JPH0378847B2

JPH0378847B2 -

Info

Publication number: JPH0378847B2
Application number: JP60013226A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Mikura; Kensuke Asada; Hajime Toguchi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-01-25
Filing date: 1985-01-25
Publication date: 1991-12-17
Also published as: JPS60222424A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は医薬品などとして有用なインターロイ
キン−２組成物に関する。従来の技術インターロイキン−２（以下IL−２と略称する
ことがある）は生体内で免疫調節に中心的な役割
をはたしており直接的あるいは間接的に癌の排除
や免疫失調からの回復やその改善に働くと考えら
れているＴ細胞やナチユラルキラー細胞の増殖因
子としての機能を有する蛋白質である〔ネイチヤ
ー、第302巻、305−310頁（1983）〕。かかる生理作用を有するためIL−２は新しい
制癌剤あるいは免疫失調治療剤としての応用が強
く期待されている。発明が解決しようとする問題点本発明者らは、IL−２が不安定であつて水溶
液の保存、凍結あるいは凍結乾燥の操作および凍
結乾燥後の保存において、とりわけ凍結乾燥を行
う際の乾燥操作において容易に活性が減じ、また
凍結乾燥品の再溶解した液に濁りを認める等の問
題点を有し、医療用等に用いる上ではなはだ不都
合であることを見い出した。かかる事実に鑑み、本発明者らは鋭意研究を進
めた結果、安定なIL−２組成物の製造に成功し、
本発明を完成した。問題点を解決するための手段本発明は、ヒト血清アルブミンを配合し、溶液
状態でPH３〜６を示すように調整したIL−２組
成物を提供するものである。本発明のIL−２は、哺乳動物のものであれば
いかなるものでもよいが、ヒトのものが好まし
い。またIL−２は、天然の、あるいは遺伝子組
み換え技術で得られるいずれのものでもよく、遺
伝子組み換え技術で得られるものが有利に用いら
れ、通常IL−２水溶液として用いる。好ましいIL−２の例として式Ｘ−Ala１ Pro Thr Ser Ser Thr Lys Lys Thr
Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
Asp20 Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
Met Leu40 Thr Phe Lys Phe Try Met Pro
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln
Cys Leu Glu60 Glu Glu Leu Lys Pro Leu
Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
Asn Phe His Leu80 Arg Pro Arg Asp Leu
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
Leu Lys Gly Ser Glu100 Thr Thr Phe Met
Cys Glu Thy Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile
Val Glu Phe Leu Asn Arg120 Trp Ile Thr
Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr133
（）〔式中、ＸはMetまたは水素を示す〕で表わされ
る遺伝子組み換え技術で製造される非グリコシル
化ヒトIL−２を挙げることができ、これらの混
合物でもよい。なお式（）においてアミノ酸残基は、
IUPAC−IUBコミツシヨンオンバイオケミ
カルノメンクレイチヤによる略号で示した。またIL−２の比活性は20000〜80000単位／mg
であることが望ましく、IL−２水溶液として１
〜80000単位／ml、とりわけ10〜50000単位／mlの
活性を有するものが有利に用いられる。上記本発
明の原料としてのIL−２水溶液は食塩等の塩を
含まないものが好ましく、IL−２の精製工程等
で塩が混在した場合は、限外過等によりこれを
除去して用いることが好ましい。ヒト血清アルブミン（以下HSAと略記する）
としては、いかなるものでもよいが、本組成物を
臨床応用するためには、非経口投与に用いる程度
の品質のものが好ましい。例えば、健康人血漿を原料としてCohnのエタ
ノール分画第６法によつて、分画精製したものが
用いられる。また安定剤としてアセチルトリプトフアンナト
リウムや、カプリル酸ナトリウムを含有するもの
であつてもよい HSAは上記濃度IL−２水溶液に対し水溶液１
ml当り0.1mg〜50mg、とりわけ0.5mg〜20mg含有さ
せることが好ましい。本発明のIL−２組成物には前記HSAに加えグ
リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニ
ン、プロリンなどのアミノ酸とりわけモノアミノ
脂肪族アミノ酸、もしくは環状アミノ酸、ブドウ
糖、マンノースなどの単糖類、ソルビツト、マン
ニツト等の糖アルコール類、およびこれらの生理
学的に許容できる塩もしくは誘導体の１種または
２種以上を配合してもよい。これら配合剤のうち
でも、とりわけグリシンが好ましい。上記配合剤は、上記IL−２水溶液１ml当り、
単糖類または糖アルコール類に関しては10〜100
mg、アミノ酸に関しては５〜50mg／ml配合するこ
とが好ましい。さらに本発明のIL−２組成物は食塩などの等
張化剤、コハク酸、酒石剤、クエン酸等の緩衝
剤、界面活性剤などを含有していてもよい。しか
し、凍結乾燥時の安定化の観点からは、本発明の
IL−２組成物は食塩を含まないものが好ましい。本発明のIL−２組成物を溶液状態でPH３〜６、
好ましくはPH３〜5.5、とりわけPH3.5〜4.5を示す
ように調整するために、グルタミン酸など酸性ア
ミノ酸を配合する場合は該物質で、または塩酸、
リン酸等の鉱酸、もしくはコハク酸、酒石酸、ク
エン酸等の緩衝剤で所定のPHに調製する。本発明のIL−２組成物は、水溶液、凍結品、
凍結乾燥品の形態が好ましく、とりわけ凍結乾燥
品が好ましい。本発明の組成物は、たとえば以下の方法により
製造することができる。 IL−２を１〜80000単位／ml含有する水溶液
に、HSAを前記所定の濃度になるように加え、
前記した方法でPH調整を行なう。単糖類、糖アルコール類、アミノ酸などもそこ
に記載した濃度として加えることもできる。また
所望により等張化剤、界面活性剤なども加えるこ
とができる。なお、HSA以外の物質を添加する
場合には、最終水溶液のPHが前記PHを示すよう
に、前記した方法でPH調節を行う。かくして得ら
れる水溶液としてのIL−２組成物は、下記の凍
結および凍結乾燥品の原料としても用いることが
できる。凍結品としてのIL−２組成物は、とたえば上
記水溶液を通常−80〜−20℃で凍結することによ
り製造できる。該凍結組成物は−80°〜−10℃で
保管することが好ましい。凍結乾燥品としてのIL−２組成物は、例えば
上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか上記
水溶液または上記凍結組成物の融解により得られ
る水溶液を、所望により小分けし、上記同様凍結
した後、常法により減圧乾燥することにより製造
することができる。また前記の方法により製造し、IL−２、HSA
及びPH調節剤等を含有する凍結乾燥品を、例えば
前記した単糖類、糖アルコール類、アミノ酸等を
含有し、所望により塩酸等でPH調整された溶解液
によつて再溶解することによつて溶液状態として
の本発明のIL−２組成物を製造することができ
る。注射用製剤としての本発明の凍結乾燥したIL
−２組成物を製造する場合は、IL−２を含有す
る水溶液および配合剤含有水溶液をそれぞれ除菌
過して混合するか、これらの混合液を小分けす
る前に除菌過等により精製し、無菌操作により
バイアル瓶等に分注小分けした後上記凍結乾燥処
理に付すことが好ましい。また、アミノ酸や単糖類あるいは糖アルコール
類を含有する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場
合には、その水溶液は除菌過し、無菌操作によ
りアンプル等に分注小分後、常法により蒸気滅菌
したものを用いることが好ましい。作用本発明のIL−２組成物は、保存中および凍結
や凍結乾燥操作におけるIL−２活性の低下が少
なく、また凍結乾燥品においてはその再溶解時の
溶状が澄明である点等に優れた特徴を有するもの
である。本発明のIL−２組成物、とりわけその凍結乾
燥品は、その外観が向上し、その器壁への吸着が
防止される効果をも奏するものである。さらにアミノ酸を配合した組成物は凍結乾燥品
とした場合にその外観が向上し、注射剤として投
与する場合の疼痛を軽減する効果をも奏する。また単糖類を配合した組成物は注射剤として投
与する場合の疼痛を軽減する効果をも奏する。本発明のIL−２組成物の中で、とりわけ凍結
乾燥品は、安定化されたIL−２の粉末として得
られ、とりわけ非経口投与製剤として有利に用い
ることができる。注射用製剤として用いる場合に
は通常用時、凍結乾燥組成物を0.5〜100mlの注射
用蒸留水、生理食塩液等に溶解するか、グリシン
等のアミノ酸、ブドウ糖等の単糖類、またはマン
ニツト等の糖アルコール類の必要であればPH調整
された水溶液を凍結乾燥組成物の専用の溶解液と
して添付する場合にはその溶解液0.5〜100mlで溶
解し筋肉内あるいは静脈内に投与する。また適当
な担体、賦型剤、希釈剤を用いて口腔内、眼、
耳、鼻内投与用の剤形として用いることができ
る。本発明のIL−２組成物は、低毒性で、公知の
IL−２と同様の目的に同様の用法により使用す
ることができる。本願明細書中IL−２の活性としての単位（Ｕ）
の算出方法は以下のようにして行つた。すなわち、IL−２濃度に依存して増殖するマ
ウス細胞株を浮遊した培地にIL−２を含む検体
を加えて培養し、該細胞株の増殖をトリチウムチ
ミジンの取込を指標として求めた。目的とする検
体中のユニツト（Ｕ）算出のためには、常に標準
IL−２（1U／ml）を並べてアツセイを実施して、
その比率からユニツトを算出した。具体的には、ヒトIL−２を含有するコンデイ
シヨンドメジウムを含む20％FCS加RPMI1640培
地中で、37℃で５％CO₂の存在下に継代維持され
たIL−２依存性マウス細胞株〔（NKC3）、
Hinumaら、バイオケミカル・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミユニケイシヨンズ、第109巻、
363頁（1982年）〕を無血清RPMI1640倍地を用い
て２回洗浄し、20％FCS加RPMI1640培地に６×
10⁵個／mlになるように再浮遊する。 IL−２を含む資料50μを96穴平底マイクロタ
イタープレート（ヌンク社、デンマーク）の第１
列目の穴に入れ、50μずつの20％FCS加
RPMI1640培地を用いて第12列目まで順次２倍段
階希釈系列を作成後、上記NKC3細胞浮遊液を
50μずつ各穴に分注し、37℃で５％CO₂の存在
下に24時間培養する。培養20時間目に、各穴に
1μCiずつトリチウムチミジン（アマルシヤム社、
イギルス）を添加してさらに４時間培養を継続
後、セルハーベスター（フロー社、アメリカ）を
使用して細胞をガラスフイルター上に回収し、液
体シンチレーシヨンカウンターを用いてトリチウ
ムチミジンの取込を測定する。測定に際しては標
準IL−２標品について資料と同一の操作を行い、
トリチウムチミジンの取込を測定する。ユニツト（Ｕ）の計算はジヤーナル・オブ・イ
ムノロジー、第120巻、2027頁（1978年）に準じ
てプロビツト変換法により行う。すなわち、標準
IL−２標品（ヒト末梢血リンパ球を５×10⁶個／
mlとなるように10％FCS加RPMI1640培地に浮遊
し、コンカナバリン−A40μｇおよび12−Ｏ−テ
トラデカノイルホルボールー13−アセテート15n
ｇ／mlを添加して、37℃で５％CO₂の存在下に48
時間培養した培養液の遠心上清をlU／mlと定め
る）の希釈系列のうち最大値の取込を100％とし
て、各希釈段階の取込値の割合（％）を計算す
る。得られた数値を正規確率紙にプロツトし、50
％の取込を示す希釈倍数を作図から求める。同様
にしてIL−２を含む各資料についても50％の取
込を示す希釈倍数を求める。資料のIL−２濃度（Ｕ／ml）は次式に従つて
計算される：資料が50％取込を示す希釈倍数／標準IL−２標品が50％
の取込を示す希釈倍数下記参考例（）に開示した形質転換体エシエ
リヒアコリ（Escherichia coli）DH1／pTF4
は財団法人発酵研究所にIFO−14299として、ま
た昭和59年４月６日から通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（FRI）に受託番号
FERMBP−628として寄託されている。実施例以下の実施例および参考例によつて本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。なお実施例において用いたいIL−２原液は、
参考例に記載の方法で得られた非グリコシル化ヒ
トIL−２蛋白質溶液である。実施例１ IL−２原液を注射用蒸留水で希釈し除菌過
して得たヒトIL−２ 17600単位を含有する水溶
液それぞれ0.5mlに、HSA5mgを含有し、塩酸で
PH４に調整し除菌過した水溶液またはHSA5mg
および食塩９mgを含有し塩酸でPH４に調整し除菌
過した水溶液0.5mlを加え、得られた２種の水
溶液おのおの１mlをバイアルに分注して−40℃で
凍結し、乾燥後バイアル空間部をN₂ガスで置換
し施栓巻締した。これらの凍結乾燥品を製造直後および40℃で
0.5カ月保存後に注射用蒸留水１mlで再溶解し、
これらの溶液の溶状（澄明度）及び力価を調べ
た。力価については凍結乾燥前の水溶液力価を
100％とした時の残存率を計算した。その結果は、
第１表に示されるとおり、本発明のIL−２組成
は溶状、力価残存率共に有意に優れていた。

【表】実施例２ IL−２原液を注射溶蒸留水で希釈し、除菌
過して得たヒトIL−２ 4115単位を含有する水
溶液0.5mlに、HSA5mg、HSA5mgと食塩９mg、
HSA5mgとグリシン23mgまたはHSA5mgとマンニ
ツト50mgを含有し、且つ塩酸でPH4.0に調整し、
除菌過し各種添加剤水溶液おのおの0.5mlを加
え、照られた４種の水溶液おのおの１mlをバイア
ルに分注して−40℃で凍結し乾燥後、バイアル空
間部をN₂ガスで置換し、施栓巻締した。対照と
してヒトIL−２のみの水溶液及びPH調節剤を含
有しない同量の各種IL−２水溶液を同様に凍結
乾燥した。これらの凍結乾燥品の外観を調べた後、注射用
蒸留水0.9％、生理食塩液、５％ブドウ糖水溶液、
５％ソルビツト水溶液、または５％マンニツト水
溶液のいずれか１mlで再溶解し、これらの溶液の
PH及び溶状（澄明度）を調べた。その結果は第２表に示される通り、本発明の
IL−２組成物は対照と比較し溶状面で有意に優
れており、時にHSAとグリシンが配合されPHが
約４の凍結乾燥品の溶状が優れていた。

【表】実施例３実施例１と同様にして得たヒトIL−２として
1620単位または128単位、HSAを５mg、グリシン
を23mg含有し、塩酸でPHを4.0に調節した除菌
過された２種の水溶液おのおの１mlを実施例１と
同様に凍結乾燥し、実施例１と同様の方法で製造
直後、及び40℃１週間、２週間及び４週間保存後
に溶状及び力価残存率を調べた。その結果は第３表に示す通りであつた。

【表】参考例非グリコシル化ヒトIL−２蛋白質溶液の製造 () 特願昭８−225079号（昭和58年11月28日出
願）明細書の実施例３で得たヒトIL−２遺伝
子を含有する形質転換体エシエリヒアコリ
（E.coli）DH1／pTE4を250ml容三角フラスコ
内のバクト・トリプトン（デイフコ・ラボラト
リーズ、アメリカ）１％、バクト・イーストエ
キス（デイフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）
0.5％、食塩0.5％およびテトラサイクリン7μ
ｇ／mlを含む液体培地（PH7.0）50mlに接種し
て37℃で１晩回転振盪培養した。この培養液を
カザミノ酸0.5％、グリコース0.5％およびテト
ラサイクリン7μｇ／mlを含むM9培地2.5の入
つた５容ジヤーフアーメンターに移し37℃で
４時間、ついで３−β−インドリルアクリル酸
（25μｇ／ml）を添加して、さらに４時間通気
撹拌培養して培養液2.5を得た。この培養液
を遠心分離し、菌体を集め、−80℃で凍結保存
した。 () 上記（）で得た凍結保存菌体37.5ｇを7M
塩酸グアニジン、0.1M Tris・HClを含む抽出
液（PH7.0）500mlに均一に懸濁し、４℃で１時
間撹拌した。この溶菌液を28000×ｇで20分間
遠心分離して上清453mlを得た。 () 上記（）で得た上清を0.01M Tris・HCl
緩衝液（PH8.5）に対して透析後19000×ｇで10
分間遠心分離して透析上清4585mlを得た。この
透析上清を0.01M Tris・HCl緩衝液（PH8.5）
で平衡化したDE52（DEAE−セルロース、ワツ
トマン社製、イギリス）カラム（50ml容）に通
して蛋白を吸着させ、NaCl濃度直線勾配（０
〜0.15M NaCl、１）を作成してIL−２を溶
出させた。活性画分105mlをYM−５メンブラ
ン（アミコン社製、アメリカ）を用いて10.2ml
に濃縮し、0.1M Tris・HCl（PH8.0）−1M
NaCl緩衝液で平衡化したセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社製、スエーデン）カラム（500
ml容）を用いてゲル過を行つた。活性画分56
mlをYM−５メンブランで4.9mlに濃縮した。
得られた濃縮液をウルトラポアRPSC（アルテ
ツクス社製、アメリカ）カラムに吸着させ、ト
リフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒
とする高速液体クロマトグラフイーを行つた。カラム、ウルトラポアRPSC（4.6×75mm）；カ
ラム温度、30℃；溶出溶媒Ａ、0.1％トリフル
オロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ、0.1％トリ
フルオロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出プ
ログラム、０分（68％Ａ＋32％Ｂ）−25分（55
％Ａ＋45％Ｂ）−35分（45％Ａ＋55％Ｂ）−45分
（30％Ａ＋70％Ｂ）−48分（100％Ｂ）；溶出速
度、0.8ml／min；検出波長、230nｍ、本条件
下で保持時間約39分の活性画分を集め、非グリ
コシル化ヒトIL−２蛋白質7.5mg〔比活性、
30000U／mg、出発材料からの活性回収率、
48.2％；蛋白質の純度、99％（デンシトメトリ
ーによる）〕を含む溶液15mlを得た。発明の効果本発明のIL−２組成物は、保存中および凍結
や凍結乾燥操作におけるIL−２活性の低下が少
なく、また凍結乾燥品においてはその外観が向上
し、その器壁への吸着が少なく、さらにその再溶
解時の溶状が澄明である点等の優れた特徴を有
し、医薬品製剤等とりわけ非経口投与製剤として
有利に用いることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒト血清アルブミンを配合し、溶液状態でPH
３〜６を示すように調整したインターロイキン−
２組成物。２さらにモノアミノ脂肪族アミノ酸を配合した
特許請求の範囲第１項記載の組成物。３凍結乾燥品である特許請求の範囲第１項また
は第２項記載の組成物。