JPH0361497A - 新規ｆｋ５２０微生物変換物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規免疫抑制剤Ｌ−６８７，７９５およびその
生産のために微生物アクチノプラナセート３１）。

（Ａｃｔｔｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ　ｓｐ、）（ＭＡ６
５５９）　ＡＴＣＣＮｌ　５３７７１を利用する発酵プ
ロセスに関するものである。このプロセスは微生物とＬ
−６８３，５９０を、Ｌ−６８３、５９０が三重脱メチ
ル化されテトラヒドロビラン環がテトラヒドロフラン構
造へ再構成される条件下で培養することを含むものであ
る。またＬ　−６８７，７９５をヒトホストに用いて自
己免疫疾患、感染症の治療、および／または臓器移植拒
絶反応を予防する方法を開示する。

１９８３年に米国ＦＤＡはシクロスポリンを認可したが
これは非常に強力な抗拒絶剤であって臓器移植の分野を
一新させた。この薬剤は、身体の免疫系が移＋ａ組織の
外来蛋白質を拒絶するために生来備わるぼう大な防御担
当細胞に動員をかけることを阻止することにより作用す
る。

この薬剤が組織移植拒絶反応を抑える効果が強ければ強
いほど、多くのケースで重篤な腎障害、肝ｍ障害、潰瘍
をひきおこすという欠点ｒある。

引用することによりここにその内容を組み入れるフジサ
ワのＥＰＯ公開ｍｏ１８４１６２においてシクロスポリ
ンより１００倍効力が強いといわれる新規マクロライド
免疫抑制剤ＦＫ−５０６が記載されている。このマクロ
ライドはストレプトミセス・ツタバエンシスの特定の菌
株が発酵生産するものである。またストレプトミセス・
ヒグロスコピクス亜種ヤクシマエンシスが生産する近縁
のマクロライド免疫抑制剤ＦＫ−５２０についても記載
されている。

Ｔ・アライのＵ　Ｓ　Ｐ３，２４４，５９２にはストレ
プトミセス・ヒグロスコピクスの変種アスコミセチクス
を培養して抗真菌剤“アスコマイシン”を生産すること
が記載されている。

しかしながらシクロスポリン型の副作用が実質的にない
といえる免疫抑制剤の生産については全く報告がない。

より新しく、副作用が少なくてより安全な薬剤がこの分
野において日夜探求されている。

微生物アクチノプラナセートｓｐ、（ＭＡ６５５９）　
ＡＴＣＣ１ｋ５３７７１をマクロライド免疫抑制剤Ｌ　
−６３８，５９０とともに、窒素栄養源を含む炭水化物
液体地中で好気的深部培養を行うと新しい免疫抑制剤Ｌ
−６８７，７９５が得られることを見出した。上記培養
条件はｐＨ７付近で２７℃で、Ｌ　−６８３，５９０の
選択的三重脱メチル化（ｔｒｉｓｄｅｍｅｔｈｙｌａｔ
ｉｏｎ）　（即ち３つの異るメトキシ基からメチルラジ
カルを３個とり除く）を行わせてテトラヒドロピラン環
から、ヒドロキシ基がＣ−１４に存在するテトラヒドロ
フラン環構造に環の再構成を起させるのに十分な時間（
例えば２４時間）培養を行うものである。この産生物は
培養混液中ではマイナーなプロダクトである。もう１つ
のマイナープロダクトＬ−６８６，２９２（Ｌ　−６８
３，５９０のＣ−１５、Ｃ−３に重脱メチル化物）は１
９８９年５月５日に出願され、本願と同一の出願人に譲
渡された米国特許ＮｆＬ３４８．４２３（Ｃａｓｅ　１
７９１１）に開示されており、ここに引用して組み込む
ものとする。培養物の主要産物はＬ６Ｂ３，５９０　（
ｉｍｍｕｎｏｍｙｃｉｎ）のＣ−１３単一（モノ）脱メ
チル化物で、■９８８年６月２９日に出願されやはり同
一の出願人に譲渡された米国特許Ｍ２１３．０２５　（
ｃａｓｅ１７７６７）に開示されたＬ　−６８３，７４
２と、Ｌ　、−６８３，５９０のＣ−１３、Ｃ−３に重
脱メチル化物であって１９８９年１月１３日に出願され
同しく同一の出願人に譲渡された米国特許Ｍ２９７　、
６３０に開示されたＬ−６８３，７５６を含み、この２
つを特にここに引用して組み込むものとする。

このＬ−６８７，７９５は免疫抑制作用を示す。即ち、
本文中で″Ｔ細胞増殖アッセイ”というカルシウムイオ
ノフオア（イオノマイシン）とホルボールミリステート
アセテ−）　（ＰＭＡ）を誘発剤とするＴ細胞刺激アッ
セイにより示されるＴ細胞活性化阻害が陽性である。

このアッセイの原理はイオノマイシンとＰＭＡの組み合
せでＴ細胞を刺激しその増殖を測定するものである。こ
のアッセイで陽性なサンプルとはＴ１１Ｉ胞増殖を阻害
するものであり、阻害はトリチウムラヘルしたチミジン
の取込み減少で示される。

本発明によれば、アクチノプラナセート種の１菌株ＭＡ
６５５９をＬ−６８３，５９０とともに窒素栄養源を含
む炭水化物液体培地中で産物Ｌ−６８７、７９５がつく
られるのに十分な時間好気的に深部培養するステップを
含む、Ｌ−６８７，７９５として同定される免疫抑制剤
の製造方法が提供される。

新規免疫抑制剤Ｌ−６８７，７９５はＴ細胞増殖試験に
おいてＴ−細胞活性化抑制が陽性を示し、図１において
同定されるとおり′の陽子核磁気共鳴スペクトルを示し
、（ＦＡＢ）マススペクトロメリーによって得られる準
（ｑｕａｓｉ）分子イオンピーク（Ｍ”−Ｌｉ）７５６
から求められる分子量７４９を有する。

また治療上有効量のＬ−６７９，９７５を含み、薬学的
に許容し得る、実質的に毒性のないキャリヤーあるいは
賦形剤と組みあわせた製薬配合物が提供される。

さらに、ヒトにおける組織移植拒絶反応や、自己免疫疾
患あるいは感染性疾患の治療のために、治療有効量のＬ
−６８７，７９５を投与することを含む使用法が提供さ
れる。

本発明はＬ−６８７，７９５を生産するためにアクチノ
プラナーセト種ＭＡ６５５９に、Ｌ−６８３，・５９０
存在下で発酵を行わせることを含むものである。本微生
物は現在アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）　（メリーランド州、Ｉ？ｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ　＋　Ｐａｒｋｌａｗｎｄｒｉｖｅ　１２３０１）
にＡＴＣＣＩｔ　５３７７１として、およびメルクカル
チャーコレクション（Ｍｅｒｋ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ）　（−ニーシャーシー州、Ｒａｈｗ
ａｙ）にＭＡ６５５９として限定寄託しである。形態学
的、培養、生物学的および生理学的特徴を含む物理的特
徴と分類学について以下簡単に記載する。

これまでに行われた分類学的解析に基づき、本菌株は仮
りにアクチノミセス目、アクチノプラナセス科に属すと
されている最終的に本国の属と種を決定するために更に
詳細な分類学的特徴を調査中である。

本国はトリブチケースソイ寒天培地（２８℃および３７
℃）、酵母・麦芽エキス寒天培地、グリセリン・アスパ
ラギン寒天培地、無機塩・デンプン寒天培地、オートミ
ール寒天培地、ツアペックドックス寒天培地、ツアペッ
ク溶液寒天培地、ツアペック溶液・ペプトン寒天培地、
ベネット寒天培地（以上２８℃）を含む通常の培地によ
く生育する。

ｉ　　本国は直径０．２〜０．４μｍの分枝した糸状菌
糸形で発育する。コロニーは不透明で隆起し、不規則形
である。コロニーのテクスチュアは酵母麦芽エキス寒天
培地上ではゴム状であるが、菌糸の顕著な断片化が観察
される他の培地上ではバター状（ｂｕ　ｔｙｒｏｕｓ）
になる傾向がある。

コロニーの表面外観は粉状となる傾向がある。

拡散性の色素産生は認められない。

肥ヱ塁　胞子嚢は主として球形で大きさは直径４−２５
μｍの範囲にある。胞子嚢はグリセリン・アスパラギン
寒天培地上では通常２１日までには肉眼で認められるよ
うになる。胞子は両端が丸い桿状（０，７６Ｘ１．９８
μｍ）で、運動性は無く、長さ１５０μｍの、長い分枝
しない鎖状をなす。

ＭＡ６５５９の沖 エキス基　　　　（ＩＳＰ　　　２） 栄養発育の色は無色から黄色であり、気菌糸は２４−７
２時間で形成され、色は鈍黄色からローズピンク、外観
は粉状である。発育の裏面は黄褐色から赤みの茶色であ
る。

オートミール寒　　　（ＩＳＰ　　　３）発育の色は無
色から黄色で、発育の裏面は無色から黄褐色である。気
菌糸の色は白色〜明るいローズ−ベージュであり、外観
は粉状である。

缶　　・でんぷん　　　　（ＩＳＰ　　　４）生育は薄
く、気菌糸形成は少ない。栄養菌糸は無色で、断片化が
はなはだしい。コロニーの周囲のでんぷんの透明化は培
養７日までに起る。

グリセリン・アスパラギン寒（ＩＳＰ　　　５）栄養発
育は無色〜黄色を呈し、発育の裏側は無色〜肉桂色であ
る。気菌糸は粉状で白色〜ローズピンクを呈する。

ペプチド−−エキス基　　　（ＴＳＰ　ｆＬ６　）栄養
発育は黄褐色を呈する。気菌糸の形成は認められず、メ
ラニン様色素は生産されない。

チロシン寒　　　　（ＩＳＰ　　　７）栄養発育は黄褐
色から培養が古くなるにつれ濃い赤紫色を呈する。気菌
糸はビロード状で灰色がかったローズベージュ色を呈す
る。

ツ　ペック・ドックス夾　１立ｌ 栄養菌糸の生育は黄褐色で、培養が古くなるにつれてピ
ンク色を帯びる。気菌糸は短くてもつれ、分泌物の多い
外観を呈する＝ 本発明の方法はアクチノブラナセートｓｐ、でＬ−６８
７，７９５を生産する菌株すべてに用いることができる
が、特に好ましいのはＡＴＣＣＮ１１５３７７１株であ
る。

一般に、資化性の炭素源と窒素源を含む液体培地中で、
できれば好気的深部培養条件下（例、振とう培養、深部
培養など）でＬ　−６８７，７９５生産性の菌株をＬ　
−６３８，５９０と共に培養する（発酵させる〉ことに
より、Ｌ−６８７，７９５を生産することができる。液
体培地は発酵開始時と終了時（取り入れ）においてｐＨ
が約７に保たれていることが望ましい。ｐｌ＋が高くな
ると産物が相当量および／または完全に失われることに
なる。所望のｐＨはモルフォリノエタンスルフォンＭ　
（ＭＥＳ）　、モルフォリノプロパンスルフォンｕ　（
ＭＯＰ　Ｓ、）　、その他の緩衝剤を用いて保つか、あ
るいは以下に記すような生産用培地のように元来緩衝能
のある栄養源を用いることによって保つことができる。

栄養培地の炭素源として好ましいものは、グルコース、
キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デ
キストリンなとである。他にマルトース、ラムノース、
ラフィノース、アラビノース、マンノース、サリシン、
コハク酸ナトリウム等も炭素源とすることができる。

窒素源として好ましいものは、酵母エキス、肉エキス、
ペプトン、グルテンミール、コツトンシードミール、大
豆ミール、その他の植物性ミール（部分的または完全に
脱脂されたもの）、カゼイン加水分解物、大豆加水分解
物、酵母加水分解物、コーンステイープリカー、乾燥酵
母、麦芽、フェザ−ミール、粉末ビーナツツ、ジスチラ
ース・ソリューブルスである。アンモニア塩（例えば硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム等）、尿素、アミノ酸などの無機および有機窒素化合
物も同様に好ましい。

炭素源および窒素源は組み合せて使用するのが有利では
あるが、純品として用いる必要はない。

微量の生長因子や無機栄養素を相当量含んでいる純度の
低いものも十分使用することができるからである。必要
がある場合は培地に炭酸ナトリウムまたはカルシウム、
リン酸ナトリウムまたはカリウム、ヨウ素、マグネシウ
ム塩、銅塩、コバルト塩などの無機塩を添加することが
できる。

もし必要ならば、特に培養液が激しく発泡する場合には
、流動パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、あるいは
シリコーンのような消泡剤を添加できる。

出発物質のＬ−６８３，５９０は、米国特許地１４８９
１記載のようにストレプトミセスヒゲロスコピウス（Ｓ
、ｈ　　ｒｏｓｃｏ　ｉｕｓ　ｖａｖアスコ旦セチクス
（ａｓｃｏ＋＊　ｃｅｔｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣＮ＆Ｌ１
４８９１による発酵によるか、あるいはここに引用する
ことによりこの特別の目的のためにその内容を組み入れ
たフジサヮのＥＰＯ公告Ｎｕ　０１８４１６２に記載さ
れているようにＳ、　　ｈ　　ｒｏｓｃｏ　ｆｕｓ　　
５ｕｂｓ　、　ａｋｕｓｈｒｍａｅｎｓｒｓ　　ＰＪｎ
７２７８によりＦＲ−９００５２０即ち“ＦＫ−５２０
”　（これはＬ−６８３，５９０と同一である）の発酵
生産を行わせて得ることができる。

Ｌ−６８７，７９５を大量に生産するめの条件としては
深部好気培養条件が好ましい。少量生産するためにはフ
ラスコあるいはボトル中での振とうあるいは表面培養が
用いられる。さらに大型タンク中で発育を行わせる場合
は、Ｌ　−６８７，７９５生産工程での生育の遅滞を避
けるために生長状態にある菌を生産タンクに接種するこ
とが望ましい。従ってまずはじめに斜面培養管中の胞子
あるいは菌糸を比較的少量の培地に植菌し、“種培地”
とも言われるこの植菌した培地を培養することにより生
長状態にある接種用菌を調製した後、これを無菌的に大
型タンクに移すことが望ましい。接種用画調製用の発酵
培地は本質的にはＬ　−６８７，７９５生産に用いる培
地と同じあるいは異ったものであり、通常培地は植菌前
にオートクレーブ滅菌を行う。培地のｐｌ＋は通常オー
トクレーブ前に酸またはアルカリによって７．０付近に
調製するが、緩衝液の状態であることが望ましい。

培養混合物の攪拌および通気は多様な方法で行うことが
できる。攪拌は、プロペラあるいは同様な機械的攪拌装
置、発酵槽の回転または振とう、種々のポンプ装置、あ
るいは培地中に無菌空気を通すことで行うことができる
。通気は無菌空気を発酵混合物に通すことにより行うこ
とができる。

発酵は通常約２０℃と４０℃の間で行わせるが、望まし
いのは２５℃〜３５℃である。発酵の期間は約１０から
２４時間であるが、発酵条件と規模によって変えること
ができる。生産用培養はロータリーシェーカー上２２０
ｒｐｎ＋で２７℃、約２４時間行い、発酵培地のｐＨは
集液時（終了時）まで７．０に保つことが望ましい。

発酵を行わせるための好ましい培養／生産培地は以下の
培地を含むものとする： 種Ｔｈ グルコース デキストリン ビーフエキス アルダミン（Ａｒｄａｍｉｎｅ）　ｐＨＮＺアミンタイ
プＥ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ＫＺＨＰＯ。

ｐＨ７，１に調製 ＣａＣ０：＋　０．５　ｇ　／−１を加える変鮫四Ｕｌ
Ｌ生　　　　　　エＺニ ゲルコース　　　　　　　１０ ハイケースＳＦ　　　　　　　２ ビーフエキス　　　　　　　１ コーンステイープリカー　　３ ｐｉ！７．０に調製 生産されたＬ−６８７，７９５は他の既知の生物活性物
質を回収するのに通常用いられる方法で培養液中から回
収することができる。生産されたＬ−６８７，７９５は
培養菌体とろ液中に存在し、従って、１．０ １０．０ ３．０ ５、０ ５．０ ０．０５ ０．３７ 培養液をろ過あるいは遠心分離することにより得られる
菌体とろ液から、減圧下濃縮、凍結乾燥、メタノール等
の通常用いられる溶媒による抽出、ｐ［ＪＮ整、通常用
いられる樹脂（例えば陽イオンあるいは陰イオン交換樹
脂、非イオン性吸着樹脂等）のどれかによる処理、通常
用いられる吸着剤〈例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル
、セルロース、アルミナ等）のどれかによる処理、結晶
化、再結晶化などの従来法により分離精製することがで
きる。望ましい方法は溶媒抽出、特にメタノールを用い
た溶媒抽出である。

発酵生産物Ｌ−６８７，７９５は“Ｔ細胞増殖アッセイ
”において免疫抑制活性陽性であり、これに基く有用性
を有する。

生産物Ｌ−６８７，７９５は以下のような物理的性質を
有する： ！、　白色不定形粉末 ２、　メタノール溶解性 ３、ＦＡＢマススペクトルにより決定された分子量は７
４９であり、これは図３で与えられた分子構造と一致す
る。

上述した発酵工程によって得られたＬ−６８７，７９５
は、従来法、例えば抽出、沈澱、分列結晶、再結晶、ク
ロマトグラフィその他により分離精製することができる
。

本物質の適当な調合物は、生分解性がありかつ従来の薬
学的許容し得るＬ−６８７，７９５のエステル類を含む
。このエステル類は酢酸などの分子の水酸基を介して形
成されるものである。

前述の発酵反応および発酵混合物の後処理における、Ｌ
−６８７，７９５のへミケタルリングシステムの再構成
による異性体を含む、Ｌ−６８７，７９５の互変異性お
よび構造異性体もまた本発明の範囲に含まれることを付
言・しておく。

本発明のＬ〜６８７．７９５は免疫抑制活性、抗微生物
活性等の薬理活性を有し、従って心臓、腎臓、肝臓、骨
髄、皮膚などの器官あるいは組織移植に対する拒絶反応
、骨髄移植による宿主−移植片（不適合）疾患、リュー
マチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎
、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜
炎等の自己免疫疾患の治療および予防に有用である。

本発明の製薬配合物は、外用、経腸管、非経口の投与形
態に適した無機あるいは有機のキャリヤーあるいは賦形
剤と混合した形で本発明のＬ−６８７，７９５を活性成
分として含有する固体、準固体あるいは液体の製剤形で
使用できる。活性成分は錠剤、顆粒、カプセル、生薬、
溶液、乳剤、懸濁液その他の使用に適した形態とするた
めに、毒性がなく薬学的に許容し得る通常用いられるキ
ャリヤーと配合することができる。使用できるキャリヤ
ーは水、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラ
チン、マニトール、でんぷんのり、マグネシウム三ケイ
酸塩、タルク、コーンスターチ、ケラチン、ケイ酸コロ
イド、バレイショでんぷん、尿素、その地固形、単回形
、液状の製剤製造に用いられるキャリヤーであり、さら
に補助剤、安定剤、増粘剤、着色剤、芳香剤を用いるこ
とができる。本薬学的配合物中には疾患の状態や進行に
所期の効果をもたらすに十分量の活性物質を含む。

本配合物をヒトに適用するには非径口あるいは腸管投与
が望ましい。治療上有効量のＬ−６８７，７９５の投与
量は治療を受ける患者により異り、また患者の年令や状
態によっても変るものであるが、般に疾患治療のために
は活性成分０．０１〜１ｏｏｏ■、好ましくは０．１〜
５００ｍｇ、さらに好ましいのは０．５〜１００■を日
用量（体重７０ｋｇの男性を基に算出）として投与する
。１回当りの投与量としては約０．５■、１■、５■、
１０■、５０■、１００ｍｇ、２５０ｍｇおよび５００
Ｑ＋が一般に用いられる。

以下の実施例は本発明を解説する目的で記載されるもの
であり、本発明の範囲に対する限定と解釈してはならな
い。

キ糸（１，０ｍ、）を２５０１容の限流型振とうフラス
コ中の種培地Ａ　（５０ｍｊ２）に接種した。この種培
地Ａはデキストリン１０．０、グルコース１．０、ビー
フエキ人３６０、アルダミンｐＨ（ＹｅａｓｔＰｒｏｄ
ｕｃｔ社）５．０．Ｎ−Ｚア旦ンタイプＥ５．０、Ｍｇ
ＳＯ４・７　ＨｚＯＯ，０５、ＫＨｚＰＯ４０，３７、
ＣａＣＯ３０，５（以上単位はｇ／ｌ）から成る。種培
地はオートクレーブする前にｐｌ＋を７．１に調整し、
植菌した種培地は２７℃で２４時間、ロータリーシェー
カー上で２２０回転／分で培養を行った。できた種培地
２．５．ｍｌを用いて２５０Ｉ１１１容の限流型でない
振とうフラスコ中のあらかしめオートクレーブした（滅
菌した）以下に述べる産生用培地８５０ｍ１に植菌した
。

Ｌ　−６８３，５９０はジメチルスルフオキシドに溶か
し、終濃度が０．１■／ｌ１ｌｌとなるように添加した
。

振とうフラスコの内容物はさらに２４時間、２７℃で２
２０回転／分のロータリーシェーカー上で培養を続けた
後、以下に述べる方法に従って抽出を行った。

１、変換用培地Ｂはグルコースｌ　Ｏ，Ｏ；　Ｈｙｃａ
ｓｅＳＦ２．Ｏｉビーフエキス１．０：コーンスティー
プリカー３．０；（単位はｇ／ｌ）からなり、オートク
レーブ前にｐＨを７．０に調整した。

土ｆｔ　　ンのハ　゛制法 産生培地Ｂによる培養液全体（５００ｍＩｌ）をメチレ
ンクロライドで３回抽出した（３Ｘ５００ｍｊ、）。メ
チレンクロライド抽出物は合して無水硫酸ナトリウムで
乾燥した後真空下で濃縮し、油状の残渣を得た。、残渣
はアセトニトリルに溶解し、高速液体クロマトグラフィ
　（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）による精製を行った。

ＨＰＬＣはワットマンパーティシル（Ｗｈａ　ｔｍａｎ
Ｐａｒｔｉｓｉｌｌｏ　　０ＤＳ−３，９，４ｍＸ２５
ｃｍＯカラムを用い、モニターは６０℃で２０５ｎｍと
２２５ｎｍにおいて行った。

カラムは流速３ｍ１１分、ｏ、　ｉ％Ｈ３ＰＯ４水溶液
ニアセトニトリル４５．：　５５から２０：８０の直線
濃度勾配を用い４０分かけて展開した。上記の抽出物を
くりかえし注入して目的物質を集めた。

保持時間１２．５分の分画を合してｐＨを６．５に調整
し、アセトニトリルを蒸発により除いた。目的物質はさ
らに七ツブパックＣｌ１ｌ（ＣＩｌｌ　Ｓｅｐ　Ｐａｋ
）（Ｗａｔｅｒｓ社）とアセトニトリル−水の溶出溶媒
を用いて精製し２．５■が得られた０本化合物はＬ　−
６８７，７９５であるとされた。

豊遣ユ江 Ｌ−６８２，９９２はＮＭＲスペクトル分析で図１の陽
子ＮＭＲスペクトルを与えると特定された。与えられた
分子構造を図３に示す。

上述のＨＰＬＣで調製した精製Ｌ−６８７，７９５を無
水エタノールに溶解して１０■／１ａｌｌとした。

２、　アッセイ Ｃ５７Ｂ１／６マウスの肺臓を無菌的に摘出し、１０％
熱不活化牛脂児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加して水冷した
ＲＰＭ１１６４０培地（ＧＩ［ｌＣＯ、ニューヨーク、
Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）中で分散させた。細胞を１
５０Ｏｒｐｍ８分間遠心してペレットとした。混入する
赤血球はペレットを４℃で２分間溶解用塩化アンモニウ
ム緩衝液（ＧＩＢＣＯ）で処理して除いた。

冷培地を加えて才、■胞を再度１５００ｒｐｍ８分間遠
心した。細胞懸濁液は以下の様にナイロンウールカラム
にかけて分離し、Ｔ−細胞を単離した。ナイロンウール
カラムは洗浄した乾燥したナイロンウール約４ｇを２０
Ｉｒｌｌのプラスチックシリンジに詰めて調製した。カ
ラムは１２１℃３０分間オートクレーブ滅菌した。ナイ
ロンウールカラムは温培地（３７°Ｃ）で湿らせ、同じ
培地でゆすいだ。

洗浄した膵臓細胞は温めた培地に再懸濁し、ゆっくりと
ナイロンウールに注ぎこみ、カラムを立てたまま３７℃
で１時間インキュベートした。接着性のないＴ細胞は温
かい培地によってカラムから溶出される。この細胞懸濁
液は上記のように遠心分離にかけた。

精製したＴ細胞は２．５Ｘ１０’コ／１１１１となるよ
う完全培地に再懸濁した。この完全培地はＲＰＭ１１６
４０培地に１０％熱不活化牛脂児血清１００ｍＭグルタ
ミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２×１０−５Ｍ２
−メルカプトエタノールを加えたもので５０μｇ／ｍｌ
のゲンタミシン、２５０ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン、
１０ｎｇ／ｍ／のＰＭＡを含んでいた。細胞懸濁液は直
ちに平底の９６孔のミクロ培養ブレート（Ｃｏｓ　ｔａ
ｒ）にウェル当り２００μｌを分注した。試験薬剤抜き
の培地を対照として、試験するサンプル（上記のＬ　−
６８７，７９５＞　　を下に述べる様に様々に希釈した
ものをウェル当り２０μ１３連分注した。Ｌ−６８３，
５９０を標準物質として用いた。培養プレートは３７℃
で、加湿した炭酸ガス５％−空気９５％の環境下で４４
時間培養した。Ｔ−細胞の増殖はトリチウムラベルチミ
ジンの取込みを測定することにより判定した。４４時間
の培養後、細胞をｌウェル当り２μＣｉのトリチウムラ
ベルチミジン（ＮＥＭ、マサチューセソツ、Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ）でパルスラベルした。

さらに４時間培養後、マルチサンプルハーベスタ−を用
いグラスファイバーフィルター上に培養細胞を集めた。

各ウェルに相当するフィルターディスクの放射能活性を
標準的な液体シンチレーション計測法（ベータカウンタ
ー）で測定した。１分当りのカウントを重複するウェル
間で平均して算出し、結果はトリチウムチミジンのとり
こみ（増殖）の％阻害として下に表わした。

種々の濃度におけるＬ−６８７，７９５の％阻害の結果
を次の表に示す。

、表２ Ｌ−６８７，７９５によるＴ Ｌ−６８７，７９５（ｎｇ／　ｍ　ｌ　）　　　　Ｘ鉦
電１０．０００　　　　　　　　　　９１６、６００　
　　　　　　　　　９０ ４４００　　　　　　　　　　８８ ２．９００　　　　　　　　　　８１ １　、９００　　　　　　　　　　７８１　、３００　
　　　　　　　　　６０８７０　　　　　　　　　　２
９ ７０２ ９００ 住：１．培養マウスＴ−細胞は４８時間目で細胞を集め
る４時間前からトリチウムチミジンでパルスラベルした
。

２、標準物質Ｌ　−６８３，５９０（１０ｎｇ／　ｍ　
７りは９９％阻害を与えた。

３、　　Ｌ−６８７，７９５のＩＣ５ｏは８９０ｎｇ／
　ｍＡ−１，１８８ｎＭで、一般に１０００〜１４００
Ｘ　１０−９ｍｏｌａｒの範囲にあった。

４、　７細胞増殖の阻害は培養開始時に組換えヒトＩＬ
−２を５０単位／ｍｌ加えることにより打ち消された。

【図面の簡単な説明】

２１国はＣＤ（Ｊ！ｊ中、４００Ｍ）Ｉｚで測定された
Ｌ−６８７，７９５のＩＨ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペ
クトルと、与えられた分子構造である。 ７３改はＣＤＣＩ！、中、４００ＭＨｚでｆｆ１ｌ＋定
されたＬ　＝６８３，５９０の’ＩＩ−ＮＭＲスペクト
ルである。 図面の浄書（内容に変更なし） 一口 手続補正書 （方式） ％式％ ２、発明の名称 新規ＦＫ５２０微生物変換物 ３、補正をする者 ツ揮トとの関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ細胞増殖アッセイにおいてＴ細胞の活性化をポジ
   ティブに阻害し、図１で規定された陽子核磁気共鳴スペ
   クトルを示し、ＦＡＢ質量分析で分子量７４９であると
   ころのＬ−６８７、７９５と命名された免疫抑制剤。 ２、図１に規定した分子構造を有する免疫抑制剤Ｌ−６
   ８７、７９５。 ３、治療上有効量のＬ−６８７、７９５と、本質的に毒
   性がなく薬学的に認容されるキャリヤーあるいは賦形剤
   を含有する薬学的配合物。 ４、ヒトホストにおける移植拒絶反応の治療、あるいは
   自己免疫疾患や感染症を治療するために、当該ヒトホス
   トに治療上有効量のＬ−６８７、７９５を投与すること
   を含む利用法。