JPH0363563A - 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、炭酸根を含有したヒドロキシアパタイトから
なる液体クロマトグラフィー用充填材、及びこれを充填
してなる液体クロマトグラフィー用カラムに関するもの
である。

〔発明の背景〕

アパタイトとは広義には、下記（１）式の組成式で表わ
される化合物をいい、この式でＭはＣａ％Ｐｂ。

Ｂａ、　Ｓｒ５Ｍｇ、　Ｎ＋、　Ｎａ、　Ｋ、　Ｆｅ、
　　Ａｎその他の金属原子を、ＺＬはＰＯ４、Ａｓ０４
、ＶＯ４％　ＳＯａ　、５ｉＯａ、ＣＯｌその他の酸根
を、ＹはＦ、ＯＨ，ＣＩ！、、Ｂｒ、　０、　Ｃｏ、＋
その他の陰イオン性原子（団）を示す広範囲な化合物群
の総称である。

Ｍ”＊−Ｍ”−ＣＺＯ”−ａ＞ｈＹ−ｚ　−−−−（１
）（ｎ＋ｍ＝１０、ｎ−０及び−〇の場合も含む）本発
明においては、上記（１）式においてＭが実質的（すな
わち、不純物レベルの他の原子、原子団が入ってもよい
）にＣａであり、ＺＯ４が実質的にＰＯ４であり、Ｙが
実質的に０１１である化合物をヒドロキシアパタイトと
呼ぶ。そして、ここでＺ０４または／及びＹの一部がＣ
０ｆｆで置換されたものを炭酸含有ヒドロキシアパタイ
トと呼ぶ。

ヒドロキシアパタイト（以下ＨＡｐと略記する）は、天
然歯や天然骨と同じ化学Ｍ或を持つ無機化合物であると
ころから、生体物質との親和性に優れているという特性
を有し、蛋白質、核酸、酵素等の生体高分子物質の分離
・精製を目的とした液体クロマトグラフィー（以下、Ｌ
Ｃと略記する）用カラムの充填材として好適に使用され
ている。

さらに、近年高速液体クロマトグラフィー（以下１１Ｐ
Ｌｃと略記する）の普及により少量の試料を短時間で処
理すること（微量分析）、あるいは−度に大量の試料を
しかも短時間に処理すること（大量分取）が可能となり
、１ｌＡｐのこの分野への応用は今後益々広がることが
予想される。従って、ＨＰＬＣを含むＬＣ用のカラム充
填材として、さらに高性能でかつ使用しゃすい１ｌＡｐ
の開発が望まれている。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］従来の
ＬＣ用のカラム充填材に使用される１ＩＡｐは、Ａ４１
ｓｅｌｊｕｓ、ｅｔ、ａｌ、＋により発表された、水溶
性のカルシウム塩と水溶性の燐酸塩を反応させる湿式合
成法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、
６５．１３２（１９５６））をもとに適宜改良を加えた
方法で製造されたものが一般的であった。これらの方法
で得られた１（Ａｐは従来、ＬＣ用カラム充填材として
の性能がすぐれているといわれているものであって、次
のような物性を示すのが通常である。

Ｃａ／Ｐ比　　　１．４〜１．５５ Ｘ線回折　　回折ピークが弱い。

ＣＯ３含有量　０．１重量％未満 しかしながらＨＡｐを製造する上記従来の方法は、原料
の調整、ｐＨ管理、撹拌状態、温度管理等の反応および
その後の処理等に非常に煩雑な操作を必要とする。

しかも、この方法では、品質的に再現性良く、ＨＡｐを
製造することは大変困難である。更には、この方法を工
業的にスケールアップすると、小型スケールと比較して
その再現性が著しく乏しくなり、工業的実施には不向き
な方法である。その上、得られた前記物性のＨＡｐは、
燐酸ナトリウム緩衝液中で冷所保存しなければ、その物
性を維持できないという問題もある。

以上述べたようにＬＣ用カラム充填材として生体高分子
の分離・精製に優れた性能を発揮するＨＡｐを、従来公
知の方法で再現性よく製造することが困難であり、この
点からＲＡＰは高価なものとなっている。そのため、Ｈ
Ａｐは生体高分子の分離・精製のためのＬＣ用カラム充
填材として他の充填材と比較して使用頻度が極度に少な
く、限られた分野で使用されているのが実情である。

また、従来使用されているＨＡｐは、耐圧性及び耐久性
において必ずしも十分でなく、特にＨＰＬＣでの長期に
わたる操り返し使用が制限されていた。

本発明は、上述の従来技術における問題を解決するため
になされたものである。

本発明の目的は、品質的に安定した製造が可能であり、
製造コストの低減化が可能なＨＡｐを提供することにあ
る。

本発明の他の目的は、ＨＰＬＣを含めたＬＣ用のカラム
充填材として、特に生体物質の分離能が向上したＨＡｐ
を提供することにある。

本発明の他の目的は、耐圧および耐久性に優れたＨＡｐ
からなるＩＩＰＬＣを含めたＬＣ用のカラム充填材を提
供することにある。

本発明の他の目的は、耐久性および生体物質の分離能に
優れたＨＰＬＣを含むＬＣ用に好適なカラムを提供する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らはこれら種々の問題を解決するために鋭意検
討を重ねた結果、ｌ１Ａｐ中に炭酸根を含有させること
で、再現性よ＜　ＨＡｐを製造することができ、かつ、
この炭酸根をＣＯｌとして０．５重量％以上含有したｎ
ａｐ　（以下、炭酸根を含有したＨＡｐを炭酸含有ヒド
ロキシアパタイトと称し、Ｃ０Ａｐと略記する）は、生
体高分子の分離能力がＨＡｐより更に優れているため、
上記の目的がすべて遠戚されることを見出し、本発明を
完成するに至ったものである。

すなわち本発明の第１は、炭酸根をＣＯ３として０．５
重量％以上含有したヒドロキシアパタイトからなること
を特徴とする液体クロマトグラフィー用充填材であり、
第２は炭酸根をＣＯ３として０．５重量％以上含有した
ヒドロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする
液体クロマトグラフィー用カラムの発明である。

〔発明の詳細な開示〕

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のＬＣ用カラムの充填材は、炭酸根をＣＯ。

として０．５重量％以上含有したＣＯ＾ｐからなる。こ
の充填材をカラムに充填することにより、本発明のＬＣ
用カラムを得ることができる。

なお、本発明の充填材およびカラムの用途としての”Ｌ
Ｃ”は”ＩＩＰＬ（：′を含む。

従来のＨＡｐからなる充填材を用いたＬＣ用カラムは先
に述べたように、分離能にやや問題があると共に、耐圧
、耐久性に劣るという問題があった。

また、ＨＡｐが品質的に再現性良く製造できないという
重大な問題もあった。さらに、従来のＨＡｐは耐圧性お
よび耐久性に劣るので、ＨＰＬＣでの繰り返し使用での
良好な耐久性が得られなかった。

これに対し本発明のＣ０Ａ９からなる充填材は、品質的
に再現性良く製造可能であり、しかも生体物質の分離能
が高い。

さらに、Ｃ０Ａｐ結晶の物理的強度が高いので、本発明
の充填材は、耐圧性および耐久性に優れる。

その結果、本発明の充填材をカラムに充填する際の充填
圧として、少なくとも５００に、／ｃｄまでの高圧が採
用できる。

さらに、本発明の充填材を充填したカラムは、１（ＰＬ
Ｏにおける繰り返し使用の耐久性に優れる。

また、従来のＨＡｐは平板状の結晶形状をしているため
、結晶を配向させながらＨＰＬＣ用カラムに充填すると
いう煩雑な操作を必要としたが、本発明で用いるＣ０Ａ
ｐの場合は、そのような配慮は特に必要がないので簡単
にカラム充填が行なえるという利点がある。さらに圧力
の調整により流速制御ができるので展開液も従来品に比
べ少量で済むという利点もある。さらにまた、本発明の
カラムは分析を目的としたＨＰＬＣ用カラム以外に、分
取を目的とした分取用ＨＰＬＣ用カラムとしても好適に
使用でき、必要とされる試料を短時間のうちに純度よく
分離・精製することが可能であるのである。

また、ＨＡｐを充填した従来のカラムを使用して分取を
行う場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸塩
の水溶液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩
を必要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作
自体は短時間であっても、後処理を含めると決して短時
間とはいえなかった。しかし、本発明のＣ０Ａｐからな
る充填材に対しては、溶離液としてこれまでアパタイト
クロマトには不向きと考えられていた、揮発性の炭酸塩
系溶離液が使用可能である。従って、カラムから溶出し
た精製フラクションを直接凍結、乾燥させて目的物を高
純度品として回収するか、または、加温または／および
減圧操作により塩を短時間に揮発、除去し、つぎの工程
での操作に用いることができるので後処理の時間を大幅
に短縮できるという利点も有している。この点は特に核
酸を分離・精製する際に威力を発揮する。

即ち、核酸類としてたとえばプラスミドＤＮＡを分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしてこの操
作は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので
沈殿回収の前処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。

しかしながらここで例えば炭酸水素アンモニウムのよう
なアルコールに対する溶解度の大きな揮発性塩を使用す
れば、直接エタノール添加による沈殿析出が実施可能で
あり、合計の処理時間が大幅に軽減される。

ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
緩衝液を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時
間を必要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使
用可能であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大
幅に短時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離
液の使用はＣ０Ａｐの如く炭酸根を含有するアパタイト
を使用することでより効果的となる。

上述のように、本発明の炭酸根含有アパタイトからなる
ＬＣ用充填材およびこれを充填したＬＣ用カラムの利点
として従来不可とされていた炭酸根を含む溶離液を用い
ることができる点もあげられる。

すなわち、これまでの１ｌＡｐを充填したしＣ用カラム
に炭酸根を含む溶離液を通液するとカラムが閉塞し通液
が困難となる。これは炭酸根がアパタイトと反応を起こ
すためと考えられる。

一方、本発明の炭酸根含有アパタイトの場合はあらかじ
め炭酸根を含有しているために炭酸根を含む溶離液を通
液しても問題を生じないものと考えられる。

以上種々列記した通り、ＬＣ用およびＨＰＬＣ用カラム
の充填材にＣ０Ａｐを使用することにより種々の効果が
あり、本発明の効果は経済的に極めて大なるものがある
。

本発明のｔ、Ｃ用充填材は、炭酸根をＣｏｘとして０．
５重量％以上含有したＣ０Ａｐからなる。

本発明における炭酸根含有量とは日本化成肥料協会技術
専門委員会（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｃｏｍ１ｔｔｅｅ　
ＪａｐａｎＰｈａｓｐｈａｔｅ　＆　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ
　Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒ−ｅ
ｒ’ｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）の定める燐鉱石分析
法に準じて測定した無水炭酸（Ｇｏ、）の測定値をＣＯ
ｚ含有量に換算したものとする。

本発明で用いられるＣ０Ａｐの製造方法には特に制限は
なく、従来公知の方法が利用できる。例えば第二燐酸カ
ルシウムと炭酸カルシウムをアンモニア水中で反応させ
る方法（特公昭５Ｂ−３０２４４号公報の方法）や、第
二燐酸カルシウム２水塩と炭酸カルシウムとを水中で反
応させる方法（特開昭６０−５００９号公報の方法）、
本発明者らが先に提案した、有ｉ溶媒を含む反応媒体中
で燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウム
とを反応させる方法（特開昭５９−１０７９１２号公報
）など、いずれの方法でも得ることができる。

しかしながら、本発明に使用するＣ０Ａｐ中には、炭酸
根がＣｏｘとして０．５重量％以上の範囲で含有してい
るのが好ましい なお、アパタイトの製造技術の面からはＣ０３含有量と
して７．０重量％まで調節可能であるが５．０重量％を
越える場合はクロマトグラフィーの充填材としての分離
性能が低下して好ましくない。従って、本発明において
はｃｏＡｐは燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸
カルシウムとを、アンモニア水、水、有機溶媒の何れか
またはそれらの混合物の反応用媒体中で下記する如きモ
ル比で反応させて得ることができる。

すなわち、反応槽にアンモニア水、水、有機溶媒の単独
もしくはそれらの混合物を反応用媒体として仕込み、こ
れに燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウ
ムとを加えて、通常大気圧下にて反応用媒体を加熱し、
蒸発した反応用媒体は還流させる方法で反応させる。な
お、この際の燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸
カルシウムの割合はカルシウムと燐の原子比がＣａ／Ｐ
として１．３０〜１．９０好ましくは１．４５〜１．７
５の範囲で、また、炭酸根と燐の割合はｃｏ３／ｐｏ、
としてｏ、ｏｉｓ〜１．９０の範囲で実施される。

反応時間は、媒体がアンモニア水または水の場合は概ね
５〜８時間必要であり、反応用媒体が有機溶媒を含有す
る場合は約２時間もあれば十分である。

加熱終了後は生成したＣ０Ａｐが析出しスラリー状とな
っているので、これを通常公知の方法で濾別・分離し、
乾燥すれば良い。

Ｃ０Ａｐの原子比（Ｃａ／Ｐ）は、理論的には５／３で
あるのでカルシウムと燐との反応時における原子比も５
／３！＝ｉ１．６７が最適であるはずであるが、実際の
反応に際しては、原子比が上記の範囲内にあれば好適に
ｃｏｉｐを合成することができる。

上記反応の原料として使用する燐酸または／及びそのカ
ルシウム塩としては、１１３ＰＯ４、ＨａＰ山、！ＩＰ
Ｏ，、Ｐ２Ｏ３、Ｃａ（ＨｔＰＯ４）ｚ　・ＨｚＯ５Ｃ
ａ（ＰＯｓ）ｚ、ＣａＨＰＯｓ、ＣａＨＰＯａ　’　２
ＨｚＯ，ＣａｚＰｔＯ？、Ｃａｚ（ＰＯ４）ｔ　％Ｃａ
ｅＫｔＣＰＯａ）ｂ　　・５ＨｔＯ１等が使用可能であ
る。しかしながら、これらの化合物は本発明において使
用可能な原料の一部であって、これらに限定する必要は
ない、また、これらの化合物は特に高純度のものを使用
する必要はなく、通常重版の工業用のもので十分である
。今一つの原料である炭酸カルシウムも同様に、工業用
のもので十分である。

カルシウム源として、上記の如き燐酸のカルシウム塩の
外にＣａＯ、Ｃａ（０１１）ｚ　、ＣａＣｌ、Ｃａ（Ｎ
Ｏｓ）ｚ、（Ｃ１ｌ：＋Ｃ００）　ｚＣａ等のカルシウ
ムの酸化物、水酸化物及び無機酸並びに有機酸のカルシ
ウム塩を使用することも可能である。

また、炭酸源として、本発明ではカルシウム原子の補給
にもなるので炭酸カルシウムを使用するかに１ＣＯ３、
ＫＨＣ（ｈ　、ＮａｔＣＯ２、Ｎａ）ＩＣＯｓ、（ＮＨ
４）　ｔｃ（ｈ、ＮＨ４ＨＣＯｓ等の炭酸塩や炭酸ガス
を使用しても差支えない。

本発明においては、炭酸カルシウムと上記の如き燐酸ま
たは／及びそのカルシウム塩の一種類以上を適宜選択し
て、カルシウムと燐の原子比Ｃａ／Ｐが１．３０〜１．
９０、好ましくは１．４５〜１．７５となるように反応
槽に投入すればよい。また、上記炭酸カルシウムの投入
量を変化させることにより、生成するＣ０Ａｐ中に含有
する炭酸根の含有量を調節することが可能であり、この
方法により炭酸根をＣＯｌとして７．０重量％以下の範
囲で調節することができる。

本発明において、反応用媒体の使用量はその種類、反応
時の原料の種類、反応時の撹拌状態などによりそれぞれ
適性値が異なるが、いずれの条件においてもスラリー濃
度として５〜６０重量％重量上程る量が好ましい。

本発明において、ｃｏＡｐの製造の際に反応用媒体とし
てアンモニア水を使用する場合は、濃度が５〜２８重量
％のアンモニア水溶液を用いて、反応媒体のｐＨを７〜
１１の範囲で適宜調節して反応を行なう。

また反応用媒体として使用できる有機溶媒としては、例
エバベンゼン、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサ
ン、ヘプタン、オクタン、デカン、各種石油ナフサや工
業用ガソリン等の芳香族及び脂肪族炭化水素類Ｈ４５ｏ
−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール等のアルコ
ール類；トリエチルアミン、トリブチルアミン、エタノ
ールアミン等のアミン類；エチルエーテル、エチルブチ
ルエーテルや各種セルソルブ、カルピトール等のエーテ
ル類；メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等
のケトン類が挙げられる。しかしこれらは本発明におい
ては使用可能な有機溶媒の一例にすぎない。

かくして得られたｃｏＡｐは、液体クロマトグラフィー
用、特に高速液体クロマトグラフィー用充填として使用
した場合、生体高分子物質の分離・精製に、従来のＯｈ
を使用した場合よりも更に優れた性能を示す。

本発明において用いられるＣ０Ａｐの粒径については０
．５〜５０μｍの範囲のものを用いることが好ましい、
さらに好ましくは、２〜１５μｍのものが選択される。

本発明においては、このＣ０Ａｐをカラムに充填して液
体クロマトグラフィー用カラムとするが、Ｃ０Ａｐをカ
ラムに充填する方法としては、従来公知の湿式充填法（
スラリー法）等を使用できる。

すなわち、湿式充填法には平衡密度法、非平衡密度法、
高粘度法などがあるが、これらの中から充填材であるＣ
０Ａｐの粒径または／及び物理的強度を考慮し、適宜好
ましい充填法を選択すればよい。

Ｃ０ＡｐをＩＩＰＬｃ用カラムに充填するには、バッカ
ーと呼ばれる充填容器と高圧ポンプが必要である。

また、充填には充填用溶媒を用い、ｃｏＡｐはこの溶媒
の１〜２０重量％のスラリーとして上記パッカーに流し
込み、７０〜３５０ｋｇ／ｄの間の一定圧力で充填する
のが望ましい。

上記の充填用溶媒としてはテトラブロモエタン、テトラ
クロロエチレン、四塩化炭素、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピル
アルコール、水、アセトン、ジオキサン、クロロホルム
、テトラヒドロフラン、シクロヘキサノール、エチレン
グリコールなどが挙げられる。そして、これらの溶媒の
一種または二種以上を組み合わせればよい。

本発明の充填材を充填するカラムの材質、形状大きさは
その用途に応じて選択することができる。

すなわち、カラムの大きさについては、内径１開程度の
小型分析用から内径１００ｍｍ以上の分取用のサイズの
カラムに適用することができる。

例えば、ＨＰＬＣ用カラムの場合では内径３１有効長さ
３０問程度の分析用カラム、内径７．６ｍｍ有効長さ１
００ｍｒａ程度の分析および亀クロ分取用カラム、内径
５００ＩｌｌＩ＋有効長さ５００１１ＩＩ１１の大型分
取用カラムなどが例としてあげられる。

本発明の充填材はこれらの分析用小型カラムから分取用
大型カラムまでその分離特性のカラムのスケールに対す
る依存性が極めて少ない。

また、カラムの材質については通常液体クロマトグラフ
ィー用カラ、ムに使われる材質、例えば、ステンレスス
チール、ガラス、樹脂などの一般的な材質が使用できる
。

なお、本発明の充填材を）ＩＰＬＣ用のカラムに充填す
る場合には、充填密度を０．５ｇ／　ｃｄ以上とすると
、分離性能が更に向上するので好ましい、また、あまり
充填密度を上げるとカラムの通液抵抗が大きくなり好ま
しくないので充填密度の上限は１．１ｇ／　ｃｄ程度で
ある。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。尚
、以下において％は重量％を表す。

製造例１ 蒸留水２　ｊ２．　Ｃａ（ＯＨ）ｚ粉末７４ｇ及びＣａ
ＣＯ５粉末６８ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有
効容積３１のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しなが
ら更に濃度４０％のＨ２ＰＯ４水溶液２００　ｄを１５
分間で添加した後、加熱して沸騰温度（約９８°Ｃ）で
５時間反応させた。

反応終了後は生成物を冷却後、加圧濾過機で濾過・水洗
し、次いで１３０℃で１６時間乾燥して白色の粉末を８
３ｇ得た。

この粉末のＸ線回折図を第１図に示す。

第１図より明らかなようにＸ線回折図は回折角度２θ−
３１，７，３２，２，３２，８に主ピークを有し、Ａｓ
ＴＭカード９−４３２に記載のＣ０Ａｐの特性回折ピー
クと一致した。また赤外吸収スペクトルを第２図に示す
。第２図より明らかなように１４５０ｃ＋ａ−’、８７
０Ｃ１”付近にＣ−０の吸収ピークが観察された。Ｃａ
ｎ含有量はＥＤＴＡキレート滴定法により、Ｐ２Ｏ，含
有量は比色定量法により測定した。またこのＣ０Ａｐの
物性分析結果を第１表に示す。

製造例２ Ｃａ　（ＮＯｚ）　ｚ粉末８３．６ｇを溶解した水溶液
１１に濃度２８％のアンモニヤ水を加えてｐＨ１０に調
整した後、これを製造例１で使用したセパラブルフラス
コに仕込みよく撹拌した。

次いで、この水溶液に（ＮＨａ）ＪＰＯｎ粉末３９．６
ｇとＮＨＪＣＯｚ粉末１１．９ｇを溶解させた混合水溶
＄１１を５〜１０ｄ／■ｉｎの速度で徐々に添加した。

しかる後これを撹拌しながら加熱し、沸１ｌｌｌ温度（
約９８’Ｃ）で５時間反応させた。

反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色の粉末を３８ｇ得た。この粉末のＸ線回折図
を第３図に示す。

第３図より明らかなようにＸ線回折図の回折角度は第１
図と同じ主ピークを有し、ＣＯ＾ｐと特定される。また
赤外吸収スペクトルを第４図に示す。

第４図より明らかなように第２図と同様のＣ−０の吸収
ピークが観察された。またこのＣ０Ａ９の物性分析結果
を第１表に示す。

製造例３ Ｃａ（ＨｔＰＯｎ）ｚ　Ｈ１１，ｏ　７５．６ｇ　、　
ＣａＣＯ５７０，Ｏｇ−水１００ｇ及びｎ−へキサン３
５０ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有効容積１１
のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しながら昇温させ
還流温度（６３°Ｃ）以下で約２時間加熱し反応させた
のち、セパラブルフラスコ内の水分とれ一ヘキサンを蒸
発させ、留出したｎ−ヘキサンと水に相当する容量のれ
一ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作が進
行するに従ってセパラブルフラスコ内の温度が上昇し、
内湯が６８°Ｃを越えた時点で加熱を中止して、生成物
を製造例１と同様に濾過・乾燥して白色の粉末を得た。

この粉末について、製造例１と同様にＸ線回折及び赤外
吸収スペクトルによってＣＯ＾ｐであることを確認した
。

製造例４ ＣａＨＰＱ４８１．６ｇ、　ＣａＣＯ３４０，Ｏｇ　、
水２００ｇ及び濃度２８％のアンモニア水１０ｇを、製
造例３で使用したセパラブルフラスコに仕込みよく撹拌
した。しかる後、これを撹拌しながら昇温し、８０〜１
００″Ｃの温度で５時間反応させた。

反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色粉末状のＣ０ＡｐをＩ　Ｌ２ｇを得た。

このＣＯ＾ｐの物性分析結果を第１表に示す。

製造例５〜８ Ｃａ＜Ｈ＊ＰＯａ）ｔ−ＨｚＯ、ＣａｔｌＰＯ４・２Ｈ
１ＯＳＣａＨＰＯ４、（：ａＣＯ３の各粉末、水及び有
ｍ溶媒を第２表に示した条件でセパラブルフラスコに仕
込み、第２表に示した以外の条件については、実施例１
と同様な操作により白色粉末状のＣ０Ａｐを第１表に示
す量を得た。このＣ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示
す。

製造例９ 製造例２を５０倍にスケールアップしてその再現性を確
認した。即ち、Ｃａ　（Ｎ（ｈ）　ｚ粉末４．１８ｋｇ
を溶解した水溶液５０ｆに濃度２８％のアンモニヤ水を
加えてｐＨ１０に調整した後、これを撹拌機及び還流冷
却器を備えた有効容積５０１のステンレス製反応槽へ仕
込みよく撹拌した。

次いで、この水溶液に（Ｎｌｌｎ）ｚｌｌＰＯ４粉末１
．９８ｋｇとＮＨ，ＨＣＯ２粉末５９５ｇを溶解させた
混合水溶液５０１を２５０〜５００　ｍｌ／ｌ１ｉｎの
速度で徐々に添加した。以下、製造例２と同様の操作を
行い、白色粉末状のＣ０Ａｐを第１表に示す量得た。こ
のＣ０Ａｐの物性を第１表に示す。

比較製造例１ 従来法による方法（Ａ、ティセリウス（７１，７ｉｓｅ
ｌｉｕｓ）　）らの方法Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　＋　　６５＋　１３２（１９５６
）に従ってＨＡｐを以下のようにして台底した。

有効容積３１のフラスコへ濃度０．５ｍｏＩ／　Ｉ！の
ＣａＣｆｆ、水溶液１１と濃度０．５ｍｏｌ／　１．の
ＮａｚｌｌＰＯａ水溶液１１を毎分１２０滴の割合で同
時に滴下し、撹拌棒でゆっくりと撹拌しながら反応を行
なった。

滴下終了後、上澄み液をデカンテーションにより除去し
、残留した沈殿物を４回、各々２１の蒸留水で洗浄した
。次にこの沈殿物に２１の蒸留水を加え、更に濃度４０
％のＮａＯＨ水溶液を５０ｍ加えた後１時間沸騰した。

反応液を冷却後再びデカンテーションにより上澄液を除
き、再度２２の蒸留水で４回洗浄した。

次にｐＨ６，８で濃度０．０１ｍｏｌ／　ｊ！の燐酸ナ
トリウム緩衝液を２１加え沸騰する直前まで加熱した。

この操作を２度繰返すが、沸騰時間は各々５分と１５分
にした０次に、ｐｎ　６．８で濃度０．０１ｖａｏｌ／
　ｌの燐酸ナトリウム緩衝液を２乏加え２度沸騰（各１
５分間）させて第１表に示す量のＨＡｐ　３６ｇを得た
。

このようにして得られたＨＡｐはｐＨ６，８で濃度０．
００１　ｍｏｌ／ｆの燐酸ナトリウム緩衝液に入れ、冷
蔵庫にて保存した。

その結果第１表に示す物性のｔｔＡｐを得た。またこの
ＨＡｐの赤外吸収スペクトルを第５図に示すが、第５図
からも明らかなように、炭酸根＜Ｃ−Ｏ＞　の吸収スペ
クトル（１４５０ｃｍ−’、　８７０　ｃ「’付近）は
見られなかった。

実施例１〜２ 内径７．６　ｍ＋ｗ、長さ１００ｎ＋ｍのＩＩＰＬＣ用
金属カラムへ、製造例１及び２により得られたＣ０Ａｐ
を通常の方法により１０　ｋｇ／１ｉ−Ｇの圧力でそれ
ぞれ充填し、２種のカラムを作成した。充填終了後各カ
ラムをＨＰＬＣ装置に装着した０両カラムとも充填密度
は０．５２ｇ／ｃｄであった。

各カラムの分離能の評価を行なうためトリプトファン（
０，１６％）、牛血清アルブミン（４，６％）、リゾチ
ウム（２，０％）、及びチトクロムＣ（１，０％）を含
有する混合溶液を標準試料として用いて展開を行なった
。展開は、燐酸緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ６，８）と３５０
　ｍＭ（ｐＨ６，８）による直線濃度勾配法により行な
い、上記標準試料を１０．０μｌ注入した。また、流速
は１ｍ　ｊ！　／ｗｉｎになるように７．５ｋｇ／ｃｄ
の展開圧とした。

タンパク賞の検出は、２８０ｎ−の吸光度を測定した。

製造例１で得たｃｏＡｐを有するカラムで得られたクロ
マトグラムを第６図に、製造例２で得たｃ。

Ａｐを有するカラムで得られたクロマトグラムを第７図
に示す。第６図及び第７図からも明らかなように、主な
ピークが４カ所にあられれており、標準試料である４戒
分がきれいに分離されていることがわかった。各ピーク
は左側からトリプトファン、牛血清アルブミン、リゾチ
ウム、チトクロムＣに対応するピークであることをＶｆ
ｉｔｖした。尚、チトクロムＣには、２種の異性体があ
りピークが２つに分離している。

実施例３〜４ 製造例２及び９で得られたＣ０Ａｐを用い、以下に示す
カラムクロマトの操作子ｈ＠に従って牛血清アルブミン
の精製を行なった。即ち、ＣＯ＾ｐ各１０ｇを５００−
のビーカーにとり、イオン交換水（以下単に水と略記す
る）を静かに加え、ゆっくり撹拌した。　１０分間静置
後デカンテーションした。この操作を上澄みが清澄にな
るまで繰り返した。その後、直径Ｌｏａｍのクロマトグ
ラフィー用（ＬＣ用）のガラスカラムに懸濁したｃｏＡ
ｐを重層した（充填高さ１００〜１２０問）　、その後
ｃｏＡｐが充填されたガラスカラムの洗浄を水で行ない
、同時に流速の測定を行なった（約１０ｄ／ｈになるよ
うに充填する）。次に１％牛血清アルブミン水溶液１−
をカラムに通し、カラム内のＣ０Ａｐに牛血清アルブミ
ンを吸着させた。この時の操作はすべて室温で行なった
０次に吸着させた牛血清アルブミンをカラムから溶出す
るため、燐酸ナトリウム１１ｉ液（ｐ）１６．８）で展
開を行なった。溶出液は重量分画型のフラクシランコレ
クターで収集した（１試験管あたり２．５ｇの溶出液）
、得られた溶出液の吸光度は紫外部２８０ｎｍで測定し
た。製造例２で得られたｃｏＡｐを有するカラムでの結
果を第８図に、製造例９で得られたｃｏＡｐを有するカ
ラムでの結果を第９図に示す、第８図、第９図から本発
明のＣ（ｌＡｐは比較製造例のアパタイトを用いた場合
の第１１図に比べてシャープなりロマトパターンが得ら
れており優れた分解能を示し、吸脱着に優れているのが
わかる。

実施例５ 内径７．６■、長さ１００ｍｍのＨＰＬＣ用カラムに、
ｌＯｋｇ）ｅｔａ−Ｇの圧力で製造例３により得られた
Ｃ０Ａｐを、実施例１及び２と同様の方法で充填し、そ
れ以降の操作は、実施例１及び２と同様にして１（ＰＬ
Ｃ用カ用人ラム作を行なった。充填密度は０．５２ｇ／
ｃｄであった。各ピークの保持時間及び半値幅によりそ
の結果を第３表に示す、第３表かられかる通り実施例１
及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示した。

実施例６ 内径７．６間、長さ１００ｍｍのＩＩＰＬＣ用カラムニ
、８０ｋｇ／　ｃｄ−Ｇの圧力で製造例６により得られ
たＣ０Ａｐを充填し、それ以降の操作は、実施例１及び
２と同様にしてＨＰＬＣ用カラム操作を行なった。充填
密度は０．６０ｇ／ｃ＋４であった。その結果を実施例
５と同様に第３表に示す、第３表からもわかる通り、実
施例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示
した。

実施例７ 実施例６で使用したカラムに対し、標準試料の分離を３
００回行なった。３００回目に得られたクロマトグラム
の結果を実施例５と同様に第３表に示す、第３表からも
わかる通り、本発明のカラムは３００回の繰返し使用に
対しても良い分離能を示し、優れた耐久性をもっている
ことがわかる。

実施例８ 内径７．６問、長さ１００ｍｍのＨＰＬＣ用カラムに、
５００ｋｇ／ｃｆｆｌ−Ｇの圧力で製造例７により得ら
れたＣ０Ａｐを密度１．０３ｇ／ｃｄに充填し、それ以
降の操作は実施例１及び２と同様な操作で）ＩＰＬＣ用
カラムの操作を行なった。その結果を実施例５と同様に
第３表に示す。

第３表から、高い圧力でＣ０Ａｐをカラムへ充填してい
るにも拘らず、実施例５及び６で得られたクロマトグラ
ムと同し結果を示し、耐圧性に優れていることがわかる
。

実施例９ 内径２１開、長さ２５０ａｉｍの分取用カラムに、８０
ｋｇ／ｃＪ−Ｇの圧力で、製造例５に従って得たＣ０Ａ
ｐを密度０．６２ｇ／ｃ＋７に充填し、操作法は実施例
１及び２と同様な方法でＨＰＬＣ用カラムの操作を行な
った。ただし標準試料は１０ｔＪｌ注入した。これによ
り得られたクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第
３表に示す、第３表の結果から本発明のカラムによれば
通常のＨＰＬＣと同じ結果が得られ、分取用としても十
分使用可能であることがわかる。

実施例１０ 内径７．６　ｍｏ＋、長さ１００＋ｙ−のＨＰＬＣ用カ
ラムに、８０ｋｇ　／ｃｄ−Ｇの圧力で、製造例７に従
って得たＣ０Ａｐを密度０．５８ｇ／ｃｄに充填し、そ
れ以降の操作は実施例１及び２と同様に行なった。ただ
し展開中の流速が３．４　ｍ／＋＊ｉｎになるように圧
力を５０ｋｇ／ｃＪ−Ｇに調整した。これにより得られ
たクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第３表に示
す、第３表からもわかる通り、分離を短時間で行なわれ
たにも拘らず、各々の４つのピークがきれいに分離して
いることがわかる。

実施例Ｈ 実施例５で使用したＨＰＬＣカラムを用い、核酸に対す
る分離能の評価を炭酸塩を展開液として行なった。

核酸のサンプルには米国シグマ社製の子牛胸腺デオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、展開は蒸留水と炭酸水素
アンモニウム水溶液２Ｍ　（ｐＨ７，８）による直＋ｌ
ｌｆｆ濃度勾配法により行ない、上記サンプルを１０．
０μｌカラムに注入した。また、流速は１ｍ１／１ｌｉ
ｎになるように７．５ｋｇ／ｃｄ−Ｇの展開圧とした。

核酸の検出は２６０ｎｍの吸光度を測定した。このカラ
ムにより得られたクロマトグラムを第１０図に示す、第
１Ｏ図からもわかるように主なピークが２カ所にあられ
れ、一部熱処理を行ない一本鎖となった核酸が、二本鎖
のそれときれいに分離されていることがわかる。さらに
それぞれのピーク分取液にエタノールを加え、核酸を糸
状沈殿物として直接回収した。

実施例１２ 標準試料による分Ｍ能評価を終えた実施例６で使用した
カラムについて、実施例１１の操作を５０回行なった０
本操作終了後、再度、標準試料による分離能評価を行な
ったところ、カラムの劣化は全く見られなかった。

比較例１ 比較製造例１に従って得た１（Ａｐを用い、以下、実施
例３及び４と全く同一の方法で、牛血清アルブミンの分
離を行なった。得られた結果を第１１図に示す。

実施例３及び４ではすぐれた分離能を示し、吸脱着にす
ぐれているのに対し、比較製造例１に従って得た炭酸根
を含有していないＨＡｐは、第１１図から回収量が劣る
ことがわかる。

比較列２ 比較製造例１に従って得たｎＡｐを内径７．６　ｍｍ、
長さ１００間のカラムに充填し、その後の操作は実施例
４と同様な操作で標準試料の分離を行った。

尚、この時の充填密度は０．２８ｇ／ｄであった。また
流速を１ａｉｄ／ｗｉｎにするため、１ｋｇ／ｃ＋Ｊ−
Ｇの圧力になるように調整を行なったが、ＨＰＬＣとし
ては低圧になるため、操作に困難をきたした。

これにより得られたクロマトグラムを第１２図に示す、
第１２図と第６図及び第７図との比較からもわかる通り
、従来法に従って得たＨＡｐを充填したものは、全体的
にブロードなピークを示した。

比較例３ 比較製造例１に従って得たＨＡｐを、内径７．６旧、長
さ１１００ｎのカラムに充填圧力１５ｋｇ／ｃ（−Ｇで
充填した。しかし内部で結晶が破壊され目づまりが生じ
、展開を行うことができなかった。

比較例４ 比較製造例１に従って得たＨＡＧＩを、内径７．６　ａ
ｍ、長さ１００開のカラムに充填して、実施例１２と同
様な操作を行なったが、五回目でカラム圧力が上昇し展
開が不可能となった。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明は炭酸根をＣｏｔ　
として０６５重量％以上含有したＣ０ＡｐをＬＣ用また
はＨＰＬＣ用カラムの充填剤として使用する、また、こ
のＣ０Ａｐを充填してなるカラムの発明である。

従来ＬＣ用またはＨＰＬＣ用カラムは充填材が１ｌＡｐ
であるので、分離能にやや問題があると共に、耐圧・耐
久性に劣るという問題があった。また、ＨＡｐが品質的
に再現性良く製造できないという重大な問題もあった。

これに対し本発明の充填材はＣ０Ａｐであるので分離能
が優れており、また結晶の強度が大きいため耐圧・耐久
性にも優れている。従って、２００回以上の繰返し使用
が可能で、優れた耐久性を持っている。以上のことから
、本発明のＣ０Ａ９は特に１ｆＰＬＣ用充填材として使
用した場合、充填密度を０．５ｇ／ｄ以上とすることが
できるので、ＨＰＬＣ特有の展開条件下で一層向上した
分離能を示すのである。

さらに、従来のＨＰＬＣ用カラムは耐圧・耐久性に劣る
のに対し、本発明のカラムにおいてはＣ０Ａｐ結晶が破
壊されにくく、従って、容易に０．５ｇ／ｃＪ以上の密
度で充填することができ、カラムの強度も大で少なくと
もＨＰＬＣの実質的な充填圧力である１０ｋｇ／ｃ１１
を満足し、さらに５００ｋｇ／ｃ＋ｆ１以上の高い圧力
をかけても充填材であるＣ０Ａｐ自体には全く支障がな
い。

また、本発明のＣ０Ａｐは従来のＨＡｐと異なり結晶を
配向させながらＩＩＰＬｃ用カラムに充填するという煩
雑な操作を必要としないので、簡単にカラム充填が行な
えるという利点がある。さらに圧力の調整により流速制
御ができるので展開液も従来品に比べ少量で済むという
利点もある。さらにまた、本発明のカラムは分析を目的
とした１（ＰＬＣ用カ用人ラム以外分取を目的とした分
取用ＨＰＬＣ用カラムとしても好適に使用でき、必要と
される試料を短時間のうちに純度よく分離・精製するこ
とが可能であるのである。

また、ＨＡｐを充填した従来のカラムを使用して分取を
行なう場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸
塩の液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩を
必要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作自
体は短時間であっても、後処理を含めると決して短時間
とはいえなかった。しかし本発明では充填材としてｃｏ
Ａｐを使用しているので、溶離液としてこれまで不向き
と考えらていた、揮発性の炭酸塩系溶離液が使用可能で
あるので、後処理の時間を大幅に短縮できるという利点
も有している。この点は特に核酸を分離・精製する際に
威力を発揮する。

即ち、核酸類としてたとえばプラスミドＤＮＡを分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしこの操作
は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので前
処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。しかしながら
ここで揮発性塩を使用すれば、直接エタノール添加によ
る沈殿析出が実施可能であり、合計の処理時間が大幅に
軽減される。

ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時間を必
要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使用可能
であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大幅に短
時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離液の使
用はＣ０Ａｐの如く炭酸根を含有するアパタイトを使用
することで初めて達成できるものであり、従来の如きＨ
Ａｐでは達成できない。

以上種々列記した通り、ＬＣ用及びＨＰＬＣ用カラ用心
ラム材にＣ０Ａｐを使用することにより種々の効果があ
り、その産業上の利用可能性はきわめて大なるものであ
るといわざるを得ない。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第３図はそれぞれ製造例１及び製造例２で得
られた本発明のＣ０ＡｐのＸ線回折図である。 第２図及び第４図はそれぞれ製造例１及び製造例２で得
られたｃｏＡｐの赤外吸収スペクトルを表す図である。 第５図は比較製造例１で得られたＩＩＡｐの赤外吸収ス
ペクトルを表す図である。 第６図及び第７図はそれぞれ実施例１及び実施例２で行
なったＨＰＬＣ用カラ用心ラム牛血清アルブミンを展開
して得られたクロマトグラムである。 第８図及び第９図はそれぞれ実施例３及び実施例４で行
なったＬＣ用カラムによる牛血清アルブミンを展開して
得られたクロマトグラムである。 第１０図は実施例１１で行なったＨＰＬＣ用カラ用心ラ
ム核酸を展開して得られたクロマトグラムである。 第１１図は比較例１で行なったＬＣ用ガラスカラムによ
る牛血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラム
である。第１２図は比較例２で行なったＨＰＬＣ用カラ
用心ラム牛血清アルブミンを展開して得られたクロマト
グラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）炭酸根をＣＯ＿３として０．５重量％以上含有した
   ヒドロキシアパタイトからなることを特徴とする液体ク
   ロマトグラフィー用充填材。 ２）炭酸根をＣＯ＿３として０．５重量％以上含有した
   ヒドロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする
   液体クロマトグラフィー用カラム。