【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、一般式
（式中R1およびR2はそれぞれ水素原子、ヒドロ
キシル基またはアシルオキシル基を意味する。）
で表わされるグリチルレチン酸誘導体またはその
ラクトン化合物に関するものである。
グリチルレチン酸およびその誘導体には抗アレ
ルギー作用、抗炎症作用、抗潰瘍作用等の薬理作
用があることが知られている。本発明者らは微生
物による化合物の変換に着目し、更に化学的手法
を組み合せて新規なグリチルレチン酸誘導体を製
造し、本発明を完成した。これらの新規誘導体に
は、上記の如き薬理作用が期待されるほか、ウサ
ギ血液から調製した多血小板血漿を用いたADP
誘起凝集反応に抑制作用を示し、医薬品としての
用途が期待される。
本発明の化合物の製造法を反応式で例示する
と、次の如くである。
（式中R1およびR2はそれぞれ水素原子、ヒドロ
キシル基またはアシルオキシル基を意味する。）
すなわち、グリチルレチン酸またはその22位ヒ
ドロキシル化体（）にチヤイニア属に属する微
生物、例えばチヤイニア アンチビオチカ
（Chainia antibiotica）IFO12246の培養菌体を触
媒としてリン酸緩衝液中で好気的条件下に反応さ
せるとＡ環の酸化的開裂および７位のヒドロキシ
ル化反応が起こり、化合物（Ia）が生成する。本
菌は培養条件を変えることによりその触媒能力に
変化が生じ、例えば、後に示す培地Ａを用いて、
28℃で深部培養（例えば坂口フラスコによる振盪
培養あるいは通気撹拌培養等）すると化合物
（）におけるＡ環の酸化的開裂反応と７位のヒ
ドロキシル化反応とを同時に行なう能力が現れ
る。また培地Ｂを用いて28℃で深部培養するとＡ
環の酸化的開裂反応が強く現れる。従つてこの性
質を巧みに利用すればR1およびR2の種々の組合
せの化合物が得られる。
生成した化合物（Ia）は反応液から例えば酢酸
エチルまたは酢酸エチルとｎ−ブタノールの混合
溶媒等で抽出し、抽出物をシリカゲルカラムクロ
マトグラフイーに供する等の処理によりそれぞれ
単離・精製することができる。
化合物（Ia）をラクトン化し化合物（Ib）とす
るには、例えば、化合物（Ia）をピリジン中で無
水酢酸と処理する方法がある。このときの反応温
度は室温付近が適当であり、無水酢酸は化合物
（Ia）に対して大過剰用いる。生成した化合物
（Ib）は反応液に水を添加して析出させる方法な
どにより単離することができる。
本発明の化合物は常法により塩の形に導いて用
いることもできる。
次に参考例および実施例をあげて説明する。
The present invention is based on the general formula (In the formula, R 1 and R 2 each mean a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an acyloxyl group.)
This invention relates to a glycyrrhetinic acid derivative or its lactone compound represented by: Glycyrrhetinic acid and its derivatives are known to have pharmacological effects such as antiallergic, antiinflammatory, and antiulcer effects. The present inventors focused on the conversion of compounds by microorganisms and further combined chemical methods to produce a novel glycyrrhetinic acid derivative, thereby completing the present invention. These new derivatives are expected to have the pharmacological effects described above, as well as ADP using platelet-rich plasma prepared from rabbit blood.
It exhibits an inhibitory effect on induced agglutination reactions, and is expected to be used as a pharmaceutical. The method for producing the compound of the present invention is illustrated by the following reaction formula. (In the formula, R 1 and R 2 each represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an acyloxyl group.) That is, glycyrrhetinic acid or its hydroxylated product at the 22-position ( ) is added to a microorganism belonging to the genus Chainia, such as Chainia antibiotica ) When the cultured cells of IFO12246 are used as a catalyst to react under aerobic conditions in a phosphate buffer, oxidative cleavage of the A ring and hydroxylation reaction at the 7-position occur to produce compound (Ia). This bacterium changes its catalytic ability by changing the culture conditions, for example, using medium A shown below,
When cultured in deep water at 28° C. (for example, shaking culture in a Sakaguchi flask or aerated stirring culture), the ability to simultaneously carry out the oxidative cleavage reaction of the A ring and the hydroxylation reaction at the 7-position in compound () appears. In addition, when cultured deep at 28℃ using medium B, A
The oxidative ring cleavage reaction appears strongly. Therefore, by skillfully utilizing this property, compounds with various combinations of R 1 and R 2 can be obtained. The generated compound (Ia) can be extracted from the reaction solution with, for example, ethyl acetate or a mixed solvent of ethyl acetate and n-butanol, and the extract can be isolated and purified by treatments such as subjecting it to silica gel column chromatography. can. To lactonize compound (Ia) into compound (Ib), for example, there is a method of treating compound (Ia) with acetic anhydride in pyridine. The reaction temperature at this time is suitably around room temperature, and acetic anhydride is used in large excess relative to compound (Ia). The generated compound (Ib) can be isolated by adding water to the reaction solution and causing precipitation. The compound of the present invention can also be used in the form of a salt by a conventional method. Next, reference examples and examples will be given and explained.
【表】
参考例
原料として用いるグリチルレチン酸の22位ヒド
ロキシル化体はグリチルレチン酸を基質としてそ
の22位を水酸化する能力を有する微生物を用いれ
ば有利に調製できる。例えば、本発明者らが東京
都下で採取した土壌から分離した一菌株がこの目
的にかなつた。この菌株は分類学的研究の結果形
態的特徴として基生菌糸は断裂せず、空中菌糸は
螺旋状の胞子連鎖形態を呈し、胞子の表面構造は
平滑であることが、また細胞壁組成は型である
ことが判明し、ストレプトミセス属に属する一菌
種であると同定し、ストレプトミセス エスピー
Ｇ−20（Streptomyces sp.G−20）と呼称した。
本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第7627号（FERM Ｐ−7627）として寄託
されている。
次に本菌による化合物（、R2＝OH）の具体
的な調製法を以下に示す。
培地A100mlを坂口フラスコ（500ml容）に注入
し、減菌後ストレプトミセス エスピーＧ−20を
その斜面培養から接種し、28℃で４日間振盪培養
して種培養液とした。
培地C4.0を容量6.0のジヤーフアーメンタ
ーに注入し滅菌後上記の種培養液80mlを接種し、
28℃で３日間通気撹拌培養した。培養液を遠心分
離して菌体を集め、この菌体にPH7.0の0.1Mリン
酸緩衝液を加え全体容量を3.0とした。本液に
界面活性剤ツイーン80を6.0mlとグリチルレチン
酸を1.50ｇ添加し、充分撹拌した後100mlずつ30
本の坂口フラスコ（500ml容）に分注し、28℃で
93時間振盪反応した。終了後反応液を一括して回
収し、PHを4.0〜4.5に調整して、反応生成物を酢
酸エチル3.0で抽出した。抽出液は充分水洗し
た後減圧濃縮し濃縮物1.4ｇを得た。
これをシリカゲルカラムクロマトグラフイーに
かけ（展開溶媒、クロロホルム／メタノール／酢
酸＝20／１／１）、反応生成物の精製を行ない、
オレアン−12−エン−11−オキソ−3β、22α−ジ
ヒドロキシ−30−オイツク酸（、R2＝OH）を
無色粉末として0.96ｇ得た。
実施例 １
培地Ａを100mlずつ坂口フラスコ（500ml容）に
分注し、減菌した後チヤイニア アンチビオチカ
IFO12246を斜面培養から接種し、28℃で４日間
振盪培養して種培養液とした。
培地B5.5を坂口フラスコ55本に100mlずつ分
注し、滅菌した後それぞれに上記種培養液を2.0
mlずつ接種した。接種後28℃で３日間振盪培養
し、培養液を遠心分離して菌体を集めた。
この菌体にPH７、５の0.1Mリン酸緩衝液を加
えて全体容量を4.0とした。本液にツイーン80
を8.0mlとグリチルレチン酸を2.00ｇ添加し、充
分撹拌した後100mlずつ40本の坂口フラスコに分
注し、28℃で20時間振盪した。終了後反応液を一
括して回収しPHを4.0〜4.5に調整し、反応生成物
を酢酸エチル3.0で抽出した。抽出液は充分水
洗した後減圧濃縮し、濃縮物1.8ｇを得た。
これをシリカゲルカラムクロマトグラフイーに
かけ（展開溶媒、ベンゼン／酢酸エチル／酢酸＝
10／10／１）、反応生成物の精製を行ない、更に
メタノールと水から再結晶することにより３，４
−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−４−ヒ
ドロキシ−３，30−ジオイツク酸（Ia、R1＝R2
＝Ｈ）を無色の結晶性粉末として1.14ｇ得た。こ
の物質の物性は次の通りである。
(1) 元素分析値
実測値（％） C71.58、H9.41
計算値（％） C71.68、H9.22
(2) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）503（M+＋
１）
(3) 分子式 C30H46O6
(4) 1Hnmrスペクトル（アセトン−d6、200M
Hz）δppm（TMS）
0.84、1.18、1.19、1.28、1.31、1.44、1.48
（各々3H、ｓ）、5.56（1H、ｓ、12位Ｈ）
(5) 13Cnmrスペクトル（CDCl3）δppm（TMS）
180.6（Ｓ、C3位）、75.9（Ｓ、C4位）、128.8
（ｄ、C12位）、168.3（Ｓ、C13位）、182.3（Ｓ、
C30位）
(6) 融点 289〜304℃（分解）
実施例 ２
培地A6.0を坂口フラスコ60本に100mlずつ分
注し、滅菌した後それぞれに実施例１と同様にし
て調製したチヤイニア アンチビオチカ
IFO12246の種培養液を2.0mlずつ接種した。接種
後28℃で１日間振盪培養し、培養液を遠心分離し
て菌体を集めた。
この菌体にPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液を加えて
全体容量を6.0とした。本液にグリチルレチン
酸を6.00ｇ添加し、充分撹拌した後100mlずつ60
本の坂口フラスコに分注し、28℃で24時間振盪し
た。終了後反応液を一括して回収し、PHを4.0〜
4.5に調整し、反応生成物を酢酸エチルとｎ−ブ
タノールの比が４対１の混合溶媒6.0で抽出し
た。抽出液は充分水洗した後減圧濃縮し、濃縮物
5.9ｇを得た。
これをシリカゲルカラムクロマトグラフイーに
かけ（展開溶媒、ベンゼン／酢酸エチル／酢酸＝
８／12／１）、反応生成物の分離を行ない、更に
エタノールと水から再結晶することにより３，４
−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−４−ヒ
ドロキシ−３，30−ジオイツク酸（Ia、R1＝R2
＝Ｈ）を無色結晶性粉末として0.38ｇおよび３，
４−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−４，
7β−ジヒドロキシ−３，30−ジオイツク酸（Ia、
R1＝OH、R2＝Ｈ）を無色板状晶として3.44ｇ得
た。後者の物性は次の通りである。
(1) 元素分析（C30H46O7・1/4H2Oとして）
実測値（％） Ｃ 68.75、Ｈ 8.91
計算値（％） Ｃ 68.87、Ｈ 8.96
(2) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）519（M+＋
１）
(3) 分子式 C30H46O7
(4) 1Hnmrスペクトル（アセトン−d6、200M
Hz）δppm（TMS）
0.85、1.18、1.20、1.28、1.31、1.44、1.54
（各々3H、Ｓ）、4.08（1H、dd、Ｊ＝9.5、4.6
Hz、７位Ｈ）、5.62（1H、Ｓ、12位Ｈ）
(5) 13Cnmrスペクトル（メタノール−d4）δppm
（TMS）
178.6（Ｓ、C3位）、75.5（Ｓ、C4位）、72.4（ｄ、
C7位）、129.5（ｄ、C12位）、171.2（Ｓ、C13
位）、180.3（Ｓ、C30位）
(6) 融点 296〜310℃（分解）
実施例 ３
実施例２と全く同様の培養操作により培地
A1.5からチヤイニア アンチビオチカ
IFO12246の菌体を調製した。この菌体にPH7.0の
0.1Mリン酸緩衝液を加え全体容量を1.0とし
た。本液にツイーン80を2.0mlおよび参考例で得
たオレアン−12−エン−11−オキソ−3β、22α−
ジヒドロキシ−30−オイツク酸500mgを添加し、
充分撹拌した後100mlずつ10本の坂口フラスコ
（500ml容）に分注し、28℃で20時間振盪した。終
了後反応液を一括して回収し、PHを4.0〜4.5に調
整し、反応生成物を酢酸エチル800mlで２回、更
にｎ−ブタノール400mlで１回抽出した。抽出液
は一括して充分水洗後滅圧濃縮し、濃縮物380mg
を得た。
これをシリカゲルカラムクロマトグラフイーに
かけ（展開溶液、クロロホルム／メタノール／酢
酸＝10／10／１）、反応生成物の分離を行ない、
粗製の３，４−セコオレアン−12−エン−11−オ
キソ−４，22α−ジヒドロキシ−３，30−ジオイ
ツク酸（Ia，R1＝Ｈ、R2＝OH）を96mgと純粋な
３，４−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−
４，7β，22α−トリヒドロキシ−３，30−ジオイ
ツク酸（Ia、R1＝R2＝OH）29mgを得た。前者に
ついては更にシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ーを行ない（展開溶媒、ベンゼン／酢酸エチル／
酢酸＝８／12／１）、次いでメタノールと水から
再結晶して無色針状結晶38mg得た。また後者につ
いてはジメチルスルホキシドと水から再結晶して
無色針状結晶18mgを得た。これらの化合物の物性
は次の通りである。
３，４−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−
４，22α−ジヒドロキシ−３，30−ジオイツク酸
（Ia、R1＝Ｈ、R2＝OH）の物性
(1) 元素分析値
実測値（％） C69.53、H8.79
計算値（％） C69.47、H8.94
(2) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）519（M+＋
１）
(3) 分子式 C30H46O7
(4) 1Hnmrスペクトル（アセトン−d6、200M
Hz）δppm（TMS）
0.97、1.18、1.22、1.28、1.32、1.44、1.50
（各々3H、Ｓ）、3.45（1H、dd、Ｊ＝12.1、
3.9Hz、22位Ｈ）、5.57（1H、Ｓ、12位Ｈ）
(5) 13Cnmrスペクトル（CDCl4／メタノール−
d4＝4/1）δppm（TMS）
178.3（Ｓ、C3位）、75.7（Ｓ、C4位）、129.2
（ｄ、C12位）、169.5（Ｓ、C13位）、75.8（ｄ、
C22位）、179.5（Ｓ、C30位）
(6) 融点＞300℃
３，４−セコオレアン−12−エン−11−オキソ−
４，7β，22α−トリヒドロキシ−３，30−ジオイ
ツク酸（Ia、R1＝R2＝OH）の物性
(1) 元素分析値
実測値（％） Ｃ 67.08、H8.74
計算値（％） Ｃ 67.39、H8.67
(2) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）535（M+＋
１）
(3) 分子式 C30H46O8
(4) 1Hnmrスペクトル（アセトン−d6、200M
Hz）δppm（TMS）
0.98、1.19、1.22、1.28、1.32、1.44、1.56
（各々3H、Ｓ）、3.44（1H、ｍ、22位Ｈ）、
4.11（1H、dd、Ｊ＝9.6、4.7Hz、７位Ｈ）、
5.61（1H、Ｓ、12位Ｈ）
(5) 13Cnmrスペクトル（メタノール−d4）δppm
（TMS）
178.7（Ｓ、C3位）、75.5（Ｓ、C4位）、72.4（ｄ、
C7位）、129.7（ｄ、C12位）、170.1（Ｓ、C13
位）、76.6（ｄ、C22位）、180.0（Ｓ、C30位）
(6) 融点 274〜279℃（分解）
実施例 ４
(イ) ３，４−セコオレアン−12−エン−11−オキ
ソ−４−ヒドロキシ−３，30−ジオイツク酸
（Ia、R1＝R2＝Ｈ）1.00ｇに乾燥ピリジン6.7ml
と無水酢酸6.7mlを添加し、28℃で１日間放置
した。反応終了後反応液に徐々に水を加えてゆ
くと無色の結晶性の沈殿が生成してくるのでこ
れを濾取し、充分水洗することにより３，４−
セコオレアン−12−エン−11−オキソ−４−ヒ
ドロキシ−３，30−ジオイツク酸３，４−ラク
トン（Ib、R1＝R2＝Ｈ）を無色結晶性粉末と
して0.95ｇ得た。この物質の物性は次の通りで
ある。
(1) 元素分析値
実測値（％） C73.75、Ｈ 9.35
計算値（％） C74.34、Ｈ 9.15
(2) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）484（M+）
(3) 分子式 C30H44O5
(4) 1Hnmrスペクトル（CDCl4、200MHz）
δppm（TMS）
0.84、1.17、1.24、1.40、1.40、1.46、1.49
（各々3H、Ｓ）5.78（1H、Ｓ、12位Ｈ）
(5) 13Cnmrスペクトル（CDCl3）δppm
（TMS）
175.6（Ｓ、C3位）、85.6（Ｓ、C4位）、128.7
（ｄ、C12位）、169.3（Ｓ、C13位）、181.5
（Ｓ、C30位）
(6) 融点 266〜270℃
(ロ) (イ)と同様の方法で３，４−セコオレアン−12
−エン−11−オキソ−４，7β−ジヒドロキシ
−３，30−ジオイツク酸（Ia、R1＝OH、R2＝
Ｈ）1.00ｇから３，４−セコオレアン−12−エ
ン−11−オキソ−４，7β−ジヒドロキシ−３，
30−ジオイツク酸３，４−ラクトン７−アセテ
ート（Ib、R1＝OCOCH3、R2＝Ｈ）を無色結
晶性粉末として1.02ｇ得た。物性は次の通りで
ある。 (1) 元素分析値
実測値（％） Ｃ 70.66、Ｈ 8.63
計算値（％） Ｃ 70.82、Ｈ 8.54
(2) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）542（M+）
(3) 分子式 C32H46O7
(4) 1Hnmrスペクトル（CDCl3、200MHz）
δppm（TMS）
0.86、1.23、1.29、1.42、1.43、1.46、1.50
（各々3H、Ｓ）、5.31（1H、dd、Ｊ＝10.5、
5.0Hz、７位Ｈ）、5.84（1H、Ｓ、12位Ｈ）、
2.06（3H、Ｓ、−OCOCH3）
(5) 13Cnmrスペクトル（CDCl3）δppm
（TMS）175.4（Ｓ、C3位）、84.8（Ｓ、C4位）、
73.2（ｄ、C7位）
(6) 融点 214〜220℃
(ハ) (イ)と同様の方法で３，４−セコオレアン−12
−エン−11−オキソ−４，22α−ジヒドロキシ
−３，30−ジオイツク酸（Ia、R1＝Ｈ、R2＝
OH）20mgから３，４−セコオレアン−12−エ
ン−11−オキソ−４，22α−ジヒドロキシ−
３，30−ジオイツク酸３，４−ラクトン22−ア
セテート（Ib、R1＝Ｈ、R2＝OCOCH3）を無
色粉末として20.6mg得た。これをクロロホル
ム、石油エーテルおよびアセトンの混合溶媒か
ら再結晶して無色結晶性粉末として19mg得た。
物性は次の通りである。
(1) 元素分析値
実測値（％） Ｃ 70.70、Ｈ 8.88
計算値（％） Ｃ 70.82、Ｈ 8.54
(2) FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）542（M+）
(3) 分子式 C32H46O7
(4) 1Hnmrスペクトル（CDCl3、200MHz）
δppm（TMS）
0.90、1.19、1.29、1.39、1.43、1.47、1.50
（各々3H、Ｓ）、4.86（1H、dd、Ｊ＝12.2、
4.0Hz、22位Ｈ）、5.86（1H、Ｓ、12位Ｈ）、
2.08（3H、Ｓ、−OCOCH3）
(5) 13Cnmrスペクトル（CDCl3）δppm
（TMS）175.6（Ｓ、C3位）、85.7（Ｓ、C4位）、
128.8（ｄ、C12位）、167.5（Ｓ、C13位）、77.3
（ｄ、C22位）、178.7（Ｓ、C30位）
(6) 融点 249〜252℃[Table] Reference Example The 22-hydroxylated product of glycyrrhetinic acid used as a raw material can be advantageously prepared by using a microorganism capable of hydroxylating the 22-position using glycyrrhetinic acid as a substrate. For example, one strain that the present inventors isolated from soil collected in Tokyo met this purpose. As a result of taxonomic research, the morphological characteristics of this strain are that the basal hyphae do not rupture, the aerial hyphae exhibit a spiral spore chain morphology, and the surface structure of the spores is smooth, and the cell wall composition is unique. It was identified that it was a species belonging to the genus Streptomyces, and it was named Streptomyces sp. G-20.
This strain has been deposited with the National Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as FERM P-7627. Next, a specific method for preparing the compound (R 2 =OH) using this bacterium is shown below. 100 ml of medium A was poured into a Sakaguchi flask (500 ml volume), and after sterilization, Streptomyces sp. Pour medium C4.0 into a jar fermentor with a capacity of 6.0, sterilize it, and inoculate it with 80 ml of the above seed culture solution.
Culture was carried out at 28°C for 3 days with aeration and agitation. The culture solution was centrifuged to collect bacterial cells, and 0.1M phosphate buffer with a pH of 7.0 was added to the bacterial cells to bring the total volume to 3.0. Add 6.0 ml of surfactant Tween 80 and 1.50 g of glycyrrhetinic acid to this solution, stir thoroughly, and then
Dispense into Sakaguchi flasks (500 ml) and heat at 28°C.
A shaking reaction was performed for 93 hours. After completion, the reaction solution was collected all at once, the pH was adjusted to 4.0 to 4.5, and the reaction product was extracted with ethyl acetate 3.0. The extract was thoroughly washed with water and then concentrated under reduced pressure to obtain 1.4 g of a concentrate. This was subjected to silica gel column chromatography (developing solvent: chloroform/methanol/acetic acid = 20/1/1) to purify the reaction product.
0.96 g of olean-12-ene-11-oxo-3β,22α-dihydroxy-30-oitsucic acid (R 2 =OH) was obtained as a colorless powder. Example 1 Dispense 100 ml of medium A into Sakaguchi flasks (500 ml volume), sterilize them, and then use Chiainia antibiotica.
IFO12246 was inoculated from a slant culture and cultured with shaking at 28°C for 4 days to prepare a seed culture. Dispense 100ml of medium B5.5 into 55 Sakaguchi flasks, sterilize them, and add 2.0ml of the above seed culture solution to each.
ml was inoculated. After inoculation, the cells were cultured with shaking at 28°C for 3 days, and the culture solution was centrifuged to collect the bacterial cells. A 0.1M phosphate buffer solution with a pH of 7.5 was added to the bacterial cells to bring the total volume to 4.0. Tween 80 in this liquid
and 2.00 g of glycyrrhetinic acid were added, stirred thoroughly, and then dispensed into 40 Sakaguchi flasks in 100 ml portions, followed by shaking at 28°C for 20 hours. After completion, the reaction solution was collected all at once, the pH was adjusted to 4.0 to 4.5, and the reaction product was extracted with ethyl acetate 3.0. The extract was thoroughly washed with water and then concentrated under reduced pressure to obtain 1.8 g of a concentrate. This was subjected to silica gel column chromatography (developing solvent, benzene/ethyl acetate/acetic acid =
10/10/1), the reaction product was purified and further recrystallized from methanol and water to obtain 3,4
-Sequoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30-dioic acid (Ia, R 1 = R 2
=H) was obtained as a colorless crystalline powder in an amount of 1.14 g. The physical properties of this substance are as follows. (1) Elemental analysis value Actual value (%) C71.58, H9.41 Calculated value (%) C71.68, H9.22 (2) FD-Mass spectrum (m/z) 503 (M + +
1) (3) Molecular formula C 30 H 46 O 6 (4) 1 Hnmr spectrum (acetone-d 6 , 200M
Hz) δppm (TMS) 0.84, 1.18, 1.19, 1.28, 1.31, 1.44, 1.48
(3H, s, respectively), 5.56 (1H, s, H at 12th position) (5) 13 Cnmr spectrum (CDCl 3 ) δppm (TMS) 180.6 (S, C 3rd position), 75.9 (S, C 4th position), 128.8
(d, C 12th place), 168.3 (S, C 13th place), 182.3 (S,
C 30th place) (6) Melting point 289-304℃ (decomposed) Example 2 Dispense 100 ml of medium A6.0 into 60 Sakaguchi flasks, sterilize them, and then prepare Chiainia antibiotica in the same manner as in Example 1.
A 2.0 ml portion of IFO12246 seed culture was inoculated. After inoculation, the cells were cultured with shaking at 28°C for 1 day, and the culture solution was centrifuged to collect the bacterial cells. A 0.1M phosphate buffer solution with a pH of 7.0 was added to the cells to bring the total volume to 6.0. Add 6.00g of glycyrrhetinic acid to this solution, stir thoroughly, and then add 6.00g of glycyrrhetinic acid to the solution.
The mixture was dispensed into Sakaguchi flasks and shaken at 28°C for 24 hours. After completion, collect the reaction solution all at once and adjust the pH to 4.0~
4.5, and the reaction product was extracted with a mixed solvent of ethyl acetate and n-butanol in a ratio of 4:1 (6.0). After washing the extract thoroughly with water, it is concentrated under reduced pressure to obtain a concentrate.
5.9g was obtained. This was subjected to silica gel column chromatography (developing solvent, benzene/ethyl acetate/acetic acid =
8/12/1), the reaction product was separated and further recrystallized from ethanol and water to obtain 3,4
-Sequoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30-dioic acid (Ia, R 1 = R 2
=H) as a colorless crystalline powder, 0.38g and 3,
4-Secoolean-12-ene-11-oxo-4,
7β-dihydroxy-3,30-dioic acid (Ia,
3.44 g of R 1 =OH, R 2 =H) was obtained as colorless plate crystals. The physical properties of the latter are as follows. (1) Elemental analysis (as C 30 H 46 O 7・1/4H 2 O) Actual value (%) C 68.75, H 8.91 Calculated value (%) C 68.87, H 8.96 (2) FD-Mass spectrum (m/ z) 519 (M + +
1) (3) Molecular formula C 30 H 46 O 7 (4) 1 Hnmr spectrum (acetone-d 6 , 200M
Hz) δppm (TMS) 0.85, 1.18, 1.20, 1.28, 1.31, 1.44, 1.54
(3H, S, respectively), 4.08 (1H, dd, J = 9.5, 4.6
Hz, H at 7th position), 5.62 (1H, S, H at 12th position) (5) 13 Cnmr spectrum (methanol-d 4 ) δppm
(TMS) 178.6 (S, C 3rd place), 75.5 (S, C 4th place), 72.4 (d,
C 7th place), 129.5 (d, C 12th place), 171.2 (S, C 13th place)
(30th position), 180.3 (S, C 30th position) (6) Melting point 296-310°C (decomposition) Example 3 Culture medium was prepared in exactly the same manner as in Example 2.
A1.5 to Chiainia Antibiotica
IFO12246 cells were prepared. This bacterial body has a pH of 7.0.
0.1M phosphate buffer was added to bring the total volume to 1.0. Add 2.0 ml of Tween 80 to this solution and olean-12-ene-11-oxo-3β, 22α- obtained in the reference example.
Add 500 mg of dihydroxy-30-oitsucic acid,
After thorough stirring, 100 ml of the mixture was dispensed into 10 Sakaguchi flasks (500 ml) and shaken at 28°C for 20 hours. After completion, the reaction solution was collected all at once, the pH was adjusted to 4.0 to 4.5, and the reaction product was extracted twice with 800 ml of ethyl acetate and once with 400 ml of n-butanol. The extract was thoroughly washed with water and concentrated under reduced pressure to obtain 380 mg of concentrate.
I got it. This was subjected to silica gel column chromatography (developing solution, chloroform/methanol/acetic acid = 10/10/1) to separate the reaction products.
96 mg of crude 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4,22α-dihydroxy-3,30-dioic acid (Ia, R 1 =H, R 2 =OH) and pure 3,4- Sequoolean-12-ene-11-oxo-
29 mg of 4,7β,22α-trihydroxy-3,30-dioic acid (Ia, R 1 =R 2 =OH) was obtained. For the former, we further performed silica gel column chromatography (developing solvent: benzene/ethyl acetate/
Acetic acid = 8/12/1), then recrystallized from methanol and water to obtain 38 mg of colorless needle crystals. The latter was recrystallized from dimethyl sulfoxide and water to obtain 18 mg of colorless needle crystals. The physical properties of these compounds are as follows. 3,4-Secoolean-12-ene-11-oxo-
Physical properties of 4,22α-dihydroxy-3,30-diosuccinic acid (Ia, R 1 = H, R 2 = OH) (1) Elemental analysis value Actual value (%) C69.53, H8.79 Calculated value (%) C69.47, H8.94 (2) FD-Mass spectrum (m/z) 519 (M + +
1) (3) Molecular formula C 30 H 46 O 7 (4) 1 Hnmr spectrum (acetone-d 6 , 200M
Hz) δppm (TMS) 0.97, 1.18, 1.22, 1.28, 1.32, 1.44, 1.50
(3H, S, respectively), 3.45 (1H, dd, J=12.1,
3.9Hz, 22nd H), 5.57 (1H, S, 12th H) (5) 13 Cnmr spectrum (CDCl 4 / methanol -
d 4 = 4/1) δppm (TMS) 178.3 (S, C 3rd place), 75.7 (S, C 4th place), 129.2
(d, C 12th place), 169.5 (S, C 13th place), 75.8 (d,
C 22nd position), 179.5 (S, C 30th position) (6) Melting point > 300℃ 3,4-Secoolean-12-ene-11-oxo-
Physical properties of 4,7β,22α-trihydroxy-3,30-diosuccinic acid (Ia, R 1 = R 2 = OH) (1) Elemental analysis value Actual value (%) C 67.08, H8.74 Calculated value (%) C 67.39, H8.67 (2) FD-Mass spectrum (m/z) 535 (M + +
1) (3) Molecular formula C 30 H 46 O 8 (4) 1 Hnmr spectrum (acetone-d 6 , 200M
Hz) δppm (TMS) 0.98, 1.19, 1.22, 1.28, 1.32, 1.44, 1.56
(3H, S respectively), 3.44 (1H, m, 22nd H),
4.11 (1H, dd, J=9.6, 4.7Hz, 7th H),
5.61 (1H, S, H at 12th position) (5) 13 Cnmr spectrum (methanol-d 4 ) δppm
(TMS) 178.7 (S, C 3rd place), 75.5 (S, C 4th place), 72.4 (d,
C 7th place), 129.7 (d, C 12th place), 170.1 (S, C 13th place)
), 76.6 (d, C 22nd position), 180.0 (S, C 30th position) (6) Melting point 274-279℃ (decomposition) Example 4 (a) 3,4-Secoolean-12-ene-11-oxo 1.00 g of -4-hydroxy-3,30-diosuccinic acid (Ia, R 1 = R 2 = H) and 6.7 ml of dry pyridine
and 6.7 ml of acetic anhydride were added thereto and allowed to stand at 28°C for 1 day. When water is gradually added to the reaction solution after the reaction is completed, a colorless crystalline precipitate is formed, which is collected by filtration and washed thoroughly with water to obtain 3,4-
0.95 g of sequoolean-12-ene-11-oxo-4-hydroxy-3,30-dioic acid 3,4-lactone (Ib, R1 = R2 =H) was obtained as a colorless crystalline powder. The physical properties of this substance are as follows. (1) Elemental analysis value Actual value (%) C73.75, H 9.35 Calculated value (%) C74.34, H 9.15 (2) FD-Mass spectrum (m/z) 484 (M + ) (3) Molecular formula C 30 H 44 O 5 (4) 1 Hnmr spectrum (CDCl 4 , 200MHz)
δppm (TMS) 0.84, 1.17, 1.24, 1.40, 1.40, 1.46, 1.49
(3H, S, respectively) 5.78 (1H, S, H at 12th position) (5) 13 Cnmr spectrum (CDCl 3 ) δppm
(TMS) 175.6 (S, C 3rd place), 85.6 (S, C 4th place), 128.7
(d, C 12th place), 169.3 (S, C 13th place), 181.5
(S, C 30th position) (6) Melting point 266-270℃ (B) 3,4-Secooleane-12 in the same manner as (A)
-ene-11-oxo-4,7β-dihydroxy-3,30-dioic acid (Ia, R 1 =OH, R 2 =
H) 1.00g to 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4,7β-dihydroxy-3,
1.02 g of 30-dioic acid 3,4-lactone 7-acetate (Ib, R1 = OCOCH3 , R2 =H) was obtained as a colorless crystalline powder. The physical properties are as follows. (1) Elemental analysis value Actual value (%) C 70.66, H 8.63 Calculated value (%) C 70.82, H 8.54 (2) FD-Mass spectrum (m/z) 542 (M + ) (3) Molecular formula C 32 H 46 O 7 (4) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 200MHz)
δppm (TMS) 0.86, 1.23, 1.29, 1.42, 1.43, 1.46, 1.50
(3H, S, respectively), 5.31 (1H, dd, J=10.5,
5.0Hz, 7th H), 5.84 (1H, S, 12th H),
2.06 (3H, S, -OCOCH 3 ) (5) 13 Cnmr spectrum (CDCl 3 ) δppm
(TMS) 175.4 (S, C 3rd place), 84.8 (S, C 4th place),
73.2 (d, C 7th position) (6) Melting point 214-220℃ (c) 3,4-secooleane-12 in the same manner as (a)
-ene-11-oxo-4,22α-dihydroxy-3,30-dioic acid (Ia, R 1 = H, R 2 =
OH) 20 mg to 3,4-secoolean-12-ene-11-oxo-4,22α-dihydroxy-
20.6 mg of 3,30-diotuccinic acid 3,4-lactone 22-acetate (Ib, R1 =H, R2 = OCOCH3 ) was obtained as a colorless powder. This was recrystallized from a mixed solvent of chloroform, petroleum ether, and acetone to obtain 19 mg of colorless crystalline powder.
The physical properties are as follows. (1) Elemental analysis value Actual value (%) C 70.70, H 8.88 Calculated value (%) C 70.82, H 8.54 (2) FD-Mass spectrum (m/z) 542 (M + ) (3) Molecular formula C 32 H 46 O 7 (4) 1 Hnmr spectrum (CDCl 3 , 200MHz)
δppm (TMS) 0.90, 1.19, 1.29, 1.39, 1.43, 1.47, 1.50
(3H, S, respectively), 4.86 (1H, dd, J=12.2,
4.0Hz, 22nd H), 5.86 (1H, S, 12th H),
2.08 (3H, S, -OCOCH 3 ) (5) 13 Cnmr spectrum (CDCl 3 ) δppm
(TMS) 175.6 (S, C 3rd place), 85.7 (S, C 4th place),
128.8 (d, C 12th place), 167.5 (S, C 13th place), 77.3
(d, C 22nd position), 178.7 (S, C 30th position) (6) Melting point 249-252℃