JPH0365187A - 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 - Google Patents
起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子Info
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- JPH0365187A JPH0365187A JP1200246A JP20024689A JPH0365187A JP H0365187 A JPH0365187 A JP H0365187A JP 1200246 A JP1200246 A JP 1200246A JP 20024689 A JP20024689 A JP 20024689A JP H0365187 A JPH0365187 A JP H0365187A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は炎症の進行に関与するホスホリパーゼＡ２に対
する阻害蛋白その製造法およびその遺伝子に関する。更
に詳しくはラット由来の起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害
蛋白、その製造方法及びそのクローン化ＤＮＡに関する
。
する阻害蛋白その製造法およびその遺伝子に関する。更
に詳しくはラット由来の起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害
蛋白、その製造方法及びそのクローン化ＤＮＡに関する
。
〈従来の技術〉
ステロイドは強力な抗炎症薬として、多くの炎症性疾患
の治療に用いられてきた。しかし、ステロイドは本来副
腎皮質ホルモン等として生体内で種々の正常ｕａに作用
しているため、これを大量に投与した場合には、これら
の８１能にｎ常が生じ様々な副作用がおこる。そのため
、より副作用の少ない新規の抗炎症薬の開発が望まれて
いる。
の治療に用いられてきた。しかし、ステロイドは本来副
腎皮質ホルモン等として生体内で種々の正常ｕａに作用
しているため、これを大量に投与した場合には、これら
の８１能にｎ常が生じ様々な副作用がおこる。そのため
、より副作用の少ない新規の抗炎症薬の開発が望まれて
いる。
ステロイドが抗炎症作用を発揮するメカニズムの一つと
して、ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の合成を誘導するこ
とにより、この酵素によるアラキドン酸の遊離を仰制し
、その結果起炎的な作用を持つアラキドン酸代謝物の産
生を低下させることが考えられている（Ｆｌｏｗｅｒ、
Ｎａｔｕｒｅ ２７８： ４５６ 。
して、ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の合成を誘導するこ
とにより、この酵素によるアラキドン酸の遊離を仰制し
、その結果起炎的な作用を持つアラキドン酸代謝物の産
生を低下させることが考えられている（Ｆｌｏｗｅｒ、
Ｎａｔｕｒｅ ２７８： ４５６ 。
１９７９） 、このホスホリパーゼＡ２阻害蛋白は、ス
テロイドと同様な抗炎症作用を持ち、がっ、より副作用
の少ない薬剤となることが期待できる。そのため、ホス
ホリパーゼＡ２阻害蛋白の探索は数多くの研究者により
行われてきた。
テロイドと同様な抗炎症作用を持ち、がっ、より副作用
の少ない薬剤となることが期待できる。そのため、ホス
ホリパーゼＡ２阻害蛋白の探索は数多くの研究者により
行われてきた。
しかしながら、これまでのところステロイドに匹敵する
ほどの強力な抗炎症作用を示すものは見いだされていな
い。
ほどの強力な抗炎症作用を示すものは見いだされていな
い。
一方、本発明者らはカゼインで誘導したラットの腹腔浸
出液よりホスホリパーゼＡ２を精製し、そのＮ末端アミ
ノ酸配列と酵素化学的性質を解析した（ Ｉｎｏｕｅ、
に、ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ、１０２，１４７
’８７ ） 。
出液よりホスホリパーゼＡ２を精製し、そのＮ末端アミ
ノ酸配列と酵素化学的性質を解析した（ Ｉｎｏｕｅ、
に、ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ、１０２，１４７
’８７ ） 。
その結果、このホスホリパーゼＡ２は横遣上Ｇｒｏｕｐ
ＩＩに属するものであり、基質特異性等の点でも膵臓
由来やコブラ毒由来のＧｒｏｕｐ ■のホスホリパーゼ
Ａ２とは異なっていること、また、このホスホリパーゼ
Ａ２が起炎性（血管透過性亢進ｅｉ）を持つことを確認
している。さらに、本発明者らはヒト慢性関節リウマチ
患者関節液からもホスホリパーゼＡ２を精製し、その構
造および酵素化学的性質がラットの起炎性ホスホリパー
ゼＡ２と極めてよく類似していることを知見し既に出願
している（特願昭６２−３２５２５５号）。
ＩＩに属するものであり、基質特異性等の点でも膵臓
由来やコブラ毒由来のＧｒｏｕｐ ■のホスホリパーゼ
Ａ２とは異なっていること、また、このホスホリパーゼ
Ａ２が起炎性（血管透過性亢進ｅｉ）を持つことを確認
している。さらに、本発明者らはヒト慢性関節リウマチ
患者関節液からもホスホリパーゼＡ２を精製し、その構
造および酵素化学的性質がラットの起炎性ホスホリパー
ゼＡ２と極めてよく類似していることを知見し既に出願
している（特願昭６２−３２５２５５号）。
ところで従来、ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の活性評価
にはＧｒｏｕｐ ■のホスホリパーゼＡ２が用いられて
きたが、上述のような酵素の特異性を考えると、この方
法はステロイドの抗炎症作用を担う物質の評価方法とし
ては適切ではないといえる。
にはＧｒｏｕｐ ■のホスホリパーゼＡ２が用いられて
きたが、上述のような酵素の特異性を考えると、この方
法はステロイドの抗炎症作用を担う物質の評価方法とし
ては適切ではないといえる。
本発明者らはこの点に着目して、起炎性ホスホリパーゼ
Ａ２を阻害する蛋白の検索を行い、目的蛋白をデキサメ
サゾン処理ラットの腹腔洗浄液より単ｆｌｉｔ精製する
ことに成功した（特開昭６３−２４６３９７号公報）、
このラット由来の起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白は
従来報告されているホスホリパーゼＡ２阻害蛋白とは異
なり、膵臓由来ホスホリパーゼＡ２は阻害せず、起炎性
ホスホリパーゼＡ２を特異的に阻害した。
Ａ２を阻害する蛋白の検索を行い、目的蛋白をデキサメ
サゾン処理ラットの腹腔洗浄液より単ｆｌｉｔ精製する
ことに成功した（特開昭６３−２４６３９７号公報）、
このラット由来の起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白は
従来報告されているホスホリパーゼＡ２阻害蛋白とは異
なり、膵臓由来ホスホリパーゼＡ２は阻害せず、起炎性
ホスホリパーゼＡ２を特異的に阻害した。
〈発明が解決しようとする課題〉
しかしながら、起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の全
アミノ酸配列は未だ解明されておらず、例えばラットの
場合には起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の収得には
ラットの腹腔浸出液が供給源として用いられている。従
ってその供給量には限りがある。
アミノ酸配列は未だ解明されておらず、例えばラットの
場合には起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の収得には
ラットの腹腔浸出液が供給源として用いられている。従
ってその供給量には限りがある。
本発明は、遺伝子組換え法によって起炎性ホスホリパー
ゼＡ２阻害蛋白に対応する遺伝子をクローン化して、そ
の配列を明らかにすることを目的とする。これによって
、起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白をコードする遺伝
子を明らかにすることができると同時に、それによって
起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白のアミノ酸配列を解
明することができる。また、本発明は起炎性ホスホリパ
ーゼＡ２阻害蛋白の化学合成法もしくは遺伝子組換え法
による合成を可能ならしめ、純度の高い起炎性ホスホリ
パーゼＡ２阻害蛋白を大量に得ることを目的とする。
ゼＡ２阻害蛋白に対応する遺伝子をクローン化して、そ
の配列を明らかにすることを目的とする。これによって
、起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白をコードする遺伝
子を明らかにすることができると同時に、それによって
起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白のアミノ酸配列を解
明することができる。また、本発明は起炎性ホスホリパ
ーゼＡ２阻害蛋白の化学合成法もしくは遺伝子組換え法
による合成を可能ならしめ、純度の高い起炎性ホスホリ
パーゼＡ２阻害蛋白を大量に得ることを目的とする。
く課題を解決するための手殴〉
すなわち本発明は、第１図に示すアミノ酸配列又はこれ
と生理学的に同等のアミノ酸配列を有する起炎性ホスホ
リパーゼＡ２阻害蛋白である。
と生理学的に同等のアミノ酸配列を有する起炎性ホスホ
リパーゼＡ２阻害蛋白である。
また本発明は開孔動物の血清を酵素処理することを特徴
とする第１図に示すアミノ酸配列又はこれと生理学的に
同等のアミノ酸配列を有する起炎性ホスホリパーゼＡ２
阻害蛋白の製造方法である。
とする第１図に示すアミノ酸配列又はこれと生理学的に
同等のアミノ酸配列を有する起炎性ホスホリパーゼＡ２
阻害蛋白の製造方法である。
更にまた本発明は、第１図に示すアミノ酸配列又はこれ
と生理学的に同等のアミノ酸配列を有する起炎性ホスホ
リパーゼＡ２阻害蛋白をコードする起炎性ホスホリパー
ゼＡ２阻害蛋白の遺伝子である。
と生理学的に同等のアミノ酸配列を有する起炎性ホスホ
リパーゼＡ２阻害蛋白をコードする起炎性ホスホリパー
ゼＡ２阻害蛋白の遺伝子である。
本発明の起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白は、第１図
に示す３４４個のアミノ酸配列から成るポリペプチドで
あるが、それと実質的に同等の生物活性が保持されてい
るならば、上記アミノ酸配列に部分的な置換、欠失、挿
入などがなされて構成されるボリベチドも本発明の起炎
性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白に含まれる。
に示す３４４個のアミノ酸配列から成るポリペプチドで
あるが、それと実質的に同等の生物活性が保持されてい
るならば、上記アミノ酸配列に部分的な置換、欠失、挿
入などがなされて構成されるボリベチドも本発明の起炎
性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白に含まれる。
本発明の製造方法においては、哺乳動物、例えばヒト、
ラット等、の血清を酵素処理して上記アミノ酸配列を有
する起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白を［遺できるが
、かかる製造方法における酵素処理とは、例えば、ラッ
ト血清を直接３７℃で６日〜１０日間処理するか、ある
いは同血清から０３を精製しこれをＦａｃｔｏｒ Ｉを
用いて通常の酵素処理操作に付すことをいう。
ラット等、の血清を酵素処理して上記アミノ酸配列を有
する起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白を［遺できるが
、かかる製造方法における酵素処理とは、例えば、ラッ
ト血清を直接３７℃で６日〜１０日間処理するか、ある
いは同血清から０３を精製しこれをＦａｃｔｏｒ Ｉを
用いて通常の酵素処理操作に付すことをいう。
更にまた、本発明の起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白
の遺伝子の一例は第２図に示す１０３２個のＤＮＡ塩基
配列からなるが、−本ｆｉＤＮＡ、またはこの−本ｇＤ
ＮＡと相補ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡのいずれもそ
の範晴に含まれる。さらに上記阻害蛋白のアミノ酸配列
をコードするものであれば、上記塩基配列に部分的な置
換、欠失、挿入がなされて構成されるＤＮＡ、上記塩基
配列を含むＤＮＡ、および上記塩基配列の一部分のみを
存するＤＮＡも当然本発明の起炎性ホスホリパーゼＡ２
阻害蛋白クローン化ＤＮＡに含まれる。
の遺伝子の一例は第２図に示す１０３２個のＤＮＡ塩基
配列からなるが、−本ｆｉＤＮＡ、またはこの−本ｇＤ
ＮＡと相補ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡのいずれもそ
の範晴に含まれる。さらに上記阻害蛋白のアミノ酸配列
をコードするものであれば、上記塩基配列に部分的な置
換、欠失、挿入がなされて構成されるＤＮＡ、上記塩基
配列を含むＤＮＡ、および上記塩基配列の一部分のみを
存するＤＮＡも当然本発明の起炎性ホスホリパーゼＡ２
阻害蛋白クローン化ＤＮＡに含まれる。
次に本発明の起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋１１の全
アミノ酸配列及びこの阻害蛋白の遺伝子に至る迄の本発
明の手法を例えばラッＩ・の場合につき説明する。
アミノ酸配列及びこの阻害蛋白の遺伝子に至る迄の本発
明の手法を例えばラッＩ・の場合につき説明する。
先述したように、本発明者は、デキサメサゾン処理ラッ
トの腹腔洗浄液から起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白
を単離精製することに成功しているが（特開昭６３−２
４６３９７公報）、この蛋白のＮ末端のアミノ酸配列を
決定したところ、ヒト補体Ｃ３の一部のアミノ酸配列と
極めて高いホモロジーがあることを知見した。
トの腹腔洗浄液から起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白
を単離精製することに成功しているが（特開昭６３−２
４６３９７公報）、この蛋白のＮ末端のアミノ酸配列を
決定したところ、ヒト補体Ｃ３の一部のアミノ酸配列と
極めて高いホモロジーがあることを知見した。
すなわちこの［Ｆｆｆｉ白は、ヒトＣ３の最終分解産物
であるＣ３ｄ（ｌあるいはＣ３ｄと類似の蛋白であると
考えられたのである０、ｔた本発明者らは、ヒトＣ３の
酵素限定分解物に起炎性ホスホリパーゼＡ２を特異的に
阻害する活性があることを知見し、既に出願している（
特願昭６３−３４２５５６号）。
であるＣ３ｄ（ｌあるいはＣ３ｄと類似の蛋白であると
考えられたのである０、ｔた本発明者らは、ヒトＣ３の
酵素限定分解物に起炎性ホスホリパーゼＡ２を特異的に
阻害する活性があることを知見し、既に出願している（
特願昭６３−３４２５５６号）。
しかしながら、供給源としてのラット腹腔浸出液には量
的制約が大きい、一方ヒト血清を３７℃で６−１０間処
理すると血清中の０３が分解されてＣ３ｄａが生成する
ことが知られている。 （Ｖｉｋ。
的制約が大きい、一方ヒト血清を３７℃で６−１０間処
理すると血清中の０３が分解されてＣ３ｄａが生成する
ことが知られている。 （Ｖｉｋ。
Ｄ、Ｐ、ｅｔ ａｌ、Ｊ、ｒ■ｕｎｏ１．１３４，２５
７１°８５）。
７１°８５）。
そこで本発明者らは、供給源としての不安のないラット
血清から起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白を得、次い
でそのアミノ酸配列の一部を明らかにし、又、マウスＣ
３ｃＤＮＡ断片をプローブとしてラット肝ｃＤＮＡをラ
イブラリーとしてスクリーニングすることにより本阻害
蛋白の遺伝子および全アミノ酸配列を明らかにすべく鋭
意検討した結果、本発明に到達したのである。
血清から起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白を得、次い
でそのアミノ酸配列の一部を明らかにし、又、マウスＣ
３ｃＤＮＡ断片をプローブとしてラット肝ｃＤＮＡをラ
イブラリーとしてスクリーニングすることにより本阻害
蛋白の遺伝子および全アミノ酸配列を明らかにすべく鋭
意検討した結果、本発明に到達したのである。
本発明の起炎性ホスホリパーゼＡ！阻害蛋白は、ラット
血清をＶｉＫらの方法により熱処理するか酵素処理後、
得られたサンプルを起炎性ホスホリパーゼＡ２活性を指
標として例えば国際特許出願公開（ＷＯ） ８８１０７
５５２号に記載の如く、アニオン交換ＨＰＬＣ，ゲル濾
過ＨＰＬＣ，逆相ＨＰＬＣ等によって単離・精製する。
血清をＶｉＫらの方法により熱処理するか酵素処理後、
得られたサンプルを起炎性ホスホリパーゼＡ２活性を指
標として例えば国際特許出願公開（ＷＯ） ８８１０７
５５２号に記載の如く、アニオン交換ＨＰＬＣ，ゲル濾
過ＨＰＬＣ，逆相ＨＰＬＣ等によって単離・精製する。
次いで、このように単離・精製されたサンプルを気相プ
ロティンシーケンサ−（＾ＤＩ）Ｉｉｅｄｅｔｏｓｙｓ
ｔｅｎ社）により、Ｎ末端アミノ酸配列を決定する。
ロティンシーケンサ−（＾ＤＩ）Ｉｉｅｄｅｔｏｓｙｓ
ｔｅｎ社）により、Ｎ末端アミノ酸配列を決定する。
一方、本発明の起炎性ホスホリパーゼＡ２１’ｌｌ害蛋
白の遺伝子は、ラット肝ｃＤＮＡライブラリーを１０−
ブとしてマウスＣ３ｃ Ｄ Ｎ Ａ （ｄｅ Ｂｒｕｉ
ｊｎ。
白の遺伝子は、ラット肝ｃＤＮＡライブラリーを１０−
ブとしてマウスＣ３ｃ Ｄ Ｎ Ａ （ｄｅ Ｂｒｕｉ
ｊｎ。
ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、へｃａｄ、ｓｃｉ
、Ｕｓ＾、８２，７０８． ’８５） を用いてス
クリーニングする。
、Ｕｓ＾、８２，７０８． ’８５） を用いてス
クリーニングする。
得られたラットＣ３ｃ ＤＮＡのホジティブクローンの
うち、λｒＣ３／１１が挿入遺伝子断片が約２、７Ｋｂ
１１と最も長く、Ｃ３ｄａと類似の蛋白と考えられる本
発明の阻害蛋白をコードする遺伝子部分を完全に含んで
いるものと考えた。
うち、λｒＣ３／１１が挿入遺伝子断片が約２、７Ｋｂ
１１と最も長く、Ｃ３ｄａと類似の蛋白と考えられる本
発明の阻害蛋白をコードする遺伝子部分を完全に含んで
いるものと考えた。
そこで、このクローンの塩基配列を決定し、更に前述の
本発明の阻害蛋白のＮ末端アミノ酸配列を指標にして本
阻害蛋白の遺伝子の塩基配列を決定した。
本発明の阻害蛋白のＮ末端アミノ酸配列を指標にして本
阻害蛋白の遺伝子の塩基配列を決定した。
本発明において用いられた各種試験、測定法は以下の通
りである。
りである。
（１） ラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害活性の
測定法。
測定法。
酵素としてカゼイン誘導ラット腹腔浸出液より単離精製
したホスホリパーゼＡ２を用い、基質としては１４ Ｃ
−酢酸と共に培養したＥ、Ｃ０Ｉｉより抽出、精製した
１４ Ｃ−ホスファチジルエタノールアミン（約２，０
ＯＯｄｐＩｌ／ｕ＋ｏ１． １１Ｈ）を用いた。
したホスホリパーゼＡ２を用い、基質としては１４ Ｃ
−酢酸と共に培養したＥ、Ｃ０Ｉｉより抽出、精製した
１４ Ｃ−ホスファチジルエタノールアミン（約２，０
ＯＯｄｐＩｌ／ｕ＋ｏ１． １１Ｈ）を用いた。
酵素反応は、Ｓｏμｌの０．５ＨＴｒｉｓ−Ｃ’ｉ （
１）８９．０）、 ２５μｌの４０１１８ ＣａＣＲ２
、２５μｌの基質にサンプルおよび水を加えて総量２４
０μｌとして混合し最後に１０μｌの酵素液（０，１ｎ
ｏ／μｍ）を加え、３７℃にて１０分間させたのち、Ｄ
ｏｌｏ’ｓ試薬（１，５ａ＋１）を加えて反応を停止し
、ｏｏｚｅの方法に従って生成した１４Ｃ−脂肪酸を抽
出し、液体シンチレーション・カウンターで測定した。
１）８９．０）、 ２５μｌの４０１１８ ＣａＣＲ２
、２５μｌの基質にサンプルおよび水を加えて総量２４
０μｌとして混合し最後に１０μｌの酵素液（０，１ｎ
ｏ／μｍ）を加え、３７℃にて１０分間させたのち、Ｄ
ｏｌｏ’ｓ試薬（１，５ａ＋１）を加えて反応を停止し
、ｏｏｚｅの方法に従って生成した１４Ｃ−脂肪酸を抽
出し、液体シンチレーション・カウンターで測定した。
ｆ２＋５Ｄｓ−ポリアクリルアミド電気泳動およびウェ
スタン・プロッティング 酵素処理またはＨＰＬＣにより得られたサンプルに１／
１０量の色素液（０，１％ＢＰＢ、ＸＣ，１０％５ＤＳ
）を加え、１００℃５分間熱処理後、１２．５％ポリア
クリルアミドゲルにアプライし１％ＳＤＳ存在下、１５
−２５ｍＡで１．５時間電気泳動した。還元状態での解
析のためにはサンプルに２−メルカプ１〜エタノール（
２ＭＢ）を加えた。泳動後、蛋白の検出のためにＣＢＢ
で染色した。
スタン・プロッティング 酵素処理またはＨＰＬＣにより得られたサンプルに１／
１０量の色素液（０，１％ＢＰＢ、ＸＣ，１０％５ＤＳ
）を加え、１００℃５分間熱処理後、１２．５％ポリア
クリルアミドゲルにアプライし１％ＳＤＳ存在下、１５
−２５ｍＡで１．５時間電気泳動した。還元状態での解
析のためにはサンプルに２−メルカプ１〜エタノール（
２ＭＢ）を加えた。泳動後、蛋白の検出のためにＣＢＢ
で染色した。
また、同様に泳動した後ミリポア社エレクトロブロッテ
ィング装置を用いて、蛋白をゲルからニトロセルロース
・フィルターに移した。抗ヒトＣ３ｄヒツジ血清（Ｄａ
ｋｏ） 、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗ヒツジ
ＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ ）および基質として４−ク
ロロ−１−ナフトール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）を用い、酵
素抗体染色法によりＣ３ｄのバンドを検出した。
ィング装置を用いて、蛋白をゲルからニトロセルロース
・フィルターに移した。抗ヒトＣ３ｄヒツジ血清（Ｄａ
ｋｏ） 、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗ヒツジ
ＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ ）および基質として４−ク
ロロ−１−ナフトール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）を用い、酵
素抗体染色法によりＣ３ｄのバンドを検出した。
（３蛋白Ｎ末端アミノ酸配列の決定状
気相プロティン・シークエンサー（アプライド・バイオ
システム４７７Ａ ）およびＩＩＰＬｃ（アプライド・
バイオシステム１２０Ａ ）を用いた。
システム４７７Ａ ）およびＩＩＰＬｃ（アプライド・
バイオシステム１２０Ａ ）を用いた。
即ち、０．１％ＴＦＡに溶解したサンプル１００μＩを
、上記気相プロテインシークエンサーにアプライした。
、上記気相プロテインシークエンサーにアプライした。
自動的にエドマン分解されたＰＴＨ（フェニルチオヒダ
ントイン）アミノ酸誘導体は、その後、高速液体クロマ
トグラフィーにて各アミノ酸として分析された。
ントイン）アミノ酸誘導体は、その後、高速液体クロマ
トグラフィーにて各アミノ酸として分析された。
本発明のラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白は、
本発明によってその全アミノ酸配列が明らかになったの
で、公知の化学合成法によって製造することもできるが
、遺伝子組換え法によって容易かつ大量に製造すること
ができる。
本発明によってその全アミノ酸配列が明らかになったの
で、公知の化学合成法によって製造することもできるが
、遺伝子組換え法によって容易かつ大量に製造すること
ができる。
〈実施例〉
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
ラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白（以下、「阻
害蛋白」と略す）の調製 ＦＡ）阻害蛋白の調製 （１） ラット血清（自生材）に０．１％ＮａＮ３を
加え、３７℃で１０日間処理した。これに１０テアーゼ
・インヒビター（２０μｔ ／ ｍ １アプロチニン、
１０Ｈｇ ／ ｍｌｌダイトリプシンインヒビター０．
５ ｎＨＥ口丁Ａ）を力■えた後、３１の２０ＩＩＨ丁
ｒｉｓ１１ｃＩ、 ｐＨ７，５に対して２回透析を行っ
た。
害蛋白」と略す）の調製 ＦＡ）阻害蛋白の調製 （１） ラット血清（自生材）に０．１％ＮａＮ３を
加え、３７℃で１０日間処理した。これに１０テアーゼ
・インヒビター（２０μｔ ／ ｍ １アプロチニン、
１０Ｈｇ ／ ｍｌｌダイトリプシンインヒビター０．
５ ｎＨＥ口丁Ａ）を力■えた後、３１の２０ＩＩＨ丁
ｒｉｓ１１ｃＩ、 ｐＨ７，５に対して２回透析を行っ
た。
（２１ｆｉｌで得られた透析後のサンプル（蛋白濃度約
３０■／ｍ１）を２０倍希釈し、遠心分離操作により不
溶物を取り除いた後、以下のようにして目的蛋白を単離
・精製した。
３０■／ｍ１）を２０倍希釈し、遠心分離操作により不
溶物を取り除いた後、以下のようにして目的蛋白を単離
・精製した。
まず、サンプルを分収用サイズのアニオン交換ＨＰＬＣ
（ＴＳＫｇｅＩＤＥＡＥ −５ＰＷ ）で分画したく第
３図）、第３図において、実線はＵＶ２８０ｎｌにおけ
る吸収、破線はＮａＣＲ濃度勾配を示す。
（ＴＳＫｇｅＩＤＥＡＥ −５ＰＷ ）で分画したく第
３図）、第３図において、実線はＵＶ２８０ｎｌにおけ
る吸収、破線はＮａＣＲ濃度勾配を示す。
溶出は２０ｎＨＴｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ 、 ｐＨ７，５
−ＮａＣｆ （０−０，３５Ｍ ） 、 ２．５０１１
１ ／ ｌ１ｉｎ 、 ２ ｆｌｉｎ、／ ｔｕｂｅで
行なった。
−ＮａＣｆ （０−０，３５Ｍ ） 、 ２．５０１１
１ ／ ｌ１ｉｎ 、 ２ ｆｌｉｎ、／ ｔｕｂｅで
行なった。
カラスサイズは２１．５φＸ ３０ｃｍである。
次いで、第３図に示されたフラクション中の５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥで３９ｋＤａのバンドが検出されたフラクション
Ｎｒ、６１−６３の部分を集め、濃縮し、これをゲル濾
過１１ＰＬｃ （ＴＳＫｑｅｌＧ３０００３Ｗ）で更に
分画した（第４図）、第４図において、実線ハＵＶ２８
０ｎｉにおける吸収、矢印は分子量マーカーの溶出位置
を示す。
ＡＧＥで３９ｋＤａのバンドが検出されたフラクション
Ｎｒ、６１−６３の部分を集め、濃縮し、これをゲル濾
過１１ＰＬｃ （ＴＳＫｑｅｌＧ３０００３Ｗ）で更に
分画した（第４図）、第４図において、実線ハＵＶ２８
０ｎｉにおける吸収、矢印は分子量マーカーの溶出位置
を示す。
溶出条件は２０１ＨＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ＯＨ７，５−
ＩＨＮａＣＩ２゜０．５ ｍｌ／ＩＩ！ｎ 、 ２１ｉ
ｎ、／１ｔｌｂｅである。
ＩＨＮａＣＩ２゜０．５ ｍｌ／ＩＩ！ｎ 、 ２１ｉ
ｎ、／１ｔｌｂｅである。
次に第４図中の５Ｏ８−ＰＡＧＥで３９ｋＤａのバンド
が検出されたフラクションＮｒ、 １９−２０のピーク
部分を集め、分析用サイズのアニオン交換ＨＰＬＣ（Ｔ
ＳＫｇｅＩＤＥＡＥ−５ＰＩ４ ）で精製した（第５図
）、第５図において実線はＵＶ２８Ｏｒ＋ｌにおける吸
収、破線はＮａＣＲ−ａ度勾配を示す。
が検出されたフラクションＮｒ、 １９−２０のピーク
部分を集め、分析用サイズのアニオン交換ＨＰＬＣ（Ｔ
ＳＫｇｅＩＤＥＡＥ−５ＰＩ４ ）で精製した（第５図
）、第５図において実線はＵＶ２８Ｏｒ＋ｌにおける吸
収、破線はＮａＣＲ−ａ度勾配を示す。
精製は、２０ｎＨＴｒｉｓ−ｔｌｃｆｆｉ 、 ｐｔ１
７．５−ＮａＣｆ （０−１，０Ｍ ） 、 １．０
ｍｌ／ｆｌｉｎ 、 ２ｎｉｎ、／１ｕｂｅで行なった
。
７．５−ＮａＣｆ （０−１，０Ｍ ） 、 １．０
ｍｌ／ｆｌｉｎ 、 ２ｎｉｎ、／１ｕｂｅで行なった
。
最後に第５図中のメイン・ピークのフラクショ７Ｎｒ、
１６を更に逆相１１ＰＬｃ （Ｂ １ｏ−ＲａｄＲＰ３
０４ ）で＃１製した（第６図）、第６図において実線
はＵＶ２１０ｎｍ ｆ、＝オける吸収、破線ｉ、ｔ Ｃ
ＨｓＣＮ：ａ度勾配を示す、精製は、０．１％ＴＥＡ／
Ｃ）１３ＣＮ ０〜８０％。
１６を更に逆相１１ＰＬｃ （Ｂ １ｏ−ＲａｄＲＰ３
０４ ）で＃１製した（第６図）、第６図において実線
はＵＶ２１０ｎｍ ｆ、＝オける吸収、破線ｉ、ｔ Ｃ
ＨｓＣＮ：ａ度勾配を示す、精製は、０．１％ＴＥＡ／
Ｃ）１３ＣＮ ０〜８０％。
１ｍｌ／１ｌｉｎ、、 ２ｉｉｎ、／１ｕｂｅで行なっ
た。
た。
このようにして得られた阻害蛋白（フラクションＮｒ、
３０）は５Ｏ３−ＰＡＧＥで単一のバンド＜ｍ定分子量
約３９ｋＤａ ）を示した（第７図３ 、５ＯＳ−ＰＡ
ＧＥは、フラクションＮｒ、 ２９−３３の各サンプル
を１０倍濃縮し、行なった。
３０）は５Ｏ３−ＰＡＧＥで単一のバンド＜ｍ定分子量
約３９ｋＤａ ）を示した（第７図３ 、５ＯＳ−ＰＡ
ＧＥは、フラクションＮｒ、 ２９−３３の各サンプル
を１０倍濃縮し、行なった。
（Ｂ）阻害蛋白のホスホリパーゼＡ２阻害活性（＾）で
得られた本発明の阻害蛋白（逆相１１ Ｐ Ｌ Ｃフラ
クションＮｒ、３０ 、蛋白濃度４０μｇ／ｍｌ）の起
炎性ホスホリパーゼＡ２及びその他のホスホリパーゼＡ
２に対する阻害活性を、前述のホスホリパーゼＡ２阻害
活性の測定法によって測定した。
得られた本発明の阻害蛋白（逆相１１ Ｐ Ｌ Ｃフラ
クションＮｒ、３０ 、蛋白濃度４０μｇ／ｍｌ）の起
炎性ホスホリパーゼＡ２及びその他のホスホリパーゼＡ
２に対する阻害活性を、前述のホスホリパーゼＡ２阻害
活性の測定法によって測定した。
（１）本発明の阻害蛋白のラットホスホリパーゼＡ２阻
害活性を見るために、阻害蛋白の種々の量（３，６，９
，１２，１５，１８ｎｏ）で測定した。
害活性を見るために、阻害蛋白の種々の量（３，６，９
，１２，１５，１８ｎｏ）で測定した。
結果を第８図に示した。
第８図から本阻害蛋白はラット起炎性ホスホリパーゼＡ
２を用量依存的に阻害することが明らかである。１ｎ９
のホスホリパーゼＡ２活性を５０％阻害するのに必要な
阻害蛋白量は約６ｎｇであり、ＩＣ５−は０．８ Ｘ１
０４ Ｍであった。
２を用量依存的に阻害することが明らかである。１ｎ９
のホスホリパーゼＡ２活性を５０％阻害するのに必要な
阻害蛋白量は約６ｎｇであり、ＩＣ５−は０．８ Ｘ１
０４ Ｍであった。
（２１ホスホリパーゼＡ２として、ラット起炎性ホスホ
リパーゼＡ２のほかに、ヒト慢性関節リウマチ患者関節
液由来ホスホリパーゼＡ２（特願昭６２−３２５２５５
号参照） 、 Ｃｒ０ｔａｌＵＳ ａｄａｆｆｉａｎｔ
ｅｕｓｖｅｎｏｍ （マムシｍ＞ホスホリパーゼＡ２
（Ｓｉｇｎａ社製）、ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２
（Ｓｉｑｎａ社製） 、 Ｎａｊａ ｎａｊａ ｖｅ
ｎｏｍ （コブラ壽）ホスホリパーゼＡ２ （Ｓｉ
ｇｎａ社製）を用い、同一条件で本発明の阻害蛋白によ
る阻害活性を測定し、結果を第９図−ａ、−ｂに各々示
した。
リパーゼＡ２のほかに、ヒト慢性関節リウマチ患者関節
液由来ホスホリパーゼＡ２（特願昭６２−３２５２５５
号参照） 、 Ｃｒ０ｔａｌＵＳ ａｄａｆｆｉａｎｔ
ｅｕｓｖｅｎｏｍ （マムシｍ＞ホスホリパーゼＡ２
（Ｓｉｇｎａ社製）、ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２
（Ｓｉｑｎａ社製） 、 Ｎａｊａ ｎａｊａ ｖｅ
ｎｏｍ （コブラ壽）ホスホリパーゼＡ２ （Ｓｉ
ｇｎａ社製）を用い、同一条件で本発明の阻害蛋白によ
る阻害活性を測定し、結果を第９図−ａ、−ｂに各々示
した。
第９図から明らかなように、本阻害蛋白はラット起炎性
ホスホリパーゼＡ２ （ＯＯ） 、ヒト慢性関節リウ
マチ患者関節液由来ホスホリパーゼＡ２ （Δ−Δ）
、 Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｌａｎｔｅｕｓＶｅｎ
ａｌホスホリパーゼＡｚ （ローロ）に対しては、は
ぼ同等の阻害活性を示したが、ブタ膵臓ホスホリパーゼ
Ａ２（Ｘ−Ｘ ） 、Ｎａｊａ ｎａｊａＶ１３ｎＯｌ
ホスホリパーゼＡ２ （×・・・・・・×）に対しては
全く阻害活性を示さなかった。これにより、本阻害蛋白
は■型ホスホリパーゼＡ２に対して特異的に阻害作用を
、示すことが明らかとなった。
ホスホリパーゼＡ２ （ＯＯ） 、ヒト慢性関節リウ
マチ患者関節液由来ホスホリパーゼＡ２ （Δ−Δ）
、 Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｌａｎｔｅｕｓＶｅｎ
ａｌホスホリパーゼＡｚ （ローロ）に対しては、は
ぼ同等の阻害活性を示したが、ブタ膵臓ホスホリパーゼ
Ａ２（Ｘ−Ｘ ） 、Ｎａｊａ ｎａｊａＶ１３ｎＯｌ
ホスホリパーゼＡ２ （×・・・・・・×）に対しては
全く阻害活性を示さなかった。これにより、本阻害蛋白
は■型ホスホリパーゼＡ２に対して特異的に阻害作用を
、示すことが明らかとなった。
（３（＾）で得られた本阻害蛋白について、活性測定系
の基質濃度を０．１−０．３５１Ｍと変化させても本阻
害蛋白の阻害活性に変化は見られなかった。
の基質濃度を０．１−０．３５１Ｍと変化させても本阻
害蛋白の阻害活性に変化は見られなかった。
また、活性測定の前に本阻害蛋白を酵素とブレインキュ
ベーションしても阻害活性に変化は見られなかった。
ベーションしても阻害活性に変化は見られなかった。
これらの結果から本阻害蛋白の活性は基質との相互作用
によるものではないと考えられた。
によるものではないと考えられた。
（４）以上の結果から本阻害蛋白は、ラット腹腔由来の
起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白と分子量がほぼ同一
でかつ同じ活性を有する蛋白であることが明らかとなっ
た。
起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白と分子量がほぼ同一
でかつ同じ活性を有する蛋白であることが明らかとなっ
た。
実施例２
起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の同定（＾）阻害蛋
白のＮ末端アミノ酸配列の決定実施例１（＾）で単離・
精製した分子量約３９ｋＤａの阻害蛋白について、＾ｐ
ｐｌｉａｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ１１社の気相プロテイン
シークエンサー４７７Ａを用いてＮ末端アミノ酸配列を
決定した。その結果、下記の様な配列であることが判明
した。
白のＮ末端アミノ酸配列の決定実施例１（＾）で単離・
精製した分子量約３９ｋＤａの阻害蛋白について、＾ｐ
ｐｌｉａｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ１１社の気相プロテイン
シークエンサー４７７Ａを用いてＮ末端アミノ酸配列を
決定した。その結果、下記の様な配列であることが判明
した。
Ｎ）＋２−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾１ａ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−これは、後に述べる
クツｌ−Ｃ３ｃ Ｄ Ｎ Ａの塩基配列から推定される
Ｃ３ｄａのＮ末端配列と完全に一致しており、また、デ
キサメサゾン処理ラットの腹腔洗浄液より精製した起炎
性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白のＮ末端アミノ酸配列と
も完全に一致していた。
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−これは、後に述べる
クツｌ−Ｃ３ｃ Ｄ Ｎ Ａの塩基配列から推定される
Ｃ３ｄａのＮ末端配列と完全に一致しており、また、デ
キサメサゾン処理ラットの腹腔洗浄液より精製した起炎
性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白のＮ末端アミノ酸配列と
も完全に一致していた。
（８）阻害蛋白のウェスタンブロッティング実施例１
（Ａ）で単離・精製した分子量約３９ｋＤａの阻害蛋白
を常法に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動後、ミリボア社製エレクトロブロッティング装置を用
い、同社プロトコールに従ってニトロセルロースメンブ
レンフィルターに移した。このフィルターについて、抗
ヒトＣ３ｄウサギ血清（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ）を−次抗
体、抗つサギＩｇＧワサビペルオキシダーゼ結合ヤギＩ
ｇＧフラクション（ＣＡＰＰＥＬ）を二次抗体とし、基
質として４−クロロ−ｌ−ナフトール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）を用いて酔素抗体染色を行った。
（Ａ）で単離・精製した分子量約３９ｋＤａの阻害蛋白
を常法に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動後、ミリボア社製エレクトロブロッティング装置を用
い、同社プロトコールに従ってニトロセルロースメンブ
レンフィルターに移した。このフィルターについて、抗
ヒトＣ３ｄウサギ血清（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ）を−次抗
体、抗つサギＩｇＧワサビペルオキシダーゼ結合ヤギＩ
ｇＧフラクション（ＣＡＰＰＥＬ）を二次抗体とし、基
質として４−クロロ−ｌ−ナフトール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）を用いて酔素抗体染色を行った。
その結果本阻害蛋白は抗ヒトＣ３ｄ血清と特異的に反応
した。
した。
以上（Ａ）、ＣＢ）から、本阻害蛋白はラットＣ３ｄａ
であることが確認された。
であることが確認された。
実施例３
ラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白遺伝子のクロ
ーニング （Ａ）マウスＣ３ｃＤＮＡ断片のＴＡ製ツマウスＣ３ｃ
ＤＮＡ断 ｐＦＣ４１５．４ （ Ｊ．Ｂ．Ｃ．２６０，１０９
３ｅ°８６）ノｔｌｉｎｄＩＩ消化物から、低融点アガ
ロースゲル電気泳動にて２、 ２ｋｂｐ断片を分離した
．またＳｔｕ Ｉ消化物からも同様な操作で１．８ｋｂ
ｌｌＩＩＲ片を得た。
ーニング （Ａ）マウスＣ３ｃＤＮＡ断片のＴＡ製ツマウスＣ３ｃ
ＤＮＡ断 ｐＦＣ４１５．４ （ Ｊ．Ｂ．Ｃ．２６０，１０９
３ｅ°８６）ノｔｌｉｎｄＩＩ消化物から、低融点アガ
ロースゲル電気泳動にて２、 ２ｋｂｐ断片を分離した
．またＳｔｕ Ｉ消化物からも同様な操作で１．８ｋｂ
ｌｌＩＩＲ片を得た。
（Ｂ）ｃＤＮＡのスクリーニング
ラット肝ｃＤＮＡλ１Ｊｔ１１ライブラリー（クロンチ
ック社製）をスクリーニングの素材として用い、クロン
チック社実験プロトコールの記載に従ってスクリーニン
グした。
ック社製）をスクリーニングの素材として用い、クロン
チック社実験プロトコールの記載に従ってスクリーニン
グした。
すなわち、λ１Ｊｔ１１ファージを感染させたＥ．ｃｏ
ｌｉＹ １０９０株を３７℃．５時間培養して得られた
約５万個の形質転換体群を対象としてナイロンフィルタ
ーメンブレンにレプリカし、０，５ＮＮａＯＨ−１．５
８ＮａＣｌにつけてＤＮＡを変性させ、７、５ＨＮａＣ
１ １ − １ ｎＨＥＤＴ＾を含有するトリス塩酸ノ
くッファー（＋）１１７．２）で中和した．その後、フ
ィルターを風乾し、トランスイルミネーターにて紫外線
を３分間照射してＤＮＡをフィルターに固定した。
ｌｉＹ １０９０株を３７℃．５時間培養して得られた
約５万個の形質転換体群を対象としてナイロンフィルタ
ーメンブレンにレプリカし、０，５ＮＮａＯＨ−１．５
８ＮａＣｌにつけてＤＮＡを変性させ、７、５ＨＮａＣ
１ １ − １ ｎＨＥＤＴ＾を含有するトリス塩酸ノ
くッファー（＋）１１７．２）で中和した．その後、フ
ィルターを風乾し、トランスイルミネーターにて紫外線
を３分間照射してＤＮＡをフィルターに固定した。
スクリーニング用プローブとしては、上記（Ａ）で得ら
れたマウスＣ３ｃＤＮＡＩ！Ｆｔ片を３２Ｐで標識した
ものを用いた。
れたマウスＣ３ｃＤＮＡＩ！Ｆｔ片を３２Ｐで標識した
ものを用いた。
上記被検フィルター上の形質転換体群をこのプローブに
て６５℃のハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グし、オートラジオダラムでの感光により判定したとこ
ろ、約５万個の形質転換体群の内７個がポジティブクロ
ーンであった．これらのポジティブクローンを各々λｒ
Ｃ３／１１〜１７と命名した。
て６５℃のハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グし、オートラジオダラムでの感光により判定したとこ
ろ、約５万個の形質転換体群の内７個がポジティブクロ
ーンであった．これらのポジティブクローンを各々λｒ
Ｃ３／１１〜１７と命名した。
これらのクローンをＥｃｏＲ Ｉ消化後、アガロースゲ
ル電気泳動を行いサザンハイプリダイゼーションにより
挿入遺伝子断片の鎖長を解析した。
ル電気泳動を行いサザンハイプリダイゼーションにより
挿入遺伝子断片の鎖長を解析した。
その結果、７つのクローンのなかでλｒＣ３／１１の挿
入′ｉｉ伝子断片が最も長く、このクローンはＥｃｏＲ
ＩによりＧ． ７ｋｂＯと２．０）ｔｂｔ）に切断さ
れる全長２． ７ｋｂｐの挿入遺伝子断片を持つことが
判明した。
入′ｉｉ伝子断片が最も長く、このクローンはＥｃｏＲ
ＩによりＧ． ７ｋｂＯと２．０）ｔｂｔ）に切断さ
れる全長２． ７ｋｂｐの挿入遺伝子断片を持つことが
判明した。
［Ｃ）ラットＣ３ｃＤＮＡの塩基配列の決定λｒＣ３／
１１のファージＤＮＡを抽出した後、ＥＣＯＲ Ｉで切
断して０， ７ｋｂｐと２． ０ｋｂｐのＤＮＡ断片を
得た．この断片をシーフェンシング用りローニングベク
ターｐＵｃ１９およびシーフェンシング用７７ージＭ
１３ｍｐ１９ＲＦＤＮ＾ （宝酒造）のＥｃｏＲ Ｉ部
位に挿入した， ０．７ｋｂＯ断片はさらにＢａｆＩｌ
ｌＩ消化により得られた０．１ｋｂｐ断片と０． ６ｋ
ｂｐ断片をシーフェンシング用ヘクター ｐＵｃ１１８
ノＥｃｏＲ Ｉ、Ｂａｌｌ１′ｌ■二重消化物に挿入し
、両末端から塩基配列を決定した。
１１のファージＤＮＡを抽出した後、ＥＣＯＲ Ｉで切
断して０， ７ｋｂｐと２． ０ｋｂｐのＤＮＡ断片を
得た．この断片をシーフェンシング用りローニングベク
ターｐＵｃ１９およびシーフェンシング用７７ージＭ
１３ｍｐ１９ＲＦＤＮ＾ （宝酒造）のＥｃｏＲ Ｉ部
位に挿入した， ０．７ｋｂＯ断片はさらにＢａｆＩｌ
ｌＩ消化により得られた０．１ｋｂｐ断片と０． ６ｋ
ｂｐ断片をシーフェンシング用ヘクター ｐＵｃ１１８
ノＥｃｏＲ Ｉ、Ｂａｌｌ１′ｌ■二重消化物に挿入し
、両末端から塩基配列を決定した。
配列解析は７−ＤＥＡＺＡ法（Ｈｉｚｕｓａｗａ， ｅ
ｔ。
ｔ。
ａｌ．Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃ１ｄ ＲｅＳ．１４、１３
１９°８６）に従った。
１９°８６）に従った。
２Ｋｂｌ）Ｉｔｔｒ片については確定した周辺部に対応
したプライマーを順次合成して塩基配列解析を進めるＩ
ｔ ｏ ｏ ｄらの手法（ｔｌｏｏｄ、 ｅｔ、ａｌ、
＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｎ。
したプライマーを順次合成して塩基配列解析を進めるＩ
ｔ ｏ ｏ ｄらの手法（ｔｌｏｏｄ、 ｅｔ、ａｌ、
＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｎ。
１５４．３５３°８６）を用いた。
第１０図にλｒＣ３／１１の塩基配列決定のストラテジ
ーを示す、最上段の数字は中断において枠で仕切られた
クツ＋−Ｃ３ｄ 示した塩基の番号であり、ＥＣＯＲ Ｉ等は用いられた
制限酵素名であり、括弧内の数字は切断部位または塩基
配列決定の開始位置（塩基番号）である、水平な矢印は
それぞれの制限酵素およびプライマーによる塩基配列決
定の方向と範囲を示している。
ーを示す、最上段の数字は中断において枠で仕切られた
クツ＋−Ｃ３ｄ 示した塩基の番号であり、ＥＣＯＲ Ｉ等は用いられた
制限酵素名であり、括弧内の数字は切断部位または塩基
配列決定の開始位置（塩基番号）である、水平な矢印は
それぞれの制限酵素およびプライマーによる塩基配列決
定の方向と範囲を示している。
実施例４
ラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白遺伝子の塩基
配列および該蛋白のアミノ酸配列の決定 （１）Ｎ末端およびＣ末端の決定 実施例３で判明したラットＣ３ｃＤＮＡクローンの塩基
配列（Ｃ）から推定されるう・ｙ トＣ ３のアミノ酸
配列のうち、ヒトＣ３のファクターＩによる切断部位近
傍のアミノ酸配列に相当する部分を第１１図に示す。
配列および該蛋白のアミノ酸配列の決定 （１）Ｎ末端およびＣ末端の決定 実施例３で判明したラットＣ３ｃＤＮＡクローンの塩基
配列（Ｃ）から推定されるう・ｙ トＣ ３のアミノ酸
配列のうち、ヒトＣ３のファクターＩによる切断部位近
傍のアミノ酸配列に相当する部分を第１１図に示す。
ヒトＣ３はａＭｉの２８３＾ｒ（］ − ２８４０１ｕ
の間でファクターＩにより切断されるが、ラットＣ３で
はこれに対応する部位はＧｌｎ−Ｇｌｙに変異しており
、５残基Ｃ末端測に＾ｒｇ−Ｇｌｕが存在する。
の間でファクターＩにより切断されるが、ラットＣ３で
はこれに対応する部位はＧｌｎ−Ｇｌｙに変異しており
、５残基Ｃ末端測に＾ｒｇ−Ｇｌｕが存在する。
そして、この部位で切断されて生成するフラグメントの
Ｎ末端アミノ酸配列はラット血清より精製した本発明の
阻害蛋白のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致している。
Ｎ末端アミノ酸配列はラット血清より精製した本発明の
阻害蛋白のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致している。
従って、ラットＣ３はこの部位でヒトのファクター■と
同様の活性を持つ酵素により切断されると考えられる。
同様の活性を持つ酵素により切断されると考えられる。
また、ヒトＣ３ａ鎖の６３２Ａｒ（１ − ６３３８Ｏ
ｒと６４９−６５０Ｓｅ「はラットＣ３でも保存され＾
「Ｑ ており、ヒトと同様にこれらの位置でファクター■によ
り切断され、本発明の阻害蛋白のＣ末端はヒトＣ３ｄｇ
のＣ末端と一致しているものと考えられる。
ｒと６４９−６５０Ｓｅ「はラットＣ３でも保存され＾
「Ｑ ており、ヒトと同様にこれらの位置でファクター■によ
り切断され、本発明の阻害蛋白のＣ末端はヒトＣ３ｄｇ
のＣ末端と一致しているものと考えられる。
（２） ラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白（
Ｃ１６ｇ）遺伝子の全塩基配列と推定される全アミノ酸
配列 以上の結果から本発明のラット起炎性ホスホリパーゼＡ
２阻害蛋白の全アミノ酸配列と遺伝子の全塩基配列は第
１図及び第２図のものと判断された．ラット起炎性ホス
ホリパーゼＡ２阻害蛋白は１０３２個の塩基でコードさ
れ、３４４個のアミノ酸からなる蛋白であった。
Ｃ１６ｇ）遺伝子の全塩基配列と推定される全アミノ酸
配列 以上の結果から本発明のラット起炎性ホスホリパーゼＡ
２阻害蛋白の全アミノ酸配列と遺伝子の全塩基配列は第
１図及び第２図のものと判断された．ラット起炎性ホス
ホリパーゼＡ２阻害蛋白は１０３２個の塩基でコードさ
れ、３４４個のアミノ酸からなる蛋白であった。
第１図は、本発明のラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻
害蛋白のアミノ酸配列を示す。 第２図は、本発明のラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻
害蛋白の遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列の一例を示す。 第３図は、アニオン交換ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃを用いた場合
のラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パタ
ーンを示す。 第４図は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用いた場合のラット起炎
性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パターンを示す。 第５図は、アニオン交換１１ＰＬＣを用いた場合のラッ
ト起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パターンを
示す。 第６図は、逆相＋＋ ｐ ｔ ｃを用いた場合のラット
起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パターンを示
す。 第７図は、ラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の
５Ｏ３−ＰＡＧＥを示す。 第８図は、本発明の阻害蛋白の阻害活性を示す。 第９図は、本発明の阻害蛋白の各種ホスホリパーゼＡ２
阻書活性を示す。 第１０図は、本発明の阻害蛋白の遺伝子を含む塩基配列
決定のストラテジーを示す。 第１１図は、ラットＣ３のアミノ酸配列のうち、ヒトＣ
３のファクターＩによる切断部位近傍のアミノ酸配列に
相当する部分を示す。
害蛋白のアミノ酸配列を示す。 第２図は、本発明のラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻
害蛋白の遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列の一例を示す。 第３図は、アニオン交換ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃを用いた場合
のラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パタ
ーンを示す。 第４図は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用いた場合のラット起炎
性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パターンを示す。 第５図は、アニオン交換１１ＰＬＣを用いた場合のラッ
ト起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パターンを
示す。 第６図は、逆相＋＋ ｐ ｔ ｃを用いた場合のラット
起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の溶出パターンを示
す。 第７図は、ラット起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害蛋白の
５Ｏ３−ＰＡＧＥを示す。 第８図は、本発明の阻害蛋白の阻害活性を示す。 第９図は、本発明の阻害蛋白の各種ホスホリパーゼＡ２
阻書活性を示す。 第１０図は、本発明の阻害蛋白の遺伝子を含む塩基配列
決定のストラテジーを示す。 第１１図は、ラットＣ３のアミノ酸配列のうち、ヒトＣ
３のファクターＩによる切断部位近傍のアミノ酸配列に
相当する部分を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、第１図に示すアミノ酸配列又はこれと生理学的に同
等のアミノ酸配列を有する起炎性ホスホリパーゼＡ＿２
阻害蛋白。 ２、第１図に示すアミノ酸配列又はこれと生理学的に同
等のアミノ酸配列の一部を有する請求項１記載の起炎性
ホスホリパーゼＡ＿２阻害蛋白。 ３、ラット血清由来の請求項１又は２記載の起炎性ホス
ホリパーゼＡ＿２阻害蛋白。 ４、哺乳動物の血清を酵素処理することを特徴とする請
求項１記載の起炎性ホスホリパーゼＡ＿２阻害蛋白の製
造方法。 ５、哺乳動物がラットである請求項４記載の起炎性ホス
ホリパーゼＡ＿２阻害蛋白の製造方法。 ６、請求項１記載の起炎性ホスホリパーゼＡ＿２阻害蛋
白の遺伝子。 ７、第２図に示すＤＮＡ塩基配列を含む請求項６記載の
起炎性ホスホリパーゼＡ＿２阻害蛋白の遺伝子、 ８、ラット由来の請求項６又は７記載の起炎性ホスホリ
パーゼＡ＿２阻害蛋白の遺伝子。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1200246A JPH0365187A (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 |
| PCT/JP1990/000996 WO1991001999A1 (fr) | 1989-08-03 | 1990-08-03 | Proteine d'inhibition de la phospholipase a2 naissant dans une region inflammee, sa production et gene prevu a cet effet |
| EP19900911691 EP0436737A4 (en) | 1989-08-03 | 1990-08-03 | Phospholipase a 2? inhibiting protein originating in inflamed region, production thereof, and gene therefor |
| US08/047,379 US5344764A (en) | 1989-08-03 | 1993-04-16 | Protein inhibitors of phospholipase A2 purified from inflammatory sites and production process |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1200246A JPH0365187A (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0365187A true JPH0365187A (ja) | 1991-03-20 |
Family
ID=16421214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1200246A Pending JPH0365187A (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0365187A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63246397A (ja) * | 1987-04-02 | 1988-10-13 | Teijin Ltd | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
-
1989
- 1989-08-03 JP JP1200246A patent/JPH0365187A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63246397A (ja) * | 1987-04-02 | 1988-10-13 | Teijin Ltd | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
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