JPH0249708B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なフイブリン吸着性蛋白―ウロキ
ナーゼ複合体の製造法に関する。 血栓溶解酵素ウロキナーゼは、血栓症治療剤と
して広く臨床で使用されているが、血栓を構成し
ている蛋白成分であるフイブリンに対して、ウロ
キナーゼは、吸着性を有しておらず、また静注さ
れたウロキナーゼは速やかに代謝排泄されてしま
う等のために、インビトロ（in vitro）の活性か
ら期待されるほどの治療効果が得られていない。
このため、欧米等においては該ウロキナーゼの大
量投与が行なわれているが、この場合、全身的に
プラスミノーゲンの活性化を引き起こし、フイブ
リノーゲンの分解等による出血傾向等の副作用も
大きい。また流血中にはα2―プラスミンインヒビ
ター（α2―Plasmin Inhibitor）やα2―マクログ
ロブリン（α2―Macroglobulin）等のプラスミン
阻害剤が多量に含まれており、ウロキナーゼのプ
ラスミン活性化（生成）による血栓溶解作用を阻
止している。 この様な観点から本発明者らはフイブリンに吸
着性のある蛋白をウロキナーゼに結合させて、ウ
ロキナーゼにフイブリン結合性を付与することが
できれば、ウロキナーゼはその治療目的である血
栓に吸着され、代謝排泄されにくくなり、血中半
減期の延長が期待され、又フイブリン上では上記
したプラスミン阻害剤の作用を受けにくくなり治
療効果の増大が期待され、更に血栓存在部位で局
所的にプラスミノーゲンが活性化されるため出血
傾向等の副作用の軽減が期待されるという着想か
ら、上記フイブリンに吸着性を有するウロキナー
ゼを得ることを目的として鋭意研究を重ねた。そ
の結果、フイブリン吸着性蛋白としてプラスミン
由来のヘビーチエイン（以下これを「プラスミン
HC」とする）を使用し、これを特定の蛋白結合
試薬を介してウロキナーゼと結合させて得られる
複合体は、フイブリン吸着能を有し、また所望の
ウロキナーゼ活性を具備し新規な血栓溶解剤とし
て有効であることを見い出した。本発明はこの新
しい知見に基づいて完成されたものである。 即ち、本発明はフイブリン吸着性蛋白とウロキ
ナーゼとを、一般式 〔式中、Ａ及びＢは、各々低級アルキレン基を、
ｌ及びｍは、各々０又は１を示す。〕 で表わされる蛋白結合試薬の存在下に反応させる
ことを特徴とするフイブリン吸着性蛋白―ウロキ
ナーゼ複合体の製造法に係る。 上記本発明方法により得られる複合体は、血栓
溶解剤としてウロキナーゼ単独に比し、より少量
の使用で血栓部位に選択的（局所的）に作用し、
代謝排泄が遅延され、しかもプラスミン阻害剤に
よる影響が少なく、充分な血栓溶解作用を持続発
現し得ると共に、全身性の出血傾向等の副作用も
少なく、非常に有効である。本発明はかかる血栓
溶解剤として有用な新しい複合体を容易に効率よ
く収得する新しい方法を確立するものであり、医
薬品業界、その他の分野において大きく貢献する
ものである。 本発明方法において、蛋白結合試薬として利用
する上記一般式〔〕で表わされる化合物におい
てＡ及びＢで示される低級アルキレン基として
は、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラ
メチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２
―メチル・トリメチレン基等の炭素数１〜６のア
ルキレン基を例示できる。該一般式〔〕で示さ
れる化合物は、公知又は新規化合物を含み、例え
ば文献〔T.Kitagawa他、J.Biochem.（Tokyo）
79，233（1976）〕等に記載の方法に準じて容易に
合成することができる。 また本発明に用いるフイブリン吸着性蛋白とし
てのプラスミンHCは、例えば文献〔Eur.J.
Biochem.，57，441（1975）〕等に記載の方法に準
じて製造され、これはプラスミンを部分還元して
得られるメルカプト基を有するものである。更に
本発明においてウロキナーゼとしては特に限定な
く公知の各種のもの、例えばローモレキユラーウ
エイト―ウロキナーゼ及びハイモレキユラーウエ
イト―ウロキナーゼ〔Low Molecular Weight
―Urokinase，LMW―UK，平均分子量32000；
High Molecular Weight―Urokinase，HMW
―UK，平均分子量54000、Biochemistry，５，
2160（1966）〕等を使用することができる。 本発明の上記フイブリン吸着性蛋白とウロキナ
ーゼとの結合反応は、例えば水溶液、生理食塩水
もしくはPH４〜10の通常の緩衝液中、好ましくは
PH６〜８の緩衝液中で、０〜40℃好ましくは室温
付近で、好ましくは窒素気流中で行なわれる。該
反応は通常約１〜24時間、好ましくは２〜３時間
で完結する。上記において用いられる緩衝液とし
ては、アンモニア及びアミノ基を含有しない公知
の各種のものをいずれも使用することができる。 上記結合反応において、フイブリン吸着性蛋
白、ウロキナーゼ及び一般式〔〕で表わされる
蛋白結合試薬の使用割合は、適宜に決定される
が、通常ウロキナーゼに対してフイブリン吸着性
蛋白を0.3〜４倍モル量程度、好ましくは約0.5〜
２倍モル量、蛋白結合試薬を１〜50倍モル量程
度、好ましくは約３〜10倍モル量用いるのがよ
い。 かくして本発明の製造法で製造される複合体
は、主としてフイブリン吸着性蛋白１モルに対し
てウロキナーゼが１〜３モル、好ましくはほぼ１
モル結合したものであり、これは結合反応終了
後、常法に従い、例えば透析法、ゲル過法、分
別沈殿法及びアフイニテイークロマトグラフイー
等により容易に単離精製できる。またこれは通常
の凍結乾燥法により保存できる。 上記の如くして得られる複合体は、フイブリン
吸着能及びウロキナーゼ活性を有しており、血栓
溶解剤として血栓症の治療に有効なものである。 本発明の製造法で得られる複合体は、これを血
栓溶解剤として用いるに当り、通常の製剤的担体
と共に製剤組成物の形態とされる。該血栓溶解剤
の投与単位形態としては、各種の形態を治療目的
に応じて適宜選択できるが、通常は注射剤として
用いられる。該注射剤は通常の方法で殺菌され、
好ましくは血液と等張とされる。注射剤の形態に
成形するに際して用いられる稀釈剤としては、こ
の分野において慣用されている各種のもの、例え
ば水、生理食塩水等を例示できる。なおこの場合
等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブド
ウ糖あるいはグリセリンを血栓溶解剤中に含有せ
しめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、
無痛化剤、保存剤等を更に必要に応じて着色剤、
保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を
該血栓溶解剤中に含有せしめてもよい。 血栓溶解剤中に含有させるべき本発明の複合体
の量は、特に限定されず広い範囲から適宜選択さ
れるが、通常全製剤組成物中に約0.01〜30重量％
含有される量とするのがよい。 又上記血栓溶解剤は、その使用に際し、各種形
態に応じた方法で投与されるが、通常は注射剤と
して単独であるいはブドウ糖、アミノ酸輸液等の
補液と混合して静脈内投与される。その投与量は
使用目的、症状等により適宜選択されるが、通常
有効成分であるフイブリン吸着性蛋白―ウロキナ
ーゼ複合体として１日当り約1000〜500000単位／
Kgとするのが好ましく、これは２〜４回に分けて
投与してもよい。 以下本発明に用いるフイブリン吸着性蛋白及び
ウロキナーゼの製造乃至調製例を参考例として挙
げ、次いで本発明複合体の製造例を実施例として
挙げ、更に実施例で得た複合体の薬理試験例を挙
げる。尚各例における各種活性の測定法及びその
他物性等の試験法は以下の通りである。 Γウロキナーゼ活性測定 合成基質法；ウロキナーゼサンプルを0.15M
―NaCl及び５ｇ／ポリエチレングリコール
（PEG6000 和光純薬K.K.）を含む水溶液で適
当濃度に希釈し、その100μに0.1M―NaClを
含有する0.05M―トリス塩酸緩衝液（PH＝8.4）
800μを加え、37℃、１分加温後、これに基
質Ｓ―2444（Pyro Glu―Gly―Arg―ｐ―
Nitroanilide、第１化学薬品社製）の0.3μMを
上記緩衝液に加えた液100μを添加し、37℃、
２分インキユベートする。50％酢酸水溶液
100μを加えて反応を停止させ、405nmにて吸
光度を測定する。標準ウロキナーゼを用い同様
に操作して得られた吸光度より、サンプルの活
性を（国際単位として標示）を算定する。 フイブリン平板法；0.3％牛フイブリノーゲ
ン（Poviet社製）の0.1M―NaCl加0.05Mベロ
ナール緩衝液（PH＝8.0）６mlに、最終0.02M
のCaCl2、最終約3NIH単位／mlの牛トロンビ
ン（持田製薬社製）を加え撹拌後、シヤーレ
（内径8.5cm）にまき、フイブリン平板を調製す
る。0.1％ウサギ血清アルブミン（シグマ社製）
の上記緩衝液に溶解したウロキナーゼサンプル
の10μを、上記フイブリン平板にスポツト
し、37℃、16時間インキユベート後、溶解円の
径を測定する。 ΓSH基の定量 サンプル100μを脱気後、これに脱気N2置換
した0.2M―トリス塩酸緩衝液（PH＝8.2）１mlを
加え、次いで脱気したメタノールに溶解した
0.01M―５，5′―ジチオビス（２―ニトロ安息香
酸）100μを添加し、撹拌後、室温にて約30分
放置後、412nmの吸光度を測定する。２―メルカ
プトエタノールを標準としてサンプルのSH基量
を換算する。 Γｍ―マレイミドベンゾイル基（MB基）の定量 サンプル100μを脱気後、２―メルカプトエ
タノールの水溶液25μ（35ナノモル）を添加
し、37℃、20分インキユベートする。以下上記
SH基の定量と同様にして、残存２―メルカプト
エタノール量を測定して、サンプルのMB基量を
換算する。 ΓSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS―
PAGE） サンプルを40％グリセロール及び２％SDSを含
有する0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH＝8.0）に等
量混合し、100℃、２分加熱後、12.5％分離用ゲ
ル及び４％濃縮用ゲルを用いラエメリ（U.K.
Laemmli）らの方法〔Nature（London），227，
680（1970）〕及びフアルマミア社製グラジエント
ゲルPAA4／30により泳動させる。泳動後コマー
シーブリリアントブルー（C.B.B.）染色し、標準
蛋白（モレキユラーウエイトキツト、フアルマミ
ア社製）より分子量を換算する。 参考例 １ プラスミンHCの製造 リツクリ（E.E.Rickli）らの方法〔Eur.J.
Biochem.，59，441（1975）〕に準じて行つた。す
なわちチバー（B.A.K.Chibber）らの方法
〔Methods in Enzymology，34，424（1974）〕に
準じてヒト血液より精製したプラスミノーゲン
150mgを、0.1M―NaCl及び25％グリセロールを
含有する0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH＝7.8）に
溶解し、ウロキナーゼ（日本ケミカルリサーチ社
製）約3000単位を添加し、室温下８時間インキユ
ベートする。更に1500単位の同ウロキナーゼを添
加して、室温下に16時間インキユベートする。こ
の溶液を窒素置換し、２―メルカプトエタノール
を最終0.1M濃度となるように添加し、20℃、20
分間放置する。その後氷冷し、あらかじめ窒素置
換した0.01M―EDTA及び0.001M―２―メルカ
プトエタノールを含有する0.01M―リン酸ナトリ
ウム塩緩衝液（PH＝7.2）で充分に平衡化したリ
ジン―セフアロースセラム（５cmφ×10cm）に付
し、該緩衝液約１で洗浄後、0.05M ６―アミ
ノヘキサン酸の同緩衝液で溶出し、280nmでの吸
光度のピーク画分を集め、アミコンPM―10限外
過膜（アミコン社製）にて、窒素加圧下に濃縮
する。これに２―メルカプトエタノールを除いた
上記緩衝液を加え再度濃縮する。この操作を数回
繰り返して約60mgのプラスミンHCを得る。これ
は窒素置換して−80℃に保存した。このものは１
モル当り約３モルのSH基が検出された。 実施例 １ LMW―UK（日本ケミカルリサーチ社製）を
アミコンPM―10にて濃縮後0.01M―リン酸ナ
トリウム塩緩衝液（PH＝7.0）にて透析する。
内液を遠心分離（8000rpm×10分）して得た上
清（LMW―UK量約１ミリモル）に6.7ミリモ
ルのｍ―マレイミドベンゾイル Ｎ―ヒドロキ
シサクシンイミドエステル（一般式〔〕、ｍ
―位置換、ｌ＝ｍ＝０、Pierce社製、以下
MBSという）のジメチルホルムアミド
（DMF）溶液を撹拌しながら滴下し、室温で30
分撹拌する。これを脱気した0.1Mリン酸ナト
リウム塩緩衝液（PH＝6.0）にて平衡化したセ
フアデツクスＧ―25フアインカラム（フアルマ
シア社製、1.5cmφ×20cm）に付し、同緩衝液
にて展開する。280nmでの吸光度のピーク画分
を分取して、MB基が結合したLMW―UK0.9
ミリモルを得る。このものはLMW―UK1モル
に対してMB基が平均2.7モル結合していた。 参考例１と同一操作により得たプラスミン
HC123mg及び上記で得たMB基含有LMW―
UK29.5mgを混合し、充分窒素置換し、室温下
３時間撹拌する。これに２―メルカプトエタノ
ールを最終1mM濃度となるように加え、10分
撹拌後、Ｎ―エチルマレイミドを最終2mM濃
度となるように加え室温下に20分撹拌する。こ
れを0.4M―NaClを含有する0.1M―リン酸ナト
リウム塩緩衝液にて平衡化したセフアデツクス
Ｇ―25フアインカラム（フアルマシア社製；
2.6cmφ×30cm）にてゲル過し280nmの吸光
度のピーク画分を分取し、これを上記緩衝液で
平衡化したベンズアミジン―CH―セフアロー
ス（ホルムベルグ（L.Holmberg）らの方法
〔Biochemica et Biophysica Acta，445，215
（1976）〕に準じて作製した）のカラム（2.5cm
φ×5.8cm）に付し、同緩衝液900mlで洗浄後、
0.1M―NaClを含有する0.1M酢酸水溶液及び
6M―尿素水溶液で溶出し、その280nmの吸光
度ピーク画分を合わせ、これを0.1M炭酸水素
アンモニウム水溶液で平衡化したセフアデツク
スＧ―25カラム（５cmφ×25cm）にてゲル過
後、得られた吸光度ピークの画分を0.1M―炭
酸水素アンモニウム水溶液で平衡化したリジン
―セフアロースカラム（1.6cmφ×14cm）に付
し、同液400ml、次いで0.2M ６―アミノヘキ
サン酸水溶液100mlで洗浄後、2M―KSCN水溶
液にて溶出する。溶出液の吸光度ピークの画分
を脱塩後、アミコンPM―10にて濃縮して、本
発明のプラスミンHC―LMW―UK複合体〔以
下「複合体Ａ」とする〕22.3mgを得る。 得られた複合体Ａは、SDS―PAGEにて分子
量８〜９万のバンドとして確認され、LMW―
UK1モルに対してプラスミンHCが約１モル結
合したものである。 実施例 ２ 前記実施例１において蛋白結合試薬として
MBSの代りに、以下の各化合物を使用し、同様
にしてプラスミンHC―LMW―UK複合体を夫々
得る。 〈蛋白結合試薬〉 Γ１―〔４―（２，５―ジオキソ―１―ピロリジ
ニルオキシカルボニル）フエニル〕―２，５―
ジヒドロピロール―２，５―ジオン 〔一般式〔〕、ｐ―位置換、ｍ＝ｌ＝０〕 Γ１―｛４―〔４―（２，５―ジオキソ―１―ピ
ロリジニルオキシカルボニル）ブチル〕フエニ
ル｝―２，５―ジヒドロピロール―２，５―ジ
オン 〔一般式〔〕、ｐ―位置換、(A)l＝（―CH2）―4、
ｍ＝０〕 Γ１―〔４―（２，５―ジオキソ―１―ピロリジ
ニルオキシカルボニル）ベンジル〕―２，５―
ジヒドロピロール―２，５―ジオン 〔一般式〔〕、ｐ―位置換、(B)n＝―CH2―、
ｌ＝０〕 得られた各複合体を順次「複合体Ｂ」、「複合体
Ｃ」及び「複合体Ｄ」とする。之等各複合体は、
SDS―PAGEにて、いずれも８〜９万のバンドと
して確認され、LMW―UK及びプラスミンHCの
モル比は約１：１である。 〈薬理試験〉 (1) フイブリン溶解活性試験 実施例１で得た複合体につき、フイブリン平
板法により、その溶解活性を測定した。結果を
第１図に示す。 第１図中、ヨコ軸は合成基質法により測定し
たウロキナーゼ活性（単位／ml）を、タテ軸は
本法による溶解円の直径（mm）を示す。また第
１図において線１は本発明実施例１で得た複合
体Ａを、また線２はLMW―UK（コントロー
ル）をそれぞれ示す。 該図より本発明の複合体Ａは、10単位／mlで
は、コントロールのLMW―UKと同程度にフ
イブリン溶解活性を保持しており、更に低濃度
ではコントロールよりも高い溶解活性を示すこ
とが明らかである。 (2) フイブリン吸着能試験 実施例１で得た複合体Ａのフイブリン結合能
を下記方法により試験した。即ちフイブリン―
モノマー―セフアロース6B（ハーネ（D.L.
Heene）らの方法〔Thrombosis Research，
２，137（1973）〕に準じて作成した）の３mlを
充填したカラムを0.135M NaClを含有する
0.005Mリン酸ナトリウム塩緩衝液（PH＝7.4）
で平衡化後、上記緩衝液に溶解した複合体Ａ、
HNW―UK、プラスミノーゲン又はプラスミ
ンHC（各２〜３mg）をアプライし、上記緩衝
液30mlにて洗浄する。10mM―６―アミノヘキ
サン酸を含有する上記緩衝液にて溶出し、プラ
スミノーゲン及びプラスミンHCは、溶出画分
の280nmにおける吸収より、又複合体Ａ及び
HMW―UKは、溶出画分のウロキナーゼ活性
を合成基質法により測定した活性より、夫々の
溶出画分への回収率を求め、これをフイブリン
吸着能とする。 上記試験の結果、本発明の複合体Ａは、プラ
スミノーゲンの約１／２及びプラスミンHCの
約１／４のフイブリン吸着能を保持し、ウロキ
ナーゼに比較して約10倍の強いフイブリン吸着
能を示した。 (3) ウサギ実験肺塞栓症に対する治療効果 この試験は、マツオ（O.Matsuo）らの方法
〔Nature，291，590（1981）〕に準じて行なつ
た。即ち 125I―フイブリノーゲンを混合した
新鮮ヒト血液から人工血栓を調製し、これを麻
酔下にウサギ頚静脈より注入し、肺塞栓症モデ
ルを作成する。実施例１で得た複合体Ａ又はコ
ントロールとしてのHMW―UK又は生理食塩
水を、耳静脈より６時間かけて持続注入し、経
時的に採血してその放射活性を測定し、投与し
た血栓の全放射活性より、その百分率を算定す
る。また、９時間後、肺を取出し、残存血栓を
回収し、その放射活性より、投与血栓の溶解率
を求める。更に肺及び尿中への放射活性の回収
率を算定する。尚、放射活性総回収率は、血
液、尿、肺及び回収血栓の放射活性の合計を、
投与した人工血栓の放射活性に対する百分率と
して算定した。 結果を第１表に示す。 【表】 上記第１表から明らかなように、HMW―
UK5万単位／body投与では、生理食塩水のみの
場合と全く変らないが、複合体Ａの５万単位投与
群では、血中の放射活性は全期間を通じて有意に
高く、また尿中への排泄量も多くなつている。更
に回収した血栓の放射活性から換算した血栓溶解
率も10％程度にまで上昇しており、有意に高い血
栓溶解作用が認められることが判る。なお複合体
Ａ投与群においては出血傾向は全く見られなかつ
た。
ナーゼ複合体の製造法に関する。 血栓溶解酵素ウロキナーゼは、血栓症治療剤と
して広く臨床で使用されているが、血栓を構成し
ている蛋白成分であるフイブリンに対して、ウロ
キナーゼは、吸着性を有しておらず、また静注さ
れたウロキナーゼは速やかに代謝排泄されてしま
う等のために、インビトロ（in vitro）の活性か
ら期待されるほどの治療効果が得られていない。
このため、欧米等においては該ウロキナーゼの大
量投与が行なわれているが、この場合、全身的に
プラスミノーゲンの活性化を引き起こし、フイブ
リノーゲンの分解等による出血傾向等の副作用も
大きい。また流血中にはα2―プラスミンインヒビ
ター（α2―Plasmin Inhibitor）やα2―マクログ
ロブリン（α2―Macroglobulin）等のプラスミン
阻害剤が多量に含まれており、ウロキナーゼのプ
ラスミン活性化（生成）による血栓溶解作用を阻
止している。 この様な観点から本発明者らはフイブリンに吸
着性のある蛋白をウロキナーゼに結合させて、ウ
ロキナーゼにフイブリン結合性を付与することが
できれば、ウロキナーゼはその治療目的である血
栓に吸着され、代謝排泄されにくくなり、血中半
減期の延長が期待され、又フイブリン上では上記
したプラスミン阻害剤の作用を受けにくくなり治
療効果の増大が期待され、更に血栓存在部位で局
所的にプラスミノーゲンが活性化されるため出血
傾向等の副作用の軽減が期待されるという着想か
ら、上記フイブリンに吸着性を有するウロキナー
ゼを得ることを目的として鋭意研究を重ねた。そ
の結果、フイブリン吸着性蛋白としてプラスミン
由来のヘビーチエイン（以下これを「プラスミン
HC」とする）を使用し、これを特定の蛋白結合
試薬を介してウロキナーゼと結合させて得られる
複合体は、フイブリン吸着能を有し、また所望の
ウロキナーゼ活性を具備し新規な血栓溶解剤とし
て有効であることを見い出した。本発明はこの新
しい知見に基づいて完成されたものである。 即ち、本発明はフイブリン吸着性蛋白とウロキ
ナーゼとを、一般式 〔式中、Ａ及びＢは、各々低級アルキレン基を、
ｌ及びｍは、各々０又は１を示す。〕 で表わされる蛋白結合試薬の存在下に反応させる
ことを特徴とするフイブリン吸着性蛋白―ウロキ
ナーゼ複合体の製造法に係る。 上記本発明方法により得られる複合体は、血栓
溶解剤としてウロキナーゼ単独に比し、より少量
の使用で血栓部位に選択的（局所的）に作用し、
代謝排泄が遅延され、しかもプラスミン阻害剤に
よる影響が少なく、充分な血栓溶解作用を持続発
現し得ると共に、全身性の出血傾向等の副作用も
少なく、非常に有効である。本発明はかかる血栓
溶解剤として有用な新しい複合体を容易に効率よ
く収得する新しい方法を確立するものであり、医
薬品業界、その他の分野において大きく貢献する
ものである。 本発明方法において、蛋白結合試薬として利用
する上記一般式〔〕で表わされる化合物におい
てＡ及びＢで示される低級アルキレン基として
は、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラ
メチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２
―メチル・トリメチレン基等の炭素数１〜６のア
ルキレン基を例示できる。該一般式〔〕で示さ
れる化合物は、公知又は新規化合物を含み、例え
ば文献〔T.Kitagawa他、J.Biochem.（Tokyo）
79，233（1976）〕等に記載の方法に準じて容易に
合成することができる。 また本発明に用いるフイブリン吸着性蛋白とし
てのプラスミンHCは、例えば文献〔Eur.J.
Biochem.，57，441（1975）〕等に記載の方法に準
じて製造され、これはプラスミンを部分還元して
得られるメルカプト基を有するものである。更に
本発明においてウロキナーゼとしては特に限定な
く公知の各種のもの、例えばローモレキユラーウ
エイト―ウロキナーゼ及びハイモレキユラーウエ
イト―ウロキナーゼ〔Low Molecular Weight
―Urokinase，LMW―UK，平均分子量32000；
High Molecular Weight―Urokinase，HMW
―UK，平均分子量54000、Biochemistry，５，
2160（1966）〕等を使用することができる。 本発明の上記フイブリン吸着性蛋白とウロキナ
ーゼとの結合反応は、例えば水溶液、生理食塩水
もしくはPH４〜10の通常の緩衝液中、好ましくは
PH６〜８の緩衝液中で、０〜40℃好ましくは室温
付近で、好ましくは窒素気流中で行なわれる。該
反応は通常約１〜24時間、好ましくは２〜３時間
で完結する。上記において用いられる緩衝液とし
ては、アンモニア及びアミノ基を含有しない公知
の各種のものをいずれも使用することができる。 上記結合反応において、フイブリン吸着性蛋
白、ウロキナーゼ及び一般式〔〕で表わされる
蛋白結合試薬の使用割合は、適宜に決定される
が、通常ウロキナーゼに対してフイブリン吸着性
蛋白を0.3〜４倍モル量程度、好ましくは約0.5〜
２倍モル量、蛋白結合試薬を１〜50倍モル量程
度、好ましくは約３〜10倍モル量用いるのがよ
い。 かくして本発明の製造法で製造される複合体
は、主としてフイブリン吸着性蛋白１モルに対し
てウロキナーゼが１〜３モル、好ましくはほぼ１
モル結合したものであり、これは結合反応終了
後、常法に従い、例えば透析法、ゲル過法、分
別沈殿法及びアフイニテイークロマトグラフイー
等により容易に単離精製できる。またこれは通常
の凍結乾燥法により保存できる。 上記の如くして得られる複合体は、フイブリン
吸着能及びウロキナーゼ活性を有しており、血栓
溶解剤として血栓症の治療に有効なものである。 本発明の製造法で得られる複合体は、これを血
栓溶解剤として用いるに当り、通常の製剤的担体
と共に製剤組成物の形態とされる。該血栓溶解剤
の投与単位形態としては、各種の形態を治療目的
に応じて適宜選択できるが、通常は注射剤として
用いられる。該注射剤は通常の方法で殺菌され、
好ましくは血液と等張とされる。注射剤の形態に
成形するに際して用いられる稀釈剤としては、こ
の分野において慣用されている各種のもの、例え
ば水、生理食塩水等を例示できる。なおこの場合
等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブド
ウ糖あるいはグリセリンを血栓溶解剤中に含有せ
しめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、
無痛化剤、保存剤等を更に必要に応じて着色剤、
保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を
該血栓溶解剤中に含有せしめてもよい。 血栓溶解剤中に含有させるべき本発明の複合体
の量は、特に限定されず広い範囲から適宜選択さ
れるが、通常全製剤組成物中に約0.01〜30重量％
含有される量とするのがよい。 又上記血栓溶解剤は、その使用に際し、各種形
態に応じた方法で投与されるが、通常は注射剤と
して単独であるいはブドウ糖、アミノ酸輸液等の
補液と混合して静脈内投与される。その投与量は
使用目的、症状等により適宜選択されるが、通常
有効成分であるフイブリン吸着性蛋白―ウロキナ
ーゼ複合体として１日当り約1000〜500000単位／
Kgとするのが好ましく、これは２〜４回に分けて
投与してもよい。 以下本発明に用いるフイブリン吸着性蛋白及び
ウロキナーゼの製造乃至調製例を参考例として挙
げ、次いで本発明複合体の製造例を実施例として
挙げ、更に実施例で得た複合体の薬理試験例を挙
げる。尚各例における各種活性の測定法及びその
他物性等の試験法は以下の通りである。 Γウロキナーゼ活性測定 合成基質法；ウロキナーゼサンプルを0.15M
―NaCl及び５ｇ／ポリエチレングリコール
（PEG6000 和光純薬K.K.）を含む水溶液で適
当濃度に希釈し、その100μに0.1M―NaClを
含有する0.05M―トリス塩酸緩衝液（PH＝8.4）
800μを加え、37℃、１分加温後、これに基
質Ｓ―2444（Pyro Glu―Gly―Arg―ｐ―
Nitroanilide、第１化学薬品社製）の0.3μMを
上記緩衝液に加えた液100μを添加し、37℃、
２分インキユベートする。50％酢酸水溶液
100μを加えて反応を停止させ、405nmにて吸
光度を測定する。標準ウロキナーゼを用い同様
に操作して得られた吸光度より、サンプルの活
性を（国際単位として標示）を算定する。 フイブリン平板法；0.3％牛フイブリノーゲ
ン（Poviet社製）の0.1M―NaCl加0.05Mベロ
ナール緩衝液（PH＝8.0）６mlに、最終0.02M
のCaCl2、最終約3NIH単位／mlの牛トロンビ
ン（持田製薬社製）を加え撹拌後、シヤーレ
（内径8.5cm）にまき、フイブリン平板を調製す
る。0.1％ウサギ血清アルブミン（シグマ社製）
の上記緩衝液に溶解したウロキナーゼサンプル
の10μを、上記フイブリン平板にスポツト
し、37℃、16時間インキユベート後、溶解円の
径を測定する。 ΓSH基の定量 サンプル100μを脱気後、これに脱気N2置換
した0.2M―トリス塩酸緩衝液（PH＝8.2）１mlを
加え、次いで脱気したメタノールに溶解した
0.01M―５，5′―ジチオビス（２―ニトロ安息香
酸）100μを添加し、撹拌後、室温にて約30分
放置後、412nmの吸光度を測定する。２―メルカ
プトエタノールを標準としてサンプルのSH基量
を換算する。 Γｍ―マレイミドベンゾイル基（MB基）の定量 サンプル100μを脱気後、２―メルカプトエ
タノールの水溶液25μ（35ナノモル）を添加
し、37℃、20分インキユベートする。以下上記
SH基の定量と同様にして、残存２―メルカプト
エタノール量を測定して、サンプルのMB基量を
換算する。 ΓSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS―
PAGE） サンプルを40％グリセロール及び２％SDSを含
有する0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH＝8.0）に等
量混合し、100℃、２分加熱後、12.5％分離用ゲ
ル及び４％濃縮用ゲルを用いラエメリ（U.K.
Laemmli）らの方法〔Nature（London），227，
680（1970）〕及びフアルマミア社製グラジエント
ゲルPAA4／30により泳動させる。泳動後コマー
シーブリリアントブルー（C.B.B.）染色し、標準
蛋白（モレキユラーウエイトキツト、フアルマミ
ア社製）より分子量を換算する。 参考例 １ プラスミンHCの製造 リツクリ（E.E.Rickli）らの方法〔Eur.J.
Biochem.，59，441（1975）〕に準じて行つた。す
なわちチバー（B.A.K.Chibber）らの方法
〔Methods in Enzymology，34，424（1974）〕に
準じてヒト血液より精製したプラスミノーゲン
150mgを、0.1M―NaCl及び25％グリセロールを
含有する0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH＝7.8）に
溶解し、ウロキナーゼ（日本ケミカルリサーチ社
製）約3000単位を添加し、室温下８時間インキユ
ベートする。更に1500単位の同ウロキナーゼを添
加して、室温下に16時間インキユベートする。こ
の溶液を窒素置換し、２―メルカプトエタノール
を最終0.1M濃度となるように添加し、20℃、20
分間放置する。その後氷冷し、あらかじめ窒素置
換した0.01M―EDTA及び0.001M―２―メルカ
プトエタノールを含有する0.01M―リン酸ナトリ
ウム塩緩衝液（PH＝7.2）で充分に平衡化したリ
ジン―セフアロースセラム（５cmφ×10cm）に付
し、該緩衝液約１で洗浄後、0.05M ６―アミ
ノヘキサン酸の同緩衝液で溶出し、280nmでの吸
光度のピーク画分を集め、アミコンPM―10限外
過膜（アミコン社製）にて、窒素加圧下に濃縮
する。これに２―メルカプトエタノールを除いた
上記緩衝液を加え再度濃縮する。この操作を数回
繰り返して約60mgのプラスミンHCを得る。これ
は窒素置換して−80℃に保存した。このものは１
モル当り約３モルのSH基が検出された。 実施例 １ LMW―UK（日本ケミカルリサーチ社製）を
アミコンPM―10にて濃縮後0.01M―リン酸ナ
トリウム塩緩衝液（PH＝7.0）にて透析する。
内液を遠心分離（8000rpm×10分）して得た上
清（LMW―UK量約１ミリモル）に6.7ミリモ
ルのｍ―マレイミドベンゾイル Ｎ―ヒドロキ
シサクシンイミドエステル（一般式〔〕、ｍ
―位置換、ｌ＝ｍ＝０、Pierce社製、以下
MBSという）のジメチルホルムアミド
（DMF）溶液を撹拌しながら滴下し、室温で30
分撹拌する。これを脱気した0.1Mリン酸ナト
リウム塩緩衝液（PH＝6.0）にて平衡化したセ
フアデツクスＧ―25フアインカラム（フアルマ
シア社製、1.5cmφ×20cm）に付し、同緩衝液
にて展開する。280nmでの吸光度のピーク画分
を分取して、MB基が結合したLMW―UK0.9
ミリモルを得る。このものはLMW―UK1モル
に対してMB基が平均2.7モル結合していた。 参考例１と同一操作により得たプラスミン
HC123mg及び上記で得たMB基含有LMW―
UK29.5mgを混合し、充分窒素置換し、室温下
３時間撹拌する。これに２―メルカプトエタノ
ールを最終1mM濃度となるように加え、10分
撹拌後、Ｎ―エチルマレイミドを最終2mM濃
度となるように加え室温下に20分撹拌する。こ
れを0.4M―NaClを含有する0.1M―リン酸ナト
リウム塩緩衝液にて平衡化したセフアデツクス
Ｇ―25フアインカラム（フアルマシア社製；
2.6cmφ×30cm）にてゲル過し280nmの吸光
度のピーク画分を分取し、これを上記緩衝液で
平衡化したベンズアミジン―CH―セフアロー
ス（ホルムベルグ（L.Holmberg）らの方法
〔Biochemica et Biophysica Acta，445，215
（1976）〕に準じて作製した）のカラム（2.5cm
φ×5.8cm）に付し、同緩衝液900mlで洗浄後、
0.1M―NaClを含有する0.1M酢酸水溶液及び
6M―尿素水溶液で溶出し、その280nmの吸光
度ピーク画分を合わせ、これを0.1M炭酸水素
アンモニウム水溶液で平衡化したセフアデツク
スＧ―25カラム（５cmφ×25cm）にてゲル過
後、得られた吸光度ピークの画分を0.1M―炭
酸水素アンモニウム水溶液で平衡化したリジン
―セフアロースカラム（1.6cmφ×14cm）に付
し、同液400ml、次いで0.2M ６―アミノヘキ
サン酸水溶液100mlで洗浄後、2M―KSCN水溶
液にて溶出する。溶出液の吸光度ピークの画分
を脱塩後、アミコンPM―10にて濃縮して、本
発明のプラスミンHC―LMW―UK複合体〔以
下「複合体Ａ」とする〕22.3mgを得る。 得られた複合体Ａは、SDS―PAGEにて分子
量８〜９万のバンドとして確認され、LMW―
UK1モルに対してプラスミンHCが約１モル結
合したものである。 実施例 ２ 前記実施例１において蛋白結合試薬として
MBSの代りに、以下の各化合物を使用し、同様
にしてプラスミンHC―LMW―UK複合体を夫々
得る。 〈蛋白結合試薬〉 Γ１―〔４―（２，５―ジオキソ―１―ピロリジ
ニルオキシカルボニル）フエニル〕―２，５―
ジヒドロピロール―２，５―ジオン 〔一般式〔〕、ｐ―位置換、ｍ＝ｌ＝０〕 Γ１―｛４―〔４―（２，５―ジオキソ―１―ピ
ロリジニルオキシカルボニル）ブチル〕フエニ
ル｝―２，５―ジヒドロピロール―２，５―ジ
オン 〔一般式〔〕、ｐ―位置換、(A)l＝（―CH2）―4、
ｍ＝０〕 Γ１―〔４―（２，５―ジオキソ―１―ピロリジ
ニルオキシカルボニル）ベンジル〕―２，５―
ジヒドロピロール―２，５―ジオン 〔一般式〔〕、ｐ―位置換、(B)n＝―CH2―、
ｌ＝０〕 得られた各複合体を順次「複合体Ｂ」、「複合体
Ｃ」及び「複合体Ｄ」とする。之等各複合体は、
SDS―PAGEにて、いずれも８〜９万のバンドと
して確認され、LMW―UK及びプラスミンHCの
モル比は約１：１である。 〈薬理試験〉 (1) フイブリン溶解活性試験 実施例１で得た複合体につき、フイブリン平
板法により、その溶解活性を測定した。結果を
第１図に示す。 第１図中、ヨコ軸は合成基質法により測定し
たウロキナーゼ活性（単位／ml）を、タテ軸は
本法による溶解円の直径（mm）を示す。また第
１図において線１は本発明実施例１で得た複合
体Ａを、また線２はLMW―UK（コントロー
ル）をそれぞれ示す。 該図より本発明の複合体Ａは、10単位／mlで
は、コントロールのLMW―UKと同程度にフ
イブリン溶解活性を保持しており、更に低濃度
ではコントロールよりも高い溶解活性を示すこ
とが明らかである。 (2) フイブリン吸着能試験 実施例１で得た複合体Ａのフイブリン結合能
を下記方法により試験した。即ちフイブリン―
モノマー―セフアロース6B（ハーネ（D.L.
Heene）らの方法〔Thrombosis Research，
２，137（1973）〕に準じて作成した）の３mlを
充填したカラムを0.135M NaClを含有する
0.005Mリン酸ナトリウム塩緩衝液（PH＝7.4）
で平衡化後、上記緩衝液に溶解した複合体Ａ、
HNW―UK、プラスミノーゲン又はプラスミ
ンHC（各２〜３mg）をアプライし、上記緩衝
液30mlにて洗浄する。10mM―６―アミノヘキ
サン酸を含有する上記緩衝液にて溶出し、プラ
スミノーゲン及びプラスミンHCは、溶出画分
の280nmにおける吸収より、又複合体Ａ及び
HMW―UKは、溶出画分のウロキナーゼ活性
を合成基質法により測定した活性より、夫々の
溶出画分への回収率を求め、これをフイブリン
吸着能とする。 上記試験の結果、本発明の複合体Ａは、プラ
スミノーゲンの約１／２及びプラスミンHCの
約１／４のフイブリン吸着能を保持し、ウロキ
ナーゼに比較して約10倍の強いフイブリン吸着
能を示した。 (3) ウサギ実験肺塞栓症に対する治療効果 この試験は、マツオ（O.Matsuo）らの方法
〔Nature，291，590（1981）〕に準じて行なつ
た。即ち 125I―フイブリノーゲンを混合した
新鮮ヒト血液から人工血栓を調製し、これを麻
酔下にウサギ頚静脈より注入し、肺塞栓症モデ
ルを作成する。実施例１で得た複合体Ａ又はコ
ントロールとしてのHMW―UK又は生理食塩
水を、耳静脈より６時間かけて持続注入し、経
時的に採血してその放射活性を測定し、投与し
た血栓の全放射活性より、その百分率を算定す
る。また、９時間後、肺を取出し、残存血栓を
回収し、その放射活性より、投与血栓の溶解率
を求める。更に肺及び尿中への放射活性の回収
率を算定する。尚、放射活性総回収率は、血
液、尿、肺及び回収血栓の放射活性の合計を、
投与した人工血栓の放射活性に対する百分率と
して算定した。 結果を第１表に示す。 【表】 上記第１表から明らかなように、HMW―
UK5万単位／body投与では、生理食塩水のみの
場合と全く変らないが、複合体Ａの５万単位投与
群では、血中の放射活性は全期間を通じて有意に
高く、また尿中への排泄量も多くなつている。更
に回収した血栓の放射活性から換算した血栓溶解
率も10％程度にまで上昇しており、有意に高い血
栓溶解作用が認められることが判る。なお複合体
Ａ投与群においては出血傾向は全く見られなかつ
た。
第１図は、本発明で得られる複合体Ａのフイブ
リン溶解活性を示す図面である。
リン溶解活性を示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ フイブリン吸着性蛋白とウロキナーゼとを、
一般式 〔式中、Ａ及びＢは、各々低級アルキレン基を、
ｌ及びｍは、各々０又は１を示す。〕 で表わされる蛋白結合試薬の存在下に反応させる
ことを特徴とするフイブリン吸着性蛋白―ウロキ
ナーゼ複合体の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57202359A JPS5993019A (ja) | 1982-11-17 | 1982-11-17 | ウロキナ−ゼ複合体の製造法 |
| US06/551,841 US4536391A (en) | 1982-11-17 | 1983-11-15 | Process for preparing urokinase complex |
| EP83111446A EP0109653A3 (en) | 1982-11-17 | 1983-11-15 | Process for preparing urokinase complex |
| CA000441285A CA1212917A (en) | 1982-11-17 | 1983-11-16 | Process for preparing urokinase complex |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57202359A JPS5993019A (ja) | 1982-11-17 | 1982-11-17 | ウロキナ−ゼ複合体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5993019A JPS5993019A (ja) | 1984-05-29 |
| JPH0249708B2 true JPH0249708B2 (ja) | 1990-10-31 |
Family
ID=16456197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57202359A Granted JPS5993019A (ja) | 1982-11-17 | 1982-11-17 | ウロキナ−ゼ複合体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5993019A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH049592U (ja) * | 1990-05-10 | 1992-01-28 |
-
1982
- 1982-11-17 JP JP57202359A patent/JPS5993019A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH049592U (ja) * | 1990-05-10 | 1992-01-28 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5993019A (ja) | 1984-05-29 |
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