JPH0361484A - 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 髪東±旦皿亘土１ この発明は、新規な組織プラスミノーゲン活性化因子に
関するものであり、より詳しくは、プラスミノーゲンを
、血栓のフィブリン網目構造を崩壊させて可溶性生成物
を生ぜしめるプラスミンへ転換させる強い活性をもち、
従って血栓溶解剤として有用な、新規な組織プラスミノ
ーゲン活性化因子、それのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ、それの製造法およびそれを含有する医薬組成物に
関するものである。

来の技術およびこの　　が解決しようとする里旦 天然のヒト「組織プラスミノーゲン活性化因子」　（以
下ｒ　ｔ−ｐ＾」という〉の全アミノ酸配列および構造
ならびにヒトメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ）　に由来す
るそれをコードするＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術に
よって既に明らかにされている［Ｎａｔｕｒｅ　３０１
．２１４（１９８３）参照］。天然ｔ−ＰＡは、単一の
ジスルフィド結合で結合される重鎮および軽鎖の２鏡形
態にプラスミンによって転換されるところの単鎖セリン
プロテアーゼである。軽鎖（Ｌ）はプロテアーゼドメイ
ンであり、従ってこの酵素の活性部位を含んでいる。重
鎮（Ｈ）はフィンガードメイン（Ｆ）、４長因子ドメイ
ン（Ｅ）および３つのジスルフィド結合をもつ２つのク
リングル（すなわちクリングル１およびクリングル２ド
メイン；に１およびに２）を有する。

従って天然のｔ−ｐ＾は５つの機能性ドメインＦ１Ｅ、
に＋　、に２およびＬからなる［ヨーロッパ特許出願公
開公報第０１９８９２０号およびＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃ１．ｌ］５Ａ８３４６７０（１９８８）
参照］。

天然のｔ−ｐ＾は、即効性のプラスミノーゲン活性化因
子阻害因子（ＦＡＩ）によって速かに不活化される［た
とえば、チャーチル・リビングストーン社刊「止血と血
栓症（Ｈａｅｍｃｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂ
ｏ−ｓｉｓ）」第２版２［１ｌ−２６２（１９８７）参
照コ、心筋梗塞患者は健康な対照者の２倍のＦＡＩ濃度
を示しており、心筋梗塞がしばしば急性冠血栓症によっ
て惹起されるとの報告がある。それゆえ、血栓症、とく
に心筋梗塞の治療のためには、該血栓溶解剤がＦＡＩに
よってより不活化されないことが望まれる。天然ｔ−Ｐ
Ａの修飾に関する種々の研究の結果、この発明の発明者
らは、天然ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の第４１５位のＬｙ
ｓが、ｔ−ＰＡとＰＡＩ　との間の相互作用に重要な役
割を演じていることを見出した。

発明の構゛および効果 それゆえ、この発明は、Ｌｙｓ４１５が他のアミノ酸に
よって構成されていることによって天然ｔ−ＰＡまたは
その他の変異ｔ−ＰＡと相違する新規ｔ−ＰＡを提供す
る。該新規ｔ−Ｐ八は、天然ｔ−Ｐ八と比較して、ＰＡ
Ｉにより不活化されにくい。

他のアミノ酸としては、酸性アミノ酸（たとえば、グル
タミン酸、アスパラギン酸）、中性アミノ酸（たとえば
、ロイシン、グルタミン）および、リジン以外の塩基性
アミノ酸を挙げることができ、好ましい他のアミノ酸は
酸性アミノ酸および中性アミノ酸である。

その他の変異ｔ−ＰＡは、Ｌｙｓ４１５以外の天然ｔ−
ＰＡの構成アミノ酸の一つ以上を他のアミノ酸で置換す
ることにより、天然ｔ−Ｐ＾の構成アミノ酸のいずれか
一つ以上を欠失させることにより、および／またはそれ
（一つ以上の任意のアよ）酸を付加することにより調製
されるｔ−ＰＡを包含しつる。

この明細書においては、天然または新規ｔ　−Ｐ　への
構成アミノ酸の番号付けは、ベニ力（Ｐｅｎｎｉｃａ）
らが提案した番号付け［Ｎａｔｕｒｅ　３０１．２１４
　（１９８３）参照］に従うものとし、たとえばＴｙｒ
”は、天然ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２位のチロシンを
意味する。

この発明の新規ｔ−ＰＡの好ましい例は、次のアミノ酸
配列によって表わすことができる：Ｈ１−Ａ２−４１５
−Ｒ２−Ａ４１７−４２８−　Ｒ３−Ａ４３Ｏ−ｆｉ２
７　（Ｔ　）（式中、Ｒ１はＳｅｒ−またはＧ１ｙ八ｌ
へＡｒｇＳｅｒ−Ｒ２は−Ｇｌｕ　− Ｒ３は−Ｌｙｓ−または−Ｇｌｕ　− Ａ２−４１５は天然ｔ−ＰＡのＴｙｒ２から６　ｌｙ　
４１５までと同じアミノ酸配列、 Ａ４１７−４２１５は天然ｔ−ＰＡのＨｉｓ４１７から
Ｌｅｕ４２ａまでと同じアミノ酸配列、 Ａ４３Ｏ−８２７は天然ｔ−ＰＡのＧｌｕ４３０からＡ
０８２？までと同じアミノ酸配列を示す。） この明細書においては、便宜上、該新規ｔ−ＰＡについ
て次のコード名を使用する： Ｐ４１Ｂ 上記アミノ酸配列（Ｉ）においで Ｒ１が、Ｓｅｒ　− Ｒ３が−Ｇｌｕ−であり Ｒ２、Ａ”ｌｓ、　Ａ”’−”’オＪ：びＡ４３Ｏ−Ｉ
Ｉ２γは各々上記定義の通りである。

ａＰ４１５−１ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において Ｒ１がＳｅｒ　− Ｒ３が−Ｌｙｓ　−であり Ｒ２、Ａ２−４１５．　Ａ４１７−４２ｅｌ　　および
Ａ−４３０−＋１２１は各々上記定義の通りである。

ａＰ４１５−２ 上記アミノ酸配列（１）において Ｒ１がＳｅｒ　− Ｒ２が一〇Ｉｎ− Ｒ３が−Ｌｙｓ−であり Ａ２−４１８、＾４１７−４２８およびＡ４３Ｏ−５２
７は各々上記定義の通りである。

ａＰ４１５−４ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において ・Ｒ１がＳｅｒ　− Ｒ２が−Ｌｅｕ　− Ｒ３が−Ｌｙｓ−であり、 ＾２−４１１１．　Ａ４１γ−４２’ｔｓ　Ｊ：　ヒＡ
４３’−”７ハ各＃　上記定義の通りである。

この発明の新規ｔ−ＰＡは、組換えＤＮＡ技術およびポ
リペプチド合成によって製造される。

すなわち、この発明の新規なｔ−ＰＡは、該新規ｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる発現
ベクターで形質転換した宿主細胞を培地に培養し、培養
物から該新規ｔ−ＰＡを採取することによって製造でき
る。

上記製造法の詳細を以下に説明する。

宿主細胞は、微生物［細菌（たとえば、大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　、等）、酵母（たとえばパン
酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒａｖｌｓｉ
ａｅ）　、等］、動物細胞糸および培養植物細胞を包含
しつる。微生物の好ましい例としては、細菌、とくにエ
シェリヒア属に属する菌株（たとえばＥ、　ｃｏｌｔ　
ＨＢＩＯＩ　ＡＴＣＣ３３６９４、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｈ
ＢＩＯＩ−１６ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８７２Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ　２９４　ＡＴＣＣ３１４４６，Ｅ、　ｃｏｌｔχ　
１７７６　ＡＴＣＣ３１５３７、等）、酵母、とくにサ
ツカロマイセス属に属する菌株［たとえばＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＣＲＦ　０１　
　（ヨーロッパ特許出願公開公報第０２２５２８６号参
照）］、動物細胞糸［例えばマウス上９２９細胞、チャ
イニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞等］な
どが含まれる。

細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターは、通常、少なくともプロモーター、開始コ
ドン、新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
、終止コドン、ターミネータ−領域および自己複製可能
ユニットから構成されるのが通常であり、酵母や動物細
胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターは少
なくともプロモーター、開始コドン、シグナル・ペプチ
ドおよび新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａならびに終止コドンから構成されるのが好ましく、さ
らにエンハンサ−配列、天然ｔ−ＰＡの５°−および３
°−非コード領域、スプライシング・ジャンクション、
ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を発現ベク
ターに挿入することもできる。

好ましいプロモーターとしては、慣用のプロモーター［
たとえば、大腸菌用のＰＬ−プロモーターおよびｔｒｐ
−プロモーター、パン酵母用のＴＲＰＩ遺伝子ＡＤ旧ま
たはへＤＨＩＩ遺伝子および酸性ホスファターゼ（ｐｏ
０５）遺伝子のプロモーター、噴孔動物細胞用のＨＴＬ
Ｖ−プロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモータ
ー、ＬＴＲ−プロモーター、マウス・メタロチオネイン
Ｉ　（ＭＭＴ）　−プロモーターおよびワタシニアープ
ロモーター等］が挙げられる。

好ましい開始コドンとしてはメチオニンコドン（ＡＴＧ
）が挙げられる。

シグナル・ペプチドとしては、天然ｔ−ＰＡなどのシグ
ナル・ペプチドが挙げられる。

シグナル・ペプチドまたは新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡは、たとえば、ＤＮＡ合成装置を用
いての部分または全ＤＮＡ合成および／または形質転換
体［たとえばＥ、　ｃｏｌｔ　ＬＥ　３９２λ０（ｐＴ
ＰＡ２１）、　　Ｅ、　　ｃｏｌｔ　ＪＡ２２１　　（
ｐＴＰＡ２５）ＡＴ（：Ｃ３９８０８、Ｅ、　ｃｏｌｔ
　ＪＡ　２２１　（ｐＴＰＡ１０２）ＡＴＣＣ３９８１
０゜Ｅ、　ｃｏｌｉＪＡ　２２１　（ｐＴＰＡ１０２）
　　（Ｌｙｓ　２７７−”ｌ１ｅ）ＡＴＣＣ３９８１１
、Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＪＭ　　１０９　　（ｐ５１Ｈ
）　　ＦＥＢＭ　　Ｐ−９７７４゜Ｅ、　ｃｏｌｉ　　
ＪＭ　１０９　（ｐＮ５３）　ＦＥＲＭ　Ｐ−９７７５
１から得られる適当なベクター［たとえば、ｐＴＰＡ２
１、ｐＴＰＡ２５、ｐＴＰＡ１０２　、ｐＴＰ＾１０２
（Ｌｙｓ　２７７−１１ｅ）、ｐ５１Ｈ，ｐＮ５３］　
に挿入された天然または変異ｔ−ＰＡをコードする完全
なりＮＡ配列の適当な酵素（たとえば、制限酵素、アル
カリホスファターゼ、ポリヌクレオチド・キナーゼ、Ｄ
ＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等）による処理のご
とき常法によって調製できる。この発明の好ましい実施
態様においては、新規ｔ−ＰＡをコードするＤＮＡの調
製を、ウエズル（Ｖｅｉｌｓ）らが５ｃｉｅｎｃｅ　２
３３，６５９−６６３　（１９８６）に記載しているカ
セット変異誘発および／またはフリック（Ｆｒ１ｔｚ）
がＤＮＡクローニング１，１５１（１９８５）、　ＩＲ
Ｌプレスに記載しているオリゴヌクレオチド特異的変異
誘発によって行うことができる。

終止コドンとしては慣用されている終止コドン（たとえ
ばＴＡＧ　、　ＴＧ＾、等）が挙げられる。ターミネー
タ−領域としては、天然または合成のターミネータ−（
たとえば、合成ｆｄファージターミネーター１等）が挙
げられる。

自己複製可能ユニットとしては、それに属する全ＤＮＡ
を宿主細胞中で自己複製しつるＤＮＡ配列で、天然のプ
ラスミド、人工的に修飾したプラスミド（たとえば、天
然プラスミドから調製したＤＮＡ断片）および合成プラ
スミドが挙げられる。

このプラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細
胞とする場合に例えばプラスミドｐＢＲ３２２またはそ
の人工修飾体（ｐＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によ
って得られたＤＮＡ断片）が挙げられ、酵母を宿主細胞
とする場合に例えば酵母２μプラスミドまたは酵母染色
体ＤＮＡが挙げられ、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場
合に例えばプラスよド、ｐＲ５Ｖｎｅｏ　ＡＴＣＣ３７
１９８、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣＣ３７１
４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　　ＡＴＣ
（：３７２２４、プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ　ＡＴＣＣ
３７１４９が挙げられる。

エンハンサ−配列としては、例えばＳＶ４０のエンハン
サ−配列（７２ｂ、Ａ）が挙げられる。

ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリア
デニル化部位が挙げられる。

スプライシング・ジャンクションとしては、例えば　Ｓ
Ｖ４０のスプライシング・ジャンクションが挙げられる
。

プロモーター、開始コドン、新規ｔ−Ｐへのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ　、終止コドンおよびターミネー
タ−領域は、適当な自己複製可能ユニット（プラスミド
）と共に、上流から下流に連続的に環状に、所望により
適当なりＮＡ断片（例えばリンカ−１他の制限部位、等
）を用いて、常法（例えば制限酵素による消化、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いたライゲーション）により連結して
、発現ベクターを調製できる。哺乳動物細胞株を宿主と
して用いる場合じは、エンハンサ−配列、プロモーター
天然ｔ−ＰＡのｃＤＮＡの５°−非コード領域、開始コ
ドン、シグナル・ペプチドおよび新規ｔ−ＰＡのアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン、３°　−非コ
ード領域、スプライシング・ジャンクションおよびポリ
アデニル化部位を上記の手法で適当な自己複製可能ユニ
ットに上流から下流に連続的にかつ環状に連結して発現
ベクターを調製してもよい。

その発現ベクターを宿主細胞に導入する。導入は常法［
たとえば、形質転換（トランスフェクションを含む）、
マイクロインジェクション等、］によって実施でき、形
質転換体が得られる。

この発明の製法における新規ｔ−ＰＡの製造のためには
、このようにして得た発現ベクター含有形質転換体を水
性培地に培養する。

培地は、炭素源（たとえば、グルコース、グリセリン、
マンニトール、フラクトース、ラクトース、等）および
無機または有機の窒素源（たとえば、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス
、ポリペプトン、バクトドリブトン、牛肉エキス、等）
を含有する。

所望により、他の成分［たとえば、無機塩類（たとえば
、Ｉ！燐酸ナトリウムまたはカリウム、燐酸水素二カリ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カル
シウム）、ビタ稟ン類（たとえば、ビタミンＢｌ）、抗
生物質（たとえば、アンピシリン、カナマイシン）、等
］を培地に加えてもよい。哺乳動物ｍｒｒａの培養には
、ウシ胎児血清および抗生物質を添加したダルベツコの
改良イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）がしばしば用い
られる。

形質転換体（トランスフエクタントを含む）の培養は、
一般に、ｐｉ（５，５〜８．５（好ましくはｐｉ（７〜
７，５）、１８〜４０℃（好ましくは２５〜３８℃）で
５〜５０時間にわたって実施すればよい。

このようにして生産された新規ｔ−Ｐ＾が培養物の溶液
画分中に存在するときには、培養物の濾過または遠心分
離によって培養濾液（上澄液）を得て、これから、天然
または合成の蛋白質の精製、単離に一般的に用いられて
いる通りの常法（たとえば、透析、ゲル濾過、抗−ｔ−
ＰＡモノクローナル抗体を用いるアフィニティ・カラム
クロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いるカラムクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、等）に
より精製、単離できる。生産された新規ｔ−Ｐ＾が培養
形質転換体の細胞中は存在するときは、細胞を濾過また
は遠心分離によって集め、細胞壁および／または細胞膜
を、たとえば、超音波および／またはリゾチームによる
処理により破壊して、デブリスとする。デブリスは適当
な水溶液（たとえば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグアニジウ
ム塩水溶液）に溶解でき、その溶液から、上述したよう
な常法により新規ｔ−ＰＡを精製することができる。

大腸菌で製造した新規ｔ−ｐ＾はリホールドする必要が
ある。リホールディングは常法によって行うことができ
る。

この発明の新規ｔ−Ｐ＾は、血管疾患（たとえば、心筋
梗塞、卒中、心臓発作、肺塞栓症、等）の治療のための
血栓溶解剤として有用である。この発明の新規ｔ−ＰＡ
は、医薬として許容しうる担体と混合して、注入剤のご
とき医薬製剤の形で、ヒトを含めた哺乳動物に非経口的
に投与できる。

医薬として許容できる担体は、ペプチドまたは蛋白質（
たとえば、血清アルブミン、等）を含有する医薬組成物
の調製に慣用されている種々の有機または無機の担体材
料を包含しうる。

この発明の新規ｔ−ＰＡの投与量は、疾患の種類、患者
の体重および／または年令、さらに投与経路の種類のご
とき種々の因子に応じて変動するが、この発明の新規ｔ
−ＰＡの最適投与量は、通常、注射または注入の場合は
０．１〜ｔｏｍｇ／ｋｇ／日の範囲内から選択される。

上記の一日量は数時間ごとに分割して患者に与えてもよ
い。

以下の実施例はこの発明を説明するためのものであって
、それらに限定されるものではない。

実施例中、使用した酵素（たとえば、制限酵素、アルカ
リホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガー
ゼ等）は全て市販のものであり、それら酵素の使用条件
は、たとえば市販の酵素に添付されている説明書を参照
すれば、当業者にとっては自明のところである。

バクテリオファージラムダシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４
ＡのＥｃｏＲ１部位にクローン化したヒトＤＮＡの部分
消化物を含有するヒトジェノムライブラリ−［Ｔ、マニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）から入手可能、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、Ｃｅ１ｌ　１５．６８７−７０１　（１９
７８）参照］を、３２ｐニツクトランスレーシヨンによ
って得られるＤＮＡプローブを用いて、ブラークハイブ
リダィゼーシ３　ン（Ｗａｈｌ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ■、　３６８３−
３６８７　（１９７９）参照］によりスクリーニングし
た。プラスミドｐＴＰＡ１０２　（Ｌｙｓ２７７−１１
ｅ）［それを含有する形質転換株Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＪＡ
２２１　（ｐＴＰＡ１０２）（Ｌｙｓ２７７−１ｉｅ）
　ＡＴＣＣ３９８１１から単離できる変異ｔ−ＰＡ（Ｌ
ｙｓ２７７−Ｔｉｅ）発現ベクター、　ＰＣＴ国際公開
第ＷＯ３６１０１５３１３号参照コの２３２ｂｐ　Ｐｓ
ｔＩ−ＲｓａＩ断片をプローブとして用いることにより
、６ＸＩＱ’プラークのスクリーニングから、３ｆ！の
重なり合う組換え体λ１８Ａ１．　　λ１９Ａ２および
λ２１Ａ２を単離した。ｔ−ＰＡ遺伝子の転写開始部位
および５゛−非コード配列を含むファージをｉｓするた
めに、ｔ−ＰＡ遺伝子の５′−非コード配列を含むλ１
９　Ａ　２　ｈ）らの１．５　Ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ　−
Ｒａｍ旧断片をプローブとして、２回目のプラークハイ
ブリダイゼーションを行った。このハイブリダイゼーシ
ョンにより、ｔ−ＰＡ遺伝子の最初の二つのエキソンを
含有するλ１３２　Ａｌおよびλ１１０　Ａｔを得た。

挿入ＤＮＡ配列のマツピング制限酵素解析によって行い
、それらのＤＮＡ配列をＭ１３シーケンシングキット（
アマ−ジャム〉を用いるジデオキシヌクレオチドチェー
ンターミネーション法によって部分的に決定した。

それらの挿入ＤＮＡの配列およびマツピングは、発表さ
れているｔ−ＰＡジェノムクローン［Ｄｅｇｅｎら、Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１．６９７２−６９８
５　　（１９８６）］と一致することがわかった。

メラノーマ（黒色腫）細胞培養からの全ＲＮＡをＣｈｉ
ｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｃｉｓｔｒｙ　１８．５２
９４　　（１９７９）　　の報告と実質的に同様にして
抽出した。ヒトメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ）を、３％
（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清および１０　ｍＭ　）ＩＥＰＳ
を補ったダルベツコの改良イーグル最小必須培地（ＤＭ
ＥＭ）　４００ｍ４をそれぞれ入れた１０本の回転びん
の中で、コンフルエントな単層となるまで培養１．た。

　ｔ−ＰＡを盛んに生産するために、ヒトメラノーマ細
胞を、プロテアーゼ阻害剤のアプロチニン６６８μｇを
含むＤＭＥＭ各４００＋ｎＪ２中で１８時間培養した。

細胞を遠心分離によって集め、６Ｍイソチオシアン酸グ
アニジウム、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）
、０．１ｖ２−メルカプトエタノールおよび０．５％Ｎ
−ラウロイルザルコシンナトリウムの５０ａｊＺに再懸
濁した。細胞をホモジナイゼーションによって分散させ
た。ホモジネートを、ベックマンＳＷ５０　、１ポリア
ロマ−管に入れた０、１　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）
中の５．７Ｍ塩化セシウムのクツション３　　ｌｌ１ａ
ｌの上へ載せ、３０、ＯＯＯｒｐｍ　、　２０℃で１２
時間遠心分離した。

上澄みを捨て、ＲＮＡベレットを水１ｍ１Ｌｋ：ｉかし
た。０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）およ
び２．５容のエタノールを加えて、ＲＮＡを沈澱させた
。オリゴ−ｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーを
用いて、全ＲＮＡ　ＹＡ製物からｍＲＮＡを精製した［
Ａｖｉｖら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　６９．１４０８（１９７２）参照］。４　Ｘ　
１０９細胞からの代表的な収量は、全ＲＮＡ的１１ｍｇ
、ポリ（Ａ）プラスｍＲＮＡ約９００　μｇであった。

このポリ（Ａ）　プラスｍＲＮＡを、５′　−プライマ
ー伸長法［Ｌａｗｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、９．８１０３−６１１４　（１９８１）参照］
による二本鎖ｃＤＮ＾の調製に用いた。　ｍＲＮＡ　１
８０μｇと配列５’　　−ＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ
ＧＡ−３°を有するブライマー５μｇを、０．１Ｍ　［
１２００μ℃中、９０℃で５分間加熱し、つぎにゆっく
り４２℃まで冷却した。アニールしたｍＲＮＡを用い、
５０ＩＩＩＭトリスＨ（：１（ｐＨ８，３）、１０ｅＭ
　Ｍｇ（：ｈ　、１０ｍＭＤＴＴ、４ｍＭ　　ビロリン
酸ナトリウムおよび各１ｍＭの４　ｆｌのデオキシリボ
ヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ
％ｄｃＴＰ、　ｄＧＴＰ）の４００μ色中で逆転写酵素
２００単位を用いて、第一のｃＤＮＡ鎮を４２℃で６０
分間にわたり合成した。混合物を、２０１１１１＋−リ
ス−〇に１．（＋）１７．５）、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２
．１０１Ｍ　（Ｎ）１４）２５０４．１００ｍＭ　ＫＣ
Ｉ　、　Ｑ、１８ｍＭ　ＮＡＤ。

５０　ｕｇ／　ｍｆｌ　　ＢＳ＾２ＩＩｌｕ中で１０車
位／ｍｕのＲＮａｓｅ　Ｈ、５０本位／ｍＡのＤＮＡポ
リメラーゼＩおよび５０！位／ｍｌｌの大腸菌ＤＮＡリ
ガーゼにより、１２℃で１時間、２２℃で１時間処理し
た。

反応混合物に７４ＤＮＡポリメラ一ゼ１５！＃位を加え
た。３７℃で１０分間インキニーベートしたのち、反応
混合物をフェノール／クロロホルムで１回抽出し、水溶
液を１容の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび４容のエタノー
ルで沈澱させた。二本鎖ｃＤＮＡを、２ＱＱ　ｍＭカコ
ジル酸カリウム、２５ｍＭトリス−）ＩＣＩ　（ｐｏ　
６．９）、１　ｍＭ　ｄＣＴＰ　、　０．１ｍＭ　ＤＴ
Ｔ　、　１ｍＭ　　ＧａＣｌ２２００μＡ中、ターミナ
ルトランスフェラーゼ１０単位を用いて、３７℃で３０
分間にわたり、デオキシ　（Ｃ）残基で伸長させた０反
応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、水溶液
を０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）および
２容量のエタノールで沈澱させた。テイルのついたｃＤ
ＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　　、
’　１ｍＭ　ＥＤＴ＾、０．１５Ｍ　ＮａＣ１６００μ
ｆｌ中、５８℃で１時間にわたり、デオキシ（Ｇ）テイ
ルつきｐｕｃ９　（ファルマシア）　６６０ｎｇとアニ
ールした。アニールしたＤＮＡを用いて、コンビ−テン
トなＥ、　ｃｏｌｔ　ＤＨｌを形質転換した。アンピシ
リン耐性表現型として約１７，０００の形質転換株を得
た。この５°−ブライマー伸長ｃＤＮＡライブラリーを
、３２ｐニツクトランスレーシヨンによって得られたＤ
Ｎ＾プローブによりコロニーパイプリダイゼーション（
Ｇｒｕｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ
、　Ｓｃｉ、７２．３９６１−３９８５　（１９７５）
参照］によりスクリーニングした。、ｔ　１９Ａ２から
の１、Ｓｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｒａｍ）ＩＩ断片をプロー
ブとして、陽性のパイプリダイゼーションシグナルを与
えた８コロニー中の一つから、ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡの
５°−非コード配列およびシグナル配列を含有するプラ
スくドｐＭ１２００を単離した。９ＭＩ２００のｃＤＮ
＾ＤＮＡ片は、長さが約１７０ｂｐで、ジデオキシヌク
レオチドチェーンターミネーション法によってＤＮＡの
塩基配列を決定した（そのｃＤＮ八配列配列４図に示す
）。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＡ２２１　（ｐＴ）’Ａ１０２）（
Ｌｙｓ２７７−１１ｅ）八ＴＣＣ３９８１＋の斜面培養
の１白金耳を、５０μｇ／　＋ｎ＋２のアンピシリンを
含有するＬ−プロス１℃に接種し、３７℃で、６００ｎ
ｍでの光学密度（０，０，）が約０．６吸収単位となる
まで、振盪しながらインキュベートした。０．Ｄ、が約
０．６となったとき、培地にクロラムフェニコール粉末
を最終濃度１００μｇ／　ｍｆｌとなるよう添加し、イ
ンキュベーションを一夜続行した。

Ｂ５プラスよドｐＴＰＡ１０２　（Ｌ　５２７７−　Ｈ
ｅ）の単離実施例３Ａで得た培養ブロスからＵ、　ｃｏ
ｌｔ　ＪＡ２２１　（ｐＴＰＡ１０２）　（Ｌｙｓ２７
７−１１ｅ）の細胞を集めた。

細胞は４０００ｇ　、　４℃で１０分間の遠心分離によ
って集め、上澄液は捨てた。細胞ベレットを、５　ｍｇ
／＋ｎｉのリゾチームを含有する溶液１（５０ｍＭグル
コース、２５ｍＭトリス−１（Ｃ１（ｐｌ（８，０）、
１０ｍＭＥＤＴＡを含有する水溶液）２０ｍｊ！に再懸
濁し、室温で５分間放置した。つぎに、リゾチーム処理
ＵＪＪ胞に溶液２　（０，２Ｎ、　ＮａＯＨおよび１％
ＳＤＳを含有する水溶液）４０ｍｊＺを加え、倒置によ
り溶液をおだやかに混合した。混合物を氷上に１０分間
放置した。

木酢１１Ｊ１１１．５ｍｕと水２Ｂ、５　ｍｊＺを５Ｍ
酢酸カリウム溶液（ｐＨ４，８）　　６０　　ｍＪＺに
加えて調製した水冷酢酸！ＸＸ液液０ｍＬＬを上で得た
混合物に加え、倒置により混合した。溶液を氷上に１０
分間放置し、ト主−・セイコーＮｏ、　４Ｎ−ＩＩ　（
またはそれの等個物）中、２０．ＯＯＱｒｐｍ　、　４
℃で２０分間遠心分離した。宿主ＤＮＡとデブリスが管
底にベレットを形成した。上澄液約７２ａｊｌを回収し
、イソプロパツール０．６容量を加え、混合し、室温で
１５分間放置した。１１，０００ｇ　、室温で１５分間
遠心分離してプラスミドＤＮＡを集めた。上澄みを捨て
、ＤＮＡベレットを室温で７０％エタノールで洗い、デ
カントした。ベレットを真空デシケータ−中で乾燥し、
ＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリス−）ＩＣＩ　（ｐ）１７．
５）　および１ｍＭ　　ＥＤＴＡ］　　８　ｒａｉｌに
再懸濁した。

そのＤＮＡ溶液にＣｓＣ１８ｇを加えた。１０ｍｇ／ｒ
ｎＩＬの臭化エチジウム水溶液をＧ５Ｃ１−ＤＮＡ溶液
の各１０ｍｆｌに加えた。溶液の最終密度は約１．５５
ｇ／ｍｆＬ、臭化エチジウム濃度は約６ＧＯμｇ　／１
ｎｆＬであった。溶液をベックマンＶＴｉ６５遠心分離
管に移し、頂部まで満たし、シールし、５０，０００ｒ
ｐｍ　。

２０℃で１２時間遠心分離した。遠心後、通常光で二つ
のＤＮＡバンドが見えた。＃２１皮下注射針つきの注射
器を遠心管の側面ぞいに挿入して、下方のＤＮＡバンド
を回収した。回収した［）ＮＡ温溶液５ＭＮａＣｌ飽和
イソプロパツールで数回抽出して臭化エチジウムを除去
した。Ｔ　Ｅ　１１　毒液に対しての透析によりＣｓＣ
１を除去した。プラスミドｐＴＰＡ１０２（Ｌｙｓ２７
７−４１Ｌｅ）約ＩＩＩＩｇが得られ、これを４℃で保
存した。

単離 プラスミドｐＴＰＡ１０２　（Ｌｙｓ２７７−”　ｌ１
ｅ）約５０μｇを、１００ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭト
リス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ
、７ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる制限緩衝液
Ａ１００μ℃中、制限酵素出ｌｌ３０！＃位により、３
７℃で２時間消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱により
濃縮し、０．８％ア・ガロースゲル上で電気泳動した。

１９７４ｂｐのＢｇｌ　ＩＩ断片（そのＤＮＡ配列を第
４図は示す）を実施例５Ａと同様にして可視化し、回収
した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　Ｄｔ＋１の
形質転色 プラスくドｐＭＩ２Ｑｏ約０．８μｇを制限酵素緩衝液
へ４０μ℃中でＬ蓬、　１１３０単位により３７℃で２
時間消化して、線状ＤＮＡを調整した。線状化したプラ
スミドを、０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下に２．５容
量のエタノールで沈殿させ、遠心分離によりＤＮＡを集
めた。　ＤＮＡベレットを、水９４μ角、アルカリホス
ファターゼ液（２５０＄位１０１．；宝酒製株式会社）
１μ℃および１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐ）１８．０）　　
５μｍ中に再懸濁し、３７℃に１時間置いた。　ＤＮＡ
を、フェノールとクロロホルムの（１：　１）混合物お
よびクロロホルムとイソアミルアルコールの（２４：１
）混合物とで抽出後、エタノールで沈澱させ、水２０μ
丑中（再懸濁した。この脱リン酸化ｐＭＩ　２００７　
ａｉｌ　（約２００ｎｇ）を１９７４ｂｐ　生１１断片
２μｉ（約１０１００ｎ、５×ライゲージコン緩衝液［
３３０ｍＭ　トリス−）ＩＣＩ　（ｐＨ７，５）、３３
１１Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、５０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、２．５１Ｍ　ＡＹＰ］　３μ℃、Ｔ４［ＩＮ＾リガ
ーゼｌμ℃および水２μ℃に加えた。この反応混合物を
１４℃で一夜インキユベートした。

実施例５Ｄと同様にして、ライゲージコン混合物により
ε、　ｃｏｌｉ　Ｄ）１１を形質転換し、生じたＥ、　
ｃａｌｆ　ＤＨＩ　（ｐＭＩ　２０５）形質転換体をそ
れらのアンピシリン耐性表現型およびそれらのプラスミ
ドＤＮＡの数種の制限酵素による分析によって同定した
。形質転換体の一つから、実施例３と同様にして、プラ
スミドｐＭＩ　２０５をｊＩＬ！ｉ！シた。

１凰逍ｊ プラスミドｐＲ５Ｖｎｅｏ　ＡＴＣＣＮｏ、　３７１９
８約１３μｇを、制限緩衝液＾５０μ℃中、制限酵素■
■ＩＩ！　３０単位および制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ　３０
車位により、３７℃で２時間消化した。消化したプラス
ミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で泳動し、ゲルを臭
化エチジウムで染色し、長波ＵＶ光で可視化した。大き
い）ｌｉｎｄｌｌｌ　−Ｒａｍ　ＨＩ制限断片を切り出
し、−８０℃で２０分間凍結した。凍結融解法（Ｔｈｕ
ｒｉｎｇ　ら、１９７５年、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、６６、　２１３参照）によりＤＮＡ溶液を回収し、
２．５容量のエタノール−０，３Ｍ酢酸ナトリウムで沈
澱させ、遠心分離によりＩＩＮＡを採取した。ベレット
を真空中で乾燥し、乾燥蒸留水２０ＡｔｆＬ中に再懸濁
させた。

Ｂ、プラスミドＭＴ２０５の約２．１ｋｂ　１（ｉｎｄ
ｌＩ［−ＢａｍＨＴ断片のＪＬＩ！Ｉ！ プラスミド９ＭＩ２０５約３０μｇを、制限緩衝液Ａ中
制限酵素■■ＩＩＩおよびミ旧各３０単位により３７℃
で完全に消化した。これにより、大きさが２．７ｋｂと
２．１ｋｂの二つのＤＮＡ断片が生じた。１％アガロー
スゲルへかけるに先立ち、ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せた。約２．１ｋｂの旧ｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩバン
ドを、実施例５Ａと同様にして可視化し、切り出し、回
収した。

Ｃ，ライゲーション 実施例５Ａおよび５Ｂで得た上記断片各駒１１０９ｎを
、６６ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、６．’６
ｍＭ　ＭｇＣｌ□、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール
および０．５．１１ＭへＴＰを含有する反応混合物２０
μ旦中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３５０，０００車位／ｍ
ｌＬ；宝酒造株式会社）１μ℃を用いて、室温で４時間
ライゲートした。

Ｄ、　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＱＩの形質転）生じたラ
イゲーション混合物を用いて、ｖ。

Ｓｉｍａｎｉｓ、ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ第１巻、ＩＲ
Ｌブレス、オックスフォード、ワシントン特別行政区（
１９８５）の形質転換法と同様にして、アンピシリン５
０μｇ／ｎ＋ＪＬ含有しプレート（１％バクトドリブト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１
．５％寒天、ｐ）１７．５）上で、旦、並ユＨＢＩＯＩ
を形質転換した。

形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型ならび
に２．Ｏｋｂ　生Ｉ！断片の存在を含めてのプラスミド
ＤＮＡの制限酵素切断パターンの分析によって同定した
。生じた細胞を用いて実施例３と同様にして、プラスミ
ドｐｓＴ１０４を−ＱＬ離した。

Ｘ凰班亙 プラスミド　５Ｔ１０５Ｎのオ築 Ａ、　　５Ｖ２ｄｈｆｒの約０．９ｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ
−ＢａｍＨＩ断　の単プラスミドｐｓＶ２ｄｈｆｒ　Ａ
ＴＣＧ　Ｎｏ、３７１４５約５０μｇを、制限１１１衝
液Ａ１００μに中、制限酵素ＢＱ　ＩＴおよびＢａｍＨ
Ｉ各３０単位を用いて、３７℃で２時間完全に消化した
。エタノール沈澱によりＤＮＡ　ｅ濃縮し、１％アガロ
ースゲルで電気泳動した。約０．９ｋｂの断片を実施例
５Ａと同様にして可視化し、回収した。

Ｂ、ライゲージコンおよびＥ、　ｃｏｌｔ　）ＩＢＩＯ
ｌの堅曵 プラスミドｐｓ７１０４約０．６　μｇを、制限緩衝液
Ａ４０Ｊｌｆ１．中、３０単位のＢａｍＨＩにより３７
℃で２時間消化して、線状ＤＮＡを調製した。線状化プ
ラスミドを２．５容のエタノールと０．３Ｍ酢酸ナトリ
ウムで沈澱させ遠心分離によりＤＮＡを採取した。

ＤＮＡペレットを水９４μ旦、アルカリホスファターゼ
溶液（２５０単位／ｍＪＬ；宝酒造株式会社）１μ角お
よびＩＭ　トリス−）ＩＣＩ　（ｐＨ８，０）　　５μ
Ａ中に再懸濁し、３７℃に１時間置いた。　ＤＮＡを、
フェノールとクロロホルムの（１：１）混合物およびク
ロロホルムとイソアミルアルコールの（２４：１）混合
物とで抽出後、エタノールで沈澱させ、水２０μ℃中に
再懸濁した。この脱リン酸化ｐｓＴ１０４７　ｕ　ｆｌ
、　（約２００ｎｇ）を、実施例６Ａで得たＢＢＩ　Ｉ
Ｉ　−Ｂａｍ旧断片２μｆｔ　（約１０１００ｎ、５×
ライゲーシヨン緩衝液（へＴＰ含有）３μ℃、Ｔ　４　
ＤＮＡリガーゼ１μ℃および水２μ℃の混合物に加えた
。この反応混合物を１４℃で一夜インキユベートした。

実施例５Ｄと同様にして、ライゲーション混合物により
Ｅ、　ｃｏｌｔ　）ＩＢＩＯＩを形質転換し、生じた形
質車云換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ｐｓＴ１０
５）をそれらのアンピシリン耐性表現型ならびにそれら
のプラスミドＤＮＡの旧ｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩ制限
酵素分析によって同定した。形質転換体の一つから、実
施例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１０５を単離し
た。

Ｃ，ｐｓＴ１０５　Ｎａｒｌ　−５ａｃＴ断片の単離プ
ラスミドｐｓＴ１０５約１０μｇを、１９ｍＭｔ−リス
−）ＩＣＩ　（ｐ）１７．５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ
、１　ｍＭ　ＤＴＴを含有する＄１１限紙街液Ｃ５０μ
ｆｉ中、制限酵素ＮａｒＩ　　２０単位および５ａｃｌ
ｌＯ単位により、３７℃で完全消化した。消化プラスミ
ドＤＮＡを１％アガロースゲルで泳動し、臭化エチジウ
ムでゲルを染色し、ＤＮＡバンドを長波ｔｔＶ光下で可
視化した。大きいＮａｒｌ　−５ａｃｌ断片を切り出し
、実施例５Ａと同様にして回収した。

Ｄ、プラスミドＴＰＡ２１の約０．９ｋｂ　ＮａｒＴ−
５ａｃＩ断片空工里 天然ｔ−ｐ＾と３°−非コード領域の一部とをコードす
るＤＮＡ配列を有するプラスよドｐＴＰＡ２１約１０μ
ｇを、制限緩衝液Ｃ中、制限酵素ＮａｒＩ２０単位およ
び５ａｃ１１０単位により、３７℃で完全消化した。エ
タノール沈澱によりＤＮＡを濃縮したのち、１％アガロ
ースゲルにかけた。実施例５Ａと同様にして、約０．９
ｋｂのＮａｒＩ　−５ａｃＩバンドを可視化し、切り出
し、回収した。（Ｎａｒｌ　−５ａｃｌ断片のＤＮＡ配
列を第８図に示す）。

Ｅ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｉｌ　ＨＢＩＯＩ
の形監恵 実施例６Ｃおよび６Ｉｌｌで得た上記断片の各々約１１
００ｎを、反応混合物２ｏμｐ中で、Ｔ　４　ＤＮＡリ
ガーゼ（３５０，０００単位／ｍｕ；宝酒造株式会社）
により室温で４時間ライゲートした。ライゲーション混
合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして、旦、二坦ＨＢ
ＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、それらのアンピ
シリン耐性ならびにプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
より同定した。得られた細胞を用いて、実施例３と同様
にして、プラスミドｐｓＴ１０５Ｎを！＃離した。

東東班ｌ Ａ、プラスよドｐｓＴ１０６のオ築 ｐｓＴ１０５Ｎ　２０μｇを、制限緩衝液Ａ５０μ℃中
、制限酵素１５単位により、ゲル電気泳動分析によって
調べたときに部分消化のみを達成するべく予備インキュ
ベーション後、３７℃で４分間消化した。エタノール沈
澱によってＤＮＡを濃縮し、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，６
ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，９）、６ｍＭＭｇＣ
１２、６ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび１００
　μｇ／　ｍｆｌのＢＳＡを含有する制限酵素５ａｌＩ
緩衝液５０μ℃に再懸濁し、そこへ２０単位の５ａｌＩ
を加えた。３０℃で２時間反応を行った。ＤＮＡをエタ
ノール沈澱により濃縮し、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４，６）、５０　ｍＭ　ＮａＣ１１ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ
および５％グリセロールを含有するマングビーンヌクレ
アーゼ緩衝液に再懸濁した。反応混合物を３７℃で３０
分間インキュベートし、フェノールとクロロホルムとの
（１：１）混合物、クロロホルムとイソアミルアルコー
ルとの（２４：１）混合物で抽出後、ＩＩＩＮＡ断片を
エタノールで沈殿させ、水２０μ℃に再懸濁した。

Ｂ、ライゲーション 実施例７Ａで得た上記ＤＮＡ断片約５０ｎｇを、６６ｍ
Ｍ）−リス−）１（：ｌ　（１１８７，５）、６．６ｍ
Ｍ　ＭｇＣＬ　、１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール
および０．５ａ＋Ｍ　　ＡＴＰを含有する反応混合物２
Ｊｊｕ中、リガーゼ（宝酒造株式会社）３５０単位を用
い、室温で４時間自己ライゲートさせた。

Ｃ，Ｅ、　ｃｏｌｔ　８８１０１の肝貿転Ｉ上記ライゲ
ーション混合物を用い、実施例５Ｄと同様にして、旦、
二旦ＨＢＩＯＩを形質転換した。

形質転換混合物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ！含有Ｉ
、プレートにブレーティングした。形質転換体をそれら
のアンピシリン耐性表現型ならびにそれらのプラスミド
の生１ｌ−５ａｌＩ制限酵素分析によって同定した。そ
れら形質転換体の一つから、実施例３と同様にして、プ
ラスミドｐｓＴ１０６を単離した。

実施例８ プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　ＡＴＣＣＮｏ、
　３７２２４約１μｇを、８ａｍＨＩ緩衝７夜（１５０
ｍＭ　Ｎａ（：１　、　６ｍＭトリス−Ｈ（：１　、　
ｐｔ（７，９，６ｍＭ　ＪＣｈ）　５０　ｕ　ｆＬ中、
制限酵素…ＨＩＩＯ車位により３７℃で完全消化した。

　Ｂａｎ　Ｈ１消化ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎ［ｌをエタノ
ールで沈澱させ、水２０μ℃中に再懸濁した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃａｌｆ　）１Ｂ＋０
１の形質転換 上記実施例８Ａで得たＤＮＡ約ｏ、ｉμｇを実施例５Ｃ
と同様にして自己ライゲートさせた。ライゲーション混
合物を用いて、実施例５Ｄと同様にしてＥ、　ｃｏｌｔ
　）１８１０１を形質転換した。形質転換体を、それら
のアンピシリン耐性表現型およびプラスミドＤＮＡの制
限分析によって同定した。形質転換体の一つから、実施
例３と同様にして、プラスミドｐＭＭＴｎｅｏを単離し
た。

実施例９ プラスミドｐＭＭＴｎｅｏ約５ｕｇを、工！ＩＭｉ毒液
（１５０［ＱＭ　ＮａＣ１、１０ｍＭｆ−リス−ＨＣｌ
、ｐ）１７．５．１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ２−
メルカプトエタノール）１００μ又中、制限酵素工１１
５０４位により３７℃で完全消化した。ＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させた。

Ｂ、　ＢｇＩ　ＩＴ末端のクレノー平滑末端化上記実施
例９Ａで得たｐＭＭ丁ｎｅｏの工１１消化産物を、５０
ｍＭｔ−リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，２）、１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ４、０，１ｍＭ　　ＤＴＴ、　　５　０　　ｔｔｇ／
　　ｍｕＢｓ八　、　０．５　　ｍｋｌｄＡＴＰ　、０
．５　ｍＭ　ｄＧＴＰ　、　０．５　ｍＭ　ｄＣＴＰお
よび０．５ｍＭ　ＴＴＰの混合物中クレノー断片１！＃
位により平滑末端化した。反応混合物を２０℃で３０分
間インキュベートし、つぎに酵素の熱不活化によって反
応を停止した。ＤＮＡをエタノール沈澱により回収した
。

Ｃ，ＭＭＴプロモーター含有断　の単離上記実施例９Ｂ
で得たＤＮＡを、制限緩衝液Ａ５０、ｕＪ！中、制限酵
素Ｒａｍ　Ｈｌ５０単位により３７℃で１時間消化した
。エタノール沈澱によってＤＮＡを濃縮し、４．３ｋｂ
の断片を実施例５Ａと同様にしてＪＩＬｉ、回収した。

Ｄ　、　　３．０ｋｂ　ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　　有断　
の単離プラスミドｐｓＴ１０８約１０μｇを、Ｈｉ　ｎ
　ｄ　ＩＩＩ緩衝液（６０ｍＭ　ＮａＣ１、７ｍＭトリ
ス−Ｈ（：ｌ　、　ｐＨ７，５、７ｍＭ　ＭｇＣ１２）
　２００μｊ２中、制限酵素旧ｎｄｌｌ１１００単位に
より３７℃で完全消化した。ＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、実施例９Ｂと同様にして平滑末端化した。エタノ
ール沈澱によってＤＮＡを回収し、Ｂａｆｆ１）ＩＩ緩
衝液５０１．ｔｌに再懸濁し、制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ２
０車位により３７℃で１時間消化した。ＤＮＡをエタノ
ール沈澱によって濃縮し、約３．Ｏｋｂの断片を実施例
５Ａと同様にして！＃離、回収した。

Ｅ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ
の　買虹曵 上記実施例９Ｃおよび９Ｄ’ｔ’得た断片の各々約１１
００ｎを、反応混合物２０７１１１中、Ｔ　４　ＤＮＡ
リガーゼ１７５４位を用いて室温で４時間ライゲートし
た。ライゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄと同様
にして、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。

形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型および
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。得
られた細胞を用いて、実施例３と同様にして、プラスミ
ドｐｓＴ１１２を単離した。

プラスよドｐｓＴ１１２約５μｇを、制限Ｐｉ衝毒液５
０μｕ中、制限酵素Ｂａｆｆ１旧および５ａｌｌ各２０
単２０単全に二重消化した。フェノール−クロロホルム
抽出後、エタノールでＤＮＡを沈澱させた。

！ｌａｍ　Ｈｌ−５ａｌ　Ｉ消化産物を、実施例９Ｂと
同様にして、ＤＮＡポリメラーゼ■クレノー断片２単位
によって平滑末端化した。ＤＮＡをエタノール沈澱によ
って回収した。平滑末端化ＤＮＡ約１１００ｎを、実施
例５Ｃと同様にして自己ライゲートさせた。ライゲーシ
ョン混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして、Ｅ、　
ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、
それらのアンピシリン耐性表現型およびプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析によって同定した。形質転換体の一つ
から、実施例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１１８
を単離した。

笈立囲旦 庄旦旦圭 プラスミドｐｓＴ１０５Ｎを、５　ｍＭ　ＭｇＣｈ、２
ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび０．Ｏ１％ＢＳＡ
を含有する５ＩＩＩＭトリスー）ＩＣＩ（ｐＨ７，１）
　１０μ℃で、制限酵素Ｂｂｅｌ　（宝酒造株式会社）
５４℃位により３７℃で４時間消化した。ＤＮＡをエタ
ノール沈澱によって回収し、１０　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、
　１０ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０．Ｏ１
％ＢＳＡを含有する１０ｍＭトリス−）ＩＣ１（ｐＨ７
，５）に再懸濁した。懸濁した［ｌＮＡを、制限酵素Ｘ
ｍａＩ２０車位により３７℃で５時間消化した。反応混
合物をフェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、
水層中のＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）０
．１容量およびエタノール２容量で沈澱させた。回収し
たＤＮＡを７５％エタノールで洗い、真空中で乾燥し、
ＴＥ緩衝毒液μ℃に溶解した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、ｃｏｌｌ　ＪＭ１０３の
　　転換 Ｍ１３ｍｐ１９　ＲＦ　ＤＮＡ（ファルマシア社から入
手可能）約１μｇを、実施例１１Ａと同様にして、制限
酵素ＢｂｅｌおよびｘＩＩｌａＩで消化した。ＢｂｅＩ
−ＸｍａＩＤＮＡ断片終１１０断片全１１００ｎ）−リ
ス−）ＩＣＩ　（ｐｉ（７，８）１０　ｍＭ　ＭｇＣｂ
、２０　ｍＷ　Ｉ）ＴＴ、　　ｔ　ｍＭ　ＡＴＰおよび
５０μｇ／ｍｆＬのＢＳＡからなるライゲーションＶＩ
Ａ　ｊＭ液２０μ℃中で、ｉ　Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造株式会社）３５０車位を用いて、ｐｓＴ１０５
ＮのＢｂｅＩ−ＸｍａＩ断片１μｇに４℃で一夜ライゲ
ートした。ライゲ−ジョン混合物を用いてコンピテント
なＥ、　ｃｏＩＩ　ＪＭ１０３（ファルマシア社から入
手可能）細胞をトランスフェクトし、トランスフェクタ
ントを、基質Ｘ−ｇａｌ　　（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−ガラクトシド）中でのそれらの
無色プラーク表現型およびそれらのファージＲＦ　ＤＮ
Ａの制限酵素分析により同定した。トランスフェクタン
トから生成ファージＭ１３ｍｐ１９ｆｕ７を単離し、こ
れを用いてＭ１３ｍｐ１９ｆｕ７　ＲＦ　ＤＮＡおよび
一本１ｉＤＮ＾を単離した。

Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＪＭ１０３の一夜培養物（この−夜培
養は、ＰｒｏＡＢを担持するＦエビソームの保持を確保
するために、最小培地ストックから接種して行った）１
５μｍを加えた２ＸＴＹブロス１．５　　ｍｆｌに、Ｍ
１３ｍｐ１９ｆｕ７の単一プラークをとった。この培養
物を３７℃で振盪しながら、６時間インキュベートした
。遠心分離によって細胞を除去し、ファージ含有上澄液
１１１Ｑｆｌを２ＸＹＴブロス（バクトドリブトン１６
ｇ／ｕ、ＮａＣ１１０ｇ／Ｊ２、ｐＨ７，２−７，４）
　４００ｍ氾オヨヒ旦、笠貝ＪＭ１０３の一夜培養物４
　ｍＪ２に接種した。この培養物を３７℃で振盪しなが
ら６時間インキュベートし、８，９００ｇ、４℃で１０
分間遠心分離した。ベレットからＭ１３ｍｐ１９ｆｕ７
フアージＲＦ　ＤＮＡを１．ｓでき、上澄液から一本鎖
ＤＮＡも単離できる。

Ｂ、　Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ７　ＲＦ　ＤＮＡの単離感染
細胞ベレットを、５ｍｇ／ｍｕのリゾチームを含有する
５０１１ＩＭグルコース、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
ｎａ、ｏ）、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）の８
　ｍｊ２に再懸濁し、５分間室温に放置した。つぎに、
０．２ＮＮａＯＨおよび１％ＳＤＳの１６１１ＩＪｉ（
をリゾチーム３８埋細胞に加え、液を倒置により混合し
た。混合物を氷上で１０分間インキュベートした。溶解
細胞混合物に水冷５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４，８）　２
０　　ｍｌＬを加えた。液を倒置により混合し、氷上で
１０分間インキュベートした。５Ｍ酢酸カリウム溶液は
、水２８．５　ｍｆｌおよび５Ｍ酢酸カリウム６０ｍｊ
２に氷酢酸Ｌ１．５　ｍｆｌを加えることにより調製し
た。得られた溶液はカリウムについて３Ｍ、酢酸塩につ
いて５Ｍとなる。

溶解細胞混合物を、トミー・セイコーＮｏ。

４Ｎ−ＩＩ　（またはそれと等価の遠心機）にて２０，
０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。細胞ＤＮ
Ａ　！５よびデブリスが管底にベレットを形成した。上
澄液的３５ｍＪ２が回収され、この上澄液に６容量のイ
ソプロパツールを混合し、生じた溶液を室温で１５分間
放置した。プラスミドＤＮ＾を、１１．０００ｇ　、室
温での１５分間の遠心分離によって採取した。上澄液を
捨て、ＤＮＡベレットを室温で７０％エタノールで洗っ
た。エタノール洗液をデカントし、ベレットを真空乾燥
量中で乾燥した。

つぎに、ベレットをＴＥ緩衝液３．８　ｍＩＬに再懸濁
した。

このＤＮＡ溶液に、ＣｓＣ１４ｇおよびＴＥ緩衝液中の
１０　ｍｇ／　ｍｆｌ臭化エチジウム溶液６４８μ℃を
加えた。溶液をベックマンＶＴ１６５遠心管に移し、頂
部まで満たし、シールし、５０，０００ｒｐｍ、２０℃
で１２時間遠心分離した。遠心分離後、長波ＵＶ光中で
可視化された２木のバンドのうち下方のＤＮＡバンドを
、遠心管の側面に沿って挿入した＃２１皮下注射針つき
注射器を利用して回収した。臭化エチジウムを、５ＭＮ
ａＣ１飽和イソプロパツールで４回抽出して除去した。

水層を、１０ｍＭトリス−）ＩＣｆｌ（９８７，５）お
よび１　ｍＭ　ＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液２℃に対し
て４℃で一夜透析した。得られたＭ１３ｍｐ１９ｆｕ７
　ＦＲＤＮＡ溶液をその次の実施例に用いた。

Ｃ，Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ７−木ｇｉ［）ＮＡの単離実施
例１２Ａで得た培養上澄液４００　ｔｎ、Ｑに、２０％
ポリエチレングリコールおよび２．５Ｍ　ＮａＣ１の８
０ｍ１２を加えた。溶液を振盪し、１時間放置し、８９
００ｇ　、　４℃で３０分間遠心分離した。上澄液を捨
て、ベレットを１０ｍＭ）−リス−〇ＣＩ　（ｐｉ４７
．５）および１　ｍＭ　ＥＤＴＡの２０ｍＩＬに再悲ｉ
蜀した。溶マ夜をＴＥ緩衝毒液和フェノール２０ｍｊ２
で１０分間抽出し、９０００ｇ、　２０℃で１０分間遠
心分離した。

水層を回収し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）およ
びエタノール５０ｍｊ２を加えて沈澱させた０回収した
Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ７−末鎖ＤＮＡを７５％エタノール
で洗い、真空中で乾燥し、ＴＥ緩衝液１　　ｍｌＬに再
懸濁した。

１里 Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ７　ＲＦ　ＤＮＡ　２０ｕｇを、６
　ｍＭ　ＭｇＣｈ、６ＩＩＩＭ　２−メルカプトエタノ
ールおよび１００　ｔｔｇ／　ｔａｌｌのＢＳＡを含有
する６ｍＭトリス−１（ＣＩ　（ｐＨ７，４）　２００
μ℃中で、制限酵素５ａｃ１５０単位により３７℃で４
時間消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、
セファクリルＳ−１０００を１０ｍｊＺ用いてのゲル濾
過により７．９ｋｂ断片を単離した。　７．９ｋｂの５
ａｃＩ断片を含有する溶出液を０．８％アガロースゲル
電気泳動により同定し、集め、エタノールで沈澱させた
。このＤＮＡを水５０μＬに再懸濁した。

Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ７−末鎖ＤＮＡ６０μｇおよびＭ１
３・ｍｐ１９ｆｕ７の７．９ｋｂ　５ａｃＩ断片２０μ
ｇを混合し、エタノールで沈澱させた。混合ＤＮＡを、
１５０　ｍＭ　ＮａＣ１および１５ｍＭクエン酸ナトリ
ウムの２００μ℃に再懸濁した。このＤＮＡ溶液を７分
間煮沸し、６５℃の水浴に１０分間移し、水冷した。生
じたギャップＤＮＡをセファクリルＳ　−１０００を用
いるゲル濾過により単離した。ギャップＤＮＡを含有す
る溶出液を１％アガロースゲル電気泳動によって同定し
、エタノールで沈澱させた。ギャップＤＮＡをＴＥｉＪ
ｔｌ液５０μＡに再懸濁し、次の変異誘発実施例で鋳型
として使用した。

Ｂ５部　　、　雪 配列５　’−ＣＡＴＧＡＧ（：ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＣ（
：ＧＣＴＣＣＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＣ＾＾ＧＧ
ＣＣＴ（：ＡＴＧＣＴＣＧＣＣＧＴＡＧＣＣ−３°　（
６１ｍｅｒ）を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

この合成は、ＤＮＡ合威装置（アプライドパイオシ、ス
テムス社、３８１Ａ型）を用いて行い、このオリゴヌク
レオチドをＨＰＬＣによって精製した。これは、第４１
５位および第４２９位の両リジン残基を二つのグルタミ
ン酸残基に置換して、更に±工制限酵素部位をつくり出
すために設計したもので、この部位によって変異ＤＮＡ
を容易に検出できた。

６１マ一オリゴヌクレオチド２μｇを、１０ｍＭＭｇＣ
１２および５ｍＭジチオスレイトール（［１ＴＴ）を含
有する７０ｍＭｔ−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）　２
０　μｕ中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位
を用いて３７℃で１時間リン酸化した。

ギャップＤＮＡ　１１００ｎとリン酸化６１マーオリゴ
ヌクレオチド２０ｎｇとを、７５　ｍＭ　ＫＣＩ含有５
１１Ｍトリス−）１０１（ｐ）１７．５）　１０μ℃中
で、６５℃で７分間アニールし、ついで４℃に冷却した
。アニールしたＤＮＡを、８０　ｍＭ　ＫＣＩ、　　３
０　ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１５　ｍＭ　
ＭｇＣｈ、２ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５　ｍＭ　ＡＴＰ。

４種のデオキシリボヌクレオチド三すン酸各５０ｎＭの
４０μ℃中で、ＤＮＡポリメラーゼ■クレノー断片１単
位およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１００４位を用いて埋め込
み、した。混合物を室温で４時間インキュベートし、コ
ンピテントなＥ−、ｃｏｌｔ　ＪＭ１０３の形質転換に
用いた。トランスフエクタントのうちの４８株からファ
ージＲＦ　ＤＮＡを調製し、制限酵素Ｘｈｏｌで消化し
た。そのＲＦ　ＤＮＡ中にＸｈｏＩ制限酵素部位を含む
ファージを用いて、上述の方法で、Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ
８　ＲＦ　ＤＮＡをｌ−！ｌｉｔ、た。

Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ７　２０　μｇを、６ｍＭ　ＮａＣ
１、６ｍＭＭｇＣｈ、６ｍＭ　２−メルカプトエタノー
ルおよび１００μｇ／　ｍ互のＢＳＡを含有する６ｍＭ
）−リス−）ＩＣＩ　（ｐＨ７，４）　２００μ℃中で
、制限酵素史Ｉ５０単位により３７℃で３時間消化した
。５ＭＮａＣ１４μ℃および制限酵素跪！５０車位を反
応混合物に加え、混合物を３７℃で３時間インキュベー
トした。ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、実質的
に実施例１３Ａの操作に従って、ゲル濾過により７．６
　ｋｂ　５ｃａＩ−へｐａｌ断片を単離した。

−本６−Ｉ　Ｍ　ｌ　３　ｒａ　ｐ　１９　ｆ　ｕ　７
とＭ１３ｍｐ１９ｆｕ７の７．８ｋｂ　５ｃａＩ　−Ａ
ｐａＩ断片とからギャップＤＮＡを実質的に実施例１３
Ａの操作に従って、調製し、単離した。

Ｂ、遁僅隻及立又且旦澄 ＤＮＡ合成装置（アブライドバイオシステムズ社、　３
８１　Ａ型）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、Ｈ
ＰＬ（：によって精製した。配列５°−ＣＡＡＧＧＣＣ
ＴＣＡＴＧＣＴＣＧ（：ＣＧＴＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＣ
ＴＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＣ−３°（４３塩基）をもつこ
のオリゴヌクレオチドブライマーを用いて、天然ｔ−Ｐ
Ａの４１５位のりジン残基をグルタミン酸残基に置換ｌ
ノた。この４３塩基のオリゴヌクレオチドおよび実施例
１４Ａ記載のギャップＤＮＡを用いてのオリゴヌクレオ
チド特異的変異誘発を、実質的に実施例１３Ｂの操作に
従って実施した。

得られた変異誘発混合物を用いて、Ｅ、　ｃｏｉｌＪＭ
１０３をトランスフェクトし、所望の変異株を制限酵素
マツピングにより同定した。実質的に実施例１２の操作
に従って調製したＭ１３ｍｐ１９ｓｔ１０５　ＲＦＤＮ
Ａ中には、２つの５ａｃｌ制限酵素認識部位の一つが存
在しなかった。

実施例１５ 断片のＩＬ離 Ｍ１３＋ｎｐ１９ｆｕ８　ＲＦ　ＤＮＡ約ＩＱμｇを、
５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ールおよび１００μｇ／ｍＡのＢＳＡを含有する５ｍＭ
トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，１）５０μＡ中で、制限酵素
ＢｂｅＩ２５単位により３７℃で４時間消化した。ＤＮ
Ａをエタノール沈澱によって回収し、１０　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｈ、８ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび１００
μｇ／ＩＩＩＩＬのＢＳＡを含有する１０ｍＭ）−リス
−〇ＣＩ　（ｐ）１７．５）　５０μ℃に再懸濁した。

懸濁ＤＮＡを、制限酵素ＳｍａＩ２５＄位により３７℃
で４時間消化した。消化ＤＮＡをエタノール沈澱により
濃縮したのち、０．５μｇ７ｍＩｌの臭化エチジウムを
含有する１、０％アガロースゲルにかけた。　１１８９
ｂｐ　ＢｂｅＩ−５ｍａＩバンドを長波ＵＶ光の下で可
視化し、切り出し、−８０℃で２０分間凍結しまた。Ｔ
ｈｕｒｉｎｇら、１９７５年、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、６６、２１３記載の凍結融解法によってゲル断片か
らＤＮＡを溶出させ、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５
，２）の存在下に２．５容量のエタノールで沈澱させた
。遠心分離後、ＤＮＡベレットを７５％エタノールで洗
い、真空中で乾燥し、ＴＥ１１街液１０ｍＪＺに再懸濁
した。

Ｂ、プラスミドｐｓＴ１１８の５．９ｋｂ　ＢｂｅＩ−
５ｍａｌ断片の！Ｐ−離 プラスミドｐｓＴ１１８約１０μｇを、５　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ、、２ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０．
０１％ＢＳ＾を含有する５ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ
７，１）　５０　ｕ　、Ｑ中で、制限酵素ＢｂｅＩ２０
単位により３７℃で４時間消化した。ＤＮＡをエタノー
ル沈澱により回収し、１０　ｍＭ　Ｍｇ（：ｈ、６＋ｎ
Ｍ２−メルカプトエタノールおよび０．Ｏ１％ＢＳＡを
含有する１０ｍＭｆ−リス−）ＩＣＩ　（ｐ）Ｉ７．５
）　５０μ℃中に再懸濁した。懸濁ＤＮＡを、制限酵素
ＳｍａＩ２０．ｉＩＬ位により３７℃で３時間消化した
。消化プラスミドＤＮＡを１％アガロースゲルにて泳動
し、大きいＢｂｅＩ−５ｍａｌ断片を、実施例５Ａ記載
のようにして、切り出し、回収した。

短負 上記実施例１５Ａおよび１５Ｂに記載の断片各約１１０
０ｎずつを、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ、１０ｍＭジチオス
レイトール、１　ｍＭ　ＡＴＰおよび５０μｇ／ｒａｉ
ｌのＢＳＡを含有する５０ｄｔ−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ
７，８）　２０　　＋ｉ中で、Ｔ４ＤＮ＾リガーゼ３５
０単位を用い、１６℃で４時間ライゲートした。ライゲ
ーション混合物を用い、実質的にＶ、Ｓｉｍａｎｉｓ、
ＤＮＡ　（：ｌｏｎｉｎｇ　、第１巻、ＩＲＬブレス、
オックスフォード、ワシントン特別行政区、１９８５年
の形質転換操作法に従い、５０μｇ／　ｍｉアンピシリ
ン含有しプレート（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ｐ）１７
．５）上でＥ、　ｃａｌｆ　ＨＢＩＯＩを形質転換した
。

形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型および
プラスミドＤＮＡの制限Ｍ素分析により同定した。得ら
れた細胞を用いて、実質的に実施例３の操作法に従い、
プラスミドｐＦｕ１６０を単離した。

去１０９１１１８ プラスミドｐｓＴ１３５の構築 Ｍ１３ｍｐ１９ｓｔ１０５　ＲＦ　ＤＮＡからの１１８
９ｂｐ　Ｂｂｅｌ−５ｍａＩ断片の単離は、実質的に実
施例１５Ａ教示の通りに行った。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　）ＩＢＩＯ
Ｉの監携 上記実施例１６Ａおよび１５Ｂ記載の断片各々約１１０
０ｎずつを、実質的に実施例１５Ｃの操作法に従って、
ライゲートした。ライゲーション混合物を用い、実質的
に実施例１５ＣＩＣ従って、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。

形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型および
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析社よって同定した。得
られた細胞を用いて、実質的に実施例３の操作法に従っ
て、プラス１１９５丁１３５を！＃離した。

実施例１７ プラスミドｐｓＴ１４５の構築 Ａ、プラスミド　５Ｔ１３５からの＋５２３ｂｐ　Ｂ　
ＩＩＩ−５ｍａＩブ”ｙスＺドｐｓＴ１３５約１０μｇ
を、１００　ｍＭ　ＮａＣ１゜１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２
．１０ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび０．０１％
ＢＳＡを含有する１０ｍＭ）−リス−〇ＣＩ（ｐＨ７，
５）　５０μ℃中、制限酵素ＢＱ　１１２０単位により
３７℃で２時間消化した。　ＤＮＡをエタノール沈澱じ
よって回収し、２０　ｍＭ　ＫＣＩ、　　６　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２．６ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０
．０１％８ＳＡを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（
ｐ）１８．０）　５０　ｕ　１１に再懸濁した。懸濁Ｄ
ＮＡを、制限酵素ＳｍａＩ２０車位により３７℃で４時
間消化した。消化ＤＮＡを１％アガロースゲルにて泳動
し、１５２３ｂｐ断片を、実施例５Ａ記載の通りにして
、切り出し、回収した。

プラスミドｐｓＴ１１２約１０７．＋ｇを、１００　ｍ
Ｍ　ＮａＣ１゜１０　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ２−
メルカプトエタノールおよび０．０１％ＢＳ八を含有す
る１０ｍＭ）−リス−〇ＣＩ（ｐＨ７，５）　５０μ角
中で、制限酵素ＬＬ！　１１２０車位により３７℃で２
時間消化したＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、２
０１Ｍ　ＭＣＩ、　Ｂ　ｍＭ　ＭｇＣｈ、６ｍＭ　２−
メルカプトエタノールおよび０．０１％ＢＳ＾を含有す
る１０ｍＭ）リス−）ＩＣＩ　（ｐ）１８．０）　５０
　ｕ　Ｉｔに再懸濁した。懸濁ＤＮＡを、制限酵素Ｓｍ
ａ１２０単位により３７℃で４時間消化した。消化ＤＮ
Ａを０．８％アガロースゲルにて泳動し、実施例５Ａ記
載の通りにして、５．８ｋｂ断片を切り出し、回収した
。

Ｃ，ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ
の短曵 上記実施例２０Ａおよび２０Ｂ記載の断片各１１００ｎ
ずつを、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ、１０ｍＭジチオスレイ
トール、１　ｍＭ　ＡＴＰおよび５ｏｕｇ／ｍｌＬのＢ
ＳＡを含有する５０ｎ１Ｍトリスー［１（ｐＨ７，８）
　２０　ｕ　ｆＬ中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位
を用いてライゲートした。ライゲーション混合物を用い
て、実質的に実施例１５Ｃに従って、旦、性態ＨＢ１０
１を形質中云換した。

形質転換体を、アンピシリン耐性表現型およびプラスミ
ドＤＮＡの制限酵素分析により同定した。

得られた細胞を用いて、実質的に実施例３の操作法に従
って、プラスミドｐｓＴ１４５を！＃離した。

ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社。

３８１Ａ型）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、Ｈ
ＰＬＣによって精製した。配列５°−ＧＣＣＴＣＡＴＧ
ＣＡＡＧＣＣＧＴＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＡＣＡＣ
ＴＣ−３°（３５塩基）をもつオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて、天然ｔ−ＰＡの４１５位のりジン残基
をロイシン残基に置換した。この３５塩基のオリゴヌク
レオチドおよび実施例１４Ａ記載の有ギャップＤＮＡを
用いて実施例１３Ｂと同じ手法でＭ１３ｍｐ１９ｓｔ１
２８　ＲＦ　ＤＮＡを得た。

Ｍ１３ｍ９１９ＳＴ１２６　ＲＦ　ＤＮＡから実施例１
５Ａで述べに方法でＢｂｅＩと±■の制限酵素で切断後
１１８９ｂｐの［ＩＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片１
１００ｎと実施例１５Ｂで調製したｐｓＴ１１８のＢｂ
ｅＩ−５ｍａＩの制限酵素で切断した５、９ｋｂ　ノＤ
ＮＡ断片１１００ｎ’を実施例１５Ｃに述べた方法で結
合させる。この結合させた反応液で旦、■旦ＨＢＩＯＩ
を実施例１５Ｃの方法で形質転換させる。形質転換体は
アンピシリン耐性で選択した後、プラスミドＤＮＡを抽
出して制限酵素切断パターンを分析してプラスミドｐｓ
Ｔ１８０を有する形質転換体を同定した。この形質転換
体より実施例３に示す方法でプラスミドｐｓＴ１８０を
−ａ離した。

ＤＮＡ合成装置（アブライドバイオシステムズ社、　３
８１　Ａ型）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、）
ＩＰＬＣｌ、：よッテ精製した。配列５°−ＧＣＣＴＣ
ＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＡ
ＣＡＣＴ−３°（３４塩基）をもつオリゴヌクレオチド
ブライマーを用いて、天然ｔ−ＰＡの４１５位のりジン
残基をグルタミン残基じ置換した。この３４塩基のオリ
ゴヌクレオチドおよび実施例１４Ａ記載のギャップ［ｌ
ＮＡを用いて実施例１３Ｂと同じ手法でＭ１３＋＋＋ｐ
１９ｓｔ１２８　ＲＦ　ＤＮＡを得た。

Ｍ１３ｍｐ１９ＳＴ１２８　ＲＦ　ＤＮＡから実施例１
５Ａで述べた方法でＢｂｅｌとＳｍａ　Ｉの制限酵素で
切断後、１１８９ｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ
断片１１００ｎと実施例１５Ｂで調製したｐｓＴ１１８
の±Ｉ−ＳｍａＩの制限酵素で切断した５、９ｋｂ　（
７）ＤＮＡ断片１１００ｎを実施例１５Ｃに述べた方法
で結合させる。この結合させた反応液でＥ、　ｃｏｎ　
ＨＢｌｏｌを実施例１５Ｃの方法で形質転換させる。形
質転換体はアンピシリン耐性で選択した後、プラスミド
ＤＮＡを抽出して制限酵素切断パターンを分析してプラ
スミドｐｓ７１８２を有する形質転換体を同定した。こ
の形質転換体より実施例３に示す方法でプラスミドｐｓ
Ｔ１８２をｌＬ離した。

Ａ、担完ビと乱髪 Ｌ　−９２９細胞（Ａ丁ＣＣ＃　ＣＣＬ、−１）の培′
養を、カナマノイシンおよび１０％（ｖ／ｖ）の牛胎児
血清を含有するダルベツコの改良イーグル必須培地で、
３７℃にて５％ＧＯ□雰囲気中で維持した。これらの細
胞を、形質転換の前日に、１０ｃｍベトリ皿１枚当たり
５　Ｘ　１０’のｉ胞密度でプレートし、形質転換日に
５０−６０％のコンフルエンシーを得た。形質転換の３
時間前に培地を交換した。各形質転換に１０ｃ＋＋＋ペ
トリ皿２枚の細胞を用いた。

Ｂ、ＤＮＡの調＼ プラスミドＤＮＡを用いてゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）法
［ＤＮＡ　（：ＩｏｎＬｎｇｌｌ　、　　１４３　　（
１！［１５）、　　ＩＲＬｐｒｅｓｓｌ　　と同様にし
てリン酸カルシウム手法によりＬ　−９２９細胞を形質
転換した。発現プラスミド（１）ＦＵ　１６０　ｐｓＴ
１４５、ｐｓＴ１８０またはｐｓＴ１８２）　　３０μ
ｇとプラスミドｐｓ２ｎｅｏ　ＡＴＣＣＮｏ、　３７１
４９　３　μｇを２Ｍ　ＣａＣｌ２１８６μＸと水１．
３　ｍＪ２に加えた。ＤＮＡ溶液１．５　　ｍｊ２を２
　Ｘ　１ｅｅｓ　（１，６３％ＮａＣ１，１，１９％ｔ
（ｅｐｅｓ、　０．０４％Ｎａ２ＨＰ０４ｐＨ７，１２
）　１．５　ｍａｌにバブリングしながら滴下した。

混合物を細胞に接触させる前に室温で３０分間放置した
。

Ｃ１細　のトランスフェックション 実施例２２Ｂで調製したＤＮＡ溶液０．６　　ｍＪＺを
ゆるく攪拌しなからＬ　−９２９細胞の１０ｃｍベトリ
皿に加え、３７℃でＣＯ２気流中１８時間加温した。

細胞をｉ）ＭＥＭで２回洗った。１０％ＦＣ５を含む完
全な新鮮成育培地を次に加え、細胞ＣＯ２気流中３７℃
で２４時間加温した。細胞をトリプシン処理し、３００
　μｇ／　ｆｆ１ｉｌのジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉ
ｃｉｎ。

Ｇ４１８）および１０％ＦＣ５を含むＤＭＥＭからなる
選択培地中で１：１０のサブカルチュアをした。

ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ遺伝子産物〉を発現
する細胞が選択培地中で生存し、コロニを形成すること
かできる。培地を３−４日ごとに交換し、コロニーを１
２−１４日後に単離した。

６４１８抵抗性コロニーを小シリンダー中おだやかなト
リプシン処理により採取し、培養塊になるまで増殖させ
、変異ｔ−ＰＡの分泌について試験した。、細胞を直径
Ｌ７ｃｍの３　　ｍａｌの培地を入れたマルチ・ウェル
・プレート皿中で約３　Ｘ　１０５細胞数になるまで増
殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を０
．０４ｍＭ　ＺｎＳＯ４，１ｍＭ酪酸ナトリウム、２％
ＦＣ５を含む、ＤＭＥＭからなる誘導培養培地１ｍｌ１
中３７℃で２４時間培養し、培地中の変異ｔ−ＰＡをＳ
　２２５１を用いる間接吸光分析法［Ｔｒｏｍｂｏｓｉ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ　３１，４２７　（１９８３）参照
］により定量した。

変異蛋白質ａｐ４１５　、　ａｐ４１Ｂ−１、ａｐ４１
５−２およびａｐ４１Ｂ−４をそれぞれ実施例２２で得
たプラスミドｐＦＵ１６０．９５丁１４５．　ｐｓＴ１
８０またはｐｓＴ１１１２テ形質転換（トランスフェク
ト）したＬ　−９２９クローンの誘導培養培地から精製
した。変異蛋白質精製の最初の工程は、モノクローナル
抗ｔ−ＰＡ抗体結合セファロース４Ｂカラム（１，６ｃ
ｍ　ｘ３ｃｍ）　　［メーカーの指示に従い、モノクロ
ーナル抗ｔ−ｐ＾抗体（その調製７去は、たとえばカイ
ズ・ットムら、Ｔｈｒｏａ＋ｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　４０．９ｌ−９９（１９８５）　に開示されている
）をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させた］で
のアフィニティクロマトグラフイーであった。カラム（
０，７ｘ　２．５ｃｍ）を、０，０１％トウィーン８０
および１０　ＫＩＬＩ／　ｎ＋ｊｌのアプロチニンを含
有す゛る０、Ｉ　Ｍトリス−１（ＣＩで平衡化した。各
誘導培地を通過させ、カラムを１０カラム容の平衡化Ｍ
′ａ液で洗った。脱着は、０．Ｏ１％トウィーン８ｏお
よび１０ＫＩＤ／　ｍＡのアプロチニンを含有する０、
１Ｍ　　塩酸グリシン（ｐ）１２．５）で行った。脱着
画分を直ちに１Ｍトリス−）ＩＣＩ　（ｐ）１９．０）
で中和し、ｔ−ＦＡ活性を含むものをプールした。精製
の次の工程は、　０．１５ＭＮａＣ１，Ｏ，００５％ト
ゥイーン８０およびｌ０ＫＩＩＩ／ｍＩｌのアプロチニ
ンを含有する０、０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ　（ｐ）１８
．０）で平衡化したベンズアミジンセファロース４Ｂ（
ファルマシア）カラム（０，４５Ｘ　３ｃｍ）でのアフ
ィニティクロマトグラフィーであった。第一工程でプー
ルした画分をベンズアミジンセファロースカラムにかけ
た。カラムを、ＩＭＮａＣｌ、０．００５％トゥイーン
８０および１０にＩｌｌ／ｍｌＬのアプロチニンを含有
する０、０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ　（ｐ）１８．０）　
１０カラム容で洗い、１Ｍアルギニンを含有する洗浄用
Ｍ！　？Ｉ液を用いて行った。　ｔ−ＰＡ活性含有画分
をプールし、０．１Ｍ　（ＮＨ４）２ＣＯ３，０，１５
ＭＮａＣ１，０，０５％トウィーン８ｏに対して透析し
た。

この操作での変異蛋白質の収量をローリ−法によって求
めた。

結果を次表に示す。

実施例２４ 変異ｔ−ＰＡであるａｐ４１８およびａｐ４１５−１の
プラスミノーゲン活性化因子活性を、間接吸光分析法［
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３１，４２
７　（１９８３）参照］によって求めた。すなわち、各
変異ｔ−ＰＡの種々量を、０．１　Ｍ塩化ナトリウムお
よび０．０１％（Ｖ／Ｖ）トライトンＸ−１００を含有
する５０＋ｎＭトリスー１（Ｃ１（ｐＨ８，８）中でＷ
ｉｍａｎらの方法［（：ｌｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔ
ａ１２７　、２７９（１９８３）参照］により調製した
、０．２μＭヒトプラスミノーゲン（ミドリ十字、大阪
）　、０．９　ｍＭ　Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−ｐ−ニトロアニリド、２８ＣＩ　（Ｓ−２２５１％Ｈ
ＡＣ：Ｉ（ＥＭ）および７０ｕｇ／ｖａＩｔの可溶化フ
ィブリンの混合物に加えた０反応部合物を３７℃で３時
間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（タ
イターチック・マルチスキャン、フローラボラトリーズ
社、米国）を用いて、活性化因子なしのブランクと対照
して、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。天然ｔ−Ｐ八
［国際標準（ＷＨＯ）　］の標準曲線を参照して、変異
ｔ−Ｐへのプラ、スミノーゲン活性化因子［ｔ−ＰＡの
国際単位（ＩＩ）］を求めた。変異ｔ−ＰＡの蛋白質濃
度をローリ−法によって求めた。結果を次表に示す。

（以下余白） Ｂ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＦＡＩ）Ｅ
、　ｃｏｌｔ　ＬＰＳのエンドトキシン注射（１μｇ／
ｋｇ）　　３時間後にエンドトキシン処理家兎からＦＡ
Ｔリッチな血漿を得た。ＦＡＩ　リッチ血漿中のＰＡＮ
　レベルは１２０　ｕ　／　ｍ　Ｊｌであった。　５ｐ
ｅｉ’ｓｅｒらの方法［Ｔｈｒｏｍｂｏｓｌｓ　Ｒｅｓ
、　４４．５０３（１９８６）参照］を改良して、ＰＡ
Ｉによるｔ−ＰＡのＰＡ活性の阻害を測定した。ｔ−Ｐ
Ａ５０μ色を緩衝液またはＦＡＩ希釈液５０μ角に加え
て最終ｔ−ＰＡ濃度が２ｕ／ｉｎとなるようにした。室
温で１０分間のインキュベーションののち、各試料に０
．ＩＭ　　酢酸緩衝液（ｐ）１３．９）　８０μ２を加
えてこれを酸性化し、室温で１０分間インキュベートし
た。その後、アッセイＭｉ毒液を試料に加えて最終量を
３００μ℃とし、この試料の２０μ℃を用いて、間接吸
光分析法により残存活性を測定した結果を次表に示す。

上記実施例で得た発現プラスミドｐＦＩ＋１６０．　ｐ
ＳＴ１４５、ｐｓＴ１８０およびｐｓＴ１８２をそれぞ
れＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩに挿入
し、得られた下記の形質転換株を、ブダペスト条約に基
く国際寄託機関の一つである日本国３０５茨城県つくば
市谷田部町東１丁目１−３工業技術院微生物工業技術研
究所（ＦＢＩ）に１９８８年６月２３日および１９８９
年６月１４日に寄託ずみである。

（以下余白）

【図面の簡単な説明】 第１図は、新規ｔ−ＰＡ発現ベクターの構築を示す。 第２図は、プラスミドｐＭＩ２００の制限部位・機能地
図を示す。 第３図は、プラスミド９ＭＩ２００のｃＤＮＡ挿入断片
のＤＮＡ配列を示す。 第４図は、プラスミドｐＴＡ１０２（Ｌｙｓ２７７−１
１ｅ）のＢｇｌ　ＩＩ　ＤＮＡ断片（１９７４ｂｐ）の
ＤＮＡ配列を示す。 第５図は、プラスミドｐＭＩ２０５の制限部位・機能地
図を示す。 第６図は、プラスミドｐｓＴ１０４の制限部位・機能地
図を示す。 第７図は、プラスミドｐｓＴ１０５の制限部位・機能地
図を示す。 第８図は、Ｎａｒｌ−ＳａｃＩ断片（〜０．９ｋｂ＋）
）のＤＮＡ配列を示す。 第９図は、プラスミドｐｓＴＩＱｓＮの制限部位・機能
地図を示す。 第１Ｏ図は、プラスミドｐｓＴ１０Ｂの制限部位・機能
地図を示す。 第１１図は、プラスくドｌ）ＭＭＴｎｅｏの制限部位・
機能地図を示す。 第１２図は、プラスミドｐｓＴ１１２の制限部位・機能
地図を示す。 第１３図は、プラスミドｐｓ’ｒ１ｔａの制限部位・機
能地図を示す。 第１４図は、Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ７　ＲＦ　ＤＮＡの制
限部位・機能地図を示す。 第１５図は、Ｍ１３ｍｐ１９ｆｕ８　ＲＦ　ＤＮＡの制
限部位・機能地図を示す。 第１６図は、Ｍ１３ｍｐ１９ｓｔ１０５　ＲＦ　ＯＮへ
の制限部位・機能地図を示す。 第１７図は、プラスミドｐＦｕ１８０の制限部位・機能
地図を示す。 第１８図は、プラスよドｐｓＴ１３５の制限部位・機能
地図を示す。 第１９図は、プラスミドｐｓＴ１４５の制限部位・機能
地図を示す。 第２０図は、Ｍ１３ｍｐ１９ｓｔ１２６　ＲＦ　ＤＮＡ
の制限部位・機能地図を示す。 第２１図は、プラスミドｐｓＴ１８０の制限部位・機能
地図を示す。 第２２図は、Ｍ１３ｍｐ１９ｓｔ１２８　ＲＦ　ＤＮへ
の制限部位・機能地図を示す。 第２３図は、プラスミドｐｓ７１８２の制限部位・機能
地図を示す。 第２４図は、第１７図に示したａＰ４１Ｂをコードする
変異ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および相当するア
ミノ酸配列を示す。 第２５図は、第１９図に示したａＰ４１５−１をコード
する変異ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および相当す
るアミノ酸配列を示す。 第２６図は、第２１図に示したａＰ４１５−２をコード
する変異ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および相当す
るアミノ酸配列を示す。 第２７図は、第２３図に示した　ａＰ４１５−４をコー
ドする変異ｔ−ａｐａ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および相
当するアミノ酸配列を示す。 第１ 図（１） 第１図（２） 第１ 図（３） 第３図 ＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣ
Ａ八ＧＴＧＡＴＣＣＣＤｈｌｌａｌＱａｌ（１ｇｌｙａ
ｌへａ＋ｇｐｅｒｌｙ＋Ｑｌｌｌｖａｌｌ（ＩＪＩ 第８図（２） Ｐｒｏ＾ｓｐＴｒｐＴｈｒＧｌｕｃｙｇＧｌｕ１０ ｃｏＲＩ シ社 ５ｎａｌ 第２４図（１） ５１ｊＴ＾＾０ＧＧＡＣＧＣＴＧＴＩ；＾＾ＣＣ＾＾Ｔ
Ｃ第２４図（２） 第２４図 （３） ＣＣＴＣ＾＾＾＾ＣＣ＾＾＾ＴＯＡＣ＋＾τＣＣＣＧＣ
ＣＴＣＴ丁Ｃ丁ＴＣＴＴ＾ｒｇＰｒｏ串中・ 例 ＾＾＾＾Ｔｏ＾＾＾ＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡＡＴＡＧＴ＾
＾＾＾Ｇ＾＾＾Ｃ＾＾Ｃ＾−３′第２５図（１） ５１、−、ＴＴ＾＾にＧＧＡＣＧＣＴＣ，ＴＧ＾＾ＣＣ
＾＾ＴＣＳｅｒＮｅｌｌｌｅＬｅｕｌ　１ｅＧＩＹＬｙ
ｉＹａｌＴｙｒＴｈｒＡｌａＧＩｎ＾５ｎＰｒＯＳｅｒ
八１ａＧｌｎＡｌａしｃｕｔ＝ｌｙ第２５図（２） 第２５図（３） ＣＧＡＣＣにＴＧＡＣＣＡにＱＡＡＣＡＣＣＣＧＡＣＴ
ＣＣＴＣＡＡＡＡにＣＡＡＡ丁ＧＡＧＡＴＣＣＣにＣＣ
ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ＾ｒｚＰｒｏ中◆◆ ＣＡＧＡＡＣへＣＡＣ１’ＧＣＡＡＡＧＧＣＧＣＡｃＴ
ＣＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣ丁ＣＣＡＧ八ＣＣ
ＣＡＣＣＡＣＡＣＣＧＣ八Ｇ＾＾ＣＣＧＧＧＡＣＧＡＧ
ＡＣＣＣ丁八ＣＡＣＯＡＯＡＧＧ（＋＾＾ＣｉＡり丁０
ＣＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＣＣＣＡＴＴ＾＾
＾＾ＴＧへ＾＾ＧＣＡＴＧＴＣＴＣＡ＾丁＾Ｇ丁＾＾＾
＾Ｇ＾＾＾Ｃ＾＾ＧＡＧＡＴＣＴ　　−３第２６図（１
） ５−　丁Ｔ＾＾ＧＧＣＡＣＣＣＴＩＩ：ＴＣへへＣＣ＾
へＴＣ第２６図（２） 第２６図 （３） ＣＣＡＣＣＧＴ（ｉＡｃｃＡＧＧ＾＾ＣＡＣＣＣＧＡＣ
ＴＣＣＴＣ＾＾＾＾ＧＣ＾＾＾ＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＣ
ＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ＾ｒｇＰｒｏ◆−◆ ■ ＣＡＣ＾＾０ＡＣＡＣＴＧＣ＾＾＾ＣＧＣＣＣＡＧＴＧ
ＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＡＣ丁ＴＣ丁ＣＣＡＧ八ＣＣＣ
ＡＣＣＡＣ八Ｃ（二〇Ｃへ〇＾＾にＣＧＧＧＡＣＧＡＣ
ＡＣＣＣＴＡＣへＧＧＡＧＡＧＧＧへ＾ＧＡＧＴＣＣＡ
ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＣＡＴＴＴＴＧＧ
ＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴ丁ＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴ
ＣＡＧＧ＾丁＾ＣＴＣＴＣＴＣＡＯＡＴＧＧＯＡＡＣＡ
Ｃ八ＴＧＡＡ丁ＧＣＡＣＡＣＴＡ（ｉＣＣＴＣＴＣＣＡ
にＧ＾＾ＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧ＾＾Ｇ
ＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＧＣへ？
、、ｌへｃｃｅｃ＾＾ＣＣＴＣＣ丁ＧＡＣＣＹＧＴＣＡ
ＣＣＧＴＧＡＣＣ人ＧＣＴＴＴＧＧ＾＾八ＣＡＧＧＡＣ
ＣＡＣへ＾＾＾＾丁Ｃ＾＾＾ＯＣ人丁ＧＴＣＴＣ＾八Ｔ
ＡＧＴ入＾＾＾Ｇへ＾＾Ｃ＾＾Ｇ＾−３第２７図（１） ５　−　　ＴＴＡＡＧＧＣＡＣＧＣＴＧＴにＡＡＧＣＡ
ＡＴＣ第２７図（２）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）Ｌｙｓ＾４＾１＾５が他のアミノ酸によって置換さ
   れていることによって天然またはその他の変異ｔ−ＰＡ
   と相異するｔ−ＰＡ。 ２）下記アミノ酸配列をもつ請求項１記載のｔ−ＰＡ： Ｒ＾１−Ａ＾２＾−＾４＾１＾５＾−Ｒ＾２−Ａ＾４＾
   ２＾６−Ｒ＾３−Ａ＾４＾３＾０＾−＾５＾２＾７（
   I ）（式中、Ｒ＾１はＳｅｒ−またはＧｌｙＡｌａＡｒ
   ｇＳｅｒ−、Ｒ＾２は−Ｇｌｕ−、−Ｇｌｎ−または−
   Ｌｅｕ−、Ｒ＾３は−Ｌｙｓ−または−Ｇｌｕ−、 Ａ＾２＾−＾４＾１＾５は天然ｔ−ＰＡのＴｙｒ＾２か
   らＧｌｙ＾４＾１＾５までと同じアミノ酸配列、 Ａ＾４＾１＾７＾−＾４＾２＾５は天然ｔ−ＰＡのＨｉ
   ｓ＾４＾１＾７からＬｅｕ＾４＾２＾８までと同じアミ
   ノ酸配列、 Ａ＾４＾３＾０＾−＾５＾２＾７は天然ｔ−ＰＡのＧｌ
   ｕ＾４＾３＾０からＰｒｏ＾５＾２＾７までと同じアミ
   ノ酸配列を示す。） ３）Ｒ＾１がＳｅｒ−、Ｒ＾３が−Ｌｙｓ−または−Ｇ
   ｌｕ−であり、Ｒ＾２、Ａ＾２＾−＾４＾１＾５、Ａ＾
   ４＾１＾７＾−＾４＾２＾８およびＡ＾４＾３＾０＾−
   ＾５＾２＾７は各々請求項２で定義した通りである請求
   項２記載のｔ−ＰＡ。 ４）請求項１で定義したｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ。 ５）請求項２で定義したｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコー
   ドするＤＮＡ。 ６）請求項４で定義したＤＮＡを含有する発現ベクター
   。 ７）請求項５で定義したＤＮＡを含有する発現ベクター
   。 ８）請求項６で定義した発現ベクターによつて形質転換
   された宿主細胞。 ９）請求項７で定義した発現ベクターによって形質転換
   された宿主細胞。 １０）請求項１のｔ−ＰＡをコードするＤＮＡを含有す
   る発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培地
   に培養し、生じたｔ−ＰＡを培養物から採取することを
   特徴とする、請求項１のｔ−ＰＡの製造法。 １１）請求項２のｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコードする
   ＤＮＡを含有する発現ベクターによって形質転換された
   宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物からｔ−ＰＡ
   を採取することを特徴とする、請求項２のｔ−ＰＡの製
   造法。 １２）請求項１のｔ−ＰＡと医薬として許容しうる担体
   とを含有する医薬組成物。