JPH0365151B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なフイブリン吸着性ウロキナーゼ
複合体、及びその製造法に関する。 人の尿から精製されるウロキナーゼには、高分
子型（分子量約5.4万で活性中心を含む分子量約
3.2万の重鎖（heavy chain）と、分子量約2.2万
の軽鎖（light chain）がＳ−Ｓで結合している）
と低分子型（上記分子量約３万前後の重鎖からな
る）の２種類があり、低分子型は高分子型が精製
中に限定分解を受けて生じたものであるが〔W.
F.White et al，Biochemistry，５，2160
（1966）〕、インビトロ（in vitro）の酵素活性に
は大差がなく、いずれも血栓溶解酵素剤として、
血栓症の治療に広く臨床で使用されている。しか
しながら之等ウロキナーゼは血栓を構成している
蛋白成分であるフイブリンに対して全く吸着性を
有しておらず、また静注されたウロキナーゼは速
やかに代謝排泄されてしまう等のために、インビ
トロの活性から期待されるほどの治療効果が得ら
れていない現状にある。 一方血中蛋白質であるプラスミンは、フイブリ
ンに対して強い結合性を有し、その結合部位もか
なり詳細に解明されている〔B.Wiman and P.
Wall′en，Thrombosis Research，１，213
（1977）〕。即ち人プラスミンはフイブリン吸着性
に関与する重鎖（分子量約６万）と活性中心を含
む軽鎖（分子量約３万）が２個のＳ−Ｓで結合し
た分子量約９万の蛋白であり、上記重鎖には５つ
の相同性の高い単位構造（「Kringle」と呼ばれ
ている）のくり返しがあり、Kringle1〜３に強
いフイブリン吸着部位があり、Kringle4にも吸
着性がある事が知られでいる〔L.Sottrup−
Jensen et al.，Progress in Chemical
Fibrinolysis and Thrombolysis，３，191
（1978）〕。 本発明は上記プラスミンを始めとしてフイブリ
ンに吸着性のある蛋白を、ウロキナーゼに結合さ
せて、ウロキナーゼにフイブリン結合性を付与す
ることができれば、該ウロキナーゼはその治療目
的である血栓に吸着され、代謝排泄されにくくな
り、血中半減期の延長が期待され、所望の治療効
果を奏し得るという着想から、上記フイブリンに
吸着性を有するウロキナーゼを得ることを目的と
して鋭意研究を重ねた結果、完成されたものであ
る。 本発明の要旨とする所は、高分子型ウロキナー
ゼの重鎖とプラスミンの重鎖とがＳ−Ｓ結合によ
り結合されていることを特徴とするフイブリン吸
着性ウロキナーゼ複合体及びその製造方法に係
る。 本発明の複合体は、血栓溶解剤としてウロキナ
ーゼ単独に比し、より少量の使用で血栓部位に選
択的（局所的）に作用し、代謝排泄が遅延され、
しかもプラスミン阻害剤による影響が少なく、充
分な血栓溶解作用を持続発現し得ると共に、全身
性の出血傾向等の副作用も少なく、非常に有効で
ある。殊に本発明複合体は、高分子型ウロキナー
ゼの重鎖とプラスミンの重鎖とを、之等夫々の重
鎖がそれぞれの軽鎖と本来結合していた部位で、
何らの結合試薬をも介することなくＳ−Ｓ結合に
より結合させた最も自然な構造を有しており、し
かも上記Ｓ−Ｓ結合によるプラスミン重鎖の結合
は、ウロキナーゼの活性発現に無関係と考えられ
る部位で行なわれているため、優れたフイブリン
分解活性（血栓溶解活性）を奏し得る。従つて本
発明の複合体は新しい血栓溶解剤として有用であ
り、医薬品業界、その他の分野において大きく貢
献するものである。また本発明はかかる血栓溶解
剤として有用な新しい複合体を、容易に効率よく
収得する新しい方法をも提供するものである。 以下本発明複合体につき、その製造方法よりこ
れを詳述する。 本発明複合体の製造に用いる高分子型ウロキナ
ーゼ重鎖は、公知の高分子型ウロキナーゼ
〔High Molecular Weight−Urokinase，HMW
−UK，平均分子量54000，Biochemistry，５，
2160（1966）〕より容易に分離、作製できる。即ち
高分子型ウロキナーゼ重鎖は、まず高分子型ウロ
キナーゼ（HMW−UK）を、例えば２−メルカ
プトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエ
リスリトール等のチオール類の存在下で部位還元
して、その重鎖と軽鎖との間のＳ−Ｓ結合を還元
的に切断し、次いで反応液を高分子型ウロキナー
ゼ重鎖の活性中心に対するアフイニテイーリガン
ドを有する樹脂に吸着、溶出させることにより分
離収得することができる〔H.Sumi and K.C.
Robbins，J.Biol.Chem.，258（13）8014
（1983）〕。 本発明複合体の製造に用いるプラスミン重鎖
は、例えば文献〔Eur.J.Biochem.，57，441
（1975）〕等に記載の方法に準じて製造され、これ
はプラスミンを部分還元して得られるメルカプト
基を有するものである。上記プラスミン重鎖は、
上記と同様にして例えばプラスミンを２−メルカ
プトエタノールの存在下に部分還元して、その重
鎖と軽鎖との間のＳ−Ｓ結合を切断し、反応液を
重鎖にのみ親和性を有するリジン−セフアロース
等に吸着、溶出させることにより分離収得するこ
とができる。 上記の如くして得られる高分子型ウロキナーゼ
重鎖とプラスミン重鎖との結合反応は、例えばＳ
−Ｓ交換反応〔Terouanne，B.，Nicolas，J.C.，
Descomps，B.＆ Crustes de Paulet，A.，J.
Immunol.Methods，35，267（1980）〕により実施
することができる。上記Ｓ−Ｓ交換反応は、例え
ば水溶液、生理食塩水もしくはPH４〜10の通常の
緩衝液中、好ましくはPH６〜８の緩衝液中で、０
〜40℃好ましくは室温付近で、好ましくは窒素気
流中で行なわれる。該反応は通常数分〜24時間程
度で完結する。上記において用いられる緩衝液と
しては、公知の各種のものをいずれも使用するこ
とができる。より好ましくは上記結合反応は、予
め高分子型ウロキナーゼ重鎖に大過剰量の５，
5′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）を作用
させて、該重鎖の軽鎖との結合に関与していたシ
ステイン残基にジチオニトロベンゾエート基を付
加し、ジチオニトロベンゾエート付加高分子型ウ
ロキナーゼ重鎖とした後、これにプラスミン重鎖
を反応させる方法により行なうのがよい。 上記結合反応において、高分子型ウロキナーゼ
重鎖もしくはジチオニトロベンゾエート付加高分
子型ウロキナーゼ重鎖とプラスミン重鎖との使用
割合は、適宜に決定されるが、通常高分子型ウロ
キナーゼ重鎖に対してプラスミン重鎖を約0.5〜
10倍モル量程度、好ましくは約１〜５倍モル量用
いるのがよい。 かくして製造される本発明の複合体は、主とし
てプラスミン重鎖１モルに対して高分子型ウロキ
ナーゼ重鎖が１〜３モル、好ましくはほぼ１モル
結合したものである。このことは得られる複合体
の分子量及び該複合体を還元状態とした後、SDS
処理し電気泳動させて生ずるバンドの活性SH基
を測定することにより確認される。即ち上記還元
（Ｓ−Ｓ結合の開裂）によれば、分子量約６万と
約３万のバンドが現われ、該約６万の分子量を有
するバンドは平均３個のSH基を有しており、ま
た約３万の分子量を有するバンドは１個のSH基
を有している。しかしてプラスミン重鎖は、その
軽鎖との間の２個のＳ−Ｓ結合の還元開裂により
生ずる２個のSH基と他に平均１個のSH基を有し
ており、また高分子型ウロキナーゼ重鎖は、その
軽鎖との間のＳ−Ｓ結合の還元的分解により生ず
る１個のSH基を有している。本発明複合体はこ
の各重鎖のSH基が相互に結合したものである。 上記により得られる本発明複合体は、結合反応
終了後、常法に従い、例えば透析法、ゲル過
法、分別沈澱法及びアフイニテイークロマトグラ
フイー等により容易に単離精製できる。またこれ
は通常の凍結乾燥法により保存できる。 上記の如くして得られる本発明複合体は、フイ
ブリン吸着性及びウロキナーゼ活性を有してお
り、血栓溶解剤として血栓症の治療に有効なもの
である。 本発明の製造方法で得られる複合体は、これを
血栓溶解剤として用いるに当り、通常の製剤的担
体と共に製剤組成物の形態とされる。該血栓溶解
剤の投与単位形態としては、各種の形態を治療目
的に応じて適宜選択できるが、通常は注射剤とし
て用いられる。該注射剤は通常の方法で殺菌さ
れ、好ましくは血液と等張とされる。注射剤の形
態に成形するに際して用いられる希釈剤として
は、この分野において慣用されている各種のも
の、例えば水、生理食塩水等を例示できる。なお
この場合等張性の溶液を調整するに充分な量の食
塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを血栓溶解剤中
に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、
緩衝剤、無痛化剤、保存剤等を、更に必要に応じ
て着色剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品
を該血栓溶解剤中に含有せしめてもよい。 血栓溶解剤中に含有させるべき本発明複合体の
量は、特に限定されず広い範囲から適宜選択され
るが、通常全製剤成型物中に約0.01〜30重量％含
有される量とするのがよい。 又上記血栓溶解剤は、その使用に際し、各種形
態に応じた方法で投与されるが、通常は注射剤と
して単独であるいはブドウ糖、アミノ酸輸液等の
補液と混合して静脈内投与される。その投与量は
使用目的、症状等により適宜選択されるが、通常
有効成分である本発明者複合体として１日当り約
1000〜500000単位／Kg（単位：ウロキナーゼ標準
品と比較換算した国際単位）とするのが好まし
く、これは２〜４回に分けて投与してもよい。 以下、本発明に用いる高分子型ウロキナーゼ重
鎖及びプラスミン重鎖の製造乃至調整剤を参考例
として挙げ、次いで本発明複合体の製造令を実施
例として挙げ、更に実施例で得た複合体の薬理試
験例を挙げる。尚各例における各種活性の測定法
及びその他物性等の試験法は以下の通りである。 Γ ウロキナーゼ活性測定 合成基質法；ウロキナーゼサンプルを0.15M
−Nacl及び５ｇ／ポリエチレングリコール
（PEG6000 和光純薬K.K.）を含む水溶液で適
当濃度に希釈し、その100μに0.1M−Naclを
含有する0.05M−トリス塩酸緩衝液（PH＝8.4）
800μを加え、37℃、１分加温後、これに基
質Ｓ−2444（PyroGlu−Gly−Ary−ｐ−
Nitroanilide、第１化学薬品社製）の0.3μMを
上記緩衝液に加えた液100μを添加し、37℃、
２分インキユベートする。50％酢酸水溶液
100μを加えて反応を停止させ、405nｍにて
吸光度を測定する。標準ウロキナーゼを用い同
様に操作して得られた吸光度より、サンプルの
活性を算定する。 フイブリン平板法；0.3％フイブリンノーゲ
ン（Povite社製）の0.1M−NaCl加0.05Mベロ
ナール緩衝液（PH＝8.0）６mlに、最終0.02M
のCaCl₂、最終的3NIH単位／mlの牛トロンビ
ン（持田製薬社製）を加え撹拌後、シヤーレ
（内径8.5cm）にまき、フイブリン平板を調製す
る。0.1％ウサギ血清アルブミン（シグマ社製）
の上記緩衝液に溶解したウロキナーゼサンプル
の10μを、上記フイブリン平板ひスポツト
し、37℃、16時間インキユベート後、溶解円の
径を測定する。 Γ SH基の定量 サンプル100μを脱気後、これに脱気N₂置換
した0.2M−トリス緩衝液（PH＝8.2）１mlを加
え、次いで脱気したメタノールに溶解した0.01M
−５，5′，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）100μを添加し、撹拌後、室温にて約30分
放置後、412nｍの吸光度を測定する。２−メル
カプトエタノールを標準としてサンプルのSH基
量を換算する。 Γ SDS ポリアクリルアミドゲル（SDS−
PAGE）電気泳動 サンプルを40％グリセロール及び２％SDSを含
有する0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH＝8.0）に等
量混合し、100℃、２分加熱後、12.5％分離用ゲ
ル及び４％濃縮用ゲルを用いラエメリ（U.K.
Laemmli）らの方法〔Nature（London），227，
680（1970）〕及びフアルマシア社製グラジエント
ルゲルPAA4/30により泳動させる。泳動後コマ
ーシーブリリアントブルー（C.B.B）染色し、標
準蛋白（モレキユラーウエイトキツト、フアルマ
シア社製）より分子量を換算する。 参考例 １ 高分子型ウロキナーゼ重鎖の製造 高分子型ウロキナーゼ（日本ケミカルリサーチ
社製）130万単位（合成基質法による、以下同じ）
を含む溶液（0.05Mトリス塩酸緩衝液、PH8.0、
0.15MNaCl及び0.02MEDTAを含有する）２ml
に、窒素置換後、最終濃度が0.01Mとなるように
２−メルカプトエタノールを加え、窒素気流下、
室温で約10時間撹拌した。冷却後、４℃下でセフ
アデツクスＧ−25フアインカラムアルマシア社、
1.5cm径×1.5cm長さ）で未反応のメルカプトエタ
ノールを除いた。カラムの平衡化及び溶出には、
充分窒素置換した同上緩衝液を用いた。次いで得
られた蛋白ピーク画分（約９ml）に、0.01M−
５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）の同
上緩衝液１mlを加え、室温下で30分間撹拌後、
1N−HClでPHを7.5に調整し、４℃下ベンズアミ
ジン−CH−セフアロース（ホルムベルグ（L.
Holmberg）らの方法〔Biochemica et
Biophysica Acta，445，215（1976）〕に準じて作
製した）のカラム（1.5cm径×４cm長さ）に吸着
させた。同カラムは、窒素置換した0.05M−トリ
ス塩酸緩衝液（PH7.5、0.4MNaCl及び
0.01MEDTAを含有する）で平衡化及び洗浄し、
0.4MNaClを含む0.1M酢酸で溶出した。溶出液の
蛋白ピーク画分を、ダイアフロー限外過膜PM
−10（アミコン社製）で濃縮後、窒素置換した
0.01M−リン酸ナトリウム緩衝液（PH8.0、
0.15MNaCl及び0.01MEDTAを含有する）で４
℃下に透析した。以上の操作により、ジチオニト
ロベンゾエート基を付加したウロキナーゼ（活性
重鎖）、約100万単位を得た。 得られたジチオニトロベンゾエート付加高分子
型ウロキナーゼ重鎖の分子量は、SDS PAGEに
より32000であつた。また該重鎖がジチオニトロ
ベンゾエート基を付加されていることは、５，５
−ジチオービス（２−ニトロ安息香酸）を作用さ
せた際に副生する５−メルカプト−２−ニトロ安
息香酸の量を測定することにより確認された。 参考例 ２ プラスミン重鎖の製造 ヒト血液より精製したプラスミノーゲン300mg
を0.1M−NaCl及び25％グリセロールを含有する
0.05M−トリス塩酸緩衝液（PH＝7.8）60mlに溶
解し、ウロキナーゼ18000単位を添加し、25℃で
８時間インキユベートする。更に9000単位のウロ
キナーゼを添加して25℃で16時間インキユベート
した。この溶液にｐ−ニトロフエニル−ｐ−グア
ニジノベンゾエート塩酸塩34mgを0.4mlのＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（DMF）に溶かした溶
液を加え、37℃で10分間撹拌した後、窒素置換
し、２−メルカプトエタノールを最終0.1M濃度
となるように添加し、20℃で20分間撹拌した。そ
の後氷冷し、あらかじめ窒素置換した0.2M−
NaCl，0.01M−EDTA及び0.001M−２−メルカ
プトエタノールを含有する0.01M−リン酸ナトリ
ム緩衝液（PH＝7.2）で充分に平衡化したリジン
セフアロースカラム（第一化学薬品株式会社製，
５cm径×15cm長さ）に付し、同緩衝液で洗浄し、
続いて0.001M−６−アミノヘキサン酸、0.15M
−NaCl、0.01M−EDTA及び−0.001M−２−メ
ルカプトエタノールを含む0.01M−リン酸ナトリ
ウム緩衝液（PH＝7.2）で洗浄した後、0.003M−
６−アミノヘキサン酸を含む同緩衝液で溶出し、
280nｍでの吸光度のピーク画分を集め、アミコ
ンPM−10限外過膜（アミコン社製）にて、窒
素加圧下に50mlまで濃縮した。濃縮液をあらかじ
め窒素置換した0.15M−NaCl及び0.01M−
EDTAを含む0.01M−リン酸ナトリウム緩衝液
（PH＝7.2）で平衡化したセフアデツクスＧ−25カ
ラム（フアルマシア社、５cm径×20cm長さ）に付
し、同緩衝液で溶出した。280nｍでの吸光度の
ピーク画分を集め、アミコンPM−10限外過膜
にて窒素加圧下に濃縮し、約100mgのプラスミン
重鎖を得る。このものは１モル当り約３モルの
SH基が検出された。 実施例 １ 参考例１で得たウロキナーゼ重鎖約100万単位
（８ml溶液）を、参考例２で得たプラスミン重鎖
24mg（約５ml、あらかじめ1N−NaOHでPH８に
調整）と混合し、窒素置換後、窒素気流下、室温
で４時間撹拌した。次いでＮ−エチルマレイミド
を最終濃度が1mMとなるように添加し、更に20
分間撹拌後、反応液をダイアフロー限外過膜
PM−10で濃縮した。濃縮液をセフアデツクス・
Ｇ−150−スーパーフアインカラム（フアルマシ
ア社、2.6cm径×92cm長さ）でゲル過した。同
カラムは0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.5、
0.5MNaCl含有）にて平衡化及び溶出した。溶出
液を３mlずつ分画し、その酵素活性を、Ｓ−2444
（カビ社製、スエーデン）を基質として前記合成
基質法に従い測定した。分子量９〜10万付近と考
えられる活性ピーク両分を混合し、ダイアフロー
限外過膜PM−10で濃縮し、同膜上で内液緩衝
液組成をリン酸塩緩衝化生理食塩水に置換した。
上記の方法により本発明複合体約12万単位（標準
ウロキナーゼと合成基質法で比較した国際単位）
を得た。 得られた複合体の分子量は、SDS PAGEで約
９〜10万であつた。またこの複合体を再び還元状
態に戻し、SDS処理後電気泳動させると、約６万
の分子量を有するバンドと約３万の分子量を有す
るバンドが出現した。これらのことから上記複合
体は、高分子型ウロキナーゼ重鎖とプラスミン重
鎖とが１対１のモル比でＳ−Ｓ結合したものであ
ると同定される。 ＜薬理試験＞ (1) フイブリン溶解活性試験 (イ) 実施例１で得た複合体につき、フイブリン
平板法により、その溶解活性を測定した。結
果を第１図に示す。 第１図中、ヨコ軸は合成基質法により測定
したウロキナーゼ活性（単位／ml）を、タテ
軸は本法によるフイブリン溶解活性（溶解円
直径、mm）を示す。また第１図において線
(1)は本発明複合体は、また線(2)はHMW−
UK（コントロール）をそれぞれ示す。 該図より本発明の複合体は、コントロール
とするHMW−UKに比し顕著に優れたフイ
ブリン溶解活性を保持していることが明らか
である。 またヒト血漿よりM.Moroi等の方法〔J.
Biol.Chem.251，5956（1976）〕に従つて得た
プラスミンインヒビターを、サンプル0.5ml
に対して0.5ml加え、該プラスミンインヒビ
ターの存在下に同様な溶解活性試験を行つた
結果、いずれのサンプルも溶解活性が低下す
る本発明複合体はプラスミンインヒビターの
存在下でも、上記と同様にコントロールとす
るウロキナーゼよりも優れたフイブリン溶解
活性を奏することが確認された。 (2) フイブリン吸着能試験 実施例１で得た本発明複合体のフイブリン結
合能を下記方法により試験した。即ちフイブリ
ン−モノマー−セフアロース6B（ハーネ（D.L.
Heene）らの方法〔Thrombosis Research，
２，137（1973）〕に準じて作成した）の３mlを
充填したカラムを0.135MNaClを含有する
0.005Mリン酸ナトリウム塩緩衝液（PH＝7.4）
で平衡化後、上記緩衝液に溶解した本発明複合
体、HMW−UK、プラスミノーゲン又はプラ
スミン重鎖（各２〜３mg）をアプライし、上記
緩衝液30mlにて洗浄した。10mM−６−アミノ
ヘキサン酸を含有する上記緩衝液にて溶出し、
プラスミノーゲン及びプラスミン重鎖は、溶出
画分の280nｍにおける吸収より、又本発明複
合体及びHMW−UKは、溶出画分のウロキナ
ーゼ活性を合成基質法により測定した活性よ
り、夫々の溶出画分への回収率を求め、これを
フイブリン吸着能とした。 上記試験の結果、本発明複合体は、優れたフ
イブリン吸着能を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明複合体のフイブリン溶解活性
を示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 高分子型ウロキナーゼの重鎖とプラスミンの
   重鎖とがＳ−Ｓ結合により結合されていることを
   特徴とするフイブリン吸着性ウロキナーゼ複合
   体。 ２ 高分子ウロキナーゼの重鎖とプラスミンの重
   鎖とをＳ−Ｓ交換反応により結合させることを特
   徴とするフイブリン吸着性ウロキナーゼ複合体の
   製造方法。