JPH0362715B2 - - Google Patents
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- JPH0362715B2 JPH0362715B2 JP60131616A JP13161685A JPH0362715B2 JP H0362715 B2 JPH0362715 B2 JP H0362715B2 JP 60131616 A JP60131616 A JP 60131616A JP 13161685 A JP13161685 A JP 13161685A JP H0362715 B2 JPH0362715 B2 JP H0362715B2
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- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
(1) 発明の分野
本発明は新規な抗腫瘍性抗生物質並びにその製
造および回収に関する。 (2) 従来技術の説明 本発明の新規化合物は、1983年１月28日に提出
された同時係属出願第461817号に開示され、特許
請求された抗腫瘍薬レベツカマイシン
（rebeccamycin）と構造的に関連があり、その全
開示は引用により本明細書に加入される。レベツ
カマイシンは式、 を有し、ノカルジア・アエロコロニゲネス
（Nocardia aerocolonigenes）の培養により得ら
れる。 本発明の化合物に構造的に多少関連するものは
ストレプトマイセス・スタウロスポレウス
（Streptomyces staurosporeus）の発酵から得ら
れる抗腫瘍薬、スタウロスポリン
（staurosporine）（またAM−2282と称される）
である。スタウロスポリンはジエー．シー．エ
ス．ケム．コム．（J.C.S.Chem.Comm.）1978、
800〜801頁およびジエー．アンチバイオテイツク
ス（J.Antibiotics）30(4)：275〜282（1977）に記
載されている。 アンゲブ．ケム．イント．エド．イングル
（Angew.Chem.Int.Ed.Engl.）19(6)：459〜600
（1980）には粘菌、アルシリア・デヌダタ
（Arcyria denudata）の子実体から得られ、スタ
ウロスポリンと構造的に関連する種々のインドー
ル色素が開示されている。それら色素のいくつか
はバシラス・ブレビス（Bacillus brevis）およ
びビー．サチリス（B.subtilis）に対し活性を示
す。 発明の概要 本発明は構造式、 を有し、ここに4′−デスクロロレベツカマイシン
（4′−deschlororebeccamycin）と称される新規
な抗腫瘍性抗生物質、および4′−デスクロロレベ
ツカマイシンを製造し、単離し、純粋な形態に精
製する方法に関する。 本発明の抗生物質はノカルジア・アエロコロニ
ゲネス（Nocardia aerocolonigenes）の4′−デ
スクロロレベツカマイシン産生菌株、好ましくは
ノカルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）株C38383−RK2
（ATCC39243）またはその突然変異体を水性栄養
培地中、液内好気性条件下に、実質量の4′−デス
クロロレベツカマイシンが前記微生物により前記
培地中に生産されるまで発酵させ、場合により共
生物質を実質的に含まない4′−デスクロロレベツ
カマイシンを培地から回収することにより得られ
る。 化合物4′−デスクロロレベツカマイシンは抗菌
活性および実験動物腫瘍系、例えばマウスにおけ
るＰ−388白血病に対する活性を示す。 詳細な説明 本発明の4′−デスクロロレベツカマイシンはノ
カルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の4′−デスクロロレベツカマ
イシン産生菌株の発酵により製造される。 殊に好ましい4′−デスクロロレベツカマイシン
産生株はレベツカマイシンに対する産生生物とし
て1983年１月28日に提出した米国出願第461817号
に開示されたものである。本出願人はこの微生物
の培養中にレベツカマシインとともに本発明の
4′−デスクロロレベツカマイシン生成物が共生さ
れることを見出した。菌株C38383−RK2と称さ
れるこの好ましい産生微生物はパナマで収集した
土壌試料から分離された。この菌株の培養物はア
メリカン・タイプ・カルチヤ・コレクシヨン
（American Type Culture Collection、
Rockville、Maryland）に寄託され、
ATCC39243としてその微生物の永久収集物に加
えられた。 菌株C38383−RK2について行なつた分類学研
究の結果は菌株が属ノカルジア（Nocardia）の
非定型種として分類されることを示す。次に示す
特性を基にすると菌株C38383−RK2はノカルジ
ア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の種群に属すと思われる。 菌株C38383−RK2は次の性質を有する： 形態学 菌株C38383−RK2は基生および気生菌糸体に
発達する単細胞の糸状細胞を形成する。両菌糸体
は長く、よく枝分れするが、短繊維（幅0.5μｍ）
に分裂しない。分節胞子は気生菌子全体に生ず
る。これらの胞子は空の菌糸を介在して配列さ
れ、または連続鎖として形成される。ノカルジオ
プシス・ダツソンビレイ（Nocardiopsis
dassonvillei）の胞子形成〔イントル．ジエー．
シスト．バクテリオル（Intl.J.Syst.Bacteriol）
26；487〜493、1976）のように菌株C38383の気
生菌糸は長いセグメントに分割され、それが後に
不規則な大きさの胞子に再分割される。介在また
は連続的な胞子の鎖は形状がまつすぐかまたは屈
曲している。鎖中に50〜100胞子を含む非常に長
い胞子鎖が短いかまたは普通の長さの鎖とともに
形成される。胞子は形状が円筒状で、大きさが
0.5〜0.7×0.7〜5μｍであり、滑らかな表面を有す
る。 菌核は気生菌糸体上に形成されるが、しかし胞
子嚢、運動胞子、および輸生体は観察されない。 培養活性 菌株C38383は偏性好気性アクチノミセス類で
あり、多くの寒天培地中でよく成長する。気生菌
糸体はツアペツク（Czapek）のスクロース−ナ
イトレート寒天、ISP培地No.２、４、５および
７、普通寒天およびベンネツト（Bennett）寒天
上で豊かに、しかしグルコース−アスパラギン寒
天およびISP培地No.３および６上で貧少に形成さ
れる。気生菌糸体の色は白色、帯黄白色または淡
黄色である。帯黄色色素が基生菌糸体中に形成さ
れ、それが寒天培地中へ僅かに拡散する。この色
素はPH−指標性ではない。メラノイド色素は生じ
ない。培養特性は表１に示される。 生理学特性 菌株C38383の最適成長温度は28〜37℃の範囲
にあり、普通の成長は20℃および41℃で認められ
る。７℃および45℃で成長は認められない。ゼラ
チンおよびデンプンは分解される。チロシナーゼ
反応は陰性である。成長は８％NaClの存在で抑
制されるが、しかしリゾチームにより0.01％で抑
制されない。菌株C38383は大抵の糖を成長に利
用する。生理学的特性および炭水化物の利用はそ
れぞれ表２および表３に示される。 細胞壁アミノ酸および全細胞糖成分 細胞壁中のアミノ酸組成はベツカー（Becker）
他〔アプル．ミクロバイオル．（Apple.
Microbiol.）13：236〜243、1965〕およびヤマグ
チ〔ジエー．バクテリオル．（J.Bacteriol.）89：
441〜453、1965〕により記載された方法により試
験し、全細胞水解物中の糖成分はレシエバリール
他（Lechevalier and Lechevalier）によりアク
チノミセス類および関連生物の生物学（Biology
of the Actinomycetes and Related
Organisms）、11：78〜92、1976に示された手順
に従つて同定した。菌株C38383の細胞壁はメソ
ージアミノピメリン酸を含むがグリシンを欠く。
全細胞水解物はグルコース、ガラクトース、マン
ノースおよびラムノースの存在を示す。上記細胞
壁組成および全細胞糖成分は菌株C38383が細胞
壁タイプｃのアクチノミセス類
（Actinomycete）種であることを示す。 分類学 菌株C38383をノカルジア（Nocardia）、ミク
ロポリスポラ（Micropolyspora）、ミクロテトラ
スポラ（Microtetraspora）、ノカルジオプシス
（Nocardiopsis）、サツカロポリスポラ
（Sacchoropolyspora）、シユードノカルジア
（Pseudonocardia）、アクチノマズラ
（Actinomadura）およびストレプトアロテイク
ス（Streptoalloteichus）を含むすべて気生菌糸
体上に胞子鎖を生じ、細胞壁中にメソジアミノピ
メリン酸を含むアクチノミセス
（Actinomycetales）目の８属と比較した。これ
らの８属の中で属ノカルジオプシス
（Nocardiopsis）は胞子鎖および胞子形態で菌株
C38383に最も関連するが、しかし全細胞水解物
中にガラクトースおよびマンノースを欠く点で菌
株C38383と異なる。 ゴルドン（Gordon）他〔ジエー．ゲン．ミク
ロバイオル．（J.Gen.Microbiol.）109：69〜78、
1978〕は生理学的性質および全細胞水解物中の化
学組成を基にしてノカルジア（Nocardia）の14
分類群の特性を示した。菌株C38383はアミノ酸
および全細胞水解物中の糖組成でノカルジア・ア
エロコロニゲネス（Nocardia aerocolonigenes）
に最も類似する。従つて菌株C38383をエヌ．ア
エロコロニゲネス（N.aerocolonigenes）の診断
的生理学的性質と比較した。表４に示されるよう
に、菌株C38383はエヌ．アエロコロニゲネス
（N.aerocolonigenes）に非常に関連するが、し
かしノカルジア（ノカルジオプシス）・ダツソン
ビレイ〔Nocardia（Nocardiopsis）dassonvillei〕
と有意に異なることが認められた。しかし、エ
ヌ．アエロコロニゲネス（N.aerocolonigenes）
の14菌株はすべて胞子および気生菌糸体を形成す
る能力を欠くかまたは喪失する。従つて、菌株
C38383はノカルジア・アエロコロニゲネス
（Nocardia aerocolonigenes）の分類群中の胞子
形成種であると思われる。 菌株C38383はまた、その気生菌糸体および胞
子を形成する能力を喪失することが認められた。
５連続継代後、単分離物の70％がこれらの能力を
喪失した。菌株C38383のそのような性質は胞子
および気生菌糸体を形成する点で報告されたノカ
ルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の変種に類似すると思われる。 表 １ 菌株No.C38383*の培養特性 トリプトン−酵母エキスブロス（ISPNo.１） G**：普通；毛状、淡黄色菌糸塊 Ｄ：なし スクロース−ナイトレート寒天（ツアペツクの寒
天） Ｇ：豊 Ｒ：強黄色（84）***ないし鮮明黄色（82） Ａ：普通、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：暗帯灰黄色（91）ないし明オリーブ褐色
（94） グルコース−アスパラギン寒天 Ｇ：貧 Ｒ：白色（263） Ａ：僅少、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：なし グリセリン−アスパラギン寒天（ISP No.５） Ｇ：豊 Ｒ：輝黄色（83）ないし強黄色（84） Ａ：豊、淡黄色（89）ないし明黄色（86） Ｄ：黄灰色（93）ないし帯灰黄色（90） 無機塩−デンプン寒天（ISP No.４） Ｇ：豊 Ｒ：淡黄色（89）ないし強黄色（84） Ａ：豊、白色（263）ないし帯黄白色（92） Ｄ：なし チロシン寒天（ISP No.７） Ｇ：豊 Ｒ：輝黄色（83）ないし強黄色（84） Ａ：普通、淡黄色（89）ないし明黄色（86） Ｄ：淡黄色（89） 普通寒天 Ｇ：豊 Ｒ：帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ａ：豊、白色（263） Ｄ：なし 酵母エキス−麦芽エキス寒天（ISP No.２） Ｇ：豊 Ｒ：輝橙黄色（67）ないし強橙黄色（67） Ａ：豊、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：暗橙黄色（72）ないし並帯黄褐色（77） オートミール寒天（ISP No.３） Ｇ：普通 Ｒ：明黄色（86）ないし輝黄色（83） Ａ：僅少、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：なし ベンネツトの寒天 Ｇ：豊 Ｒ：輝黄色（83）ないし強黄色（84） Ａ：豊、帯黄白色（82）ないし淡黄色 Ｄ：鮮明黄色（82） ペプトン−酵母エキス−鉄寒天（ISP No.６） Ｇ：普通 Ｒ：淡黄色（89）ないし明黄色（86） Ａ：貧、白色（263）ないし帯黄白色（92） Ｄ：なし ＊28℃、３週間培養後観察 ＊＊略語：Ｇ＝成長；Ｒ＝裏面色；Ａ＝気生 菌糸体；Ｄ＝拡散性色素 ＊＊＊色および括弧内の数字はケリー他
（Kelly、K.L.and D.B.Judd）：セントロイド、
カラー（Centroid Colors）で示したISCC−
NBS色名チヤート。ユーエス・デプト．オブ．
コム．シル．（US Dept.of Comm.Cir.553、
Washington D.C.No.、1975）中の色標準に従
う。 【表】 【表】 表 ３ 菌株No.C38383の炭水化物利用性 グリセリン ＋ Ｄ（−１）−アラビノース ＋ Ｌ（＋）−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−フルクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｌ（−）−ソルボース − スクロース ＋ ラクトース ＋ メリビオース ＋ トレハロース ＋ ラフイノース ＋ Ｄ（＋）−メレジトース − 溶性デンプン ＋ セルロース ＋ ズルシトール − イノシトール ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｄ−ソルビトール − サリシン ＋ 37℃で３週間培養後観察 基礎培地：プリダム−ゴツトリーブ（Pridham−
Gottlieb）の無機培地 略語：＋：利用陽性、−：利用陰性 【表】 【表】 本発明は前記の殊に好ましい菌株C38383−
RK2の使用または前記記載に完全に答える生物
に限定されないことを理解すべきである。殊に、
他の4′−デスクロロレベツカマイシン産生菌株ま
たはＸ線、紫外線、ナイトロジエンマスタードに
よる処理、フアージ感染などのような普通の方法
により製造できる前記生物の突然変異体を含むも
のである。 4′−デスクロロレベツカマイシンの製造 4′−デスクロロレベツカマイシンはノカルジ
ア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の4′−デスクロロレベツカマ
イシン産生菌株、殊にノカルジア・アエロコロニ
ゲネス（Nocardia aerocolonigenes）株C38383
−PK−２（ATCC 39243）の性質を有する菌株ま
たはその突然変異体、を水性栄養培地中で液内好
気性条件下に培養することにより製造できる。生
物は同化性炭素源、例えばスクロース、ラクトー
ス、グルコース、ラムノース、フルクトース、マ
ンノース、メリビオース、グリセリンまたは溶性
デンプンを含む栄養培地中で成長させる。栄養培
地はまた同化性窒素源、例えば魚粉、ペプトン、
大豆粉、落花生粕、綿実粕、またはトウモロコシ
浸漬液を含むべきである。栄養無機塩もまた培地
に混合することができる。そのような塩はナトリ
ウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リ
ン酸、硫酸、塩化物、臭化物、硝酸、炭酸などの
イオンを与えることができる普通の塩を含むこと
ができる。 4′−デスクロロレベツカマイシンの製造は生物
を十分に成長させる温度、例えば20〜41℃で行な
うことができ、便宜には約27℃の温度で行なわれ
る。 発酵はフラスコ中、あるいは種々の容量の研究
室または工業発酵装置中で行なうことができる。
タンク発酵を用いようとするとき、少容積の培地
に生物の斜面または土壌培養菌あるいは凍結乾燥
培養菌を接種することにより栄養ブロス中に増殖
型（vegetative）接種材料を生産することが望ま
しい。この方法で活性接種材料を得た後、それを
4′−デスクロロレベツカマイシンの大規模生産用
の発酵タンク培地に無菌的に移す。増殖型接種材
料を生成させる培地は、生ずる生物の良好な成長
が得られさえすればタンク中に用いるものと同一
であつても異なつていてもよい。 一般に、4′−デスクロロレベツカマイシンの最
適生産は約７日の培養期間後に達成される。 4′−デスクロロレベツカマイシンは発酵の少量
生成物であり、培地から回収し、実施例１に記載
する多段階手順により実質的に純粋な形態に単離
できる。従つて、所望の4′−デスクロロレベツカ
マイシンは主に菌糸体中に見出され、菌糸体から
の回収は有機溶媒、例えばテトラヒドロフランで
抽出することにより行なうことができる。抽出物
の容積を減少させた後、所望の4′−デスクロロレ
ベツカマイシンを含む粗固体を得ることができ
る。この粗固体は次いで次の流れ図に例示した打
段階精製図式にかけることができる。 【表】 濾液
固体
廃棄 モノク
ロロレベツカマイシン
4′−デスクロロレベツカマイシンの物理化学的性
質 4′−デスクロロレベツカマイシンの物理化学的
性質は次のとおりである： 4′−デスクロロレベツカマイシンは
C27H22O7N3Clの分子式および535.8397の分子量
を有する黄色無定形固体である。それは炭素、水
素、酸素、窒素および塩素の元素からなる。元素
分析データは次のとおりである： 計算値（C27H22O7N3Cl・H2O）： Ｃ、58.54；Ｈ、4.37；Ｎ、7.58 測定値： Ｃ、58.43；Ｈ、4.28；Ｎ、7.29。 4′−デスクロロレベツカマイシンの高分解能質
量スペクトルはクレイトス（Kratos）MS−50分
光計およびFABイオン化で測定した。観測した
質量は次のとおりである： （Ｍ＋Ｈ）+イオンに対する計算値：536.1224 （Ｍ＋Ｈ）+イオンに対する測定値：536.1188 4′−デスクロロレベツカマイシンは水に不溶性
でジメチルスルホキシドに溶解する。 4′−デスクロロレベツカマイシンの赤外吸収ス
ペクトルはKBr中でペレツトにしたとき逆セン
チメートルで表わした次の振動数に特性バンドを
表わす： 3400、3330、2930、1745、1703、1575、1490、
1470、1458、1435、1398、1380、1330、1273、
1238、1140、1105、1083、1050、1015、947、
910、800、798、755、738、670、665、633 4′−デスクロロレベツカマイシンの紫外吸収ス
ペクトルはメタノール中（0.03462ｇ／）で中
性条件下に測定した。観察された吸収極大および
吸収率は次のとおりである： 400nｍ（8.6）、315nｍ（96.5）、290nｍ
（107.7）、257nｍ（sh）、235nｍ（76.3）。 ジメチルスルホキシドに溶解した4′−デスクロ
ロレベツカマイシンのプロトン磁気共鳴スペクト
ルをブルカー（Bruker）WN−360分光計で
360MHzで操作し、テトラメチルシランを内部標
準として測定した。観測された化学シフト（δ
値）、結合定数（Ｊ値、Hz）およびパタン説明は
次のとおりである： 11.81（ｓ、1H、N8−Ｈ）、11.24（ｓ、1H、
N5′−Ｈ）、9.26（ｄ、Ｊ＝7.9、1H、C1−Ｈまた
はC1′−Ｈ）、9.10（ｄ、Ｊ＝7.9、1H、C1−Ｈま
たはC1′−Ｈ）7.77（ｄ、Ｊ＝7.9、1H、C4′−Ｈ）、
7.63（ｍ、2H、C3−ＨおよびC3′−Ｈ）、7.42（ｍ、
2H、C2−ＨおよびC2′−Ｈ）、6.91（ｄ、Ｊ＝9.4、
1H、C1″−Ｈ）、6.30（bs 1H、C6″−OH）、5.25
（ｄ、Ｊ＝5.7、1H、C3″−OH）、4.91（ｄ、Ｊ＝
5.7、1H、C2″−OH）、4.01（bs、2H、C6″−Ｈ）、
3.90（ｄ、1H、C5″−Ｈ）、3.67（ｔ、1H、C4″−
Ｈ）、3.62（ｓ、3H、C4″−OCH3）、3.53（ｍ、
1H、C2″−Ｈ H2Oと重複）。 ジメチルスルホキシドに溶解した4′−デスクロ
ロレベツカマイシンの炭素−13磁気共鳴スペクト
ルをブルカー（Bruker）WM−360分光計で
22.5MHzで操作し、テトラメチルシランを内部標
準として用いて測定した。観察された化学シフト
（ppm値）および帰属は次のとおりである。 化学シフト（ppm） 帰 属 170.7 C7 170.6 C7 140.7 C4a 138.1 C4a′ 130.4 C5a 129.9 C5a′ 129.4 C3′ 127.3 C3 125.6 C5c 124.6 C1′ 123.9 C1 122.8 C5c′ 122.3 C2 121.1 C6 120.6 C2′ 119.4 C6′ 119.1 C5b′ 117.4 C5b 116.4 C4 112.1 C4′ 83.9 C1″ 77.6 C3″ 77.0 C4″ 76.6 C5″ 72.1 C2″ 60.0 OCH3 58.7 C6″ 4′−デスクロロレベツカマイシンの生物学的活性 4′−デスクロロレベツカマイシンの抗菌活性を
多くのグラム陽性およびグラム陰性生物に対し一
連の倍々寒天希釈法により測定した。結果はレベ
ツカマイシンの活性と比較して表５に示される。 【表】 【表】 4′−デスクロロレベツカマイシンはまた、移植
マウス白血病Ｐ−388に対して試験し、結果は表
６に示される。用いた方法は一般にナシヨナル・
カンサー・インステイチユート（National
Cancer Institute）〔カンサー・ケモセラピー・
レプ（Cancer Chemotherapy Rep.）、パート
３、３、１〜103（1972）〕のプロトコルに従つた。
重要な試験の詳細は表６の下に示される。 【表】 【表】 前記抗菌およびマウス腫瘍データによつて示さ
れるように、4′−デスクロロレベツカマイシンは
抗生物質として、また哺乳動物の悪性腫瘍、例え
ばＰ−388白血病の抑制のための抗腫瘍剤として
有用である。 本発明はその範囲内に、4′−デスクロロレベツ
カマイシンの有効抗菌または腫瘍抑制量を不活性
な製剤に許容されるキヤリヤーまたは希釈剤と組
合せて含む薬剤組成物を包含する。そのような組
成物はまた、他の活性抗菌または抗腫瘍薬を含む
ことができ、所望の投与経路に適する薬剤形態に
仕上げることができる。そのような組成物の例に
は経口投与用固体組成物、例えば錠剤、カプセ
ル、丸剤、粉末および顆粒、経口投与用の液体組
成物例えば溶液、懸濁液、シロツプまたはエリキ
シル並びに非経口投与薬剤例えば無菌の溶液、懸
濁液または乳濁液が含まれる。それらはまた使用
直前に無菌水、生理的食塩水または若干の他の無
菌の注入可能媒質中に溶解できる無菌固体組成物
の形態に製造することができる。 抗菌剤としての使用には、4′−デスクロロレベ
ツカマイシンまたはその薬剤組成物は活性成分の
濃度が治療される個々の生物に対する最小阻止濃
度より大きいように投与される。抗腫瘍剤として
の使用には投与哺乳動物患体に対する4′−デスク
ロロレベツカマイシンの最適投薬量および規制は
当業者により容易に確かめられることができる。
もちろん、用いる4′−デスクロロレベツカマイシ
ンの実際の用量は配合した個々の組成物、適用方
式、並びに治療される個々の位置、患体および疾
患により変動することが認められよう。年令、体
重、性、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、
患者の状態、薬物の組合せ、反応感受性および疾
患の状態を含む薬物の作用を変化させる多くの因
子が考慮されよう。 以下の実施例は単に本発明の例示目的に提供さ
れ、その範囲を限定するものではない。スケリソ
ルブＢは異性体ヘキサン類を含み60〜69℃の沸点
を有する市販石油溶剤〔スケリ・オイル社
（Skelly Oil Co.）である。ダイカライト
（Dicalite）はグレフコ社（Grefco、Inc.）により
製造されたケイソウ土である。他に示さなければ
以下の温度はすべて摂氏度である。 実施例 １ 4′−デスクロロレベツカマイシンの製造 Ａ 発酵 ノカルジア・アエロコロニゲネス
（Nocardia aercolonigenes）菌株C38383−
RK2（ATCC39243を維持し、培養試験管中、
酵母−麦芽エキス寒天の寒天斜面に移した。こ
の培地はグルコース4.0ｇ、酵母エキス4.0ｇ、
麦芽エキス10ｇおよび寒天20ｇを蒸溜水で１
にしたものからなる。各移転で寒天斜面培養は
27℃で７日間培養した。増殖期用の接種物を調
製するため、斜面培養から表面成長物を、グル
コース30ｇ、大豆粉10ｇ、綿実胚粕10ｇおよび
CaCO33ｇを蒸留水で１にして無菌培地100
mlを含む500ml三角フラスコに移した。この増
殖型培養（vegetative culture）は、210回
転／分に設定し、5.1cm直径で円を画くジヤイ
ロトリー・チール（Gyrotory tier）振とう機
〔モデルG53、ニユー・ブルンスウイツク・サ
イエンテイフイツク社（New Brunswick
Scintific Co.、Inc.）〕上、27℃で48時間培養
した。増殖型培養物４mlを、コーンスターチ60
ｇ、グルコース10ｇ、綿実粕15ｇ、自己分解酵
母5.0ｇ、FeSO4・7H2O 1.0ｇ、NH4H2PO4
1.0ｇ、（NH4）2SO4 1.0ｇおよびCaCO3 10ｇを
脱イオン水で１にしてなる無菌生産培地
（production medium）100mlを含む500ml三角
フラスコに移した。生産培養は増殖型培養に用
いたような振とう機上で27℃で培養した。撹拌
速度は250回転／分に設定した。発酵は168時間
で終えた。 Ｂ 単離 実施例1Aにより得られた発酵ブロスを、ケ
イソウ土濾過助剤（濾過助剤はブロスと混合さ
れ、またマツトの形成に使用される）を用いて
濾過する。瀘液を廃棄し、マツトを、テトラヒ
ドロフラン（THF）で初めのブロス体積基準
0.1〜0.2容量を用いて、30〜60分間抽出する
（THFは、好ましくは0.025％のブチル化ヒド
ロキシトルエンを防腐剤として含有する。）
THF抽出物を濾過し、不溶物を廃棄する。瀘
液をTHFがほとんどすべて除去されるまで減
圧で濃縮する。次いで不活性濾過助剤を濃縮物
に混合し、生じた混合物を不活性濾過助剤のマ
ツト上で濾過する。マツトを通して空気を４時
間またはより長時間吸引してマツトをできるだ
け乾燥する。 上記のように得られたマツトを次に良好なス
ラリーにする十分なTHFで約30分間抽出する。
抽出物を濾過し、マツトを廃棄する。瀘液を１
気圧で沸騰させることにより濃縮する。体積が
小さくなると同時に熱メタノールを加える。黄
色固体の結晶化が始まつた後、混合物を突沸が
問題になるまで穏やかに沸騰させる。次に反応
混合物を冷却させ、５〜８℃に冷却する。固体
生成物を濾過し、冷メタノールで洗浄して乾燥
する。所望の4′−デスクロロレベツカマイシン
を含むこの物質を次の分解手順に用いる。 Ｃ 分離および精製 実施例1Bからの粗固体（336.3ｇ）をクロロ
ホルム２部とメタノール１部との混合物2.5
中に懸濁して部分的に溶解させ、６丸底フラ
スコに移した。濾過助剤（ダイカライト）約１
Kgを懸濁液に混合した。混合物をスケリソルブ
Ｂ約1.5で希釈した。得られたスラリーを回
転蒸発器中で減圧で粉末に濃縮した。この粉末
をスケリソルブB6中スラリーにし、12cm外
径×90cmのフラツシユクロマトグラフイーカラ
ムに充てんした。床は加圧流（H2−5.7psi）で
形成した。充てんしたカラムを次の溶離性系列
で加圧流で溶離した。スケリソルブB9（新
３＋充てん溶媒６）：トルエン13；塩化
メチレン12；酢酸エチル12；テトラヒドロ
フラン18；およびメタノール７。トルエン
溶離液を回転蒸発器中で減圧で蒸発乾固すると
固体5.15ｇが得られ、残留物Ａと称した。 グレンコ（Glenco）シリーズ3500ユニバー
サルLCカラム（2.67cm内径×75cm）にクロロ
ホルム中でワウルム（Woelm）シリカゲル
（0.063〜0.200mm）80ｇを充てんした。残留物
Ａをクロロホルム40mlに溶解し、直接カラム上
へ送つた。溶離はクロロホルム500mlの初期イ
ソクラテツクリンスで開始した。溶離をクロロ
ホルム〜クロロホルム95部中メタノール５部の
４の直線勾配で続け、200mlフラクシヨン20
個を捕集した。フラクシヨン13〜16がほぼ均質
と判断された。これらを一緒にして蒸発乾固す
ると残留物Ｂ、663mgが得られた。 グレンコカラム（2.67cm内径×75cm）にベー
カー（Baker）ボンデツドフエースオクタデシ
ルシリカゲル（Ｃ−18）をメタノール中で充て
んした。カラムを溶離剤：アセトニトリル３
部、メタノール３部および0.1M酢酸アンモニ
ウム４部、約2.5床体積と平衡させた。ジメチ
ルスルホキシド３ml中の残留物Ｂを試料ループ
に吸入し、溶離剤でカラム上に送つた。溶離液
を280nｍでモニターしながら溶離を開始した。
初め２の初留後、50mlのフラクシヨン40個を
捕集した。UVクロマトグラムを基にしてフラ
クシヨン９〜32を一緒にした。複合物をクロロ
ホルム２で抽出した。下相を分離して回転蒸
発器中で減圧で濃縮乾固した。残留物をクロロ
ホルム50ml中に超音波処理して部分溶解した。
懸濁液をスケリソルブB1に速やかにかきま
ぜながら加えた。生じた沈澱を濾過により捕集
すると4′−デスクロロレベツカマイシン606mg
が得られた。 さらに上記単離手順の詳細が以下に示される： 分析用HPLC 次の要素を分析用HPLC系の構成に用いた：ウ
オーター・アソシエーテス（Water Associates）
モデル6000Aソルベント・デリベリ・システム・
ポンプ；バリアン・バリクロム（Varian
Varichrom）モデルVUV−10UV／visデテクタ
ー、設定254nｍ0.1 O.D.；フイツシヤレ・コーダ
ル（Fisher Recordal）シリーズ5000レコーダ
ー；ウオーター・アソシエーテス（Water
Associates）モデルU6Kインジエクター；アル
テツクス・スフエリソルブ（Altex Spherisorb）
ODS（10μ）カラム（4.6mm内径×25cm）。要素は
316ステンレス鋼管（1.6mm外径−0.23mm内径）で
連結した。アセトニトリル４部、メタノール３部
および0.1M酢酸アンモニウム３部の溶離剤を全
分析間２ml／分で送つた。場合によりヒユーレツ
ト・パツカード（Hewlett Packard）1040A
HPLC デテクターシステムをバリアン・バリク
ロム（Varian Varichrom）VUV−10デテクタ
ーの代りに用いた。 薄層クロマトグラフイー（TLC）： TLCはアナルテク（Analtech）プレコーテツ
ドシリカゲルGHLFプレート（2.5cm×10cm、
0.25mm厚層）上で行なつた。プレートはワツトマ
ン社（Whatman Inc.）から購入したガラスシリ
ンダー（6.4cm直径×150cm高）中で展開した。タ
ンクはメタノール５部−クロロホルム95部の混合
物を10mlを充てんし、プレートを入れる前に平衡
させた。展開した風乾プレートは、クロマト
（Chromato）−VUEモデルCC−20ライトボツク
〔ウルトラ−バイオレツト・プロダクツ社
（Ultra−Violet Products Inc.）〕またはモデル
UVSL−58ハンドヘルドミネラルラインランプ
〔ウルトラ−バイオレツト・プロダクツ社
（Ultra−Violet Products Inc.）〕を用いて254n
ｍおよび366nｍの紫外線で可視化した。 分析用HPLC： 次の要素を用いて中圧液体クロマトグラフイー
系を構成した：フルーイド・メータリング社
（Fluid Metering、Inc.）モデルRP−SY2CSC
FMIラブ・ポンプ（Lab Pump）；フルーイド・
メータリング社（Fluid Metering、Inc.）モデル
PD−60−LF FMIパルスダンパー；厚紙管
（8.65cm外径）に巻付けたポリプロピレン管（3.0
mm外径×1.5mm内径）で構成した15ml試料ルー
プ；グレンコ（Glenco）シリーズ3500ユニバー
サルLCカラム（2.67cm内径×75cm）；タイプ６光
学装置を有するインスツルメンテーシヨン・スペ
シヤルテイーズ社（Instrumentation Specialties
Co.）モデルUA−５アブソーバンス／フルオレ
スセンスモニター；インスツルメンテーシヨン・
スペシヤルテイーズ（Instrumentation
Specialties Co.）モデル590フロー・インタラプ
ター・バリユー；およびインスツルメンテーシヨ
ン・スペシヤルテイーズ（Instrumentation
Specialties Co.）モデル328フラクシヨンコレク
ター。これらの要素はポリプロピレンおよびテフ
ロン管（3.0mm外径×1.5mm内径）およびグレンコ
（Glenco）マルチフイツトコネクターおよびバル
ブで前記順序に連結した。 グレンコ（Glenco）シリーズ3500ユニバーサ
ルLCカラムは標準法を用いて示した溶媒中の規
定吸着剤を充てんした。沈降した床と管上部との
間の空隙は標準オツタワ（Ottwa）砂を充てんし
た。溶離剤は60psi背圧を超えない最大速度（約
20ml／分）で送つた。 勾配溶離： テフロンバルブで縦列に連結した直径、高さお
よび容積の等しい２室からなるグレンコ
（Glenco）勾配溶離装置を勾配溶離に用いた。１
室は混合室として、他は静止槽として用いた。極
性の小さい溶媒、クロロホルム、を初めに混合室
に保持した。より極性の溶媒、クロロホルム95部
中メタノール５部、は静止室に保持した。テフロ
ン被覆磁気かくはん棒（1.0×3.7cm）を両室内に
置き、トーマス（Thomas）モデル15マグネーマ
チツクスターラーにより駆動した。溶離剤は混合
室からポリプロピレン管（1.5mm内径×3.0mm外
径）を通して中圧hplc系に送つた。溶離剤が混合
室から移動されるにつれて静止槽中の溶媒を自由
にそれに置換させ、従つて溶離剤の直線勾配が生
じた。
造および回収に関する。 (2) 従来技術の説明 本発明の新規化合物は、1983年１月28日に提出
された同時係属出願第461817号に開示され、特許
請求された抗腫瘍薬レベツカマイシン
（rebeccamycin）と構造的に関連があり、その全
開示は引用により本明細書に加入される。レベツ
カマイシンは式、 を有し、ノカルジア・アエロコロニゲネス
（Nocardia aerocolonigenes）の培養により得ら
れる。 本発明の化合物に構造的に多少関連するものは
ストレプトマイセス・スタウロスポレウス
（Streptomyces staurosporeus）の発酵から得ら
れる抗腫瘍薬、スタウロスポリン
（staurosporine）（またAM−2282と称される）
である。スタウロスポリンはジエー．シー．エ
ス．ケム．コム．（J.C.S.Chem.Comm.）1978、
800〜801頁およびジエー．アンチバイオテイツク
ス（J.Antibiotics）30(4)：275〜282（1977）に記
載されている。 アンゲブ．ケム．イント．エド．イングル
（Angew.Chem.Int.Ed.Engl.）19(6)：459〜600
（1980）には粘菌、アルシリア・デヌダタ
（Arcyria denudata）の子実体から得られ、スタ
ウロスポリンと構造的に関連する種々のインドー
ル色素が開示されている。それら色素のいくつか
はバシラス・ブレビス（Bacillus brevis）およ
びビー．サチリス（B.subtilis）に対し活性を示
す。 発明の概要 本発明は構造式、 を有し、ここに4′−デスクロロレベツカマイシン
（4′−deschlororebeccamycin）と称される新規
な抗腫瘍性抗生物質、および4′−デスクロロレベ
ツカマイシンを製造し、単離し、純粋な形態に精
製する方法に関する。 本発明の抗生物質はノカルジア・アエロコロニ
ゲネス（Nocardia aerocolonigenes）の4′−デ
スクロロレベツカマイシン産生菌株、好ましくは
ノカルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）株C38383−RK2
（ATCC39243）またはその突然変異体を水性栄養
培地中、液内好気性条件下に、実質量の4′−デス
クロロレベツカマイシンが前記微生物により前記
培地中に生産されるまで発酵させ、場合により共
生物質を実質的に含まない4′−デスクロロレベツ
カマイシンを培地から回収することにより得られ
る。 化合物4′−デスクロロレベツカマイシンは抗菌
活性および実験動物腫瘍系、例えばマウスにおけ
るＰ−388白血病に対する活性を示す。 詳細な説明 本発明の4′−デスクロロレベツカマイシンはノ
カルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の4′−デスクロロレベツカマ
イシン産生菌株の発酵により製造される。 殊に好ましい4′−デスクロロレベツカマイシン
産生株はレベツカマイシンに対する産生生物とし
て1983年１月28日に提出した米国出願第461817号
に開示されたものである。本出願人はこの微生物
の培養中にレベツカマシインとともに本発明の
4′−デスクロロレベツカマイシン生成物が共生さ
れることを見出した。菌株C38383−RK2と称さ
れるこの好ましい産生微生物はパナマで収集した
土壌試料から分離された。この菌株の培養物はア
メリカン・タイプ・カルチヤ・コレクシヨン
（American Type Culture Collection、
Rockville、Maryland）に寄託され、
ATCC39243としてその微生物の永久収集物に加
えられた。 菌株C38383−RK2について行なつた分類学研
究の結果は菌株が属ノカルジア（Nocardia）の
非定型種として分類されることを示す。次に示す
特性を基にすると菌株C38383−RK2はノカルジ
ア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の種群に属すと思われる。 菌株C38383−RK2は次の性質を有する： 形態学 菌株C38383−RK2は基生および気生菌糸体に
発達する単細胞の糸状細胞を形成する。両菌糸体
は長く、よく枝分れするが、短繊維（幅0.5μｍ）
に分裂しない。分節胞子は気生菌子全体に生ず
る。これらの胞子は空の菌糸を介在して配列さ
れ、または連続鎖として形成される。ノカルジオ
プシス・ダツソンビレイ（Nocardiopsis
dassonvillei）の胞子形成〔イントル．ジエー．
シスト．バクテリオル（Intl.J.Syst.Bacteriol）
26；487〜493、1976）のように菌株C38383の気
生菌糸は長いセグメントに分割され、それが後に
不規則な大きさの胞子に再分割される。介在また
は連続的な胞子の鎖は形状がまつすぐかまたは屈
曲している。鎖中に50〜100胞子を含む非常に長
い胞子鎖が短いかまたは普通の長さの鎖とともに
形成される。胞子は形状が円筒状で、大きさが
0.5〜0.7×0.7〜5μｍであり、滑らかな表面を有す
る。 菌核は気生菌糸体上に形成されるが、しかし胞
子嚢、運動胞子、および輸生体は観察されない。 培養活性 菌株C38383は偏性好気性アクチノミセス類で
あり、多くの寒天培地中でよく成長する。気生菌
糸体はツアペツク（Czapek）のスクロース−ナ
イトレート寒天、ISP培地No.２、４、５および
７、普通寒天およびベンネツト（Bennett）寒天
上で豊かに、しかしグルコース−アスパラギン寒
天およびISP培地No.３および６上で貧少に形成さ
れる。気生菌糸体の色は白色、帯黄白色または淡
黄色である。帯黄色色素が基生菌糸体中に形成さ
れ、それが寒天培地中へ僅かに拡散する。この色
素はPH−指標性ではない。メラノイド色素は生じ
ない。培養特性は表１に示される。 生理学特性 菌株C38383の最適成長温度は28〜37℃の範囲
にあり、普通の成長は20℃および41℃で認められ
る。７℃および45℃で成長は認められない。ゼラ
チンおよびデンプンは分解される。チロシナーゼ
反応は陰性である。成長は８％NaClの存在で抑
制されるが、しかしリゾチームにより0.01％で抑
制されない。菌株C38383は大抵の糖を成長に利
用する。生理学的特性および炭水化物の利用はそ
れぞれ表２および表３に示される。 細胞壁アミノ酸および全細胞糖成分 細胞壁中のアミノ酸組成はベツカー（Becker）
他〔アプル．ミクロバイオル．（Apple.
Microbiol.）13：236〜243、1965〕およびヤマグ
チ〔ジエー．バクテリオル．（J.Bacteriol.）89：
441〜453、1965〕により記載された方法により試
験し、全細胞水解物中の糖成分はレシエバリール
他（Lechevalier and Lechevalier）によりアク
チノミセス類および関連生物の生物学（Biology
of the Actinomycetes and Related
Organisms）、11：78〜92、1976に示された手順
に従つて同定した。菌株C38383の細胞壁はメソ
ージアミノピメリン酸を含むがグリシンを欠く。
全細胞水解物はグルコース、ガラクトース、マン
ノースおよびラムノースの存在を示す。上記細胞
壁組成および全細胞糖成分は菌株C38383が細胞
壁タイプｃのアクチノミセス類
（Actinomycete）種であることを示す。 分類学 菌株C38383をノカルジア（Nocardia）、ミク
ロポリスポラ（Micropolyspora）、ミクロテトラ
スポラ（Microtetraspora）、ノカルジオプシス
（Nocardiopsis）、サツカロポリスポラ
（Sacchoropolyspora）、シユードノカルジア
（Pseudonocardia）、アクチノマズラ
（Actinomadura）およびストレプトアロテイク
ス（Streptoalloteichus）を含むすべて気生菌糸
体上に胞子鎖を生じ、細胞壁中にメソジアミノピ
メリン酸を含むアクチノミセス
（Actinomycetales）目の８属と比較した。これ
らの８属の中で属ノカルジオプシス
（Nocardiopsis）は胞子鎖および胞子形態で菌株
C38383に最も関連するが、しかし全細胞水解物
中にガラクトースおよびマンノースを欠く点で菌
株C38383と異なる。 ゴルドン（Gordon）他〔ジエー．ゲン．ミク
ロバイオル．（J.Gen.Microbiol.）109：69〜78、
1978〕は生理学的性質および全細胞水解物中の化
学組成を基にしてノカルジア（Nocardia）の14
分類群の特性を示した。菌株C38383はアミノ酸
および全細胞水解物中の糖組成でノカルジア・ア
エロコロニゲネス（Nocardia aerocolonigenes）
に最も類似する。従つて菌株C38383をエヌ．ア
エロコロニゲネス（N.aerocolonigenes）の診断
的生理学的性質と比較した。表４に示されるよう
に、菌株C38383はエヌ．アエロコロニゲネス
（N.aerocolonigenes）に非常に関連するが、し
かしノカルジア（ノカルジオプシス）・ダツソン
ビレイ〔Nocardia（Nocardiopsis）dassonvillei〕
と有意に異なることが認められた。しかし、エ
ヌ．アエロコロニゲネス（N.aerocolonigenes）
の14菌株はすべて胞子および気生菌糸体を形成す
る能力を欠くかまたは喪失する。従つて、菌株
C38383はノカルジア・アエロコロニゲネス
（Nocardia aerocolonigenes）の分類群中の胞子
形成種であると思われる。 菌株C38383はまた、その気生菌糸体および胞
子を形成する能力を喪失することが認められた。
５連続継代後、単分離物の70％がこれらの能力を
喪失した。菌株C38383のそのような性質は胞子
および気生菌糸体を形成する点で報告されたノカ
ルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の変種に類似すると思われる。 表 １ 菌株No.C38383*の培養特性 トリプトン−酵母エキスブロス（ISPNo.１） G**：普通；毛状、淡黄色菌糸塊 Ｄ：なし スクロース−ナイトレート寒天（ツアペツクの寒
天） Ｇ：豊 Ｒ：強黄色（84）***ないし鮮明黄色（82） Ａ：普通、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：暗帯灰黄色（91）ないし明オリーブ褐色
（94） グルコース−アスパラギン寒天 Ｇ：貧 Ｒ：白色（263） Ａ：僅少、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：なし グリセリン−アスパラギン寒天（ISP No.５） Ｇ：豊 Ｒ：輝黄色（83）ないし強黄色（84） Ａ：豊、淡黄色（89）ないし明黄色（86） Ｄ：黄灰色（93）ないし帯灰黄色（90） 無機塩−デンプン寒天（ISP No.４） Ｇ：豊 Ｒ：淡黄色（89）ないし強黄色（84） Ａ：豊、白色（263）ないし帯黄白色（92） Ｄ：なし チロシン寒天（ISP No.７） Ｇ：豊 Ｒ：輝黄色（83）ないし強黄色（84） Ａ：普通、淡黄色（89）ないし明黄色（86） Ｄ：淡黄色（89） 普通寒天 Ｇ：豊 Ｒ：帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ａ：豊、白色（263） Ｄ：なし 酵母エキス−麦芽エキス寒天（ISP No.２） Ｇ：豊 Ｒ：輝橙黄色（67）ないし強橙黄色（67） Ａ：豊、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：暗橙黄色（72）ないし並帯黄褐色（77） オートミール寒天（ISP No.３） Ｇ：普通 Ｒ：明黄色（86）ないし輝黄色（83） Ａ：僅少、帯黄白色（92）ないし淡黄色（89） Ｄ：なし ベンネツトの寒天 Ｇ：豊 Ｒ：輝黄色（83）ないし強黄色（84） Ａ：豊、帯黄白色（82）ないし淡黄色 Ｄ：鮮明黄色（82） ペプトン−酵母エキス−鉄寒天（ISP No.６） Ｇ：普通 Ｒ：淡黄色（89）ないし明黄色（86） Ａ：貧、白色（263）ないし帯黄白色（92） Ｄ：なし ＊28℃、３週間培養後観察 ＊＊略語：Ｇ＝成長；Ｒ＝裏面色；Ａ＝気生 菌糸体；Ｄ＝拡散性色素 ＊＊＊色および括弧内の数字はケリー他
（Kelly、K.L.and D.B.Judd）：セントロイド、
カラー（Centroid Colors）で示したISCC−
NBS色名チヤート。ユーエス・デプト．オブ．
コム．シル．（US Dept.of Comm.Cir.553、
Washington D.C.No.、1975）中の色標準に従
う。 【表】 【表】 表 ３ 菌株No.C38383の炭水化物利用性 グリセリン ＋ Ｄ（−１）−アラビノース ＋ Ｌ（＋）−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−フルクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｌ（−）−ソルボース − スクロース ＋ ラクトース ＋ メリビオース ＋ トレハロース ＋ ラフイノース ＋ Ｄ（＋）−メレジトース − 溶性デンプン ＋ セルロース ＋ ズルシトール − イノシトール ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｄ−ソルビトール − サリシン ＋ 37℃で３週間培養後観察 基礎培地：プリダム−ゴツトリーブ（Pridham−
Gottlieb）の無機培地 略語：＋：利用陽性、−：利用陰性 【表】 【表】 本発明は前記の殊に好ましい菌株C38383−
RK2の使用または前記記載に完全に答える生物
に限定されないことを理解すべきである。殊に、
他の4′−デスクロロレベツカマイシン産生菌株ま
たはＸ線、紫外線、ナイトロジエンマスタードに
よる処理、フアージ感染などのような普通の方法
により製造できる前記生物の突然変異体を含むも
のである。 4′−デスクロロレベツカマイシンの製造 4′−デスクロロレベツカマイシンはノカルジ
ア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）の4′−デスクロロレベツカマ
イシン産生菌株、殊にノカルジア・アエロコロニ
ゲネス（Nocardia aerocolonigenes）株C38383
−PK−２（ATCC 39243）の性質を有する菌株ま
たはその突然変異体、を水性栄養培地中で液内好
気性条件下に培養することにより製造できる。生
物は同化性炭素源、例えばスクロース、ラクトー
ス、グルコース、ラムノース、フルクトース、マ
ンノース、メリビオース、グリセリンまたは溶性
デンプンを含む栄養培地中で成長させる。栄養培
地はまた同化性窒素源、例えば魚粉、ペプトン、
大豆粉、落花生粕、綿実粕、またはトウモロコシ
浸漬液を含むべきである。栄養無機塩もまた培地
に混合することができる。そのような塩はナトリ
ウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リ
ン酸、硫酸、塩化物、臭化物、硝酸、炭酸などの
イオンを与えることができる普通の塩を含むこと
ができる。 4′−デスクロロレベツカマイシンの製造は生物
を十分に成長させる温度、例えば20〜41℃で行な
うことができ、便宜には約27℃の温度で行なわれ
る。 発酵はフラスコ中、あるいは種々の容量の研究
室または工業発酵装置中で行なうことができる。
タンク発酵を用いようとするとき、少容積の培地
に生物の斜面または土壌培養菌あるいは凍結乾燥
培養菌を接種することにより栄養ブロス中に増殖
型（vegetative）接種材料を生産することが望ま
しい。この方法で活性接種材料を得た後、それを
4′−デスクロロレベツカマイシンの大規模生産用
の発酵タンク培地に無菌的に移す。増殖型接種材
料を生成させる培地は、生ずる生物の良好な成長
が得られさえすればタンク中に用いるものと同一
であつても異なつていてもよい。 一般に、4′−デスクロロレベツカマイシンの最
適生産は約７日の培養期間後に達成される。 4′−デスクロロレベツカマイシンは発酵の少量
生成物であり、培地から回収し、実施例１に記載
する多段階手順により実質的に純粋な形態に単離
できる。従つて、所望の4′−デスクロロレベツカ
マイシンは主に菌糸体中に見出され、菌糸体から
の回収は有機溶媒、例えばテトラヒドロフランで
抽出することにより行なうことができる。抽出物
の容積を減少させた後、所望の4′−デスクロロレ
ベツカマイシンを含む粗固体を得ることができ
る。この粗固体は次いで次の流れ図に例示した打
段階精製図式にかけることができる。 【表】 濾液
固体
廃棄 モノク
ロロレベツカマイシン
4′−デスクロロレベツカマイシンの物理化学的性
質 4′−デスクロロレベツカマイシンの物理化学的
性質は次のとおりである： 4′−デスクロロレベツカマイシンは
C27H22O7N3Clの分子式および535.8397の分子量
を有する黄色無定形固体である。それは炭素、水
素、酸素、窒素および塩素の元素からなる。元素
分析データは次のとおりである： 計算値（C27H22O7N3Cl・H2O）： Ｃ、58.54；Ｈ、4.37；Ｎ、7.58 測定値： Ｃ、58.43；Ｈ、4.28；Ｎ、7.29。 4′−デスクロロレベツカマイシンの高分解能質
量スペクトルはクレイトス（Kratos）MS−50分
光計およびFABイオン化で測定した。観測した
質量は次のとおりである： （Ｍ＋Ｈ）+イオンに対する計算値：536.1224 （Ｍ＋Ｈ）+イオンに対する測定値：536.1188 4′−デスクロロレベツカマイシンは水に不溶性
でジメチルスルホキシドに溶解する。 4′−デスクロロレベツカマイシンの赤外吸収ス
ペクトルはKBr中でペレツトにしたとき逆セン
チメートルで表わした次の振動数に特性バンドを
表わす： 3400、3330、2930、1745、1703、1575、1490、
1470、1458、1435、1398、1380、1330、1273、
1238、1140、1105、1083、1050、1015、947、
910、800、798、755、738、670、665、633 4′−デスクロロレベツカマイシンの紫外吸収ス
ペクトルはメタノール中（0.03462ｇ／）で中
性条件下に測定した。観察された吸収極大および
吸収率は次のとおりである： 400nｍ（8.6）、315nｍ（96.5）、290nｍ
（107.7）、257nｍ（sh）、235nｍ（76.3）。 ジメチルスルホキシドに溶解した4′−デスクロ
ロレベツカマイシンのプロトン磁気共鳴スペクト
ルをブルカー（Bruker）WN−360分光計で
360MHzで操作し、テトラメチルシランを内部標
準として測定した。観測された化学シフト（δ
値）、結合定数（Ｊ値、Hz）およびパタン説明は
次のとおりである： 11.81（ｓ、1H、N8−Ｈ）、11.24（ｓ、1H、
N5′−Ｈ）、9.26（ｄ、Ｊ＝7.9、1H、C1−Ｈまた
はC1′−Ｈ）、9.10（ｄ、Ｊ＝7.9、1H、C1−Ｈま
たはC1′−Ｈ）7.77（ｄ、Ｊ＝7.9、1H、C4′−Ｈ）、
7.63（ｍ、2H、C3−ＨおよびC3′−Ｈ）、7.42（ｍ、
2H、C2−ＨおよびC2′−Ｈ）、6.91（ｄ、Ｊ＝9.4、
1H、C1″−Ｈ）、6.30（bs 1H、C6″−OH）、5.25
（ｄ、Ｊ＝5.7、1H、C3″−OH）、4.91（ｄ、Ｊ＝
5.7、1H、C2″−OH）、4.01（bs、2H、C6″−Ｈ）、
3.90（ｄ、1H、C5″−Ｈ）、3.67（ｔ、1H、C4″−
Ｈ）、3.62（ｓ、3H、C4″−OCH3）、3.53（ｍ、
1H、C2″−Ｈ H2Oと重複）。 ジメチルスルホキシドに溶解した4′−デスクロ
ロレベツカマイシンの炭素−13磁気共鳴スペクト
ルをブルカー（Bruker）WM−360分光計で
22.5MHzで操作し、テトラメチルシランを内部標
準として用いて測定した。観察された化学シフト
（ppm値）および帰属は次のとおりである。 化学シフト（ppm） 帰 属 170.7 C7 170.6 C7 140.7 C4a 138.1 C4a′ 130.4 C5a 129.9 C5a′ 129.4 C3′ 127.3 C3 125.6 C5c 124.6 C1′ 123.9 C1 122.8 C5c′ 122.3 C2 121.1 C6 120.6 C2′ 119.4 C6′ 119.1 C5b′ 117.4 C5b 116.4 C4 112.1 C4′ 83.9 C1″ 77.6 C3″ 77.0 C4″ 76.6 C5″ 72.1 C2″ 60.0 OCH3 58.7 C6″ 4′−デスクロロレベツカマイシンの生物学的活性 4′−デスクロロレベツカマイシンの抗菌活性を
多くのグラム陽性およびグラム陰性生物に対し一
連の倍々寒天希釈法により測定した。結果はレベ
ツカマイシンの活性と比較して表５に示される。 【表】 【表】 4′−デスクロロレベツカマイシンはまた、移植
マウス白血病Ｐ−388に対して試験し、結果は表
６に示される。用いた方法は一般にナシヨナル・
カンサー・インステイチユート（National
Cancer Institute）〔カンサー・ケモセラピー・
レプ（Cancer Chemotherapy Rep.）、パート
３、３、１〜103（1972）〕のプロトコルに従つた。
重要な試験の詳細は表６の下に示される。 【表】 【表】 前記抗菌およびマウス腫瘍データによつて示さ
れるように、4′−デスクロロレベツカマイシンは
抗生物質として、また哺乳動物の悪性腫瘍、例え
ばＰ−388白血病の抑制のための抗腫瘍剤として
有用である。 本発明はその範囲内に、4′−デスクロロレベツ
カマイシンの有効抗菌または腫瘍抑制量を不活性
な製剤に許容されるキヤリヤーまたは希釈剤と組
合せて含む薬剤組成物を包含する。そのような組
成物はまた、他の活性抗菌または抗腫瘍薬を含む
ことができ、所望の投与経路に適する薬剤形態に
仕上げることができる。そのような組成物の例に
は経口投与用固体組成物、例えば錠剤、カプセ
ル、丸剤、粉末および顆粒、経口投与用の液体組
成物例えば溶液、懸濁液、シロツプまたはエリキ
シル並びに非経口投与薬剤例えば無菌の溶液、懸
濁液または乳濁液が含まれる。それらはまた使用
直前に無菌水、生理的食塩水または若干の他の無
菌の注入可能媒質中に溶解できる無菌固体組成物
の形態に製造することができる。 抗菌剤としての使用には、4′−デスクロロレベ
ツカマイシンまたはその薬剤組成物は活性成分の
濃度が治療される個々の生物に対する最小阻止濃
度より大きいように投与される。抗腫瘍剤として
の使用には投与哺乳動物患体に対する4′−デスク
ロロレベツカマイシンの最適投薬量および規制は
当業者により容易に確かめられることができる。
もちろん、用いる4′−デスクロロレベツカマイシ
ンの実際の用量は配合した個々の組成物、適用方
式、並びに治療される個々の位置、患体および疾
患により変動することが認められよう。年令、体
重、性、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、
患者の状態、薬物の組合せ、反応感受性および疾
患の状態を含む薬物の作用を変化させる多くの因
子が考慮されよう。 以下の実施例は単に本発明の例示目的に提供さ
れ、その範囲を限定するものではない。スケリソ
ルブＢは異性体ヘキサン類を含み60〜69℃の沸点
を有する市販石油溶剤〔スケリ・オイル社
（Skelly Oil Co.）である。ダイカライト
（Dicalite）はグレフコ社（Grefco、Inc.）により
製造されたケイソウ土である。他に示さなければ
以下の温度はすべて摂氏度である。 実施例 １ 4′−デスクロロレベツカマイシンの製造 Ａ 発酵 ノカルジア・アエロコロニゲネス
（Nocardia aercolonigenes）菌株C38383−
RK2（ATCC39243を維持し、培養試験管中、
酵母−麦芽エキス寒天の寒天斜面に移した。こ
の培地はグルコース4.0ｇ、酵母エキス4.0ｇ、
麦芽エキス10ｇおよび寒天20ｇを蒸溜水で１
にしたものからなる。各移転で寒天斜面培養は
27℃で７日間培養した。増殖期用の接種物を調
製するため、斜面培養から表面成長物を、グル
コース30ｇ、大豆粉10ｇ、綿実胚粕10ｇおよび
CaCO33ｇを蒸留水で１にして無菌培地100
mlを含む500ml三角フラスコに移した。この増
殖型培養（vegetative culture）は、210回
転／分に設定し、5.1cm直径で円を画くジヤイ
ロトリー・チール（Gyrotory tier）振とう機
〔モデルG53、ニユー・ブルンスウイツク・サ
イエンテイフイツク社（New Brunswick
Scintific Co.、Inc.）〕上、27℃で48時間培養
した。増殖型培養物４mlを、コーンスターチ60
ｇ、グルコース10ｇ、綿実粕15ｇ、自己分解酵
母5.0ｇ、FeSO4・7H2O 1.0ｇ、NH4H2PO4
1.0ｇ、（NH4）2SO4 1.0ｇおよびCaCO3 10ｇを
脱イオン水で１にしてなる無菌生産培地
（production medium）100mlを含む500ml三角
フラスコに移した。生産培養は増殖型培養に用
いたような振とう機上で27℃で培養した。撹拌
速度は250回転／分に設定した。発酵は168時間
で終えた。 Ｂ 単離 実施例1Aにより得られた発酵ブロスを、ケ
イソウ土濾過助剤（濾過助剤はブロスと混合さ
れ、またマツトの形成に使用される）を用いて
濾過する。瀘液を廃棄し、マツトを、テトラヒ
ドロフラン（THF）で初めのブロス体積基準
0.1〜0.2容量を用いて、30〜60分間抽出する
（THFは、好ましくは0.025％のブチル化ヒド
ロキシトルエンを防腐剤として含有する。）
THF抽出物を濾過し、不溶物を廃棄する。瀘
液をTHFがほとんどすべて除去されるまで減
圧で濃縮する。次いで不活性濾過助剤を濃縮物
に混合し、生じた混合物を不活性濾過助剤のマ
ツト上で濾過する。マツトを通して空気を４時
間またはより長時間吸引してマツトをできるだ
け乾燥する。 上記のように得られたマツトを次に良好なス
ラリーにする十分なTHFで約30分間抽出する。
抽出物を濾過し、マツトを廃棄する。瀘液を１
気圧で沸騰させることにより濃縮する。体積が
小さくなると同時に熱メタノールを加える。黄
色固体の結晶化が始まつた後、混合物を突沸が
問題になるまで穏やかに沸騰させる。次に反応
混合物を冷却させ、５〜８℃に冷却する。固体
生成物を濾過し、冷メタノールで洗浄して乾燥
する。所望の4′−デスクロロレベツカマイシン
を含むこの物質を次の分解手順に用いる。 Ｃ 分離および精製 実施例1Bからの粗固体（336.3ｇ）をクロロ
ホルム２部とメタノール１部との混合物2.5
中に懸濁して部分的に溶解させ、６丸底フラ
スコに移した。濾過助剤（ダイカライト）約１
Kgを懸濁液に混合した。混合物をスケリソルブ
Ｂ約1.5で希釈した。得られたスラリーを回
転蒸発器中で減圧で粉末に濃縮した。この粉末
をスケリソルブB6中スラリーにし、12cm外
径×90cmのフラツシユクロマトグラフイーカラ
ムに充てんした。床は加圧流（H2−5.7psi）で
形成した。充てんしたカラムを次の溶離性系列
で加圧流で溶離した。スケリソルブB9（新
３＋充てん溶媒６）：トルエン13；塩化
メチレン12；酢酸エチル12；テトラヒドロ
フラン18；およびメタノール７。トルエン
溶離液を回転蒸発器中で減圧で蒸発乾固すると
固体5.15ｇが得られ、残留物Ａと称した。 グレンコ（Glenco）シリーズ3500ユニバー
サルLCカラム（2.67cm内径×75cm）にクロロ
ホルム中でワウルム（Woelm）シリカゲル
（0.063〜0.200mm）80ｇを充てんした。残留物
Ａをクロロホルム40mlに溶解し、直接カラム上
へ送つた。溶離はクロロホルム500mlの初期イ
ソクラテツクリンスで開始した。溶離をクロロ
ホルム〜クロロホルム95部中メタノール５部の
４の直線勾配で続け、200mlフラクシヨン20
個を捕集した。フラクシヨン13〜16がほぼ均質
と判断された。これらを一緒にして蒸発乾固す
ると残留物Ｂ、663mgが得られた。 グレンコカラム（2.67cm内径×75cm）にベー
カー（Baker）ボンデツドフエースオクタデシ
ルシリカゲル（Ｃ−18）をメタノール中で充て
んした。カラムを溶離剤：アセトニトリル３
部、メタノール３部および0.1M酢酸アンモニ
ウム４部、約2.5床体積と平衡させた。ジメチ
ルスルホキシド３ml中の残留物Ｂを試料ループ
に吸入し、溶離剤でカラム上に送つた。溶離液
を280nｍでモニターしながら溶離を開始した。
初め２の初留後、50mlのフラクシヨン40個を
捕集した。UVクロマトグラムを基にしてフラ
クシヨン９〜32を一緒にした。複合物をクロロ
ホルム２で抽出した。下相を分離して回転蒸
発器中で減圧で濃縮乾固した。残留物をクロロ
ホルム50ml中に超音波処理して部分溶解した。
懸濁液をスケリソルブB1に速やかにかきま
ぜながら加えた。生じた沈澱を濾過により捕集
すると4′−デスクロロレベツカマイシン606mg
が得られた。 さらに上記単離手順の詳細が以下に示される： 分析用HPLC 次の要素を分析用HPLC系の構成に用いた：ウ
オーター・アソシエーテス（Water Associates）
モデル6000Aソルベント・デリベリ・システム・
ポンプ；バリアン・バリクロム（Varian
Varichrom）モデルVUV−10UV／visデテクタ
ー、設定254nｍ0.1 O.D.；フイツシヤレ・コーダ
ル（Fisher Recordal）シリーズ5000レコーダ
ー；ウオーター・アソシエーテス（Water
Associates）モデルU6Kインジエクター；アル
テツクス・スフエリソルブ（Altex Spherisorb）
ODS（10μ）カラム（4.6mm内径×25cm）。要素は
316ステンレス鋼管（1.6mm外径−0.23mm内径）で
連結した。アセトニトリル４部、メタノール３部
および0.1M酢酸アンモニウム３部の溶離剤を全
分析間２ml／分で送つた。場合によりヒユーレツ
ト・パツカード（Hewlett Packard）1040A
HPLC デテクターシステムをバリアン・バリク
ロム（Varian Varichrom）VUV−10デテクタ
ーの代りに用いた。 薄層クロマトグラフイー（TLC）： TLCはアナルテク（Analtech）プレコーテツ
ドシリカゲルGHLFプレート（2.5cm×10cm、
0.25mm厚層）上で行なつた。プレートはワツトマ
ン社（Whatman Inc.）から購入したガラスシリ
ンダー（6.4cm直径×150cm高）中で展開した。タ
ンクはメタノール５部−クロロホルム95部の混合
物を10mlを充てんし、プレートを入れる前に平衡
させた。展開した風乾プレートは、クロマト
（Chromato）−VUEモデルCC−20ライトボツク
〔ウルトラ−バイオレツト・プロダクツ社
（Ultra−Violet Products Inc.）〕またはモデル
UVSL−58ハンドヘルドミネラルラインランプ
〔ウルトラ−バイオレツト・プロダクツ社
（Ultra−Violet Products Inc.）〕を用いて254n
ｍおよび366nｍの紫外線で可視化した。 分析用HPLC： 次の要素を用いて中圧液体クロマトグラフイー
系を構成した：フルーイド・メータリング社
（Fluid Metering、Inc.）モデルRP−SY2CSC
FMIラブ・ポンプ（Lab Pump）；フルーイド・
メータリング社（Fluid Metering、Inc.）モデル
PD−60−LF FMIパルスダンパー；厚紙管
（8.65cm外径）に巻付けたポリプロピレン管（3.0
mm外径×1.5mm内径）で構成した15ml試料ルー
プ；グレンコ（Glenco）シリーズ3500ユニバー
サルLCカラム（2.67cm内径×75cm）；タイプ６光
学装置を有するインスツルメンテーシヨン・スペ
シヤルテイーズ社（Instrumentation Specialties
Co.）モデルUA−５アブソーバンス／フルオレ
スセンスモニター；インスツルメンテーシヨン・
スペシヤルテイーズ（Instrumentation
Specialties Co.）モデル590フロー・インタラプ
ター・バリユー；およびインスツルメンテーシヨ
ン・スペシヤルテイーズ（Instrumentation
Specialties Co.）モデル328フラクシヨンコレク
ター。これらの要素はポリプロピレンおよびテフ
ロン管（3.0mm外径×1.5mm内径）およびグレンコ
（Glenco）マルチフイツトコネクターおよびバル
ブで前記順序に連結した。 グレンコ（Glenco）シリーズ3500ユニバーサ
ルLCカラムは標準法を用いて示した溶媒中の規
定吸着剤を充てんした。沈降した床と管上部との
間の空隙は標準オツタワ（Ottwa）砂を充てんし
た。溶離剤は60psi背圧を超えない最大速度（約
20ml／分）で送つた。 勾配溶離： テフロンバルブで縦列に連結した直径、高さお
よび容積の等しい２室からなるグレンコ
（Glenco）勾配溶離装置を勾配溶離に用いた。１
室は混合室として、他は静止槽として用いた。極
性の小さい溶媒、クロロホルム、を初めに混合室
に保持した。より極性の溶媒、クロロホルム95部
中メタノール５部、は静止室に保持した。テフロ
ン被覆磁気かくはん棒（1.0×3.7cm）を両室内に
置き、トーマス（Thomas）モデル15マグネーマ
チツクスターラーにより駆動した。溶離剤は混合
室からポリプロピレン管（1.5mm内径×3.0mm外
径）を通して中圧hplc系に送つた。溶離剤が混合
室から移動されるにつれて静止槽中の溶媒を自由
にそれに置換させ、従つて溶離剤の直線勾配が生
じた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式、 を有する化合物。 ２ 式、 を有する4′−デスクロロレベツカマイシンの製造
方法であつて、ノカルジア・アエロコロニゲネス
（Nocardia aerocolonigenes）の4′−デスクロロ
レベツカマイシン産生菌株を同化性の炭素および
窒素源を含む水性栄養培地中で深部好気性条件下
に、実質量の4′−デスクロロレベツカマイシンが
前記生物により前記培地中に生産されるまで培養
し、次いで実質的に共生物質を含まない前記4′−
デスクロロレベツカマイシンを培地から回収する
ことを含む方法。 ３ 4′−デスクロロレベツカマイシン産生菌株が
ノカルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia
aerocolonigenes）ATCC39243またはその突然変
異体である、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 式、 を有する4′−デスクロロレベツカマイシンの有効
抗菌量を不活性の製剤に許容されるキヤリヤーま
たは希釈剤と組合せて含む抗菌剤。 ５ 式、 を有する4′−デスクロロレベツカマイシンの有効
腫瘍抑制量を不活性の製剤に許容されるキヤリヤ
ーまたは希釈剤と組合せて含む抗腫瘍剤。
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