヌクレオチド残基を少なくとも１つ予
め選択された位置に有する、基本的に200ヌクレ
オチドを越えない予め選択された配列からなる実
質上純粋な一本鎖オリゴヌクレオチドの化学的合
成法であつて、予め選択された配列を有する、
200ヌクレオチド未満の実質上純粋な一本鎖オリ
ゴヌクレオチドに、選択した反応性ヌクレオチド
を段階的に付加することからなり、該ヌクレオチ
ドまたは該オリゴヌクレオチドは3′または5′ヒド
ロキシ基に結合した反応性のリン含有基を含有
し、該反応性ヌクレオチドのうち少なくとも１個
は、式： ［式中、R′、ＢおよびＲは前記の定義と同意
義である］ で示されるヌクレオチド残基を形成することので
きるヌクレオチドであることを特徴とする方法。 技術分野 本発明は、細胞系または細胞不含系に於いて、
問題としている相補的な核酸配列の固定、位置づ
け、および検出に有用な一本鎖オリゴヌクレオチ
ドであつて、その塩基に、１またはそれ以上の検
出可能なリポーターグループとして機能し得る置
換基が結合しているか、または１またはそれ以上
の検出可能なリポーターグループが結合してい
る、１またはそれ以上のヌクレオチド単位を含ん
でいる、長さが200塩基単位以下の定まつた配列
の１本鎖オリゴヌクレオチドに関する。 発明の背景 ニツクトランスレーシヨン法（P.Rigbyら、J.
Mol.Biol.113：237−251、1977年）またはギヤツ
プ充填反応（G.Bourguignonら、J.Virol.20：290
−306、1976年）による２本鎖DNAへの放射性同
位元素の挿入を含む先行技術を用いて、標識した
２本鎖デオキシポリヌクレオチドを酵素を用いて
製造する方法は確立されている。具体的には、
DNaseにより切り目をつくり、DNAポリメラー
ゼを用いてDNA鎖に沿つて翻訳させる。このニ
ツクトランスレーシヨン過程では、大腸菌からの
DNAポリメラーゼ（Pol Ｉ）は、添加したデオ
キシヌクレオシド三燐酸の存在下で、２本鎖
DNAの１本鎖の切れ目領域の3′水酸基末端方向
へヌクレオチドを縮合していく。同時に、この酵
素は切れ目の5′末端からヌクレオチドを除去して
いく。もし添加するこの三燐酸体の１またはそれ
以上を、例えば³²P燐酸で標識しておくと、Pol
Ｉによる新しい鎖にこの標識が導入される。ギヤ
ツプ充填法によれば、制限酵素で切断した後のく
ぼんだ末端をPol Ｉからのクレノー断片または
T₄DNAポリメラーゼを用いて充填することがで
きる。 ニツクトランスレーシヨンおよびギヤツプ充填
法のいずれによつても、標識された２本鎖の
DNAが得られる。この生成物の長さはDNase
Ｉをどれくらい反応に加えるかによる。通常、標
識の30％が導入され、鎖の長さが400〜800ヌクレ
オチド単位になる様に行なう。生成物の長さは、
400〜800単位の範囲内では予測できない程度に不
均質である。標識したヌクレオチドと同様に酵素
を保存するために、通常各反応容器中、１マイク
ログラムのDNAだけを標識する。 Ｃ−５位を炭素鎖で修飾したピリミジン塩基を
持つた２本鎖ポリヌクレオチドが同様の方法で酵
素的に製造されている。これは、J.Sagiら
（Biochem.Biosphys.Acta.606：196−201、1980
年）によつて報告されているホモポリマーのプラ
イマー鋳型の酵素的伸長法、またはP.Langerら
（Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78：6633−6637、
1981年）によつて報告されているビオチンに共有
結合した2′−デオキシウリジン5′−三燐酸を使つ
て、DNAポリメラーゼによりニツクトランスレ
ーシヨン／ギヤツプ充填することによつて行なわ
れた。このビオチンは、アビジンのための認識部
位として機能し得る。 Rigbyら、BourguignonらおよびLangerらに
よつて記載されている酵素法によつて、同様の物
理的特性を持つた生成物が得られる。この酵素法
によつて製造されたポリヌクレオチドは、長さが
400〜800単位であり、出発物質として２本鎖ポリ
ヌクレオチドを必要とし、全ゆる場合に２本鎖ポ
リヌクレオチドを生産し、そして、予め選択され
た部位を標識化することができない。 更に、全ての酵素法は、ポリヌクレオチドの両
方の鎖を修飾し、生成した鎖を互いに分離するこ
とができない。この方法によれば、酵素は全ての
単位を、修飾した単位で置き換えるか、あるい
は、修飾されたヌクレオシド三燐酸および天然の
ヌクレオシド三燐酸の混合物を添加した場合は、
修飾された単位をランダムに挿入していく。更
に、Langerらの酵素法では、螢光性、発光性ま
たは抗原性のレポーターグループを挿入したポリ
ヌクレオチドを製造することはできない。この技
術のいずれを用いても、レポーターグループを持
つた、あるいは持たない、定まつた長さの、定ま
つた配列または一本鎖特性のオリゴヌクレオチド
を製造することはできない。更にまた、この先行
技術の方法では、レポーターグループが付着した
修飾された塩基を、ポリヌクレオチドの予め定め
られた位置に挿入することもできない。 Ｃ−８位を修飾されたアデニン塩基を取り入れ
た２本鎖ポリヌクレオチドも酵素法で製造されて
いる。これは、C.Vincentら（Nucl.Acids
Res.10：6787−6796、1982年）によつて報告され
ている様に、DNAフラグメントに８−アミノヘ
キシルアミノ−ATP（リボヌクレオチド）を挿入
することにより行なわれた。しかしこの方法は範
囲が限定されており、アデニンリボヌクレオチド
の三燐酸により3′−末端だけを標識することがで
きる。修飾したピリミジンヌクレオシドは挿入す
ることができない。更に、他の酵素法と同様、２
本鎖ポリヌクレオチドの両鎖が標識され、定まつ
た配列の短い（＜100単位）オリゴヌクレオチド
を製造することができない。 上記の先行技術としての酵素法は、置換された
ヌクレオチド5′−三燐酸の化学合成が必要であ
り、次いで酵素的な認識およびこの非天然の基質
の、切目をつけた２本鎖DNAへの挿入が必要で
ある。この様な方法は、予め選択した長さまたは
配列のポリヌクレオチドを製造することができ
ず、かつ、ここで使用するポリメラーゼや
DNaseは高価なものである。更に、これらの方
法は時間がかかり、非能率なものであり、高い酵
素活性を必要とし、２本鎖DNAに限定されてい
る。ほんの少量の、即ち数マイクログラムのはつ
きりしないポリヌクレオチド、通常制限フラグメ
ント、が生産されるだけであるので、これらを天
然起源のものから煩雑な方法で分離しなくてはな
らない。更に、DNAポリメラーゼは、螢光また
はジニトロフエニルの様な潜在的に有用なリポー
ターグループを認識したり挿入したりできないの
で、このポリヌクレオチド生成物においては、達
成し得る修飾の範囲が著しく制限される。 限られた生物学的応用のために、長いポリリボ
ヌクレオチド分子（RNA）の3′末端に１つの螢
光分子を取りつける方法がJ.G.J.Baumanらによ
つて開示されている（J.Histochem.
Cytochem.29：238、1981年）。この方法も、酵素
法を使つて天然の起源から煩雑な方法で分離した
極く少量（マイクログラム量）のRNAを使用し
ており、この方法には2′および3′の水酸基が必要
であるのでDNAに応用することやできない。ま
た、DNAに比較してRNAが化学的に遥かに不安
定であることが、この方法によつて製造されたポ
リリボヌクレオチドの応用範囲を狭くしている。 天然の核酸塩基を持つた、定まつた列のオリゴ
ヌクレオチドの非酵素的合成法は、S.A.Narang
ら（Meth.Enzymol 65：610、1980年）、R.
Letsinger（J.Org.Chem・45：2715、1980年）、
M.Matteucciら（J.Amer.Chem.Soc.103：3185、
1982年）およびG.Alvarado−Urbinaら
（Science 214：270、1981年）により報告され、
またはまとめられている。この様な合成法は、通
常、活性化したヌクレオチドモノマーを、生長す
るヌクレオチド鎖の遊離水酸基−含有末端単位と
カツプリングさせることにより鎖伸長を行なうも
のである。このカツプリングは、Narangらによ
つてまとめられているホスフエート・トリエステ
ル法、あるいはホスフアイト・トリエステル法の
１つと同様、燐含有基を介して行なわれる。後者
の内、LetsingerらおよびAlvarado−Urbinaら
の方法はホスホクロリダイトの化学を使用し、
Matt−eucciらの方法はホスホアミダイトの化学
を使用している。 上記のオリゴヌクレオチドの化学合成では、修
飾されていない、即ち天然の核酸塩基だけを挿入
するのであるから、その目的生成物は短かいフラ
グメントにあり、修飾されていない、即ち天然の
RANまたはDNAに似ている。この様な合成の目
的生成物は、標識もリポーターグループでも挿入
していないという点に注意すべきである。 ホモポリマーポリヌクレオチドの直接的な修飾
は、ポリウリジル酸系で報告されている（Bigge
ら、J.Carb.，Nucleosides，Nucleotides8：259、
1981年）。しかし報告された方法は範囲が限定さ
れており、有用な生成物を製造し得ない。その処
置法は、著しいポリヌクレオチドの開裂と破壊を
引き起し、除去できない金属イオン類が混在した
生成物が得られ、しかもこの方法は、DNAポリ
ヌクレオチドのシトシン残基だけを修飾できるに
過ぎない。更にこの方法は、特定の長さの定まつ
た配列のオリゴヌクレオチドを製造することがで
きず、チミンまたはプリン塩基を修飾することが
できず、そして予め選択した部位を修飾すること
ができない。 以上の記載から明らかな様に、従来、定まつた
配列のポリヌクレオチドは、既述した様な欠点、
特に時間、費用、生成物の長さ、配列および収率
に関する欠点を持つた酵素法によつてのみ生産さ
れて来た。更に、この様な方法は２本鎖生成物を
生産し得るに過ぎない。２本鎖ポリヌクレオチド
は、溶液中でアルカリまたは熱により変性し、短
時間、鎖を自然に分離することができる。しか
し、個々の１本鎖を物理的に、互いに分離するこ
とはできず、そしてまた、変性条件を取り除く
と、急速に自然の２本鎖の形に戻る。ハイブリダ
イゼーシヨンを行なうための条件は、自然復帰の
ための条件でもあるので、変性したポリヌクレオ
チドをハイブリダイゼーシヨンの条件下に置く
と、このポリヌクレオチドはその元の２本鎖配置
に戻る。従つて、どちらか一方の鎖と標的ポリヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーシヨンは、もう
一方の鎖との競合によつて制限を受ける。 ヌクレオシドの修飾は、例えば抗ウイルス性Ｃ
−５置換ピリミジンヌクレオシドの合成
（Bergstromら、J.Amer.Chem.Soc.98：1587−
1589、1976年；Ruthら、J.Org.Chem.43：2870−
2876、1978年；およびBergstromら、米国特許第
4247544並びに4267171号参照）またはＣ−８置換
アデニン誘導体の合成（Zappelliら、米国特許第
4336188並びに4199498号参照）において行なわれ
ている。これらのヌクレオシドおよびLangerら
およびD.Wardによつて報告されているもの（ヨ
ーロツパ特許出願第0063879号）は、本発明方法
に於いては有用でない。この様な報告されている
ヌクレオシドは、望ましくない部位での反応性が
高く、これを化学的方法によるオリゴヌクレオチ
ドの合成に使用すると、望ましくない副産物が得
られたり、コントロールできない合成が行なわれ
たり、所望の生成物が得られなかつたりする。更
に、上記のヌクレオシドは、置換基中に適当な部
位を持つておらず、リポーターグループを結合さ
せて修飾することができず、また、マスク（遮
蔽）した反応性官能基も持つていない。この様な
ヌクレオシドは、いずれも本発明方法に於いては
有用でない。 リポーターグループを持つた、あるいは持つて
いない、何らかの修飾された塩基が導入されてい
る定められた配列のオリゴヌクレオチドの化学合
成について記載された先行技術は全くない。 危険な、そして不安定な放射性同位元素を含ん
でいない、高品質の標識された一定配列の１本鎖
オリゴヌクレオチドの速やかな出現が待たれてお
り、この要求を満たすことが本発明の主たる目的
である。この目的が、予測可能な、優れた製品を
高収率で与える化学的方法、即ち非酵素的方法に
より達成された。更に詳しくは、本発明方法は、
定められた配列のオリゴヌクレオチド中への、多
種多様の選択された検出可能なリポーターグルー
プを修飾されたヌクレオチドの化学的導入を達成
したものであり、この様なオリゴヌクレオチド
は、例えば、問題としている相補配列に同定、位
置づけ、分離そして／または定量に有用である。 本発明のもう１つの目的は、標識した、定めら
れた配列の１本鎖オリゴヌクレオチドの化学的合
成に有用な新規なヌクレオチドを提供するもので
ある。 本発明方法は、標識した、定められた配列のオ
リゴヌクレオチドの新規な化学合成法であり、
種々の面で先行技術の酵素法に優るものである。
更に詳しくは、従来の酵素法による２本鎖性の、
不均質な予測不能な400〜10000塩基単位のものの
生産とは異なり、本発明方法は、好ましくは200
塩基単位以下の、均質な、予測可能な様に定めら
れた長さの、標識された、定められた配列の１本
鎖オリゴヌクレオチドの合成を可能にするもので
ある。 本発明方法によつて製造される生成物の収量
は、先行技術の酵素法によつて得られる２〜３マ
イクログラムの収量と違つて、数百〜数万マイク
ログラムのオーダーである。更に、本発明方法で
得られるオリゴヌクレオチドは、酵素法で得られ
る２本鎖と違つて、１本鎖である。オリゴヌクレ
オチド生成物が１本鎖形態であることは、２本鎖
ポリヌクレオチドの再ハイブリダイゼーシヨンに
つきものの相補鎖からの競合を回避できるのであ
る。 本発明の説明 本発明は、約200塩基単位の長さより短い、定
められた配列の１本鎖オリゴヌクレオチドであつ
て、１種またはそれ以上の検出可能なリポーター
グループとして機能し得るか、あるいはまた、１
種またはそれ以上の検出可能なリポーターグルー
プと結合し得る置換基が、その塩基の立体的に耐
容性のある部位（例えばピリミジンのＣ−５、プ
リンのＣ−８）に結合している様なヌクレオチド
単位を少なくとも１個含んでいる１本鎖オリゴヌ
クレオチドを提供するものである。さらに具体的
には、本発明は、式 ［式中、R′は水素またはヒドロキシ、 Ｂはピリミジン塩基またはプリン塩基、 Ｒは、着色、蛍光、発光もしくは放射活性グル
ープまたはリガンド認識グループとして機能する
少なくとも１個のリポーターグループまたは固形
担体と既に結合しているかまたはそれらと結合し
得るリンカーアームである］ で示されるヌクレオチド残基を少なくとも１つ予
め選択された位置に有する、基本的に200ヌクレ
オチドを越えない予め選択された配列からなる実
質上純粋な一本鎖オリゴヌクレオチドに関するも
のである。本発明はまた、定められた配列の１本
鎖オリゴヌクレオチドの化学的合成法、即ち、非
酵素的合成法を提供するものであり、該方法は、
活性化されたヌクレオチドモノマーと、伸長しつ
つあるヌクレオチド鎖の遊離の水酸基を持つた端
末単位とをカツプリングさせることからなり、該
モノマーおよび端末単位の少なくとも一方が、そ
の塩基の立体的に耐容性のある部位に、１種また
はそれ以上の検出可能なリポーターグループとし
て機能し得る、あるいは１種またはそれ以上の検
出可能なリポーターグループと結合し得る置換基
が結合することによつて修飾されていることを特
徴とするものである。 本発明方法によつて製造されるオリゴヌクレオ
チドは、１種またはそれ以上のピリミジンを塩基
とする、またはプリン塩基とする単位を含んでい
て、その単位はリボヌクレオチドであつてもデオ
キシリボヌクレオチドであつてもよく、その合成
前に、リポーターグループが結合する特定のヌク
レオチド単位と同様、そのリポーターグループ
も、予め選択される。 本発明を実施する上の最も好ましい態様 本発明の定められた配列の１本鎖オリゴヌクレ
オチドを合成するための好ましい化学的方法は、
活性化されたヌクレオチドモノマーと、伸長しつ
つあるヌクレオチド鎖の、遊離の水酸基を持つた
端末単位の少なくとも一方が、その塩基の立体的
に耐容性のある部位に、１種またはそれ以上の検
出可能なリポーターグループとして機能し得る、
あるいは１種またはそれ以上の検出可能なリポー
ターグループと結合し得る置換基が結合すること
によつて修飾されているという特徴を有する該ヌ
クレオチドモノマーと該端末単位をカツプリング
させることからなる。 リポーターグループと結合し得る本発明に於け
る置換基は、一般的に求核性の性質を示すもので
あると言うことができる。この様な置換基の例と
しては、第１級アミン、芳香族アミン、カルボン
酸、水酸基などを含んでいるものが挙げられる。 ヌクレオチドモノマーおよび端末単位の塩基
は、目的生成物であるオリゴヌクレオチド中に希
望する予め定められたヌクレオチド単位の配列が
得られる様に選択される。この様な塩基はプリン
類であるアデニン(A)、グアニン(G)、またはヒポキ
サンチン(H)の形をとるか、あるいはピリミジン類
であるウラシル（Ｕ）、シトシン(C)、またはチミ
ン（Ｔ）の形をとることができる。この様な塩基
はまた、天然から単離し得るその他の塩基の形を
とつていてもよい。 ヌクレオチド単位上の立体的に耐容性のある部
位とは、その単位の核酸塩基上の位置であつて、
その位置に、置換基が結合することによつて該単
位が修飾されるものであり、その際、生成物であ
るオリゴヌクレオチドと相補的核酸成分とのハイ
ブリダイゼーシヨンが重大な妨害を受けず、そし
て該置換基が１若しくはそれ以上のリポーターグ
ループとして機能したり、あるいは１若しくはそ
れ以上のリポーターグループに結合するのが立体
的に妨げられない様な位置であると定義すること
ができる。立体的に耐容性のある部位はプリン類
のＣ−８位、ピリミジン類のＣ−５位である。本
発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼー
シヨン用のプロープとして特に有用であるので、
置換基および／またはリポーターグループを取り
付ける修飾は、特定のハイブリダイゼーシヨンに
必要なピリミジンまたはプリン塩基上の部位で行
なわれてはいけない。修飾されてはいけない部位
には、アデニン塩基のN¹およびN⁶、グアニン塩
基のN¹，N²およびO⁶、シトシン塩基のN³および
N⁴などが含まれる。一般的に、ヘテロ原子（Ｎ
またはＯ）への置換は避けるべきである。 リポーターグループとは、芳香族および／また
は多環式グループであつてよく、適当な物理的ま
たは化学的検出系あるいは検出法によつて容易に
測定または検出し得る物理的あるいは化学的特性
を持つた化学的グループであると定義することが
できる。本発明に於けるオリゴヌクレオチドに有
用なリポーターグループは容易に検出できる。容
易な検出能は、色の変化、発光、螢光または放射
活性の様な特性によつて与えられる。あるいはま
た、リポーターグループがリガンド認識部位とし
て機能し得ることによつても、検出能は得られ
る。この様なグループは、機能的には着色、発
光、螢光、放射活性またはリガンド認識グループ
と呼ばれる。この様なグループの中には、通常の
検出技術、例えば比色検出、分光光度検出、螢光
検出または放射活性検出などによつて検出するの
に適したもの、あるいは、この様な通常の検出法
によつて検出できるグループを含んでいる特定の
リガンド−リガンド複合体の形成に関与し得るも
のなどがある。 本明細書においては、リポーターグループは、
適当な測定法または検出法を使つて容易に測定ま
たは検出できる物理的、化学的またはその他の特
性を持つた置換基であると定義される。ここで定
義されたリポーターグループには、適当な測定法
または検出法を使つて容易に測定または検出でき
る物理的、化学的またはその他の特性を持つた反
応生成物または複合体を最終的に与える１若しく
はそれ以上の相互作用、を開始させることができ
る置換基も含まれる。 この様なグループ、反応生成物または複合体が
持つている、あるいは引き起す測定可能な、ある
いは検出可能な特性の例は、色の変化、発光、螢
光または放射活性である。この様な特性は通常の
比色計、分光光度計、螢光分析計または放射活性
感応計を使つて測定または検出することができ
る。 ここで定義したリポーターグループによつて開
始され得る相互作用には、例えば比色法、分光光
度法、螢光法または放射活性検出法などによつて
容易に検出し得るグループまたは複合体を生成す
る適当に特異的で選択的なリガンド−リガンド相
互作用が含まれる。この様な相互作用は、タンパ
ク質−リガンド、酵素−基質、抗原−抗体、炭水
化物−レクチン、タンパク質−補助因子、タンパ
ク質−作動因子、核酸−核酸または核酸−リガン
ド相互作用などの形をとることがある。このリガ
ンド−リガンド相互作用の例として、ジニトロフ
エニル−ジニトロフエニル抗体、ビオチン−アビ
ジン、オリゴヌクレオチド−相補性オリゴヌクレ
オチド、DNA−DNA、RNA−DNAおよび
NADH−デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
当業者であれば、その他の有用な相互作用につい
ても思い浮ぶことであろう。 本発明方法に於いては、選択されたリポーター
グループ（群）は、ヌクレオチド鎖の端末単位に
カツプリングさせる前のヌクレオチドモノマーに
取り付けてもよいが、オリゴヌクレオチド生成物
ができ上つた後に、取り付けることもできる。オ
リゴヌクレオチド生成物におけるヌクレオチド単
位の配列は、その最終的な用途のための正確な特
異性を持つたオリゴヌクレオチドが得られる様
に、予め選定しておく。本発明のオリゴヌクレオ
チドは、組換えDNAおよび核酸の再ハイブリダ
イゼーシヨン技術が関与するその他の計画を行な
うのに有用である。その様な用途として、細胞系
または細胞不含系において注目している相補配列
の同定、位置づけ、分離および／または定量など
が挙げられる。更に詳しくは、その様な用途に
は、核酸成分のハイブリダイゼーシヨンが関与す
る全ゆる基礎的な生物学的操作または診断的応
用、あるいは、立体的に耐容性のある部位の修飾
によつてオリゴヌクレオチド生成物を固形担体に
結合させた場合の、アフイニテイークロマトグラ
フイーによる相補配列に精製（その後検出するか
否かは不間）が含まれる。 オリゴヌクレオチド生成物中のヌクレオチド単
位はプリンまたはピリミジンを塩基とするもので
あり、修飾された塩基を持つた単位とまざり合つ
た天然の塩基を持つた単位を含んでいてもよい。
この様な単位はリボヌクレオチド、またはデオキ
シリボヌクレオチドである。カツプリング工程
は、3′位が活性化されたモノマー単位と、伸長し
つつあるヌクレオチド鎖の端末単位の遊離の5′ヒ
ドロキシをカツプリングさせるのが好ましい。あ
るいは、5′位を活性化したモノマー単位を、ヌク
レオチド鎖の端末単位の遊離の3′ヒドロキシとカ
ツプリングさせることもできる。この端末単位
は、ヌクレオチドモノマーがカツプリングする時
の、伸長するヌクレオチド鎖の最初の単位、即ち
唯一の単位であるか、あるいは複数個のヌクレオ
チド単位群の端末の１つである。 本発明方法により、以下の一般式で示される定
まつた配列のオリゴヌクレオチドが生産される。 式中、ｎは１〜約199、好ましくは約５〜約60、
最も好ましくは約10〜約40、R′は水素またはヒ
ドロキシ、Ｂは天然に存在するプリンまたはピリ
ミジン塩基であるアデニン、グアニン、シトシ
ン、ウラシル、チミンまたはその他の天然に存在
する塩基であり、天然に存在する塩基を持つたヌ
クレオチド単位は、それぞれ修飾された塩基
（B^m）を持つた１またはそれ以上のヌクレオチド
単位と混じり合つている。修飾されたピリミジン
塩基（Py^m）は、Ｃ−５位が置換されたものであ
り、その典型的な例は以下の一般式で示されるウ
ラシルおよびシトシン塩基である： 修飾されたプリン塩基（Pu^m）はＣ−８位が置
換されており、その代表例は以下の一般式で示さ
れる修飾されたアデニンおよびグアニン塩基であ
る： 置換基Ｒは、１またはそれ以上のリポーターグ
ループとして機能し得る、あるいは１またはそれ
以上のリポーターグループに結合し得るという特
徴を持つている。修飾されたピリミジン塩基で
は、置換基Ｒは２またはそれ以上の炭素原子を含
んでおり、一方、修飾されたプリン塩基では、Ｒ
は１またはそれ以上の炭素原子を含んでいる。こ
れに関し、Ｒは以下の官能化された炭素鎖の１つ
の形をとるのが好ましい： Ｒ＝−CH＝CR₁R₂、−CH₂CHR₁R₂、−
CHR₁R₂、

【式】または

【式】 上記式中、R₁は水素またはアルキル、R₂はア
ルキル、アルケニル、アリールまたは官能化され
たアルキル、アルケニル、アリール（ここで官能
基には１またはそれ以上のアミン、アミド、ニト
リル、カルボン酸、カルボン酸エステル、ヒドロ
キシ、ジニトロフエニル、アミノベンゼンスルホ
ネートなどが含まれる）、Ｚは窒素、酸素または
硫黄の如き多価ヘテロ原子である。更に、R₂は
固形担体あるいは、例えば着色、螢光、発光、放
射活性またはリガンド認識基として機能する１ま
たはそれ以上のリポーターグループに結合してい
てよい。機能的な螢光基には、フルオレセイン、
ローダミンなど、およびそれらの付加物が挙げら
れる。機能的な発光基には、ルミノール、アクリ
ジン、ルシフエリン、ジオキセタン、ジオキサミ
ドなど、およびそれらの付加物が挙げられる。リ
ガント認識基には、蛋白質とのリガンド様相互作
用によつて認識し得る、あるいはその様なリガン
ド様相互作用を誘導し得るビタミン（例えばビオ
チン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン）、
抗原、例えばジニトロフエノール、炭水化物およ
びその他の官能基またはその様な基の付加物が含
まれる。核酸と相互作用し得るもう１つのオリゴ
ヌクレオチドは、リガン様相互作用を誘導し得る
基の例である。リガンド認識基はまた、認識によ
つて着色が生じる場合は、機能的な着色リポータ
ーグループとしても役立つ。例えば、ジニトロフ
エニルをリポーターグループとして使用した場
合、検出系として、色変化を生じるパーオキシダ
ーゼと結合した抗ジニトロフエニル抗体を用いた
既知の検出系を使用することができる。機能的な
放射活性基は、選ばれたリポーターグループ中に
放射活性要素を含んでいる。 本明細書に於いて、プリンまたはピリミジン塩
基という表現を使用する場合は、その様な塩基の
類似体をも含んでいるものとする。この様な類似
体には、デアザアデノシン（ツベルシジン、ホル
ミシンなど）の様なプリン塩基類似体、デアザウ
ラシル、デアザシトシン、アザウラシル、アザシ
トシンなどの様なピリミジン塩基の類似体が挙げ
られる。 式のオリゴヌクレオチドは、以下の式で示さ
れるモノマーヌクレオチド類似体単位から、化学
合成により製造するのが最もよい： ここでR₆＝メチル、クロロフエニル；Ｘ＝ク
ロロ、ジアルキルアミノ、モルホリノ 上記式中、R₃はトリチル（トリフエニルメチ
ル）、ジメトキシトリチル、または5′−ヒドロキ
シの為のその他の適当なマスキング基であり、Ｂ
およびR′は、適切ならばマスクされており、
はオリゴヌクレオチド生成物の合成に於ける鎖伸
長に際し、ヌクレオチド間結合形成に適した燐含
有基である。ヌクレオチド間結合形成に適した燐
含有基の好ましいものはアルキルホスホモノク
ロリダイトまたはアルキルホスホモノアミダイト
である。あるいは、ホスフエートトリエステルを
この目的に使用してもよい。このモノマー単体は
また、3′−ヒドロキシに結合したR₃および5′−ヒ
ドロキシに結合したを持ついてもよい。 一般に、「マスキング基」または「ブロツキン
グ基」という用語は、完全な官能基の化学反応性
を変化させ、望ましくない反応を起さない様に、
その官能基に第２の部分を結合させて、その官能
基を化学的に修飾することまたは「ブロツク」す
ることの機能的な表現である。この様な修飾は可
逆的であり、適当な処理によつてもとの官能基に
変換することができる。多くの場合、この様なマ
スキングは、形の上では構造的な機能性の相互変
換である。例えば第１級アミンはアセチル化によ
つてマスクされて置換アミドとなり、これはその
後適当な加水分解によつて第１級アミンにもどす
ことができる。 式の化合物には、その許容し得る共役酸塩も
含まれる。この様な塩の製造に使用し得る共役酸
は非反応性のカチオンを含むものであり、例えば
窒素含有塩基、例えばアンモニウム塩、モノー、
ジー、トリーまたはテトラー置換アミン塩など、
あるいは適当な金属塩、例えばナトリウム、カリ
ウムなどの塩である。 以下に本発明の製造工程を概説し、図式的に例
示する。その後、本発明をより具体的に例示し、
詳細な説明を挙げる。本発明はピリミジンを塩基
とするヌクレオチド単位およびプリンを塩基とす
るヌクレオチド単位の両者を含んでいるオリゴヌ
クレオチドに関するものであるので、合成過程で
ピリミジンおよびプリンを塩基とする両化合物を
使用するものを例示する。例示した個々のピリミ
ジンおよびプリンを塩基とする化合物は、それぞ
れピリミジンおよびプリン群の一例に過ぎず、そ
れらは、適当であるかまたは所望の場合、その製
造工程およびオリゴヌクレオチド生成物におい
て、それぞれの群の他のもので置き換え得るもの
と理解されるべきである。大部分に於いて、デオ
キシリボヌクレオチドを示したが、本発明はリボ
ヌクレオチドをも意図するものであると理解され
るべきであり、オリゴヌクレオチド生成物中に於
いてリボヌクレオチド化合物が必要である場合
は、デオキシリボヌクレオチド化合物をリボヌク
レオチド化合物で置き換えることができる。 本発明のより重要な点は、新規なオリゴヌクレ
オチドの合成法に於ける中間体として必須である
新しいヌクレオチド群を提供することである。こ
の様なヌクレオチドは全て、官能化された炭素鎖
と１またはそれ以上のアミドからなる置換基によ
つて修飾された塩基を持つており、このアミドの
窒素は、この塩基の立体的に耐容し得る部位に、
炭素鎖を介して結合している。ピリミジンを基礎
とするヌクレオシドの場合は、炭素鎖はＣ−５位
に結合しており、プリンを基礎とするヌクレオシ
ドの場合は、炭素鎖は多価ヘテロ原子、例えば窒
素、酸素または硫黄を介してＣ−８位で結合して
いる。更に、この様なヌクレオシドは、オリゴヌ
クレオチドの化学合成に適した、例えばジメトキ
シトリチルの様な基で、5′位（または3′位）が化
学的にブロツクされている。 この新規なヌクレオシド群に於いて、置換基は −CH₂CHR₁C_oH_2oＹ、−CH＝CR₁C_oH_2oＹ、

【式】または

【式】から選ばれる。ここに 於いてR₁は水素またはC_1-6低級アルキル、Ｙは
１またはそれ以上のアミド、置換アミド、置換ア
ミノまたは置換アミノアルキルフエニル基であ
る。より詳しくは、Ｙは１またはそれ以上の

【式】（Ｘは水素、弗素または塩素）を 含んでいてもよい。これらのヌクレオチドおよび
そのマスクされたものの合成は、実施例，，
，，，，，XIIおよびに記載してあ
る。好ましいヌクレオシドは、ピリミジンヌクレ
オシドのＣ−５に置換基

【式】（ｎ＝３〜12、Ｙ は

【式】）を持つている。最も好ましい のは、ピリミジン塩基がウラシルであるヌクレオ
シドである。 本発明方法は、選択したヌクレオシドの製造か
ら開始することができる。一般に、最も好ましい
ヌクレオシドは以下の如くして製造するのが最も
よい。Bergs−tromおよびRuthの方法〔J.Amer.
Chem.Soc.96：1587（1976）〕により、2′−デオキ
シウリジンから５−（メチル３−アクリリル）−
2′−デオキシウリジンを製造する。次いでこのヌ
クレオシドをピリジン中、1.05当量のジメトキシ
トリチルクロリドで処理して5′ヒドロキシをジメ
トキシトリチル（DMT）で保護する。２％のト
リエチルアミンを含有するクロロホルム中の０〜
10％メタノールのグラジエントで溶出するシリカ
クロマトグラフイーにより、得られた生成物を精
製する。精製した5′−DMT−５−（メチル３−ア
クリリル）−2′−デオキシウリジンを、周囲温度
にて、1N KOHで24時間処理し、メチルエステ
ルを加水分解する。得られた5′−DMT−５−（３
−アクリリル）−2′−デオキシウリジンを、ピリ
ジン中の過剰のジシクロヘキシルカルボジイミド
およびヒドロキシベンズトリアゾールで処理す
る。４時間後、２〜５倍過剰量の１，７−ジアミ
ノヘプタンを加え、反応物を一夜攪拌する。12〜
20時間後、10〜20倍過剰量の無水トリフルオロ酢
酸を加え、反応物を室温で４時間攪拌する。２％
のトリエチルアミンを含有するクロロホルム中の
０〜10％メタノールのグラジエンで溶出するシリ
カクロマトグラフイー、次いで１％のトリエチル
アミンを含むメタノールを溶出するセフアデツク
スLH−20を用いた排斥クロマトグラフイーによ
り、生成物を精製する。適切なフラクシヨンを集
めると、5′DMT−５−〔Ｎ−（７−トリフルオロ
アセチルアミノヘプチル）−１−アクリルアミド〕
−2′−デオキシウリジンが得られる。この生成物
は、実施例およびに記載したホスホクロ
リダイト法によるオリゴヌクレオチド合成に適切
である。別法として、この化合物は実施例およ
びに記載した方法を組み合せて製造することも
できる。この方法に於けるジアミノヘプタンを他
のジアミノアルカン（例えばジアミノプロパン、
ジアミノヘキサン、ジアミノドデカン）で置き換
えると、ｎが３，６または12であり、Ｒが

【式】である長 さの置換基を持つた他の化合物が得られる。この
様な２つのヌクレオシド、１つはピリミジン（ウ
ラシル）を塩基とし、他方はプリン（アデニン）
を塩基とするものを、この方法を例示する後記の
図式の最初に示した。次いで、反応１に示す様
に、例えばアデニンを基礎とするヌクレオシドの
６位のアミンにベンゾイル基（Bz）を結合させ
ることによつて、ヌクレオシドの塩基上の反応部
位にをマスクする。この様なマスキングについて
は、「Synthetic Procedures in Nucleic Acid
Chemistry」、第１巻、W.ZorbachおよびR.
Tipson 編、Wiley−Int−erscience，N.Y.，
1968に一般的に記載されている。反応１に示す様
に、例えば、トリフルオロアセチル基（Ac）を
結合させることによつて置換基上の非保護アミン
をマスクする。 次いで、ヌクレオシドの選択した3′または5′ヒ
ドロキシを、ジメトキシトリチル（DMT）基を
結合させることによつてマスクする。後に示す反
応２に於いては、5′−ヒドロキシをマスクし、
3′ヒドロキシを遊離、即ち反応し得る様にしてお
く。あるいはまた、3′ヒドロキシをマスクし、
5′ヒドロキシを遊離にしておいてもよい。 次いでこのヌクレオシドを、好ましくはその
3′ヒドロキシに、活性化部分を含んでいる燐含有
基を結合させることによつて、活性化されたヌク
レオチドモノマーに変換する。この修飾されたヌ
クレオシドを適当にブロツクする場合は、
Letsingerら、Matteucciらによつて記載された
方法、またはNarangによつてまとめられた方法
の改良法をオリゴヌクレオチド合成に使用するこ
とができる。Letsingerらによつて記載されてい
る様なホスホクロリダイト化学を用いる方法は実
施例−に詳しく述べてある。ホスホアミ
ダイト化学を使用するには、Dorperらの改良法
〔Nucleic Acids Res.11：2575（1983）〕と同様、
Matteucciらの方法の修正法を使用し、保護され
た、修飾されたヌクレオシドをメチルクロロ
（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホアミデートま
たはメチルクロロ−ホスホモルホリデートでホス
フイチル化する。あるいは、保護され、修飾され
たヌクレオシドを室温でトリメチルホスフエート
中、1.2当量のクロロフエニルジクロロホスフエ
ートでホスホリル化し、次いで水に入れて、修飾
されたヌクレオシドの3′−クロロフエニルホスフ
エート付加物を得ることができる。この様な付加
物は、Narangらによつて例示的にまとめられて
いる様に、ホスホトリエステル・アプローチの修
飾に有用である。反応３の図式は、塩素が活性化
部分として機能するホスホモノクロリダイト基を
ヌクレオシドの3′ヒドロキシに結合させることに
よる、式の活性化モノマーヌクレオチド単位の
合成を示している。 選択された活性化ヌクレオシドモノマー、即ち
ウラシルを塩基とするモノマーまたはアデニンを
塩基とするモノマーの、伸長しつつあるヌクレオ
チド鎖の端末単位へのカツプリング即ち縮合は、
図式の反応４に示してある。ヌクレオチド鎖は、
その右側末端に、天然に存在する基およびその
3′ヒドロキシに結合したマスキング基R₄または固
形の担体を持つたヌクレオシド単位を含む様に描
いてある。例示した鎖はまた、天然に存在する塩
基を持つた１またはそれ以上（n′）のヌクレオチ
ド単位を含んでおり、この単位はヌクレオシド単
位の5′ヒドロキシに結合しており、ヌクレオチド
単位の末端のものは5′位に遊離のヒドロキシを持
つている。このカツプリング反応に於いて、モノ
マーの塩素が端末単位の遊離ヒドロキシの水と反
応して除去され、かして、図示した様に端末単位
の酸素がモノマーの燐にカツプリングし、このモ
ノマーがヌクレオチド鎖の新しい端末単位とな
る。 次いでDMT5′ブロツキング基を除去し、さら
に活性化ヌクレオチドモノマー単位を次々とカツ
プリングさせてヌクレオチド鎖を伸長させ得る様
にする。鎖に付加するヌクレオチド単位は予め選
択することができ、天然に存在する塩基または修
飾された塩基のいずれかである。天然に存在する
塩基を持つた１またはそれ以上（n″）のヌクレオ
チド単位を付加することによる更なる鎖の伸長を
図止の反応4aに示す。 選択された長さ及び配列のオリゴヌクレオチド
を合成したら、その端末単位からDMT基を除去
し、マスクした反応性基を脱マスクする。反応性
基が脱マスクされた修飾されたウラシルおよびア
デニン塩基の例を反応５に図式的に示す。鎖の最
初のヌクレオチド単位が固形担体R₄に結合して
いる場合は、その固形担体から鎖をり離す。脱マ
スクの適切な順序は予め選択することができる。 修飾された塩基の置換基が、オリゴヌクレオチ
ド生成物の意図する用途に於いてリポーターグル
ープとして機能し得ない場合は、反応６に例示し
た様に、適当なリポーターグループR₅をその様
な置換基に結合させることができる。反応６は、
塩基のそれぞれの置換基に結合したリポーターグ
ループを持つたそれぞれの塩基を示している。 上記式中、例えば、オリゴヌクレオチド生成物
中のB^mは以下の通りである： オリゴヌクレオチド生成物に、各種の有用なリ
ポーターグループ（R₅）を結合することができ
る。例えば： リポーターグループを持つたオリゴヌクレオチ
ド生成物（R₅＝ビオチンまたはフルオレセイ
ン） 本発明の工程を一般的に説明し、図式化して示
したが、その説明した各反応について、以下によ
り詳細に説明する。 反応１について、シトシンのN⁴、アデニンの
N⁶、グアニンのN²、および修飾された塩基のア
ルキルまたはアリールアミンの様な化学的に反応
性のあるアミンの、適当なマスキング基によるマ
スキングは、アルコール類、ピリジン類、ルチジ
ン類、クロロホルムの様な適当な溶媒中、ヌクレ
オシドを過剰量の適当な酸無水物と、０℃110℃
の範囲の温度、通常20℃〜80℃で、約１〜24時間
反応させることにより好適に実施することができ
る。適当な酸無水物には無水酢酸、無水トリフル
オロ酢酸、無水安息香酸、無水アニス酸などがあ
る。好ましいのは無水酢酸、無水トリフルオロ酢
酸、無水安息香酸および無水イソ酪酸である。 反応２に於ける5′−ヒドロキシのマスキング
は、ヌクレオシドをやや過剰量の適当な酸に不安
定なマスキング剤、例えばトリチルクロライド、
モノメトキシトリチルクロライド、ジメトキシト
リチルクロライド（DMTCl）トリメトキシトリ
チルクロライドなどと反応させることにより好都
合に行なうことができる。好ましいのはジメトキ
シトリチルクロライドである。典型的な反応は、
例えばピリジン類、ルチジン類、トリアルキルア
ミン類などの適当な溶媒中、−20℃〜120℃の範囲
の温度、通常20℃〜100℃の温度で約１〜48時間
反応させることである。好ましい反応では、ピリ
ジン中のDMTCl1.1当量を使用し、室温で約２時
間反応させる。 上記の各反応のそれぞれの生成物は、それを次
の反応の出発物質として使用する前に、分離／お
よびまたは単離するのが一般的に好ましい。分離
および単離は、例えば蒸発、過、結晶化、カラ
ムクロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイー
などの適当な精製法によつて行なうことができ
る。典型的な分離および単離法の具体的な例につ
いては、後記の適当な実施例を参照することがで
きる。しかし、勿論その他の同等の分離法を採用
することもできる。また、典型的な反応条件（例
えば温度、モル比、反応時間）が与えられてはい
るが、その様な範囲以上または以下の条件も、通
常好適性には劣るものの、使用し得るということ
も理解されねばならない。 反応３に示したホスフアイト体への活性化は、
ヌクレオシド化合物を、適当な溶媒中、−90℃〜
60℃の温度で、１分〜２時間、適当なホスフイチ
ル化剤で処理することにより、最も好適に行なう
ことができる。好適なホスフイチル化剤には、メ
チルホスホジクロリダイト、ｏ−クロロフエニル
ホスホジクロリダイト、ｐ−クロロフエニルホス
ホジクロリダイト、メチルホスホ（ジアルキルア
ミノ）モノクロリダイトなどが含まれる。適切な
溶媒としては、０〜20％の適当な塩基（通常１〜
５容量％）、例えばルチジン類、コリジン類、ト
リアルキルアミンなどを含有しているピリジン、
ルチジン類、アセトニトリル、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、クロロホルムなどが挙げられ
る。好ましいホスフイチル化剤はメチルホスホジ
クロリダイト、ｏ−クロロフエニルホスホジクロ
リダイト、およびメチルホスホ（ジ−イソプロピ
ルアミノ）−モノクロリダイトである。好ましい
ホスフイチル化条件は、５％の２，６−ルチジン
を含有しているアセトニトリルまたはピリジン中
の0.9当量のメチルホスホジクロリダイトを用い
て５〜10分間、室温またはそれ以下で行なうこと
である。 伸長しつつあるヌクレオチド鎖に、修飾された
ヌクレオチドモノマー体を化学的に挿入して、一
定のヌクレオチド配列を作成する例は反応４およ
び4aに示してある。典型的な条件は、適当な溶
媒中、−20℃〜50℃、好ましくは周囲温度で、約
１〜60分間行なうことである。好適な溶媒混合物
は、０〜20％の適当な塩基（通常１〜５容量％）、
例えばルチジン類、コリジン類、トリアルキルア
ミン類などを含有しているピリジン、ルチジン
類、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオ
キサン、クロロホルムなどである。伸長しつつあ
る鎖は溶解性であるか、非溶解性であるか、また
は当技術分野で知られている適当な化学的方法に
よつて適当な固形担体に結合されているかであ
る。固形担体に結合しているのが好ましい。更
に、伸長しつつある鎖は、既に１またはそれ以上
の修飾されたヌクレオシド体を含有している場合
もあれば、そうでない場合もある。 反応４で伸長しつつある鎖に活性化モノマーを
縮合させた後、その最初の生成物を適当な試薬で
処理して中間体ホスフアイトトリエステルの酸化
を行ない、要すればオリゴヌクレオチドの未反応
の5′−ヒドロキシをブロツクするためにキヤツピ
ングを行ない、5′−DMT基を除去する。ホスフ
アイトトリエステルの酸化は、適当な溶媒、例え
ばテトラヒドロフラン／水／ルチジン混合物中
で、0.1〜５重量／容量％のヨウ素で処理するこ
とにより行なうことができる。未反応の5′−ヒド
ロキシの化学的キヤツピングは、例えばテトラヒ
ドロフラン／ルチジン混合物中、無水酢酸および
４−ジメチルアミノピリジンを使つてアセチル化
またはアシル化することで達成し得る。5′−ブロ
ツキング基、通常DMT、の除去は、非プロトン
性溶媒中緩和な有機酸で、例えばクロロホルム酢
酸またはジクロロメタン中の１〜５容量％のジク
ロロ酢酸またはトリクロロ酢酸で処理することに
より、最も都合よく行なうことができる。DMT
を除去された伸長しつつあるヌクレオチド鎖は、
活性化されたモノマーによる次の反応で更に伸長
するための受容体となり、その結果、反応4aに
示す様に、所望の長さおよび配列にオリゴヌクレ
オチドが得られる。 所望の配列のオリゴヌクレオチドが製造された
ら、反応５を行なつてオリゴヌクレオチド生成物
を得る。この目的で、チオフエノール処理をして
ホスフエートトリエステルからメチルマスキング
基を除去し、適当な水性アルカリまたはアンモニ
ア処理をして保護されたアミンからベンゾイル、
アセチル、イソブチル、トリフルオロアセチルま
たはその他の基を除去し、そして／または固形担
体から生成物を脱離させる。オリゴヌクレオチド
生成物からのDMTの除去は、周囲温度〜40℃に
於いて、水性酢酸の様な緩和な酸で10〜60分間適
当に処理することにより行なう。この様な反応
は、最後の精製段階で、あるいはその前に行なう
ことができる。最後の精製は適当な方法、例えば
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高圧液体クロ
マトグラフイー（HPLC）、DEAE−セルロース
上の逆相またはアニオン交換、またはこれらの方
法の組合せによつて行なう。 ここに述べたオリゴヌクレオチドの合成法は、
修飾されたデオキシリボヌクレオシド（R′はＨ）
または修飾されたリボヌクレオシド（R′はヒド
ロキシ）にも利用できる。リボヌクレオシドを使
用する場合は、適当なマスキング基、例えばシリ
ルエーテルで与えられるもの、によつて2′−ヒド
ロキシをマスクする。アラビノースおよび3′−デ
オキシリボースを含むその他のリボース体も、所
望のオリゴヌクレオチドを製造する方法に使用す
ることができる。 ヌクレオチド塩基を修飾する置換基は、それ自
体が１またはそれ以上のリポーターグループとし
て機能してもよい。その例は、ジニトロフエニル
基を含んでいる置換基である。置換基がリポータ
ーグループとして機能し得ない場合は、鎖伸長の
カツプリング反応の前または後で、１またはそれ
以上のリポーターグループと結合することができ
なければならない。選択されたオリゴヌクレオチ
ド生成物は、適当な試剤と反応してその様なリポ
ーターグループと結合する。例えば、修飾された
塩基をオリゴヌクレオチドに挿入し、その置換基
のR₂が１またはそれ以上の１級アミンを含んで
いる場合は、適当な緩和な条件を用いてアミン−
反応性基、例えばイソシアネート、イソチオシア
ネート、活性カルボン酸共役体、エクスポキシド
または活性芳香族化合物とカツプリングさせてア
ミド、ウレア、チオウレア、アミンまたは芳香族
アミン結合を生成させる。例えば、反応５の図式
に示した様に、１級アミンを持つた置換基で修飾
されたウラシルまたはアデニン塩基を含んでいる
オリゴヌクレオチドは、フルオレセイン・イソチ
オシアネートの様な適当な試剤と反応させて、反
応６に示した様に、置換基に結合したリポーター
グループR₅（フルオレセイン）を得ることができ
る。同様にして結合することができるその他のリ
ポーターグループには、多種多様の有機部分、例
えばフルオレセイン類、ローダミン類、アクリジ
ニウム塩類、ジニトロフエニル類、ベンゼンスル
ホニル類、レミノール類、ルシフエリン類、ビオ
チン類、ビタミン類、炭水化物などが含まれる。
好適な活性リポーターグループは市販のものを使
用できるが、例えば「Bioluminescence and
Chemiluminescence」に一般的に記載されてい
るタイプの方法〔M.DeLucaおよびW.McElroy
編、Acad.Press、ニユーヨーク（1981）〕、D.
RoswellらまたはH.Schroederらの方法〔Meth．
Enzymol．LX₁₁、1978〕およびそこに引用され
ている文献の方法によつて合成することができ
る。 典型的には、リポーターグループの付加は、望
ましくは水性溶媒中、R₂がC_oH_2oNH₂である修飾
された塩基の置換基を、過剰の選択されたリポー
ターグループと、約−20℃〜50℃（好ましくは20
℃〜40℃）の範囲の温度で１〜24時間反応させる
ことによつて達成するのが好都合である。好適な
溶媒は水性緩衝液および０〜50％の有機溶媒、例
えば低級アルコール、テトラヒドロフラン、ジメ
チルホルムアミド、ピリジなどである。好ましい
リポーターグループ反応体には、フルオレセイ
ン・イソチオシアネート類、ジニトロフエニルイ
ソチオシアネート類、フルオロジニトロベンゼ
ン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルビオチン、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルジニトロベンゾ
エート、イソチオシアネート類、例えばアミノブ
チルエチルイソルミノールイソチオシアネートな
ど、カルボキシフルオレセインの活性エステル、
ローダミン、ビオチン付加物、ジオキセタン類、
ジオキサミド類、カルボキシアクリジン類、炭水
化物などが含まれる。 更に、オリゴヌクレオチド生成物が、Ｒが１ま
たはそれ以上のカルボン酸を含んでいる修飾され
た塩基を含有している場合は、例えば１級アルキ
ルアミン類と緩和に縮合させてアミド結合を生成
させ得る。典型的には、これは、望ましくは水性
溶媒中、オリゴヌクレオチドを、１級アミンを含
有している過剰のリポーターグループと、水溶性
カルボジイミドの様な適当な縮合剤の存在下で、
約−20℃〜50℃（好ましくは20℃〜40℃）の範囲
の温度で、６〜72時間反応させて行なうのが好都
合である。この種の反好ましいリポーターグルー
プには、（アミノアルキル）−アミノ−ナフタレン
−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド類、アミノ−
フルオレセイン類、アミノローダミン類、アミノ
アルキルルミノール類、アミノアルキルアミノベ
ンゼンスルホニル付加物、アミノ糖類などが含ま
れる。更に、最初のオリゴヌクレオチド生成物の
化学合成を、置換基がその様なリポーターグルー
プを含んでいる修飾されたヌクレオチドモノマー
を用いて行なつてもよい。その様なグルプをマス
クする必要がある場合には、カツプリング反応の
間に適当にマスクされる。一方、ある種のリポー
ターグループはマスキングを必要としない。例え
ば、マスキングされていないニトロフエニル付加
物は、カツプリング反応中、悪影響を受けること
なく修飾されたヌクレオチドモノマー上に存在し
得る。 訪発明方法で使用されるリポーターグループ
は、通常芳香族系、多芳香族系、環系、および多
環系の有機部分を含んでおり、これは更に、窒
素、酸素、硫黄の様なヘテロ原子を含むことによ
つて官能化されているものである。 オリゴヌクレオチド生成物は１つのタイプ以上
の修飾、または１つ以上の修飾された塩基を含む
ことができる。このタイプのオリゴヌクレオチド
の例は、以下の構造式で示されるものである： 上記式中、C^mは５−（３−アミノプロピル）シ
トシン、U^mは５−〔Ｎ−（４−アミノブチル）−１
−アクリルアミド〕ウラシル、A^mは８−〔６−
２，４−ジニトロフエニル〕−アミノヘキシル〕
アミノアデニンである。この生成物を更にフルオ
レセイソ・イソチオシアネートと反応させて修飾
し、C^mおよびU^m上にフルオレセインリポーター
グループを付与する。 この様なオリゴヌクレオチド生成物は、本発明
方法によつて可能となつたオリゴヌクレオチド生
成物中の修飾された、および修飾されていないヌ
クレオチド単位の選択の多様性を示している。よ
り詳細に述べると、この様なオリゴヌクレオチド
は、同じか、または異なつたタイプのリポーター
グループ機能を提供する置換基によつてその塩基
が修飾されている１種以上のヌクレオチド単位を
用いる例を示している。また、その塩基が、リポ
ーターグループが結合している置換基によつて修
飾されている単位、即ちC^mおよびU^mが例示され
ており、一方A^mは、その塩基が、それ自体にジ
ニトロフエニル基を含んでいるがためにリポータ
ーグループとして機能し得る置換基によつて修飾
されている単位の例である。更にこの様なオリゴ
ヌクレオチドは、それが同じタイプの１以上のヌ
クレオチド単位を含有し得ること、および修飾さ
れた塩基を持つた単位と混合した、非修飾塩基を
持つた単位を含有し得ることを示している。 反応６に示した様に、置換基の１級アミンにリ
ポーターグループを結合させる代りに、２者択一
的にこの様なアミンまたはその他の基を、適当に
活性化された固形担体に結合させることができ
る。こうすることによつて、修飾された塩基を介
してその様な担体に共有結合している一定のオリ
ゴヌクレオチド配列が得られる。この様な固形担
体は、相補的な核酸成分の検出および単離に有用
である。あるいはまた、修飾されたヌクレオチド
モノマーを、鎖伸長カツプリング反応４の前に固
形担体とカツプリングさせ、それによつてカツプ
リング反応中にその様なモノマーのための固形担
体を提供してもよい。 当業者が本発明を実施し得る様に、以下に具体
的な実施例を挙げる。この実施例は本発明の範囲
を制限するものと解釈してはならず、単に本発明
の例示であり、代表例であると解釈すべきであ
る。構造を明らかにする為に、前記の工程の図式
を参照するとよい。 実施例 この実施例では修飾されたヌクレオシド前駆
体、５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロ
ペニル）−2′−デオキシウリジンの合成について
説明する。 ５−クロロマーキユリー−2′−デオキシウリジ
ン（3.6ｇ、7.8mmol）をメタノール200mlに懸濁
する。Ｎ−アリルトリフルオロアセトアミド
（6.8ml、55mmol）を加え、次いでメタノール中
の0.2Nリチウムテトラクロロパラジウム酸塩41
mlを加える。室温で18時間攪拌した後、この反応
物を重力過して黒色固型のパラジウムを除去
し、黄色のメタノール性液を200mgづつのホウ
水素化ナトリウムで５回処理し、次いで減圧濃縮
して固型の残留物を得る。残留物をシリカゲル上
フラツシユ・カラムクロマトグラフイーにかけ、
クロロホルム中のメタノール15容量％混液で溶離
して精製する。生成物が適当に精製されている画
分を合わせて減圧濃縮し、５−（３−トリフルオ
ロアセチルアミノプロペニル）−2′−デオキシウ
リジンの結晶2.4ｇを得る。UVλ_nax291nm
（ε7800）、λ_nio266nm（ε（4400）；TLC（シリカ、
クロロホルム中メタノール15容量％溶液で溶離）
R_f＝0.4。 実施例 この実施例では修飾されたヌクレオシド前駆体
５−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘプチ
ル）−１−アクリルアミド〕−2′−デオキシウリジ
ンの合成について説明する。 ５−クロロマーキユリー−2′−デオキシウリジ
ン（3.6ｇ、7.8mmol）をメタノール200mlに懸濁
する。Ｎ−（７−トリフルオロアセチルアミノヘ
プチル）−アクリルアミド（55mmol）を加え、
次いでメタノール中の0.2Nリチウムテトラクロ
ロパラジウム酸塩41mlを加える。室温で18時間攪
拌した後、この反応物を重力過して黒色固型の
パラジウムを除く。黄色のメタノール性液を
200mgづつのホウ水素化ナトリウムで５回処理し、
次いで減圧濃縮して固型の残留物を得る。残留物
をシリカゲル上フラツシユ・カラムクロマトグラ
フイーにかけ、クロロホルム中のメタノール10容
量％混液で容離して精製する。生成物が適当に精
製されている画分を合わせて減圧濃縮し、５−
〔Ｎ−（７−トリフルオロアセチルアミノヘプチ
ル）−１−アクリルアミド〕−2′−デオキシウリジ
ンの結晶2.8ｇを得る。UVλ_nax302nm（ε18000）、
λ_nio230nm、280nm；TLC（シリカ、クロロホル
ム中メタノール15容量％混液で溶離する）R_f＝
0.3。 実施例 この実施例では、反応で示した如く、5′−ジメ
トキシトリチル−５−（３−トリフルオロアセチ
ルアミノプロペニル）−2′−デオキシウリジンの
製造のための、5′−ヒドロキシのマスキングにつ
いて説明する。 ５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペ
ニル）−2′−デオキシウリジン（2.4ｇ）を２回、
ピリジンから完全に蒸発させ、次いでピリジン40
ml中で攪拌する。ジメトキシトリチル（DMT）
クロライド（2.3ｇ、6.6mmol）を加え、この混
合物を室温で４時間攪拌する。薄層クロマトグラ
フイー（シリカ上、クロロホルム中のメタノール
10容量％混液で溶離する）によつて反応の完了を
確認した後、この反応物を濃縮して残留固型物を
得る。この残留物をシリカ上カラムクロマトグラ
フイーにかけ、流速の速い不純物をクロロホルム
で全て溶離してしまつてから、生成物をクロロホ
ルム中のメタノール５容量％混液で溶離する。次
いでこの残留物を濃縮し、5′−ジメトキシトリチ
ル−５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロ
ペン−１−イル）−2′−デオキシウリジンを、白
色のふわふわした（毛羽立つた）固形物（４ｇ）
として得る。この生成物は熱時分解する；
UVλ_nax291nm、λ_nio266nm；（TLC（シリカ、ク
ロロホルム中メタノール10容量％混液で溶離す
る）：R_f0.6である。 実施例 この実施例では5′−ジメトキシトリチル−５−
（３−トリフルオロアセチルアミノプロピル）−
2′−デオキシウリジンを得るための、環外二重結
合に対する水素添加、並びに5′−ヒドロキシのマ
スキングについて説明する。 実施例およびのヌクレオシド前駆体の合
成、並びに5′−ヒドロキシマスキングを繰返す
〔ただし、DMTクロライドの添加前に、精製５
−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペニル）
−2′−デオキシウリジンをメタノール中、10％パ
ラジウム−炭素触媒上、室温で攪拌しながら２大
気圧の水素で処理する〕ことにより、5′−ジメト
キシトリチル−５−（３−トリフルオロアセチル
アミノプロピル）−2′−デオキシウリジンを製造
する。 実施例からにおいては、その他の修飾され
たウラシルヌクレオシドの合成、次いで、反応２
で示したヒドロキシのマスキングについて説明す
る。 実施例 Ｎ−アリルトリフルオロアセトアミドを下記の
化合物群（番号１〜８）に置き換え、実施およ
びの操作を繰返してヌクレオシド前駆体の合
成、並びに5′ヒドロキシのマスキングを行ない、
それぞれ、下記の化合物群（番号、1′〜8′）を得
る：即ち、以下の化合物に置き換える： １ Ｎ−（３−ブテニル）トリクロロアセトアミ
ド ２ Ｎ−（５−ヘキセニル）トリフルオロアセチ
ルアミド ３ Ｎ−（２−メチル−２−プロペニル）トリフ
ルオロアセトアミド ４ Ｎ−（４−エテニルフエニルメチル）トリフ
ルオロアセトアミド ５ Ｎ−（１−メチル−３−ブテニル）トリフル
オロアセトアミド ６ Ｎ−（12−トリクロロアミノドデシル）アク
リルアミド ７ （ペルトリフルオロアセチルポリリシル）ア
クリルアミド ８ Ｎ−（３−トリフルオロアセチルアミドプロ
ピル）アクリルアミド、そして以下の化合物を
得る： 1′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−トリク
ロロアセチルアミノブテン−１−イル）−2′−
デオキシウリジン 2′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（６−トリフ
ルオロアセチルアミノヘキセン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 3′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノ−２−メチルプロペン−
１−イル）−2′−デオキシウリジン 4′ 5′−ジメトキシトリチル−５−〔２−（４−ト
リフルオロアセチルアミノメチルフエニル）エ
テン−１−イル〕−2′−デオキシウリジン 5′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−トリフ
ルオロアセチルアミノ−４−メチルブテン−１
−イル）−2′−デオキシウリジン 6′ 5′−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（12−ト
リクロロアセチルアミノドデシル）−１−アク
リルアミド〕−2′−デオキシウリジン 7′ 5′−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（ペルト
リフルオロアセチルポリリシル）−１−アクリ
ルアミド〕−2′−デオキシウリジン 8′ 5′−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（３−ト
リクロロアセチルアミノプロピル）−アクリル
アミド〕−2′−デオキシウリジン 実施例 ５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペ
ニル）−2′−デオキシウリジンを下記の５−置換
−2′−デオキシウリジン類（番号、９〜18）に置
換え、実施例の5′ヒドロキシのマスキング操作
を繰返すことにより、下記の生成物群（9′〜18′）
を製造する。即ち、以下の化合物に置き換える： ９ ５−（プロペン−１−イル）−2′−デオキシウ
リジン 10 ５−（カルブトキシエチル）−2′−デオキシウ
リジン 11 ５−（３−カルブメトキシルプロパン−１−
イル）−2′−デオキシウリジン 12 ５−（４−カルブメトキシ−２−メチルブテ
ン−１−イル）−2′−デオキシウリジン 13 ５−（３−シアノプロペン−１−イル）−2′−
デオキシウリジン 14 ５−（４−シアノ−２−メチルブテン−１−
イル）−2′−デオキシウリジン 15 ５−〔２−（４−カルブメトキシフエニル）エ
テン−１−イル〕−2′−デオキシウリジン 16 ５−（４−アセトキシブテン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 17 ５−（４−アセトキシブタン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン、そして以下の5′−ジメ
トキシトリチル−５−アルキル−2′−デオキシ
ウリジン類を得る： 9′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（プロペン−
１−イル）−2′−デオキシウリジン 10′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（２−カルブ
メトキシエチル）−2′−デオキシウリジン 11′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−カルブ
メトキシプロパン−１−イル）−2′−デオキシ
ウリジン 12′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−カルブ
メトキシ−２−メチルブテン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 13′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−シアノ
プロペン−１−イル）−2′−デオキシウリジン 14′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−シアノ
−２−メチルブテン−１−イル）−2′−デオキ
シウリジン 15′ 5′−ジメトキシトリチル−５−〔２−（４−
カルブメトキシフエニル）エテン−１−イル〕
−2′−デオキシウリジン 16′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−アセト
キシブテン−１−イル）−2′−デオキシウリジ
ン 17′ 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−アセト
キシブタン−１−イル）−2′−デオキシウリジ
ン 18′ 5′−ジメトキシトリチル−５−〔４−（２，
４−ジニトロフエニル）ブチル〕−2′−デオキ
シウリジン 実施例 ５−クロロマーキユリー−2′−デオキシウリジ
ンを５−クロロマーキユリーウリジンで置き換え
て実施例−のヌクレオシド前駆体の合成およ
び5′−ヒドロキシのマスキング法を繰返して行な
うことにより、対応する5′−ジメトキシトリチル
−５−置換ウリジン類を製造する。 実施例−XIは修飾されたシトシンヌクレオシ
ドの合成を例示するものである。シトシンヌクレ
オシド類は、アデノシンヌクレオシド類と同様
に、ウラシルヌクレオシド類と異なり、塩基部分
の上に反応性基を持つているので、その様な反応
性基を、望ましくない反応から防御するためにマ
スクする。これらの実施例では、反応２における
5′−ヒドロキシのマスキングと同様、反応１で示
したシトシンの塩基部分にある反応性基のマスキ
ングについて説明する。 実施例 ５−（３−トリフルオロアセチルアミ
ノプロペニル）−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキ
シウリジン ５−クロロマ−キユリー−2′−デオキシウリジ
ンを５−クロロマ−キユリー−2′−デオキシシチ
ジンで置換え、実施例のヌクレオシド前駆体の
合成方法を繰返して行ない５−（３−トリフルオ
ロアセチルアミノプロペニル）−2′−デオキシシ
チジン（UVλ_nax287nm）を製造する。精製５−
（３−トリフルオロアセチルアミノプロペニル）−
2′−デオキシシチジン（1.3ｇ、4.6mmol）を無水
エタノール80ml中で攪拌し、無水ベンゾイル
（1.5ｇ、7mmol）を加え、この反応物を還流させ
る。更に、1.5ｇづつの無水ベンゾイルを１時間
毎に５回加える。薄層クロマトグラフイー〔シリ
カプレート、ｎ−ブタノール／メタノール／濃
NH₄OH／水（60：20：１：20）で溶離する〕に
より反応の終了を判定した後（６−10時間の間）、
この反応混合物を冷却し、減圧濃縮して半固型物
を得る。この固型物をエーテルと共に３回こね、
デカントし、乾燥する。この粗生成物を水から再
結晶し、クロマトグラフ的に純粋なN⁴−ベンゾ
イル−５−（３−トリフルオロアセチルアミノプ
ロペニル）−2′−デオキシシチジンを白色固型物
として得る。この生成物は120℃以上で分解す
る；UV_nax＝311nm。 実施例 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−
トリフルオロアセチルアミノプロペニル）−N⁴
−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン ５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペ
ニル）−2′−デオキシウリジンを５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノプロペニル）−N⁴−ベンゾ
イル−2′−デオキシシチジンで置換え、実施例
の5′−ヒドロキシのマスキング操作を繰返すこと
により、5′−ジメトキシトリチル−５−（３−ト
リフルオロアセチルアミノプロペニル）−N⁴−ベ
ンゾイル−2′−デオキシシチジンを製造する。 実施例 Ｎ−アリルトリフルオロアセトアミドを実施例
のＮ−アルキルトリフルオロアセトアミド類に
置換え、実施例およびのヌクレオシド前駆体
の合成および5′ヒドロキシのマスキング操作を繰
返すことにより、対応する5′−ジメトキシトリチ
ル−５−（トリフルオロアセチル）アミノアルキ
ル）−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン類
を製造する。即ち、以下の化合物群である。 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−トリフル
オロアセチルアミノブテン−１−イル）−N⁴−ベ
ンゾイル−2′−デオキシシチジン 5′−ジメトキシトリチル−５−（６−トリフル
オロアセチルアミノヘキセン−１−イル）−N⁴−
ベンゾイル−2′−デオキシシチジン 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフル
オロアセチルアミノ−２−メチルプロペン−１−
イル）−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン 5′−ジメトキシトリチル−５−〔２−（４−トリ
フルオロアセチルアミノメチルフエニル）エテン
−１−イル〕−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシ
チジン 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−トリフル
オロアセチルアミノ−４−メチルブテン−１−イ
ル）−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン 5′−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（12−トリ
フルオロアセチルアミノドデシル）−１−アクリ
ルアミド〕−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシチ
ジン 5′−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（ペルトリ
フルオロアセチルポリリシル）−１−アクリルア
ミド〕−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシチジン 実施例XI 5′−ジメトキシトリチル−N⁴−ベン
ゾイル−５−（２−カルブメトキシエテニル）−
2′−デオキシシチジンの合成 ５−（２−カルブメトキシエテニル）−2′−デオ
キシシチジン（0.82ｇ、2.6mmol）を無水エタノ
ール50ml中で攪拌する。無水安息香酸（500mg、
2.2mmol）を加え、この反応物を加熱還流させ
る。更に、500mgづつの無水安息香酸を１時間毎
に５回加える。薄層クロマトグラフイーで反応の
完了を判定した後（通常、６−８時間）、この反
応物を冷却し、減圧蒸留して黄色の半固型物質を
得る。シリカゲルを用いたクロマトグラフイーに
かけ、メタノール／クロロホルムの１：19から
１：３に至る直線的な割合の混合物で溶離し、適
当な画分を合わせて蒸発させることによりN⁴−
ベンゾイル−５−（２−カルブメトキシエテニル）
−2′−デオキシシチジンを無晶形の白色固形物質
として得る。UVλ_nax296nm、λ_nio270nm。この
固型物を完全に乾燥させ、ピリジン20mlに溶か
す。ジメトキシトリチルクロライド（1.1当量）
を加え、この反応物を周囲温度で６時間攪拌す
る。濃縮して固型物を得、次いでこれをシリカゲ
ル上カラムクロマトグラフイーにかけ、クロロホ
ルム中のメタノール10％混液で溶離して5′−ジメ
トキシトリチル−N⁴−ベンゾイル−５−（２−カ
ルブメトキシエテニル）−2′−デオキシシチジン
を、灰色がかつた白色のふわふわした固型物とし
て得る。 実施例 XII ５−（２−カルブメトキシエテニル）−2′−デオ
キシシチジンを下記の化合物群（番号19〜27ま
で）で置換え、実施例XIのヌクレオシド前駆体の
合成法を繰返して行なうことにより、それぞれ対
応する下記の化合物群（番号19′から27′まで）を
得る。即ち、次の化合物群で置き換える： 19 ５−（２−カルブメトキシエチル）−2′−デオ
キシシチジン 20 ５−（３−カルブメトキシプロパン−１−イ
ル）−2′−デオキシシチジン 21 ５−（４−カルブメトキシ−２−メチルブテ
ン−１−イル）−2′−デオキシシチジン 22 ５−（３−シアノプロペン−１−イル）−2′−
デオキシシチジン 23 ５−（４−シアノ−２−メチルブテン−１−
イル）−2′−デオキシシチジン 24 ５−〔２−（４−カルブメトキシフエニル）エ
テン−１−イル）−2′−デオキシシチジン 25 ５−（４−アセトキシブテン−１−イル）−
2′−デオキシシチジン 26 ５−（４−アセトキシブタン−１−イル）−
2′−デオキシシチジン 27 ５−〔４−（２，４−ジニトロフエニル）ブチ
ル〕−2′−デオキシシチジン そして次の5′−ジメトキシトリチル−N⁴−ベン
ゾイル−５−アルキル−2′−デオキシシチジン類
を得る： 19′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（２−カ
ルブメトキシエテン−１−イル））−2′−デオキ
シシチジン 20′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−カ
ルブメトキシプロパン−１−イル）−2′−デオ
キシシチジン 21′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−カ
ルブメトキシ−２−メチルブテン−１−イル）
−2′−デオキシシチジン 22′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−シ
アノプロペン−１−イル）−2′−デオキシシチ
ジン 23′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−シ
アノ−２−メチルブテン−１−イル）−2′−デ
オキシシチジン 24′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−〔２（４−
カルブメトキシフエニル）エテン−１−イル〕
−2′−デオキシシチジン 25′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−ア
セトキシブテン−１−イル）−2′−デオキシシ
チジン 26′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−ア
セトキシブタン−１−イル）−2′−デオキシシ
チジン 27′ 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−〔４−
（２，４−ジニトロフエニル）ブチル〕−2′−デ
オキシシチジン 同様に、その他の酸無水物、例えば無水酢酸、
アニソイル無水物またはトリル無水物を用いるこ
とにより、実施例およびXIにおいて、ベンゾイ
ルがアセチルまたはアシルで置き換えられてた形
のN⁴−アシルまたはN⁴−アセチル−５−アルキ
ル−2′−デオキシシチジンが、それぞれ、製造さ
れる。 実施例 ５−クロロマ−キユリー−2′−デオキシシチジ
ンを５−クロロマ−キユリーシチジンに置換え、
実施例からのヌクレオシド前駆体の合成法お
よび5′−ヒドロキシのマスキング法を繰返すこと
により、対応する5′−ジメトキシトリチル−N⁴
−ベンゾイル−５−置換シチジン類を製造する。 実施例 この実施例は、アデニンヌクレオシドの反応性
塩基部分のマスキングおよび5′ヒドロキシのマス
キングを例示するものである。 N⁶−ベンゾイル−８−（６−アミノヘキシル）
アミノ−2′−デオキシシアデノシン（4mmol）を
無水エタノール60ml中で攪拌する。トリフルオロ
酢酸無水物（6mmol）を加え、この反応物を室
温で攪拌する。更に１時間毎にトリフルオロ酢酸
無水物を、２部加える。４時間後、反応物を濃縮
して固型残留物を得、これを一夜凍結乾燥する。
このN⁶−ベンゾイル−８−（６−トリフルオロア
セチルアミノヘキシル）アミノ−2′−デオキシア
デノシン粗生成物を完全に乾燥し、２回、ピリジ
ン中から固型残留物になるまで濃縮する。この固
型物質を攪拌下、ピリジン40mlに入れ、ジメトキ
シトリチルクロライド（6.5mmol）を加える。４
時間後、反応物を濃縮して固型残留物を得る。こ
れをシリカゲル上、カラムクロマトグラフイーに
かけ、クロロホルム中のメタノール含量が０から
15％の間である多段グラデイエント溶離を行な
い、5′−ジメトキシトリチル−N⁶−ベンゾイル
−８−（６−トリフルオロアセチルアミノヘキシ
ル）アミノ−2′−デオキシアデノシンを灰白色の
固型物として得る。 実施例からは、図表の反応３の如く、
5′位がマスクされた５−置換−ヌクレオシドおよ
び天然起源のヌクレオシドを活性化して、各々対
応するホスホモノクロリダイト類
（phosphomonochloridites）とすることに関す
る。 実施例 5′−DMT−５−（３−トリフルオロ
アセチルアミノプロパン−１−イル）−2′−デ
オキシウリジンの3′−ホスホモノクロリダイト
の製造 乾燥5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチ
ルアミノプロパン−１−イル）−2′−デオキシウ
リジン（1.54ｇ、2.2mmol）を、残留する水およ
び溶媒を除去するために、いずれも12時間以上を
要して３回、ベンゼン20ml中から凍結乾燥する。
得られた非常にふわふわした白色粉末を、減圧下
のままで窒素雰囲気中に移し、２，６−ルチジン
を５容量％含有する無水アセトニトリル中に、最
終濃度が30mMとなる様に溶かす。窒素雰囲気
下、激しく攪拌しながらメチルホスホジクロリダ
イト（1.0当量）の巨大丸薬を迅速にシリンジ
（注射器）で加える。この反応物を窒素雰囲気下、
約１分間渦巻き状に操作する。次いで、得られた
粗5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロパン−１−イル）−2′−デオキシウリジ
ン3′−メチルホスホモノクロリダイトの反応溶液
を、更に精製することなく、デオキシオリゴヌク
レオチドの合成（実施例）にそのまま用い
る。この物の³¹P−NMR（CH₃CN／CDCl₃）は、
通常、40−70mol％が所望の生産物であることを
示している（167.5ppm）。残りは、ビス−3′，
3′−〔5′DMT−５−（３−トリフルオロアセチル
アミノプロパン−１−イル）−2′−デオキシウリ
ジリル〕メチルホスフアイト（140ppm）と、
5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルアミ
ノプロパン−１−イル）−2′−デオキシウリジン
3′−メチルホスホネート（9.5ppm）で構成され、
この後者の化合物は、反応系中の水の存在を反映
した量だけ生成される。 実施例 天然起源の2′−デオキシヌクレオシ
ドの3′−ホスホモノクロリダイト類の製造 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロパン−１−イル）−2′−デオキシウリジ
ンを、 5′−DMT−2′−デオキシチミジン 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシ
チジン 5′−DMT−N⁶−ベンゾイル−2′−デオキシア
デノシン 5′−DMT−N²−イソブチリル−2′−デオキシ
グアノシン で置換え、実施例の操作を繰返すことによ
り、下記の対応するホスホモノクロリダイト類を
製造する。即ち、 5′−DMT−2′−デオキシチミジン3′−メチルホ
スホモノクロリダイト 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシ
チジン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N⁶−ベンゾイル−2′−デオキシア
デノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N⁶−ベンゾイル−2′−デオキシア
デノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N²−イソブチリル−2′−デオキシ
グアノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト 実施例 メチルホスホジクロリダイトを、ｏ−クロロフ
エニルホスホジクロリダイトで置き換え、実施例
およびのホスホモノクロリダイトの合成
法を繰返すことにより、対応する5′−DMT−ヌ
クレオシド3′−ホスホモノクロリダイト類、即
ち、 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル）−2′−デオキシウリジン3′−ｏ−
クロロフエニルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−2′−デオキシチミジン3′−ｏ−クロ
ロフエニルホスホモノクロリダイト、 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシ
チジン3′−ｏ−クロロフエニルホスホモノクロリ
ダイト 5′−DMT−N⁶−ベンゾイル−2′−デオキシア
デノシン−3′−ｏ−クロロフエニルホスホモノク
ロリダイト 5′−DMT−N²−イソブチリル−2′−デオキシ
グアノシン3′−ｏ−クロロフエニルホスホモノク
ロリダイトを得る。 同様に、ｐ−クロロフエニルホスホジクロリダ
イトを用いることにより、類似物質の3′−ｐ−ク
ロロフエニルホスホモノクロリダイト付加物が製
造される。ｏ−クロロフエニルホスホモノクロリ
ダイト生成物の〔³²P〕NMR（CH₃CNCDCl₃）
は、160.7、160.5ppm（ジアステレオマー）であ
る。 実施例−は、図表の反応４および５
に示した如く、修飾された塩基が組み込まれたオ
リゴヌクレオチド類の化学合成を例示するもので
ある。 実施例 ５−（３−アミノプロピル）−ウラシ
ルおよび天然起源のヌクレオチド単位を含有す
るデオキシオリゴヌクレオチド類の合成 デオキシオリゴヌクレオチド合成の直前に、実
施例およびのホスホモノクロリダイトの
合成操作を行ない、その生成物をそのまま無水ア
セトニトリル／５容量％２，６−ルチジン中に
30mMの粗3′−メチルホスホモノクロリダイトを
含んだものとして使用する。 固体の担体（５−DMT−N⁶−ベンゾイル−
2′−デオキシアデノシン3′−サクシンアミドプロ
ピル・シリカ250mg、20μ当量）を適当な反応フ
ロー容器（ガラスまたはテフロン 製のカラムま
たは漏斗）に入れる。この固体担体は、予め、ア
セトニトリル／５容量％ルチジン、テトラヒドロ
フラン／水／ルチジン中に沃素2w／ｖ％を含む
もので２分間、アセトニトリル／５％ルチジン、
クロロホルム、クロロホルム中にジクロル酢酸を
４容量％含むもので2.5分間、そしてアセトニト
リル／５％ルチジンで順次処理して予めコンデイ
シヨンを調整しておく。この場合、各処理は所望
に応じて総容量５−15mlを２または３回に分けて
用いるかあるいは定常的に流すか、そのいずれで
もよい。 デオキシオリゴヌクレオチドは反応４に従い、
所望の活性化された5′−DMT−ヌクレオチド
3′メチルホスホモノクロリダイトモノマーを連続
的に添加し、伸長しつつあるヌクレオチド鎖の端
末単位（これは、最初、この鎖の唯一の単位であ
る。つまり、固体担体を含んでいるデオキシアデ
ノシンを塩基とする単位である。）の遊離の5′−
水酸基にこれを結合させることで合成される。付
加は、実施例およびの中から選択した
30mMの粗モノクロリダイト10mlを、鎖上の脱保
護されたばかりの、5′ヒドロキシと２〜３部づつ
に分けるか、または定常的に流し、２〜６分間反
応させることにより行なう。１つの完全な試薬サ
イクルが後に続く所の最初のホスホモノクロリダ
イト付加は次の連続処理で構成される： −5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチル
アミノプロピル）−2′−デオキシウリジン3′−メ
チルホスホモノクロリダイト、 −アセトニトリル／ルチジン洗浄、 −無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフラン
（１：３：２）中0.3M4−ジメチルアミノピリジ
ンにより５分間キヤツピングする、 −アセトニトリル／５％ルチジン洗浄、 −テトラヒドロフラン／水／ルチジン（６：
２：１）中２％沃素で２分間、酸化する、 −アセトニトリル／５％ルチジン洗浄、 −クロロホルム洗浄、 −クロロホルム中４容量％ジクロル酢酸で2.5
分間処理してDMTを除去する、 −クロロホルム洗浄、 −アセトニトリル／ルチジン洗浄。 上記のサイクルを、各回毎に、5′−DMT−５
−（３−トリフルオロアセチルアミノプロピル）−
2′−デオキシウリジン3′−メチルホスホモノクロ
リダイトを下記の3′−メチルホスホモノクロリダ
イト類の中の異なつたもので置換え、13回繰返し
て行なう。ただし最終試薬サイクルではジクロル
酢酸処理は除外する： 5′−DMT−2′−デオキシチミジン3′−メチルホ
スホモノクロリダイト 5′−DMT−５−（３−ト
リフルオロアセチルアミノプロピル）−2′−デオ
キシウリジン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N⁶−ベンゾイル−2′−デオキシア
デノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシ
チジン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N²−イソブチリル−2′−デオキシ
グアノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル）−2′−デオキシウリジン3′−メチ
ルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−2′−デオキシチミジン3′−メチルホ
スホモノクロリダイト 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル）−2′−デオキシウリジン3′−メチ
ルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−デオキシチミジン3′−メチルホス
ホモノクロリダイト 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル）−2′−デオキシウリジン3′−メチ
ルホスホモノクロリダイト 5′−DTM−N²−イソブチリル−2′−デオキシ
グアノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N⁶−ベンゾイル−2′−デオキシア
デノシン3′−メチルホスホモノクロリダイト 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−2′−デオキシシ
チジン3′−メチルホスホモノクロリダイト 担体を移し、濃水酸化アンモニウム２mlで、周
囲温度において４時間処理し、この担体から生成
物を放出させる。上清を取除き固型物を濃水酸化
アンモニウム0.5mlで３回洗浄し、これらの上清
を合わせて密封し、一夜50℃で加熱する。透明な
黄色の上清を完全に凍結乾燥する。一次精製は、
RP−８（Ｃ−８）カラム上、PH9.8の25mM酢酸
アンモニウム中のアセトニトリルの割合が０−30
容量％である様なグラデイエント溶離（60分間）
による、逆相高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）で行なう。約40分後に鋭いピークを示
して溶離する5′−DMT−末端化生成物を集め
る；もつと短い鎖を持つものは、キヤツプされた
ものもされていないものも、共に25分より以前に
溶離してしまう。集めた生成物を蒸留して固形残
留物を得、これを80％酢酸で周囲温度において20
分間処理（DMTを除くため）した後、凍結乾燥
して固型物残渣を得、これを少量の水性緩衝液に
溶かす。生産物は一般に、HPLC後において90％
以上の均質性がある。更に、これを通常の20％ポ
リアクリルアミドゲル（厚さ１〜６mm）上、電気
泳動にかけ、適当な生成物バンド（生成物は、通
常、同様の長さの修飾されていないデオキシオリ
ゴヌクレオチド類よりもゆつくり泳動する）を切
り取り、抽出することにより、なお一層精製され
る。こうして製造された精製（純化）５−アミノ
プロピル−ウラシル−含有ペンタデカデオキシオ
リゴヌクレオチド生成物を以下に図式的に示す
〔図中U^m＝５−（３アミノプロピル）ウラシル〕。 従来のアンモニアによるオリゴヌクレオチドの
脱保護によれば、置換基上のマスキング基である
トリフルオロアセチル基も除去されてしまつたこ
とに注目されたい。次いで、このオリゴヌクレオ
チドの長さおよび配列の決定を、適当なプロトコ
ール（例えば、そのヌクレオチド単位に含まれる
塩基が修飾されていない様な、従来技術に属する
オリゴヌクレオチド類の長さおよび配列を決定す
るために既に用いられたプロトコール等）を利用
して、³²P−キナーゼ法および配列決定により行な
うことができる。 同様に、本発明で採用したメチルホスホモノク
ロリダイト付加物の順序および数を計画的に変化
させることにより、選択された長さおよび塩基配
列において異なる、他の５−（修飾された）ウラ
シル−含有デオキシオリゴヌクレオチド類が製造
される。また、実施例およびのヌクレオ
シド3′−メチルホスホモノクロリダイト付加物を
相当する実施例の3′−ｏ−またはｐ−クロロ
フエニルホスホモノクロリダイト付加物に置換え
ると共に、クロロフエニル保護基を除くためにピ
リジニウムオキシメート処理を行なう（デオキシ
オリゴヌクレオチド合成の終りであつて、濃水酸
化アンモニウム処理の前）ことによつても、同じ
デオキシオリゴヌクレオチド生成物が得られる。 実施例 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル）−2′−デオキシウリジンを下記の
5′−DMT−５−アルキル−2′−デオキシウリジ
ン類（番号28−36）で置換え、実施例−
のホスホモノクロリダイトおよびデオキシオリゴ
ヌクレオチドの合成法を繰返すことにより、それ
ぞれに対応する、ウラシル塩基U^mを持つ下記の
オリゴヌクレオチド類（番号28′−36′）が製造さ
れる。即ち、下記の化合物に置き換えると： 28 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノプロペン−１−イル）−
デオキシウリジン 29 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−トリフ
ルオロアセチルアミノブタン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 30 5′−ジメトキシトリチル−５−（４−トリフ
ルオロアセチルアミノブテン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 31 5′−ジメトキシトリチル−５−（６−トリフ
ルオロアセチルアミノヘキサン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 32 5′−ジメトキシトリチル−５−（６−トリフ
ルオロアセチルアミノヘキセン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 33 5′−ジメトキシトリチル−５−（２−トリフ
ルオロアセチルアミノプロパン−２−イル）−
2′−デオキシウリジン 34 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノ−２−メチル−プロペン
−１−イル）−2′−デオキシウリジン 35 5′−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノ−２−メチル−プロパン
−１−イル）−2′−デオキシウリジン 36 5′−ジメトキシトリチル−５−〔２−（４−ト
リクルオロアセチルアミノメチルフエニル）エ
テン−１−イル〕−2′−デオキシウリジン 37 5′−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（ペルト
リフルオロアセチルポリリシル）−１−アクリ
ルアミド〕−2′−デオキシウリジン 38 5′−DMT−５−〔Ｎ−（７−トリフルオロア
セチルアミノヘプチル）−１−アクリルアミド〕
−2′−デオキシウリジン、 U^mが下記のものである実施例の生成物に
相当するデオキシヌクレオチド類が製造される。 28′ ５−（３−アミノプロペン−１−イル）ウラ
シル 29′ ５−（４−アミノブタン−１−イル）ラウシ
ル 30′ ５−（４−アミノブテン−１−イル）ラウシ
ル 31′ ５−（６−アミノヘキサン−１−イル）ラウ
シル 32′ ５−（６−アミノヘキセン−１−イル）ラウ
シル 33′ ５−（３−アミノプロパン−２−イル）ラウ
シル 34′ ５−（３−アミ−２−メチルプロペン−１−
イル）ラウシル 35′ ５−（３−アミノ−２−メチルプロパン−１
−イル）ラウシル 36′ ５−〔２−（４−アミノエチルフエニル）エ
テン−１−イル〕ラウシル 37′ ５−〔Ｎ−（ポリリシル）−１−アクリルアミ
ド〕ラウシル 38′ ５−〔Ｎ−（７−アミノヘプチル）−１−アク
リルアミド〕ラウシル。 同様に、他の5′−DMT−５（アシルアミノアル
キル）−2′−デオキシウリジン類を用いれば、類
似のデオキシオリゴヌクレオチド類が製造され
る。 実施例 5′−DMT−５−（３−アセチルアミノプロピ
ル）−2′−デオキシウリジンを下記の５−置換−
2′−デオキシウリジン類（番号37−46）に置換え
て実施例〜のホスホモノクロリダイトお
よびデオキシオリゴヌクレオチドの合成法を繰返
すことにより、それぞれ、下記の対応する、U^m
ウラシル塩基を持つたオリゴヌクレオチド類（番
号37′−46′を製造する。即ち、次の化合物に置換
える。 37′ 5′−DMT−５−（プロペン−１−イル）−
2′−デオキシウリジン 38 5′−DMT−５−（２−カルブメトキシエチ
ル）−2′−デオキシウリジン 39 5′−DMT−５−（３−カルブメトキシプロパ
ン−１−イル）−2′−デオキシウリジン 40 5′−DMT−５−（４−カルブメトキシ−２−
メチルブテン−１−イル）−2′−デオキシウリ
ジン 41 5′−DMT−５−（３−シアノプロペン−１−
イル）−2′−デオキシウリジン 42 5′−DMT−５−（４−シアノ−２−メチルブ
テン−１−イル）−2′−デオキシウリジン 43 5′−DMT−５−〔２−（４−カルブメトキシ
フエニル）エテン−１−イル）−2′−デオキシ
ウリジン 44 5′−DMT−５−（４−アセトキシブテン−１
−イル）−2′−デオキシウリジン 45 5′−DMT−５−（４−アセトキシブタン−１
−イル）−2′−デオキシリジン 46 5′−DMT−５−〔４−（２，４−ジニトロフ
エニル）ブチル〕−2′−デオキシウリジン。 そしてU^mが以下のものである生成物を得る。 37′ ５−（プロペン−１−イル）ウラシル 38′ ５−（２−カルボキシエチル）ウラシル 39′ ５−（３−カルボキシプロパン−１−イル）
ウラシル 40′ ５−（４−カルボキシ−２−メチルブテン−
１−イル）ウラシル 41′ ５−（３−シアノプロペン−１−イル）ウラ
シル 42′ ５−（４−シアノ−２−メチルブテン−１−
イル）ウラシル 43′ ５−〔２−（４−カルボキシフエニル）エテ
ン−１−イル〕ウラシル 44′ ５−（４−ヒドロキシブテン−１−イル）ウ
ラシル 45′ ５−（４−ヒドロキシブタン−１−イル）ウ
ラシル 46′ ５−〔４−（２，４−ジニトロフエニル）ブ
チル〕ウラシル 注：46′は、直接リポーターグループとして機能
する、即ち、抗ジニトロフエニル抗体のリガンド
として用い得る。同様に、他の適当な5′−DMT
−５−アルキル−2′−デオキシウリジン類を用い
れば類似のデオキシオリゴヌクレオチド類が製造
される。 実施例 XI 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル）−2′−デオキシウリジンを5′−
DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−トリクロロ
アセチルアミノプロピル）−2′−デオキシシチジ
ンで置換え、実施例−の操作を繰返すこ
とにより、実施例と同様（ただしU^m〔５−
（３−アミノプロピル）−ウラシル〕が５−（３−
アミノプロピル）シトシン類で置換えられた）、
デオキシオリゴヌクレオチドが製造される。例え
ば、式： （式中、C^mは５−（３−アミノプロピル）シト
シンを表わす） で示される化合物である。 実施例 XII 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−トリ
クロロアセチルアミノプロピル）−2′−デオキシ
シチジンを下記の化合物群（番号47−57）で置き
換えて実施例XIのデオキシリボヌクレオチド合
成法を繰返すことにより、それぞれ、下記のC^m
シトシン塩基類（番号47′−57′）を持つた、対応
するオリゴヌクレオチド類が製造される。即ち、
以下の化合物に置換える。 47 ５−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−ト
リフルオロアセチルアミノプロペン−１−イ
ル）−2′−デオキシシチジン 48 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−ト
リフルオロアセチルアミノブタン−１−イル）
−2′−デオキシシチジン 49 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−ト
リフルオロアセチルアミノブテン−１−イル）
−2′−デオキシシチジン 50 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（６−ト
リフルオロアセチルアミノヘキサン−１−イ
ル）−2′−デオキシシチジン 51 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（６−ト
リフルオロアセチルアミノヘキセン−１−イ
ル）−2′−デオキシシチジン 52 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−ト
リフルオロアセチルアミノプロパン−２−イ
ル）−2′−デオキシシチジン 53 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−ト
リフルオロアセチルアミノ−２−メチルプロペ
ン−１−イル）−2′−デオキシシチジン 54 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−ト
リフルオロアセチルアミノ−２−メチルプロパ
ン−１−イル）−2′−デオキシシチジン 55 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−〔２−（４
−トリフルオロアセチルアミノメチルフエニ
ル）エテン−１−イル〕−2′−デオキシシチジ
ン 56 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−〔Ｎ−（ペ
ルトリフルオロアセチルポリリシル）−１−ア
クリルアミド〕−2′−デオキシシチジン 57 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−〔Ｎ−（ト
リフルオロアセチルアミノヘプチル）−アクリ
ルアミド〕−2′−デオキシシチジン。 そしてC^mが次のものである生成物を得る。 47′ ５−（３−アミノプロペン−１−イル）シト
シン 48′ ５−（４−アミノブタン−１−イル）シトシ
ン 49′ ５−（４−アミノブテン−１−イル）シトシ
ン 50′ ５−（６−アミノヘキサン−１−イル）シト
シン 51′ ５−（６−アミノヘキセン−１−イル）シト
シン 52′ ５−（３−アミノプロパン−２−イル）シト
シン 53′ ５−（３−アミノ−２−メチルプロペン−１
−イル）シトシン 54′ ５−（３−アミノ−２−メチルプロパン−１
−イル）シトシン 55′ ５−〔２−（４−アミノメチルフエニル）テ
ン−１−イル）シトシン 56′ ５−〔Ｎ−（ポリリシル）−１−アクリルアミ
ド〕シトシン 57′ ５−〔Ｎ−（７−アミノヘプチル）−１−アク
リルアミド〕シトシン 同様に、他のN⁴−アシル−５−（アシルアミノ
アルキル）−2′−デオキシシチジン類を用いるこ
とにより、類似のデオキシオリゴヌクレオチド類
が製造される。 実施例 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−トリ
フルオロアセチルアミノプロピル）−2′−デオキ
シシチジンを下記の化合物群（番号58−68）に置
換えて実例XIのデオキシオリゴヌクレオチド合
成法を繰返すことにより、それぞれ、下記のC^m
シトシン塩基類（番号58′−68′）を持つた、対応
するオリゴヌクレオチド類が製造される。即ち、
次の化合物に置換える。 58 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（プロペ
ン−１−イル）−2′−デオキシシチジン 59 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（２−カ
ルブメトキシエチル）−2′−デオキシシチジン 60 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（２−カ
ルブメトキシエテン−１−イル）−2′−デオキ
シシチジン 61 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−カ
ルブメトキシプロパン−１−イル）−2′−デオ
キシシチジン 62 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−カ
ルブメトキシ−２−メチルブテン−１−イル）
−2′−デオキシシチジン 63 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（３−シ
アノプロペン−１−イル）−2′−デオキシシチ
ジン 64 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−シ
アノ−２−メチルブテン−１−イル）−2′−デ
オキシシチジン 65 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−〔２−（４
−カルブメトキシフエニル）エテン−１−イ
ル〕−2′−デオキシシチジン 66 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−ア
セトキシブテン−１−イル）−2′−デオキシシ
チジン 67 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−（４−ア
セトキシブタン−１−イル）−2′−デオキシシ
チジン 68 5′−DMT−N⁴−ベンゾイル−５−〔４−
（２，４−ジニトロフエニル）ブチル〕−２−デ
オキシシチジン。 そして、C^mが次のものである生成物を得る。 58′ ５−（プロペン−１−イル）シトシン 59′ ５−（２−カルボキシエチル）シトシン 60′ ５−（２−カルボキシエテン−１−イル）シ
トシン 61′ ５−（３−カルボキシプロパン−１−イル）
シトシン 62′ ５−（４−カルボキシ−２−メチルブテン−
１−イル）シトシン 63′ ５−（３−シアノプロペン−１−イル）シト
シン 64′ ５−（４−シアノ−２−メチルブテン−１−
イル）シトシン 65′ ５−〔２−（４−カルボキシフエニル）エテ
ン−１−イル〕シトシン 66′ ５−（４−ヒドロキシブテン−１−イル）シ
トシン 67′ ５−（４−ヒドロキシブタン−１−イル）シ
トシン 68′ ５−〔４−（２，４−ジニトロフエニル）ブ
チル〕シトシン 同様に、他の適当な5′−DMT−N⁴−アシル−５
−アルキル−2′−デオキシシチジン類を用いるこ
とにより、類似のデオキシオリゴヌクレオチド類
が製造される。 実施例 XI 5′−DMT−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロピル）−2′−デオキシウリジンを5′−
DMT−N⁶−ベンゾイル−８−（４−トリフルオ
ロアセチルアミノヘキシル）アミノ−2′−デオキ
シアデノシンで置き換えて実施例−の
ホスホモノクロリダイトおよびデオキシオリゴヌ
クレオチド合成法を繰返すことにより、実施例
と同様にデオキシオリゴヌクレオチド類（ただ
し、U^mはA^mで置換えられており、このA^mは８−
（６−アミノヘキシル）アミノ−2′−デオキシア
デノシンを表わす〕を製造する。 実施例−は、反応６で示される様
に、適当に修飾された塩基類を有するオリゴヌク
レオチド類へのリポーター基の結合を例示するも
のである。 実施例 フルオレセイン化デオキシオリゴ
ヌクレオチド 式： 〔式中、U^mは５−〔Ｎ−（７−アミノヘプチル）
−１−アクリルアミド〕ウラシルを表わす〕 で示される純化ペンタデカ−ヌクレオチド（実施
例から得たもの）を、30mMの塩化ナトリウ
ムを含有するPH9.5の300mMホウ酸ナトリウム水
溶液または炭酸ナトリウム緩衝液に、25A260単
位／mlの割合で溶かす。固型のフルオレツセイン
イソチオシアネート（0.5mg／ml）を加え、この
混合物を密封し、４℃〜25℃で一夜、ゆるやかに
振盪する。この反応物を直接Ｇ−50Sephadex
カラムにかけて非結合−フルオレツセイン添加物
を分離する（このものは保持される）；フルオレ
セイン化デオキシオリゴヌクレオチド付加物は空
容量付近で溶出する。顕著にA260単位を含む初
期の画分を合わせて凍結乾燥し、出発物質のペン
タデカオキシオリゴヌクレオチドに類似した構造
の固型の生成物を得る。ただし、この場合、U^m
は式： であるか、あるいは未反応の５−〔Ｎ−（７−アミ
ノヘプチル）−１−アクリルアミド〕ウラシルの
いずれかである。λ_nax（H₂O）262nm、498nm 実施例，XI，XIIおよびで述べた
化合物群を用いてこの操作を行なえば、同様にし
て、対応するフルオレセイン化されたまたはポリ
フルオレレセイン化されたデオキシオリゴヌクレ
オチド類が製造される。 実施例 フルオレツセイン以外のレポーター基の結合
は、フルオレツセイン・イソチオシアネートを例
えば下記の化合物に置き換え、実施例の操
作を繰返し行なうことによつて達成し得る。それ
らの化合物群は、例えば ２，４−ジニトロフエニル・イソチオシアネー
ト １−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン アミノエチル・イソルミノール・イソチオシア
ネート アミノエチルアミノナフタレン−１，２−カル
ボキシリツク・ヒドラジツド・イソチオシアネー
ト Ｎ，N′−ビス（アルキルスルホニル）−Ｎ−ア
リール−N′−イソチオシアネートアリール−ジ
オキサミド ｍ−スルホニル・アニリン・イソチオシアネー
ト ９−（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル）ビオ
チン ９−（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル・カル
ボキシ）−Ｎ−メチルアクリジン、または 臭化シアン活性化Sepharose であり、これらによつて、フルオレツセン以外の
基が結合した、対応する付加物を製造することが
できる。 実例 イソルミノールおよび遊離の第１級
アミン−含有リポーターグループの結合 実施例から得た式： 〔式中、U^mは５−（２−カルボキシエテニル）
ウラシルを表わす〕 で示される純化ペンタデカヌクレオチドを、水に
30A260単位／mlの割合で溶かし、１容量のピリ
ジンで希釈する。アミノブチルエチルイソルミノ
ールを終濃度が１mg／mlになる様に加え、次いで
５倍モル過剰量の１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カーボジイミドを加える。こ
の反応物を密封し、暗所で12〜48時間、ゆるやか
に振盪する。この反応混合物を減圧濃縮して固型
残留物を得、これをそのままＧ−50Sephadex
カラムでクロマトグラフする。イソルミノール−
デオキシオリゴヌクレオチド連結物は、空容量付
近で溶出する。顕著にA260単位を含有している
初期の画分を合わせて凍結乾燥し、出発物質のデ
オキシオリゴヌクレオチドに類似した構造を有す
る固型生成物を得る。ただし、この場合、U^mは
式： あるいは未反応の５−（２−カルボキシエテニル）
ウラシルのいずれかである。 R₂がカルボキシを含んでいる様な実施例
およびの化合物群を用いてこの操作を行な
えば、同様に、対応するデオキシオリゴヌクレオ
チド−イソルミノールが製造される。 また、アミノブチルイソルミノールをその他の
遊離第一級アミンを含むレポーター基で置換え、
この操作を繰返すことにより、同様にして相当す
るデオキシオリゴヌクレオチド−レポーター付加
物が製造される。 実施例 ジニトロフエニルリポーターグル
ープの結合 式： 〔式中、A^mは８−（６アミノヘキシル）アミノ
アデニンを表わす〕 で示される純化ノナヌクレオチドをPH９の
250mM炭酸ナトリウム緩衝液に20A260単位／ml
の割合で溶かし、１−フルオロ−２，４−ジニト
ロベンゼンを加える。この反応溶液を周囲温度で
１夜振盪した後、直接Sephadex Ｇ−50カラム
にかけてクロマトグラフする。顕著にA260単位
を含む初期の画分を合わせて濃縮し、出発物質の
デカヌクレオチドと類似の構造を有するオリゴヌ
クレオチド生成物を得る。ただし、この場合、
A^mは式： で示されるか、あるいは未反応の８−（６−アミ
ノヘキシル）アミノアデニンである。 ８−（６−アミノヘキシル）アミノアデニンを
その他の、遊離第一級アミンを含有する修飾され
た塩基で置換えてこの操作を繰返し行なうことに
より、同様に対応するジニトロフエニル化された
オリゴヌクレオチド付加物が製造される。