JPH0361652B2

JPH0361652B2 -

Info

Publication number: JPH0361652B2
Application number: JP59071568A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Mikura; Kensuke Asada; Hajime Toguchi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-04-09
Filing date: 1984-04-09
Publication date: 1991-09-20
Also published as: ZA852302B; JPS60215631A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は医薬品などとして有用なインターロイ
キン−２組成物に関する。従来の技術インターロイキン−２（以下IL−２と略称する
ことがある）は生体内で免疫調節に中心的な役割
をはたしており直接的あるいは関接的に癌の排除
や免疫失調からの回復やその改善に働くと考えら
れているＴ細胞やナチユラルキラー細胞の増殖因
子としての機能を有する蛋白質である〔ネイチヤ
ー、第302巻、305−310頁（1983）〕。かかる生理
作用を有するためみIL−２は新しい制癌剤ある
いは免疫失調治療剤としての応用が強く期待され
ている。発明が解決しようとする問題点本発明者らは、IL−２が不安定であつて水溶
液の保存、凍結あるいは凍結乾燥の操作および凍
結乾燥後の保存において、とりわけ凍結乾燥を行
う際の乾燥操作において容易に活性が減じ、また
凍結乾燥品の再溶解した液に濁りを認める等の問
題点を有し、医療用等に用いる上ではなはだ不都
合があることを見い出した。かかる事実に鑑み、本発明者らは鋭意研究を進
めた結果、安定なIL−２組成物の製造に成功し、
本発明を完成した。問題点を解決するための手段本発明は、グルタチオンまたはアスコルビン酸
を配合したIL−２組成物を提供するものである。本発明のIL−２は、哺乳動物のものであれば
いかなるものでもよいが、ヒトのものが好まし
い。またIL−２は、天然の、あるいは遺伝子組
み換え技術で得られるいずれのものでもよく、遺
伝子組み換え技術で得られるものが有利に用いら
れ、通常IL−２水溶液として用いる。好ましいIL−２の例として式

【表】

【表】〔式中、ＸはMetまたは水素を示す〕で表わさ
れる遺伝子組み換え技術で製造される非グリコシ
ル化ヒトIL−２を挙げることができ、これらの
混合物でもよい。なお式（）においてアミノ酸残基は、
IUPAC−IUB コミツシヨンオンバイオケ
ミカルノメンクレイチヤによる略号で示した。またIL−２の比活性は20000〜80000単位／mg
であることが望ましく、IL−２水溶液として１
〜80000単位／ml、とりわけ10〜50000単位／mlの
活性を有するものが有利に用いられる。また上記還元性物質であるグルタチオンまたは
アスコルビン酸は、１種または２種以上併用する
こともできる。これら還元性物質は、上記濃度IL−２水溶液
に対し、水溶液１ml当り0.01mg以上、とりわけ
0.05〜20mg含有させることが好ましい。本発明のIL−２組成物には前記した還元性物
質に加え人血清アルブミン（以下HSAと略記す
る）、ブドウ糖、果糖、マンノース、ガラクトー
ス等の単糖類、シヨ糖、マルトース、乳糖等の二
糖類、マンニツト、イノシツト、ソルビツト等の
糖アルコール、グリシン、アスパラギン酸、グル
タミン酸、プロリン等のアミノ酸とりわけモノア
ミノ脂肪族アミノ酸もしくは環状アミノ酸または
これらの生理学的に許容しうる塩もしくは誘導体
のうち１種あるいは２種以上を加えることによ
り、一層の安定性、凍結乾燥品とした場合のその
外観やそれを溶解した液の溶状、容器への吸着防
止等を向上させることができるためこれらを適宜
配合することができる。上記配合剤のうちでも
HSA、ブドウ糖、マンノース、マンニツト、ソ
ルビツト、プロリン、グリシンが好ましく、これ
らを配合する場合には、例えば前記濃度のIL−
２水溶液で１ml当りHSAの場合01〜50mg、好ま
しくは0.5〜10mg、マンニツト、ソルビツト、ブ
ドウ糖またはマンノースの場合10〜100mg、グリ
シンまたはプロリンの場合５〜50mg加えることが
好ましい。さらに本発明のIL−２組成物は食塩などの等
張化剤、コハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝
剤、界面活性剤などを含有していてもよい。また上記IL−２組成物の容器の空間部を配合
した還元性物質の酸化を防止するため真空にする
か窒素ガス置換することによりIL−２組成物の
安定性をさらに高めることができる。本発明のIL−２組成物は、水溶液、凍結品、
凍結乾燥品等の形態が好ましく、とりわけ凍結乾
燥品が好ましい。本発明の組成物は、たとえば以下の方法により
製造することができる。 IL−２を１〜80000単位／mlを含有する水溶液
に、還元性物質を0.01mg／ml以上、好ましくは
0.05〜20mg／ml（２種以上の還元性物質を用いる
場合は合計量として）の濃度になるように加え
る。さらに前記したHSA、ブドウ糖、マンニツ
ト、ソルビツト、プロリン、グリシンなどもそこ
に記載した濃度として加えることもできる。また
所望により等張化剤、界面活性剤なども加えるこ
とができる。かくして得られる水溶液としての
IL−２組成物は、下記の凍結および凍結乾燥品
の原料としても用いることができる。凍結品としてのIL−２組成物は、たとえば上
記水溶液を通常−80〜−20℃で凍結することによ
り製造できる。該凍結組成物は−80゜〜−10℃で
保管することが好ましい。凍結乾燥品としてのIL−２組成物は、例えば
上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか上記
水溶液または上記凍結組成物の融解により得られ
る水溶液を、所望により小分けし、上記同様凍結
した後、常法により減圧乾燥することにより製造
することができる。注射用製剤としての本発明の凍結乾燥したIL
−２組成物を製造する場合は、IL−２を含有す
る水溶液および配合剤含有水溶液をそれぞれ除菌
過して混合するか、これらの混合液を小分けす
る前に除菌過等により精製し、無菌操作により
バイアル瓶等に分注小分けした後上記凍結乾燥処
理に付すことが好ましい。上記した還元性物質を配合したIL−２組成物
とは別途、本発明は下記のIL−２組成物をも提
供するものである。すなわち、グリシン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、アラニンなどのアミノ酸とりわけモノア
ミノ脂肪族アミノ酸、ブドウ糖、マンノースなど
の単糖類、ヒト血清アルブミン（HSA）および
これらの生理学的に許容できる塩もしくは誘導体
の１種または２種以上を配合したIL−２組成物
である。上記IL−２に関しては、前記したIL−２と同
様のものが挙げられ、IL−２水溶液が好ましい。
上記単糖類に関しては10〜100mg／ml、アミノ酸
に関しては５〜50mg／ml、HSAに関しては0.1〜
５mg／ml、好ましくは0.5〜10mg／ml配合するこ
とが好ましい。上記IL−２組成物は、いずれも水溶液の保存、
凍結あるいは凍結乾燥の操作および凍結乾燥後の
保存において、とりわけ凍結乾燥を行う際の乾燥
操作においてIL−２活性の低下が少ないという
特徴を有する。上記安定化効果に加えて、アミノ酸を配合した
組成物は凍結乾燥品として場合にその外観が向上
し、注射剤として投与する場合の疼通を軽減する
効果をも奏する。また単糖類を配合した組成物は注射剤として投
与する場合の疼痛を軽減する効果をも奏する。 HSAを配合した組成物、とりわけその凍結乾
燥品は、その外観が向上し、その器壁への吸着が
防止される効果をも奏するものである。さらに上記IL−２組成物には食塩などの等張
化剤、コハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝剤、
界面活性剤なども配合することができる。上記IL−２組成物は、水溶液、凍結品、凍結
乾燥品等の形態が好ましく、とりわけ凍結乾燥品
が好ましい。上記IL−２組成物は、前記した還元性物質を
配合したIL−２組成物の製造法に準じて製造す
ることができ、本IL−２組成物においては凍結
する前に、グルタミン酸など酸性アミノ酸を配合
する場合は該物質で、または塩酸、リン酸等の鉱
塩もしくは、上記緩衝剤で、酸性（PH３〜６）に
調製することが好ましい。作用本発明のIL−２組成物は、保存中および凍結
や凍結乾燥操作におけるIL−２活性の低下が少
なく、また凍結乾燥品においてはその再溶解時の
溶状が澄明である点等に優れた特徴を有するもの
であり、とりわけ凍結乾燥を行う時の乾燥操作時
のIL−２活性の低下が少ないことに特徴を有す
る。また凍結乾燥品は、安定化されたIL−２の
粉末として得られ、とりわけ非経口投与製剤とし
て有利に用いることができる。注射用製剤として
用いる場合は、通常用時、凍結乾燥組成物をバイ
アル当り0.5〜100mlの注射用蒸留水、生理食塩液
またはブドウ糖注射液に溶解し、筋肉内あるいは
静脈内に投与する。また適当な担体、賦型剤、希
釈剤を用いて口腔内、眼、耳、鼻内投与用の剤形
として用いることができる。本発明のIL−２組成物は、低毒性で、公知の
IL−２と同様の目的に同様の用法により使用す
ることができる。本願明細書中IL−２の活性としての単位（Ｕ）
の算出方法は以下のようにして行つた。すなわち、IL−２濃度に依存して増殖するマ
ウス細胞株を浮遊した培地にIL−２を含む検体
を加えて培養し、該細胞株の増殖をトリチウムチ
ミジンの取込を指標として求めた。目的とする検
体中のユニツト（Ｕ）算出のためには、常に標準
IL−２（1U／ml）を並べてアツセイを実施して、
その比率からユニツトを算出した。具体的には、ヒトIL−２を含有するコンデイ
シヨンドメジウムを含む20％FCS加RPMI1640培
地中で、37℃で５％Co₂の存在下に継代維持され
たIL−２依存性マウス細胞株〔（NKC3）、
Hinumaら、バイオケミカル・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミユニケイシヨンズ、第109巻、
363頁（1982年）〕を無血清RPMI1640培地を用い
て２回洗浄し、20％FCS加RPMI1640培地に６×
10⁵個／mlになるように再浮遊する。 IL−２を含む資料50μlを96穴平底マイクロタイ
タープレート（ヌンク社、デンマーク）の第１列
目の穴に入れ、50μlずつの20％FCS加RPMI1640
培地を用いて第12列目まで順次２倍段階希釈系列
を作成後、上記NKC3細胞浮遊液を50μlずつ各穴
に分注し、37℃で５％Co₂の存在下に24時間培養
する。培養20時間目に、各穴に1μCiずつトリチ
ウムチミジン（アマルシヤム社、イギリス）を添
加してさらに４時間培養を継続後、セルハーベス
ター（フロー社、アメリカ）を使用して細胞をガ
ラスフイルター上に回収し、液体シンチレーシヨ
ンカウンターを用いてトリチウムチミジンの取込
を測定する。測定に際しては標準IL−２標品に
ついて資料と同一の操作を行い、トリチウムチミ
ジンの取込を測定する。ユニツト（Ｕ）の計算はジヤーナル・オブ・イ
ムノロジー、第120巻、2027頁（1978年）に準じ
てプロビツト変換法により行う。すなわち、標準
IL−２標品（ヒト末梢血リンパ球を５×10⁶個／
mlとなるように10％FCS加RPMI1640培地に浮遊
し、コンカナバリン−A40μgおよび12−Ｏ−テト
ラデカノイルホルボール−13−アセテート
15ng／mlを添加して、37℃で５％CO₂の存在下に
48時間培養した培養液の遠心上清を1U／mlと定
める）の希釈系列のうち最大値の取込を100％と
して、各希釈段階の取込値の割合（％）を計算す
る。得られた数値を正規確率紙にプロツトし、50
％の取込を示す希釈倍数を作図から求める。同様
にしてIL−２を含む各資料についても50％の取
込を示す希釈倍数を求める。資料のIL−２濃度（Ｕ／ml）は次式に従つて
計算される：資料が50％取込を示す希釈倍数／標準IL−２標品が50
％の取込を示す希釈倍数下記参考例１(i)に開示した形質転換体エシエリ
ヒアコリ（Escherichia coli）DH1／pTF4
（IFO−14299）は、昭和59年４月６日から通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に
受託番号FERM Ｐ−7578として寄託され、該寄
託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられ
て、受託番号FERM BP−628として同研究所に
保管されている。実施例以下の実施例および参考例によつて本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。なお実施例および参考例２，３において用いた
原液は、参考例１に記載の方法で得られた非グリ
コシル化ヒトIL−２蛋白質溶液である。実施例１原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２ 2450単位を含有する水溶液それぞ
れ0.5mlに、グルタチオン２mgまたはアスコルビ
ン酸２mgを含有する除菌過液0.5mlを加え、グ
ルタチオン２mgまたはアスコルビン酸２mgを含有
する除菌過液0.5mlを加え、得られた２種の水
溶液おのおの１mlをバイアルに分注して−40℃で
凍結し、乾燥後バイアル空間部をN₂ガスで置換
し施栓巻締した。対照としてグルタチオンおよびアスコルビン酸
を含まない同量の水溶液およびグルタチオンおよ
びアスコルビン酸のかわりに凍結乾燥製剤に繁用
されるマンニツト25mgを含有する同量の水溶液を
同様に凍結乾燥した。これらの凍結乾燥品をいずれも注射用蒸留水１
mlで再溶解し、これらの溶液の溶状（澄明度）及
び力価を調べた。力価については凍結乾燥前の水
溶液力価を100％とした時の残存率を計算した。
その結果は、第１表に示されるとおり、本発明の
IL−２組成物は対照と比較し溶状、力価残存率
共に有意に優れていた。

【表】実施例２原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２ 7680単位を含有する水溶液それぞ
れ0.5mlに、グルタチオン２mgまたはアスコルビ
ン酸２mgを含有する除菌過液0.5mlを加え得ら
れた２種の水溶液おのおの１mlを実施例１と同様
に凍結乾燥し、実施例１と同様の方法で製造直後
に溶状を、25℃で１カ月保存後に溶状及び力価残
存率を調べた。その結果は第２表に示す通りであつた。

【表】実施例３原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２ 7680単位を含有する水溶液それぞ
れ0.5mlに、HSA5mgとグルタチオン２mgもしく
はアスコルビン酸２mgとを含有する除菌過液
0.5mlを加え、得られた２種の水溶液おのおの１
mlを実施例１と同様に凍結乾燥し、実施例２と同
様に溶状および力価残存率を調べた。その結果は第３表に示す通りであつた。

【表】実施例４原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２ 7680単位を含有する水溶液それぞ
れ0.5mlに、HSA5mgおよび食塩９mgとグルタチ
オン２mgもしくはアスコルビン酸２mgとを含有す
る除菌過液0.5mlを加え、得られた２種の水溶
液おのおの１mlを実施例１と同様に凍結乾燥し、
実施例２と同様に溶状および力価残存率を調べ
た。その結果は第４表に示す通りであつた。

【表】実施例５原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２ 7680単位を含有する水溶液0.5mlに、
マンニツト50mgとグルタチオン２mgもしくはアス
コルビン酸２mgとを含有する除菌過液0.5mlを
加え、得られた２種の水溶液おのおの１mlを実施
例１と同様に凍結乾燥し、実施例２と同様に溶状
および力価残存率を調べた。その結果は第５表に示す通りであつた。

【表】実施例６原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２ 23350単位を含有する水溶液0.5ml
に、グルタチオン５mgおよびグリシン23mgを含有
する除菌過した水溶液0.5mlを加え、得られた
水溶液１mlを実施例１と同様に凍結乾燥し実施例
１と同様の方法で製造直後及び40℃、３週間保存
後に溶状及び力価残存率を調べた。その結果は第６表に示す通りであつた。

【表】実施例７原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２を1790単位または130単位を含有する
水溶液それぞれ0.5mlに、グルタチオン２mg、
HSA5mgおよび食塩９mgを含有する除菌過した
水溶液0.5mlを加えて、得られた２種の水溶液お
のおの１mlを実施例１と同様に凍結乾燥し実施例
１と同様の方法で製造直後および40℃１週間保存
後に溶状及び力価残存率を調べた。その結果は第７表に示す通りであつた。

【表】実施例８原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２を1860単位または116単位を含有する
水溶液それぞれ0.5mlにグルタチオン２mg、
HSA1mgおよびグリシン23mgを含有する除菌過
した水溶液0.5mlを加えて、得られた２種の水溶
液おのおの１mlを実施例１と同様に凍結乾燥し製
造直後および40℃１週間保存後に溶状および力価
残存率を調べた。その結果は第８表に示す通りであつた。

【表】参考例１非グリコシル化ヒトIL−２蛋白質溶液
の製造 (i) 特願昭58−225079号（昭和58年11月28日出
願）明細書の実施例３で得たヒトIL−２遺伝
子を含有する形質転換体エシエリヒアコリ
（E.coli）DH1／pTF4を250ml容三角フラスコ
内のバクト・トリプトン（デイフコ・ラボラト
リーズ、アメリカ）１％、バクト・イーストエ
キス（デイフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）
0.5％、食塩0.5％およびテトラサイクリン
7μg／mlを含む液体培地（PH7.0）50mlに接種し
て37℃で１晩回転振盪培養した。この培養液を
カザミノ酸0.5％、グルコース0.5％およびテト
ラサイクリン7μg／mlを含むM9培地2.5の入
つた５容ジヤーフアーメンターに移し37℃で
４時間、ついで３−β−インドリルアクリル酸
（25μg／ml）を添加して、さらに４時間通気撹
拌培養して培養液2.5を得た。この培養液を
遠心分離し、菌体を集め、−80℃で凍結して保
存した。 (ii) 上記(i)で得た凍結保存菌体37.5ｇを7M塩酸
グアニジン、0.1M Tris・HClを含む抽出液
（PH7.0）500mlに均一に懸濁し、４℃で１時間
撹拌した。この溶菌液を28000×ｇで20分間遠
心分離して上清453mlを得た。 (iii) 上記(ii)で得た上清を0.01M Tris・HCl緩衝
液（PH8.5）に対して透析後19000×ｇで10分間
遠心分離して透析上清458mlを得た。この透析
上清を0.01M Tris・HCl緩衝液（PH8.5）で平
衡化したDE52（DEAE−セルロース、ワツトマ
ン社製、イギリス）カラム（50ml容）に通して
蛋白を吸着させ、NaCl濃度直線勾配（０〜
0.15M NaCl、１）を作成してIL−２を溶出
させた。活性画分105mlをYM−５メンブラン
（アミコン社製、アメリカ）を用いて10.2mlに
濃縮し、0.1M Tris・HCl（PH8.0）−1M NaCl
緩衝液で平衡化したセフアクリルＳ−200（フア
ルマシア社製、スエーデン）カラム（500ml容）
を用いてゲル過を行つた。活性画分56mlを
YM−５メンブランで4.9mlに濃縮した。得ら
れた濃縮液をウルトラポアRPSC（アルテツク
ス社製、アメリカ）カラムに吸着させ、トリフ
ルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とす
る高速液体クロマトグラフイーを行つた。カラム、ウルトラポアRPSC（4.6×75mm）；カ
ラム温度、30℃；溶出溶媒Ａ、0.1％トリフル
オロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ、0.1％トリ
フルオロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出プ
ログラム、０分（68％Ａ＋32％Ｂ）−25分（55
％Ａ＋45％Ｂ）−35分（45％Ａ＋55％Ｂ）−45分
（30％Ａ＋70％Ｂ）−48分（100％Ｂ）；溶出速
度、0.8ml／min；検出波長、230nm。本条件下
で保持時間約39分の活性画分を集め、非グリコ
シル化ヒトIL−２蛋白質7.5mg〔比活性、
30000U／mg、出発材料からの活性回収率、
48.2％；蛋白質の純度、99％（デンシトメトリ
ーによる）〕を含む溶液15mlを得た。参考例２原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過して得た
ヒトIL−２ 17600単位を含有する水溶液それぞ
れ0.5mlに、HSA5mgを含有し塩酸でPH４に調整
し除菌過した水溶液またはHSA5mgおよび食塩
９mgを含有し塩酸でPH４に調整し除菌過した水
溶液0.5mlを加え、得られた２種の水溶液を実施
例１と同様に凍結乾燥し、実施例２と同様の方法
で製造直後及び40℃0.5カ月後に溶状及び力価残
存率を調査した。その結果は第９表に示す通りであつた。

【表】参考例３原液を注射用蒸留水で希釈し無菌過して得た
ヒトIL−２を17600単位を含有する水溶液0.5mlに
グリシン23mgを含有しコハク酸でPH４に調整し除
菌過した水溶液0.5mlを加えて、得られた水溶
液１mlを実施例１と同様に凍結乾燥し、実施例２
と同様の方法で製造直後及び40℃0.5カ月後に溶
状及び力価残存率を調べた。その結果は第10表に示す通りであつた。

【表】発明の効果本発明のIL−２組成物は、保存中および凍結
や凍結乾燥操作におけるIL−２活性の低下が少
なく、また凍結乾燥品においてはその再溶解時の
溶状が澄明である点等の優れた特徴を有し、医薬
品製剤等とりわけ非経口投与製剤として有利に用
いることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１グルタチオンまたはアスコルビン酸を配合し
たインターロイキン−２組成物。２さらにヒト血清アルブミンを配合した特許請
求の範囲第１項記載の組成物。３凍結乾燥品である特許請求の範囲第１項また
は第２項記載の組成物。