JPH0743358B2 - 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム - Google Patents

液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム

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JPH0743358B2
JPH0743358B2 JP63117096A JP11709688A JPH0743358B2 JP H0743358 B2 JPH0743358 B2 JP H0743358B2 JP 63117096 A JP63117096 A JP 63117096A JP 11709688 A JP11709688 A JP 11709688A JP H0743358 B2 JPH0743358 B2 JP H0743358B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、炭酸根を含有したヒドロキシアパタイトから
なる液体クロマトグラフィー用充填材、及びこれを充填
してなる液体クロマトグラフィー用カラムに関するもの
である。
〔発明の背景〕 アパタイトとは広義には、下記（１）式の組成式で表わ
される化合物をいい、この式でＭはCa、Pb、Ba、Sr、M
g、Ni、Na、Ｋ、Fe、Alその他の金属原子を、ZO4はP
O4、AsO4、VO4、SO4、SiO4、CO3その他の酸根を、Ｙは
Ｆ、OH、Cl、Br、Ｏ、CO3、その他の陰イオン性原子
（団）を示す広範囲な化合物群の総称である。
M+ 2nM2+ m（ZO3- 4）6Y- 2 ……（１） （ｎ＋ｍ＝10、ｎ＝０及びｍ＝０の場合も含む） 本発明においては、上記（１）式においてＭが実質的
（すなわち、不純物レベルの他の原子、原子団が入って
もよい）にCaであり、ZO4が実質的にPO4であり、Ｙが実
質的にOHである化合物をヒドロキシアパタイトと呼ぶ。
そして、ここでZO4または／及びＹの一部がCO3で置換さ
れたものを炭酸含有ヒドロキシアパタイトと呼ぶ。
ヒドロキシアパタイト（以下HApと略記する）は、天然
歯や天然骨と同じ化学組成を持つ無機化合物であるとこ
ろから、生体物質との親和性に優れているという特性を
有し、蛋白質、核酸、酵素等の生体高分子物質の分離・
精製を目的とした液体クロマトグラフィー（以下、LCと
略記する）用カラムの充填材として好適に使用されてい
る。
さらに、近年高速液体クロマトグラフィー（以下HPLCと
略記する）の普及により少量の試料を短時間で処理する
こと（微量分析）、あるいは一度に大量の試料をしかも
短時間に処理すること（大量分取）が可能となり、HAp
のこの分野への応用は今度益々広がることが予想され
る。従って、HPLCを含むLC用のカラム充填材として、さ
らに高性能でかつ使用しやすいHApの開発が望まれてい
る。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕
従来のLC用のカラム充填材に使用されるHApは、A.Tisel
ius,et.al.,により発表された、水溶性のカルシウム塩
と水溶性の燐酸塩を反応させる湿式合成法（Arch.Bioch
em.Biophys.,65,132（1956））をもとに適宜改良を加え
た方法で製造されたものが一般的であった。これらの方
法で得られたHApは従来、LC用カラム充填材としての性
能がすぐれているといわれているものであって、次のよ
うな物性を示すのが通常である。
Ca/P比 1.4〜1.55 Ｘ線回折 回折ピークが弱い。
CO3含有量 0.1重量％未満 しかしながらHApを製造する上記従来の方法は、原料の
調整、pH管理、攪拌状態、温度管理等の反応およびその
後の処理等に非常に煩雑な操作を必要とする。
しかも、この方法では、品質的に再現性良く、HApを製
造することは大変困難である。更には、この方法を工業
的にスケールアップすると、小型スケールと比較してそ
の再現性が著しく乏しくなり、工業的実施には不向きな
方法である。その上、得られた前記物性のHApは、燐酸
ナトリウム緩衝液中で冷所保存しなければ、その物性を
維持できないという問題もある。
以上述べたようにLC用カラム充填材として生体高分子の
分離・精製に優れた性能を発揮するHApを、従来公知の
方法で再現性よく製造することが困難であり、この点か
らHApは高価なものとなっている。そのため、HApは生体
高分子の分離・精製のためのLC用カラム充填材として他
の充填材と比較して使用頻度が極度に少なく、限られた
分野で使用されているのが実情である。
また、従来使用されているHApは、耐圧性及び耐久性に
おいて必ずしも十分でなく、特にHPLCでの長期にわたる
繰り返し使用が制限されていた。
本発明は、上述の従来技術における問題を解決するため
になされたものである。
本発明の目的は、品質的に安定した製造が可能であり、
製造コストの低減化が可能なHApを提供することにあ
る。
本発明の他の目的は、HPLCを含めたLC用のカラム充填材
として、特に生体物質の分離能が向上したHApを提供す
ることにある。
本発明の他の目的は、耐圧および耐久性に優れたHApか
らなるHPLCを含めたLC用のカラム充填材を提供すること
にある。
本発明の他の目的は、耐久性および生体物質の分離能に
優れたHPLCを含むLC用に好適なカラムを提供することに
ある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らはこれら種々の問題を解決するために鋭意検
討を重ねた結果、HAp中に炭酸根を含有させることで、
再現性よくHApを製造することができ、かつ、この炭酸
根をCO3として0.5〜5.0重量％含有したHAp（以下、炭酸
根を含有したHApを炭酸含有ヒドロキシアパタイトと称
し、COApと略記する）は、生体高分子の分離能力がHAp
より更に優れているため、上記の目的がすべて達成され
ることを見出し、本発明を完成するに至ったものであ
る。
すなわち本発明の第１は、炭酸根をCO3として0.5〜5.0
重量％含有したヒドロキシアパタイトからなることを特
徴とする液体クロマトグラフィー用充填材であり、第２
は炭酸根をCO3として0.5〜5.0重量％含有したヒドロキ
シアパタイトを充填密度を0.5g/cm3以上に充填してなる
ことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの発
明である。
〔発明の詳細な開示〕
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のLC用カラムの充填材は、炭酸根をCO3として0.5
〜5.0重量％含有したCOApからなる。この充填材をカラ
ムに充填することにより、本発明のLC用カラムを得るこ
とができる。
なお、本発明の充填材およびカラムの用途としての“L
C"は“HPLC"を含む。
従来のHApからなる充填材を用いたLC用カラムは先に述
べたように、分離能にやや問題があると共に、耐圧、耐
久性に劣るという問題があった。また、HApが品質的に
再現性良く製造できないという重大な問題もあった。さ
らに、従来のHApは耐圧性および耐久性に劣るので、HPL
Cでの繰り返し使用での良好な耐久性が得られなかっ
た。
これに対し本発明のCOApからなる充填材は、品質的に再
現性良く製造可能であり、しかも生体物質の分離能が高
い。
さらに、COAp結晶の物理的強度が高いので、本発明の充
填材は、耐圧性および耐久性に優れる。
その結果、本発明の充填材をカラムに充填する際の充填
圧として、少なくとも500kg/cm2までの高圧が採用でき
る。
さらに、本発明の充填材を充填したカラムは、HPLCにお
ける繰り返し使用の耐久性に優れる。
また、従来のHApは平板状の結晶形状をしているため、
結晶を配向させながらHPLC用カラムに充填するという煩
雑な操作を必要としたが、本発明で用いるCOApの場合
は、そのような配慮は特に必要がないので簡単にカラム
充填が行なえるという利点がある。さらに圧力の調整に
より流速制御ができるので展開液も従来品に比べ少量で
済むという利点もある。さらにまた、本発明のカラムは
分析を目的としたHPLC用カラム以外に、分取を目的とし
た分取用HPLC用カラムとしても好適に使用でき、必要と
される試料を短時間のうちに純度よく分離・精製するこ
とが可能であるのである。
また、HApを充填した従来のカラムを使用して分取を行
う場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸塩の
水溶液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩を
必要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作自
体は短時間であっても、後処理を含めると決して短時間
とはいえなかった。しかし、本発明のCOApからなる充填
材に対しては、溶離液としてこれまでアパタイトクロマ
トには不向きと考えられていた、揮発性の炭酸塩系溶離
液が使用可能である。従って、カラムから溶出した精製
フラクションを直接凍結、乾燥させて目的物を高純度品
として回収するか、または、加温または／および減圧操
作により塩を短時間に揮発、除去し、つぎの工程での操
作に用いることができるので後処理の時間を大幅に短縮
できるという利点も有している。この点は特に核酸を分
離・精製する際に威力を発揮する。
即ち、核酸類としてたとえばプラスミドDNAを分離・精
製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノールを
加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしてこの操作
は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので沈
殿回収の前処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。し
かしながらここで例えば炭酸水素アンモニウムのような
アルコールに対する溶解度の大きな揮発性塩を使用すれ
ば、直接エタノール添加による沈殿析出が実施可能であ
り、合計の処理時間が大幅に軽減される。
ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
緩衝液を使用した場合、この処理には通常15〜24時間を
必要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使用可
能であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大幅に
短時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離液の
使用はCOApの如く炭酸根を含有するアパタイトを使用す
ることでより効果的となる。
上述のように、本発明の炭酸根含有アパタイトからなる
LC用充填材およびこれを充填したLC用カラムの利点とし
て従来不可とされていた炭酸根を含む溶離液を用いるこ
とができる点もあげられる。
すなわち、これまでのHApを充填したLC用カラムに炭酸
根を含む溶離液を通液するとカラムが閉塞し通液が困難
となる。これは炭酸根がアパタイトと反応を起こすため
と考えられる。
一方、本発明の炭酸根含有アパタイトの場合はあらかじ
め炭酸根を含有しているために炭酸根を含む溶離液を通
液としても問題を生じないものと考えられる。
以上種々列記した通り、LC用およびHPLC用カラムの充填
材にCOApを使用することにより種々の効果があり、本発
明の効果は経済的に極めて大なるものがある。
本発明のLC用充填材は、炭酸根をCO3として0.5〜5.0重
量％含有したCOApからなる。
本発明における炭酸根含有量とは日本化成肥料協会技術
専門委員会（Technical Comittee Japan Phasphate ＆
Compound Fertilizers Manufacturer′s Association）
の定める燐鉱石分析法に準じて測定した無水炭酸（C
O2）の測定値をCO3含有量に換算したものとする。
本発明で用いられるCOApの製造方法には特に制限はな
く、従来公知の方法が利用できる。例えば第二燐酸カル
シウムと炭酸カルシウムをアンモニア水中で反応させる
方法（特公昭58−30244号公報の方法）や、第二燐酸カ
ルシウム２水塩と炭酸カルシウムとを水中で反応させる
方法（特開昭60−5009号公報の方法）、本発明者らが先
に提案した、有機溶媒を含む反応媒体中で燐酸または／
及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウムとを反応させる
方法（特開昭59−107912号公報）など、いずれの方法で
も得ることができる。
しかしながら、本発明に使用するCOAp中には、炭酸根が
CO3として0.5〜5.0重量％の範囲で含有しているのが好
ましい。
なお、アパタイトの製造技術の面からはCO3含有量とし
て7.0重量％まで調節可能であるが5.0重量％を越える場
合はクロマトグラフィーの充填材としての分離性能が低
下して好ましくない。従って、本発明においてはCOApは
燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウムと
を、アンモニア水、水、有機溶媒の何れかまたはそれら
の混合物の反応用媒体中で下記する如きモル比で反応さ
せて得ることができる。
すなわち、反応槽にアンモニア水、水、有機溶媒の単独
もしくはそれらの混合物を反応用媒体として仕込み、こ
れに燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウ
ムとを加えて、通常大気圧下にて反応用媒体を加熱し、
蒸発した反応用媒体は還流させる方法で反応させる。な
お、この際の燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸
カルシウムの割合はカルシウムと燐の原子比がCa/Pとし
て1.30〜1.90好ましくは1.45〜1.75の範囲で、また、炭
酸根と燐の割合はCO3/PO4として0.015〜1.90の範囲で実
施される。
反応時間は、媒体がアンモニア水または水の場合は概ね
５〜８時間必要であり、反応用媒体が有機溶媒を含有す
る場合は約２時間もあれば十分である。
加熱終了後は生成したCOApが析出しスラリー状となって
いるので、これを通常公知の方法で濾別・分離し、乾燥
すれば良い。
COApの原子比（Ca/P）は、理論的には5/3であるのでカ
ルシウムと燐との反応時における原子比も5/3≒1.67が
最適であるはずであるが、実際の反応に際しては、原子
比が上記の範囲内にあれば好適にCOApを合成することが
できる。
上記反応の原料として使用する燐酸または／及びそのカ
ルシウム塩としては、H3PO4、H4P2O7、HPO3、P2O5、Ca
（H2PO4）２・H2O、Ca（PO3）２、CaHPO4、CaHPO4・2H2
O、Ca2P2O7、Ca3（PO4）２、Ca8H2（PO4）６・5H2O、等
が使用可能である。しかしながら、これらの化合物は本
発明において使用可能な原料の一部であって、これらに
限定する必要はない。また、これらの化合物は特に高純
度のものを使用する必要はなく、通常市販の工業的のも
ので十分である。今一つの原料である炭酸カルシウムも
同様に、工業的のもので十分である。
カルシウム源として、上記の如き燐酸のカルシウム塩の
外にCaO、Ca（OH）２、CaCl、Ca（NO3）２、（CH3COO）
2Ca等のカルシウムの酸化物、水酸化物及び無機酸並び
に有機酸のカルシウム塩を使用することも可能である。
また、炭酸源として、本発明ではカルシウム原子の補給
にもなるので炭酸カルシウムを使用するがK2CO3、KHC
O3、Na2CO3、NaHCO3、（NH4）2CO3、NH4HCO3等の炭酸塩
や炭酸ガスを使用しても差支えない。
本発明においては、炭酸カルシウムと上記の如き燐酸ま
たは／及びそのカルシウム塩の一種類以上を適宜選択し
て、カルシウムと燐の原子比Ca/Pが1.30〜1.90、好まし
くは1.45〜1.75となるように反応槽に投入すればよい。
また、上記炭酸カルシウムの投入量を変化させることに
より、生成するCOAp中に含有する炭酸根の含有量を調節
することが可能であり、この方法により炭酸根をCO3と
して7.0重量％以下の範囲で調節することができる。
本発明において、反応用媒体の使用量はその種類、反応
時の原料の種類、反応時の攪拌状態などによりそれぞれ
適性値が異なるが、いずれの条件においてもスラリー濃
度として５〜60重量％程度となる量が好ましい。
本発明において、COApの製造の際に反応用媒体としてア
ンモニア水を使用する場合は、濃度が５〜28重量％のア
ンモニア水溶液を用いて、反応媒体のpHを７〜11の範囲
で適宜調節して反応を行なう。
また反応用媒体として使用できる有機溶媒としては、例
えばベンゼン、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサ
ン、ヘプタン、オクタン、デカン、各種石油ナフサや工
業用ガソリン等の芳香族及び脂肪族炭化水素類;iso−ブ
チルアルコール、ｎ−アミルアルコール等のアルコール
類；トリエチルアミン、トリブチルアミン、エタノール
アミン等のアミン類；エチルエーテル、エチルブチルエ
ーテルや各種セルソルブ、カルビトール等のエーテル
類；メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等の
ケトン類が挙げられる。しかしこれらは本発明において
は使用可能な有機溶媒の一例にすぎない。
かくして得られたCOApは、液体クロマトグラフィー用、
特に高速液体クロマトグラフィー用充填として使用した
場合、生体高分子物質の分離・精製に、従来のHApを使
用した場合よりも更に優れた性能を示す。
本発明において用いられるCOApの粒径については0.5〜5
0μｍの範囲のものを用いることが好ましい。さらに好
ましくは、２〜15μｍのものが選択される。
本発明においては、このCOApをカラムに充填して液体ク
ロマトグラフィー用カラムとするが、COApをカラムに充
填する方法としては、従来公知の湿式充填法（スラリー
性）等を使用できる。
すなわち、湿式充填法には平衡密度法、非平衡密度法、
高粘度法などがあるが、これらの中から充填材であるCO
Apの粒径または／及び物理的強度を考慮し、適宜好まし
い充填法を選択すればよい。
COApをHPLC用カラムに充填するには、パッカーと呼ばれ
る充填容器と高圧ポンプが必要である。また、充填には
充填用溶媒を用い、COApはこの溶媒の１〜20重量％のス
ラリーとして上記パッカーに流し込み、70〜350kg/cm2
の間の一定圧力で充填するのが望ましい。
上記の充填用溶媒としてはテトラブロモエタン、テトラ
クロロエチレン、四塩化炭素、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピル
アルコール、水、アセトン、ジオキサン、クロロホル
ム、テトラヒドロフラン、シクロヘキサノール、エチレ
ングリコールなどが挙げられる。そして、これらの溶媒
の一種または二種以上を組み合わせればよい。
本発明の充填材を充填するカラムの材質、形状、大きさ
はその用途に応じて選択することができる。
すなわち、カラムの大きさについては、内径1mm程度の
小型分析用から内径100mm以上の分取用のサイズのカラ
ムに適用することができる。
例えば、HPLC用カラムの場合では内径3mm有効長さ30mm
程度の分析用カラム、内径7.6mm有効長さ100mm程度の分
析およびミクロ分取用カラム、内径500mm有効長さ500mm
の大型分取用カラムなどが例としてあげられる。
本発明の充填材はこれらの分析用小型カラムから分取用
大型カラムまでその分離特性のカラムのスケールに対す
る依存性が極めて少ない。
また、カラムの材質については通常液体クロマトグラフ
ィー用カラムに使われる材質、例えば、ステンレススチ
ール、ガラス、樹脂などの一般的な材質が使用できる。
なお、本発明の充填材をHPLC用のカラムに充填する場合
には、充填密度を0.5g/cm3以上とすると、分離性能が更
に向上するので好ましい。また、あまり充填密度を上げ
るとカラムの通液抵抗が大きくなり好ましくないので充
填密度の上限は1.1g/cm3程度である。
〔実施例〕 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
尚、以下において％は重量％を表す。
製造例１ 蒸留水２、Ca（OH）２粉末74g及びCaCO3粉末68gを、
攪拌機及び還流冷却器を備えた有効容積３のセパラブ
ルフラスコに仕込み、攪拌しながら更に濃度40％のH3PO
4水溶液200mlを15分間で添加した後、加熱して沸騰温度
（約98℃）で５時間反応させた。
反応終了後は生成物を冷却後、加圧濾過機で濾過、水洗
し、次いで130℃で16時間乾燥して白色の粉末を83g得
た。
この粉末のＸ線回折図を第１図に示す。
第１図より明らかなようにＸ線回折図は回折角度２θ＝
31.7、32.2、32.8に主ピークを有し、ASTMカード９−43
2に記載のCOApの特性回折ピークと一致した。また赤外
吸収スペクトルを第２図に示す。第２図より明らかなよ
うに1450cm-1、870cm-1付近にＣ−Ｏの吸収ピークが観
察された。CaO含有量はEDTAキレート滴定法により、P2O
5含有量は比色定量法により測定した。またこのCOApの
物性分析結果を第１表に示す。
製造例２ Ca（NO3）２粉末83.6gを溶解した水溶液１に濃度28％
のアンモニヤ水を加えてpH10に調整した後、これを製造
例１で使用したセパラブルフラスコに仕込みよく攪拌し
た。
次いで、この水溶液に（NH4）2HPO4粉末39.6gとNH4HCO3
粉末11.9gを溶解させた混合水溶液１を５〜10ml/min
の速度で徐々に添加した。しかる後これを攪拌しながら
加熱し、沸騰温度（約98℃）で５時間反応させた。
反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色の粉末を38g得た。この粉末のＸ線回折図を
第３図に示す。
第３図より明らかなようにＸ線回折図を回折角度は第１
図と同じ主ピークを有し、COApと特定される。また赤外
吸収スペクトルを第４図に示す。第４図より明らかなよ
うに第２図と同様のＣ−Ｏの吸収ピークが観察された。
またこのCOApの物性分析結果を第１表に示す。
製造例３ Ca（H2PO4）２・H2O75.6g、CaCO370.0g、水100g及びｎ
−ヘキサン350gを、攪拌機及び還流冷却器を備えた有効
容量１のセパラブルフラスコに仕込み、攪拌しながら
昇温させ還流温度（63℃）以下で約２時間加熱し反応さ
せたのち、セパラブルフラスコ内の水分とｎ−ヘキサン
を蒸発させ、留出したｎ−ヘキサンと水に相当する容量
のｎ−ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作
が進行するに従ってセパラプルフラスコ内の温度が上昇
し、内温が68℃を越えた時点で加熱を中止して、生成物
を製造例１と同様に濾過・乾燥して白色の粉末を得た。
この粉末について、製造例１と同様にＸ線回折及び赤外
吸収スペクトルによってCOApであることを確認した。
製造例４ CaHPO481.6g、CaCO340.0g、水200g及び濃度28％のアン
モニア水10gを、製造例３で使用したセパラブルフラス
コに仕込みよく攪拌した。しかる後、これを攪拌しなら
が昇温し、80〜100℃の温度で５時間反応させた。
反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色粉末状のCOApを112gを得た。このCOApの物性
分析結果を第１表に示す。
製造例５〜８ Ca（H2PO4）２・H2O、CaHPO4・2H2O、CaHPO4、CaCO3の
各粉末、水及び有機溶媒を第２表に示した条件でセパラ
ブルフラスコに仕込み、第２表に示した以外の条件につ
いては、実施例１と同様な操作により白色粉末状のCOAp
を第１表に示す量を得た。このCOApの物性分析結果を第
１表に示す。
製造例９ 製造例２を50倍にスケールアップしてその再現性を確認
した。即ち、Ca（NO3）２粉末4.18kgを溶解した水溶液5
0に濃度28％のアンモニヤ水を加えてpH10に調整した
後、これを攪拌機及び還流冷却器を備えた有効容積50
のステンレス製反応槽へ仕込みよく攪拌した。
次いで、この水溶液に（NH4）2HPO4粉末1.98kgとNH4HCO
3粉末595gを溶解させた混合水溶液50を250〜500ml/mi
nの速度で徐々に添加した。以下、製造例２と同様の操
作を行い、白色粉末状のCOApを第１表に示す量得た。こ
のCOApの物性を第１表に示す。
比較製造例１ 従来法による方法（A.ティセリウス（A.Tiselius））ら
の方法Arch.Biochem.Biophys.,65,132（1956）に従って
HApを以下のようにして合成した。
有効容積３のフラスコへ濃度0.5mol/のCaCl2水溶液
１と濃度0.5mol/のNa2HPO4水溶液１を毎分120滴
の割合で同時に滴下し、攪拌棒でゆっくりと攪拌しなが
ら反応を行なった。滴下終了後、上澄み液をデカンテー
ションにより除去し、残留した沈殿物を４回、各々２
の蒸留水で洗浄した。次にこの沈殿物に２の蒸留水を
加え、更に濃度40％のNaOH水溶液を50ml加えた後１時間
沸騰した。
反応液を冷却後再びデカンテーションにより上澄液を除
き、再度２の蒸留水で４回洗浄した。次にpH6.8で濃
度0.01mol/の燐酸ナトリウム緩衝液を２加え沸騰す
る直前まで加熱した。この操作を２度繰返すが、沸騰時
間は各々５分と15分にした。次に、pH6.8で濃度0.01mol
/の燐酸ナトリウム緩衝液を２加え２度沸騰（各15
分間）させて第１表に示す量のHAp36gを得た。
このようにして得られたHApはpH6.8で濃度0.001mol/
の燐酸ナトリウム緩衝液に入れ、冷蔵庫にて保存した。
その結果第１表に示す物性のHApを得た。またこのHApの
赤外吸収スペクトルを第５図に示すが、第５図からも明
らかなように、炭酸根（Ｃ−Ｏ）の吸収スペクトル（14
50cm-1、870cm-1付近）は見られなかった。
実施例１〜２ 内径7.6mm、長さ100mmのHPLC用金属カラムへ、製造例１
及び２により得られたCOApを通常の方法により10kg/cm2
−Ｇの圧力でそれぞれ充填し、２種のカラムを作成し
た。充填終了後各カラムをHPLC装置に装着した。両カラ
ムとも充填密度は0.52g/cm3であった。
各カラムの分離能の評価を行なうためトリプトファン
（0.16％）、牛血清アルブミン（4.6％）、リゾチウム
（2.0％）、及びチトクロムＣ（1.0％）を含有する混合
溶液を標準試料として用いて展開を行なった。展開は、
燐酸緩衝液10mM（pH6.8）と350mM（pH6.8）による直線
濃度勾配法により行ない、上記標準試料を10.0μ注入
した。また、流速は1ml/minになるように7.5kg/cm2の展
開圧とした。
タンパク質の検出は、280nmの吸光度を測定した。製造
例１で得たCOApを有するカラムで得られたクロマトグラ
ムを第６図に、製造例２で得たCOApを有するカラムで得
られたクロマトグラムを第７図に示す。第６図及び第７
図からも明らかなように、主なピークが４カ所にあらわ
れており、標準試料である４成分がきれいに分離されて
いることがわかった。各ピークは左側からトリプトファ
ン、牛血清アルブミン、リゾチウム、チトクロムＣに対
応するピークであることを確認した。尚、チトクロムＣ
には、２種の異性体がありピークが２つに分離してい
る。
実施例３〜４ 製造例２及び９で得られたCOApを用い、以下に示すカラ
ムフロマトの操作手順に従って牛血清アルブミンの精製
を行なった。即ち、COAp各10gを500mlのビーカーにと
り、イオン交換水（以下単に水と略記する）を静かに加
え、ゆっくり攪拌した。10分間静置後デカンテーション
した。この操作を上澄みが清澄になるまで繰り返した。
その後、直径10mmのクロマトグラフィー用（LC用）のガ
ラスカラムに懸濁したCOApを重層した（充填高さ100〜1
20mm）。その後COApが充填されたガラスカラムの洗浄を
水で行ない、同時に流速の測定を行なった（約10ml/hに
なるように充填する）。次に１％牛血清アルブミン水溶
液1mlをカラムに通し、カラム内のCOApに牛血清アルブ
ミンを吸着させた。この時の操作はすべて室温で行なっ
た。次に吸着させた牛血清アルブミンをカラムから溶出
するため、燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で展開を行
なった。溶出液は重量分画型のフラクションコレクター
で収集した（１試験管あたり2.5gの溶出液）。得られた
溶出液の吸光度は紫外部280nmで測定した。製造例２で
得られたCOApを有するカラムでの結果を第８図に、製造
例９で得られたCOApを有するカラムでの結果を第９図に
示す。第８図、第９図から本発明のCOApは比較製造例の
アパタイトを用いた場合の第11図に比べてシャープなク
ロマトパターンが得られており優れた分解能を示し、吸
脱着に優れているのがわかる。
実施例５ 内径7.6mm、長さ100mmのHPLC用カラムに、10kg/cm2−Ｇ
の圧力で製造例３により得られたCOApを、実施例１及び
２と同様の方法で充填し、それ以降の操作は、実施例１
及び２と同様にしてHPLC用カラムの操作を行なった。充
填密度は0.52g/cm3であった。各ピークの保持時間及び
半値幅によりその結果を第３表に示す。第３表からわか
る通り実施例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ
結果を示した。
実施例６ 内径7.6mm、長さ100mmのHPLC用カラムに、80kg/cm2−Ｇ
の圧力で製造例６により得られたCOApを充填し、それ以
降の操作は、実施例１及び２と同様にしてHPLC用カラム
操作を行なった。充填密度は0.60/cm3であった。その結
果を実施例５と同様に第３表に示す。第３表からもわか
る通り、実施例１及び２で得られたクロマトグラムと同
じ結果を示した。
実施例７ 実施例６で使用したカラムに対し、標準試料の分離を30
0回行なった。300回目に得られたクロマトグラムの結果
を実施例５と同様に第３表に示す。第３表からもわかる
通り、本発明のカラムは300回の繰返し使用に対しても
良い分離能を示し、優れた耐久性をもっていることがわ
かる。
実施例８ 内径7.6mm、長さ100mmのHPLC用カラムに、500kg/cm2−
Ｇの圧力で製造例７により得られたCOApを密度1.03g/cm
3に充填し、それ以降の操作は実施例１及び２と同様な
操作でHPLC用カラムの操作を行なった。その結果を実施
例５と同様に第３表に示す。
第３表から、高い圧力でCOApをカラムへ充填しているに
も拘らず、実施例５及び６で得られたクロマトグラムと
同じ結果を示し、耐圧性に優れていることがわかる。
実施例９ 内径21mm、長さ250mmの分取用カラムに、80kg/cm2−Ｇ
の圧力で、製造例５に従って得たCOApを密度0.62g/cm3
に充填し、操作法は実施例１及び２と同様な方法でHPLC
用カラムの操作を行なった。ただし標準試料は70μ注
入した。これにより得られたクロマトグラムの結果を実
施例５と同様に第３表に示す。第３表の結果から本発明
のカラムによれば通常のHPLCと同じ結果が得られ、分取
用としても十分使用可能であることがわかる。
実施例10 内径7.6mm、長さ100mmのHPLC用カラムに、80kg/cm2−Ｇ
の圧力で、製造例７に従って得たCOAp密度0.58g/cm3に
充填し、それ以降の操作は実施例１及び２と同様に行な
った。ただし展開中の流速が3.4ml/minになるように圧
力を50kg/cm2−Ｇに調整した。これにより得られたクロ
マトグラムの結果を実施例５と同様に第３表に示す。第
３表からもわかる通り、分離を短時間で行なわれたにも
拘らず、各々の４つのピークがきれいに分離しているこ
とがわかる。
実施例11 実施例５で使用したHPLCカラムに用い、核酸に対する分
離能の評価を炭酸塩を展開液として行なった。
核酸のサンプルには米国シグマ社製の子牛胸腺デオキシ
リボ核酸（DNA）を使用し、展開は蒸留水と炭酸水素ア
ンモニウム水溶液2M（pH7.8）による直線濃度勾配法に
より行ない、上記サンプルを10.0μカラムに注入し
た。また、流速は1ml/minになるように7.5kg/cm2−Ｇの
展開圧とした。
核酸の検出は260nmの吸光度を測定した。このカラムに
より得られたクロマトグラムを第10図に示す。第10図か
らもわかるように主なピークが２カ所にあらわれ、一部
熱処理を行ない一本鎖となった核酸が、二本鎖のそれと
きれいに分離されていることがわかる、さらにそれぞれ
のピーク分取液にエタノールを加え、核酸を糸状沈殿物
として直接回収した。
実施例12 標準試料による分離能評価を終えた実施例６で使用した
カラムについて、実施例11の操作を50回行なった。本操
作終了後、再度、標準試料による分離能評価を行なった
ところ、カラムの劣化は全く見られなかった。
比較例１ 比較製造例１に従って得たHApを用い、以下、実施例３
及び４と全く同一の方法で、牛血清アルブミンの分離を
行なった。得られた結果を第11図に示す。
実施例３及び４ではすぐれた分離能を示し、吸脱着にす
ぐれているのに対し、比較製造例１に従って得た炭酸根
を含有していないHApは、第11図から回収量が劣ること
がわかる。
比較例２ 比較製造例１に従って得たHApを内径7.6mm、長さ100mm
のカラムに充填し、その後の操作は実施例４と同様な操
作で標準試料の分離を行った。尚、この時の充填密度は
0.28g/cm3であった。また流速を1ml/minにするため、1k
g/cm2−Ｇの圧力になるように調整を行なったが、HPLC
としては低圧になるため、操作に困難をきたした。
これにより得られたクロマトグラムを第12図に示す。第
12図と第６図及び第７図との比較からもわかる通り、従
来法に従って得たHApを充填したものは、全体的にブロ
ードなピークを示した。
比較例３ 比較製造例１に従って得たHApを、内径7.6mm、長さ100m
mのカラムに充填圧力15kg/cm2−Ｇで充填した。しかし
内部で結晶が破壊され目づまりが生じ、展開を行うこと
ができなかった。
比較例４ 比較製造例１に従って得たHApを、内径7.6mm、長さ100m
mのカラムに充填して、実施例12と同様の操作を行なっ
たが、五回目でカラム圧力が上昇し展開が不可能となっ
た。
〔発明の効果〕
以上詳細に説明したように、本発明は炭酸根をCO3とし
て0.5重量％以上含有したCOApをLC用またはHPLC用カラ
ムの充填剤として使用する、また、このCOApを充填して
なるカラムの発明である。従来LC用またはHPLC用カラム
は充填材がHApであるので、分離能にやや問題があると
共に、耐圧・耐久性に劣るという問題があった。また、
HApが品質的に再現性良く製造できないという重大な問
題もあった。
これに対し本発明の充填材はCOApであるので分離能が優
れており、また結晶の強度が大きいため耐圧・耐久性に
も優れている。従って、200回以上の繰返し使用が可能
で、優れた耐久性を持っている。以上のことから、本発
明のCOApは特にHPLC用充填材として使用した場合、充填
密度を0.5g/cm3以上とすることができるので、HPLC特有
の展開条件下で一層向上した分離能を示すのである。
さらに、従来のHPLC用カラムは耐圧・耐久性に劣るのに
対し、本発明のカラムにおいてはCOAp結晶が破壊されに
くく、従って、容易に0.5g/cm3以上の密度で充填するこ
とができ、カラムの強度も大で少なくともHPLCの実質的
な充填圧力である10kg/cm2を満足し、さらに500kg/cm2
以上の高い圧力をかけても充填材であるCOAp自体には全
く支障がない。
また、本発明のCOApは従来のHApと異なり結晶を配向さ
せながらHPLC用カラムに充填するという煩雑な操作を必
要としないので、簡単にカラム充填が行なえるという利
点がある。さらに圧力の調整により流速制御ができるの
で展開液も従来品に比べ少量で済むという利点もある。
さらにまた、本発明のカラムは分析を目的としたHPLC用
カラム以外に、分取を目的とした分取用HPLC用カラムと
しても好適に使用でき、必要とされる試料を短時間のう
ちに純度よく分離・精製することが可能であるのであ
る。
また、HApを充填した従来のカラムを使用して分取を行
なう場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸塩
の液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩を必
要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作自体
は短時間であっても、後処理を含めると決して短時間と
はいえなかった。しかし本発明では充填材としてCOApを
使用しているので、溶離液としてこれまで不向きと考え
られていた、揮発性の炭酸塩系溶離液が使用可能である
ので、後処理の時間を大幅に短縮できるという利点も有
している。この点は特に核酸を分離・精製する際に威力
を発揮する。
即ち、核酸類としてたとえばプラスミドDNAを分離・精
製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノールを
加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしこの操作は
燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので前処
理として燐酸塩の脱塩が必要であった。しかしながらこ
こで揮発性塩を使用すれば、直接エタノール添加による
沈殿析出が実施可能であり、合計の処理時間が大幅に軽
減される。
ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
を使用した場合、この処理には通常15〜24時間を必要と
していたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使用可能であ
るので、この脱塩処理時間は１時間以内と大幅に短時間
で完了することができる。この炭酸塩系溶離液の使用は
COApの如く炭酸根を含有するアパタイトを使用すること
で初めて達成できるものであり、従来の如きHApでは達
成できない。
以上種々列記した通り、LC用及びHPLC用カラムの充填材
にCOApを使用することにより種々の効果があり、その産
業上の利用可能性はきわめて大なるものであるといわざ
るを得ない。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第３図はそれぞれ製造例１及び製造例２で得
られた本発明のCOApのＸ線回折図である。第２図及び第
４図はそれぞれ製造例１及び製造例２で得られたCOApの
赤外吸収スペクトルを表す図である。第５図は比較製造
例１で得られたHApの赤外吸収スペクトルを表す図であ
る。 第６図及び第７図はそれぞれ実施例１及び実施例２で行
なったHPLC用カラムによる牛血清アルブミンを展開して
得られたクロマトグラムである。第８図及び第９図はそ
れぞれ実施例３及び実施例４で行なったLC用カラムによ
る牛血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラム
である。 第10図は実施例11で行なったHPLC用カラムによる核酸を
展開して得られたクロマトグラムである。第11図は比較
例１で行なったLC用ガラスカラムによる牛血清アルブミ
ンを展開して得られたクロマトグラムである。第12図は
比較例２で行なったHPLC用カラムによる牛血清アルブミ
ンを展開して得られたクロマトグラムである。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】炭酸根をCO3として0.5〜5.0重量％含有し
    たヒドロキシアパタイトからなることを特徴とする液体
    クロマトグラフィー用充填材。
  2. 【請求項２】炭酸根をCO3として0.5〜5.0重量％含有し
    たヒドロキシアパタイトを充填密度を0.5g/cm3以上に充
    填してなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用
    カラム。
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