JPH03501205A - ペプチジル‐グリシンアルファ‐アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）をコードするｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 明　細　書 ペプチジル−グリシンアルファーアミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）をコー ドするｃＤＮＡ本発明は国立衛生研究所の許可を得てなされたものである。連邦 政府は本発明について、ある権利を保有し得る。

発明の技術分野 本発明は翻訳後のプロセッシング酵素、さらに詳しくはペプチジル−グリシンア ルファーアミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）として知られている酵素に関す るものである。

Ｒ更９宣屡 小さい、生物学的に活性なペプチドは、通常は非活性な大きい前駆体（プレプロ ホルモン）として産生されることが多い。特異的なタンパク質加水分解により、 これらの前駆体から様々なペプチドが放出される。前駆体分子および小さいペプ チドが様々な共有結合的な［ｉを受けて、プレプロホルモンが合成される。その ような修飾の１つはアルファーアミド化であり、これによりペプチドのカルボキ シ末端カルボン酸基がアルファーアミド基で保護される。既知の全生物活性ペプ チドのほぼ半数がＣ−末端にアミド基を有する。大多数の場合、保護されていな いペプチドは、アミド化誘導体よりもはるかに低活性である（０．１〜１％のオ ーダー）。

Ｃ−末端にアミド基（アルファーアミド）を有する小さいペプチドは化学的に合 成できるがより大きいアルファーアミド化ペプチドの合成は困難であって費用が かかる。より大きいペプチドは、細菌または酵母による発現により製造されるが 、これらの微生物が、発現したペプチドのペプチドアルファーアミド化を触媒し 得る酵素を含有していることは未だ明らかにされていない。従って、培養微生物 細胞が産生じたペプチドの多くが完全に活性となるためにはＰＡＭの作用が必要 である。

ＰＡＭ活性はブタ、ウシ、ヒトおよびラットの脳下垂体、並びに他の種および組 織、例えばカエルの皮膚等に検出されている。これらＲＡＭ酵素の幾つかは精製 または部分精製された。例えば、マーシーら（Ｍｕｒｔｈｙ）、Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、　２６１、ｐｐ 、１８１５−１８２２（１９８６）およびミズノら（Ｍｉｚｕｎｏ）、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、Ｖｏｌ、１３７．　ｐｐ、９８ ４　９９］（１９８６）参照。従来技術のＰＡＭ活性精製法は組織抽出物から酵 素を可溶化することであった。この方法により、ブタ脳下垂体から、分子量約６ ０．０００のタンパク質、ウシ脳下垂体から、分子量３８，０００および５４， ０００のタンパク質が同定された。しかしながら、研究結果によるとウシやブタ のような天然起源からのＰＡＭタンパク質の単離は殆どできないとされている。

従って、ＰＡＭ酵素の簡便な供給源を得ることが当該技術分野で必要とされてい る。

本発明の目的はＰＡＭ酵素をコードするＤ　Ｎ　Ａベクターを提供することにあ る。

本発明はまた、膜（メンブタン）スバニングドメインを含有するＰＡＭタンパク 質を提供することを目的とするものである。

また、本発明は、培養細胞によってＰＡＭ酵素を製造する方法を提供することを 目的とするものである。

さらにまた本発明は、ＰＡＭ製品を用いてペプチドホルモン前駆体をその成熟ア ミド化体に活性化する方法を提供することを目的とするものである。

これらのおよび他の本発明の目的は、後述する本発明の実施態様の１またはそれ 以上によって達成された。１つの実施態様では、ＰＡＭ酵素をコードするＤＮＡ ベクターを提供する。他の実施態様ではＰＡＭ酵素をコードしているＤＮＡ単離 体を提供する。

他の実施態様では、イントロン不含のＰＡＭ酵素の暗号配列を発現する、複製可 能な培養細胞を得、該培養細胞を培養し、該培養細胞によって産生されたＰＡＭ を回収することからなるＰＡＭ酵素の製造方法を提供する。本発明は、形質転換 細胞自身をも想定している。

また本発明の他の実施態様では、実質上、ＰＡＭ活性を持たない他のタンパク質 を含有しない、膜スパニングドメインを含むＰＡＭタンパク質を提供する。

さらにまた本発明は、インビトロで、ホルモン前駆体を活性化してＣ−末１アミ ノ酸残基にアルファーアミド基を有する成熟ホルモンを得る方法であって、成熟 ホルモンのＣ−末端アミノ酸残基のＣ−末端部位にグリシン残基を有するペプチ ドホルモン前駆体を得、該ペプチドホルモン前駆体とＰＡＭ活性を有する膜製品 とを接触させてペプチドホルモンのアルファーアミド化誘導体を得ることからな る。

本発明は天然起源（例えば脳下垂体）から精製されるＰＡＭタンパク質と同様の ＰＡＭタンパク質、並びにその前駆体形および膜結合形のＰＡＭタンパク質の好 都合な供給源を当業者に提供するものである。培養細胞内でＰＡＭタンパク質を 製造することにより、今日、天然起源から実際に得ることができる量よりもはる かに多量のタンパク質を得ることがでできる。その上、膜結合形のＰＡＭ酵素の 存在により、遺伝的に操作されたホルモンおよび生物活性ペプチドのインビトロ における熟成およびプロセッシングに固定化ＰＡＭ酵素を用いることが可能にな る。

図面の簡単な説明 第１図はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（まずＰＡＭ抗体で、次いで、 ＰＡＭｃＤＮＡ断片により）により得たラムグーＰＡＭクローンを示す図、並び にＤＮＡ配列の決定に用いた方法を示す図である。

第２図はＰＡＭｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を示す図である。

第３図は完全なＰＡＭタンパク質の重要な特徴を示す模式図である。

詳細な説明 雌牛から得たＰＡＭをコードする遺伝子によって、従来精製された２種のウシＰ ＡＭタンパク質の２倍以上の大きさのタンパク質が産生されることが発見された 。従来精製されたウシＰＡＭタンパク質、ＰＡＭ−ＡおよびＰＡＭ−Ｂは、凍結 した脳下垂体中葉組織を水性バッファー中でホモジナイズし、遠心して不溶性（ 固形）物質を除去することにより得られた可溶性酵素である。本明細書で開示す る１つの型のＰＡＭタンパク質は膜と結合している。この型のタンパク質が存在 することは予想も予測もされていなかった。

大きいＰＡＭタンパク質の他の特徴は、ＰＡＭ遺伝子の完全なＣＤＮＡ配列の研 究から推定された。そのような特徴として、おそらくタンパク質の最初の２０ア ミノ酸配列からなる疎水性シグナル配列がある。さらに、実験的に２種のＰＡＭ 　Ｎ−末端集団が観察されることの原因と考えられる２個の潜在的なエンドプロ テアーゼ開裂部位がある。これらの開裂はＡｒｇ３０とｐ、１ｇ３＠の後で起き る。成熟ＰＡＭタンパク質のＰｈｅ”とＮ−末端残基との間のタンパク質セグメ ントは“ブローペプチド”を表し、シグナルペプチドの開裂により除去される。

ブローペプチドの酵素活性への影響は未知である。

ＰＡＭ−ＡおよびＰＡＭ−ＢのＣ−末端の生成は、それぞれ、残基番号４３２お よび３７８に位置する塩基性アミノ酸残基対のエンドプロテアーゼ開裂による。

そのような開裂の結果、それぞれ推測される分子量が４５．０００および３９． ０００のタンパク質が得られる。残基３７９から４３２までの間のアミノ酸セグ メントは酸性である。このセグメントの性質は、ＰＡＭ−Ａは中性ｐＨでＤＥＡ Ｅセルロースと結合するがＰＡＭ−Ｂは結合しないという事実と一致する。

ＤＮＡ配列から明らかなＰＡＭ酵素の他の性質は残基番号２４０および３６０に おける２個のヒスチジン残基クラスターであって、これは銅結合と関連している らしい。

タンパク質の膜スバニングまたはトランスメンブランドメインは残基８６４から ８８７までの極めて疎水性の２４アミノ酸セグメントで構成される。ドメインの 疎水性指数（ヒトロバシーインデックス）計算値は２．９である。疎水性指数が １．６以上のこの長さのペプチドセグメントは、メンブラン−スパンである可能 性が極めて高い。カイトら（Ｋｙｔｅ）、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、 　１５７．　ｐＰ、　１０５−１３２（１９８２）：およびフォノ・ヘイジン（ ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ）、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｔ、　Ｖｏｌ、１２０．　 ｐｐ、２７５　２７８（１９８１）。本発明により、実質量の膜と結合したＰＡ Ｍ活性がマウス皮質刺激性腫瘍細胞およびラット脳下垂体前葉に、少量の膜結合 ＰＡＭ活性がラット脳下垂体中葉に見出された。膜結合ＰＡＭ活性の存在はＣＤ ＮＡ配列から推測されるウシタンパク質中の膜スパニングドメインの存在と一致 する。可溶性画分と不溶性画分との間にＰＡＭ活性が分布していることは予測さ れていなかった。

トランスメンブランドメインの直後に塩基性アミノ酸クラスター（残基８８８− ８９３）がある。これはトランスメンブランドメイン（領域）の細胞質側に特徴 的であり、輸送停止シグナルとして作用すると考えられる。カイト（前掲）およ びフォンンヘイジン（前掲）。この領域には２つの型が検出され、その１つ（ラ ムダＰＡＭ−１）はもう１つの型（ラムダＰＡＭ−５）よりも多くのアミノ酸を 有する（１８アミノ酸）。最も可能なこの不均質性（ヘテロジェニティー）の理 由はｍＲＮＡ内に別々のスプライシング部位があることである。または、この相 異はｃＤＮＡライブラリーの調製に用いた雌牛集団のボリモルフイズム（多形性 ）によるものかもしれない。Ｃ−末端までのタンパク質残余は細胞質内タンパク 質であろう。

ＰＡＭ−Ａカルボキシ末端からトランスメンブラン領域までに、−次翻訳産物の ４３０残基領域がある。この領域には２対の塩基性アミノ酸と、Ａ　ｓｎ”’　 −Ｐ　ｈｅ　−Ｓ　ｅｔ”’に潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位がある。この領 域はタンパク質の安定性、またはその凝集に寄与しているかもしれない。この領 域はまた、タンパク質が樹脂等の他の物質と酵素活性を損なうことなく交差結合 し得る領域でもある。

本発明のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列はｍＲＮＡの逆転写によって得られたのでイントロ ンを持たない。転写されたｍＲＮＡは成熟ｍＲＮＡであり、従って介在配列は既 に除去されている。ウシ染色体のＰＡＭ遺伝子は移しい数のイントロンを含有す る。

本発明のＰＡＭコード化配列配列所望のアルファーアミド化酵素活性を有するタ ンパク質を産生ずる配列であればどれでも包含される。これらには、ＰＡＭ−Ａ およびＰＡＭ−Ｂタンパク質、並びに、例えばシグナル配列、ブローペプチド配 列、膜スパニングドメインおよび／または細胞質内ドメイン等の他のタンパク質 量が包含される。ＰＡＭ−Ａはゲルろ過測定による見掛けの分子量が約５４，０ ００、ヌクレオチド配列に基づく推定の分子量が約４５，０００の、大きい型の 可溶性酵素である。ＰＡＭ−Ｂはより小さい型の酵素であり、見掛けの分子量が 約３８．　ＯＯＯ１推定の分子１が約３９，０００である。シグナル配列は開始 メチオニンの直後の疎水性セグメントであって、形成期のペプチドが合成された オルガネラを通って輸送される際に用いられる。シグナル配列は一般にそれらが 輸送された後、タンパク質から切断される。ＰＡＭ前駆体タンパク質におけるシ グナル開裂はおそら（Ｑ　１ｙ　＊　ＯとＰｈｅ”の間でおきる。

成熟ＰＡＭ−ＢのＮ−末端をアミノ酸配列決定によって決定した。

ＰＡＭ−Ｂ群は各サイクルに２個のアミノ酸が得られることから、ヘテロジーニ アス（不均質）のようであった。１つのタンパク質量はＰｈｅ”から始まり、も う１つのタンパク質量はＳｅｔ”から始まつた。

この不均質性はおそら＜Ｌｙｓ”Ａｒｇ”およびＡｒｇ”の後における別個のエ ンドプロテアーゼ開裂に起因するものと思われる。ＰＡＭ−Ｂのシグナ配列とＮ −末端残基との間の短い領域はブローペプチドを表し、それはシグナル配列の開 裂により除去される。

ＰＡＭｍＲＮＡの一次翻訳産物は記載した全ての領域を含有する。

翻訳後のエンドプロテアーゼ開裂によって組織に認められる種々の型のＰＡＭが 生成される。これら種々の型の可溶性ＰＡＭの幾つかはゲルろ過カラムからの広 い溶出活性を有し、文献記載の報告を充分に説明するものである。完全長ｍＲＮ Ａ配列は全−次翻訳産物をコードしている。このｍＲＮＡの介在配列は既にスプ ライシングによって除去されており成熟型ｍＲＮ−Ａである。

ＰＡＭコード化ＤＮＡ配列は第２図記載の配列に従って得ることができる。この 配列は化学合成することができる。または、少なくとも約３０ヌクレオチドの短 いセグメントを合成し、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーにおけ るハイブリザイゼーシ曹ツブローブとして用いることができる。そのようなライ ブラリーはＰＡＭ活性をコードし、および／または発現する任意の種、例えば、 ラット、ウシ、ヒト、およびマウスから調製することができる。このように、Ｐ ＡＭ酵素をフードする、イントロン不含の、またはイントロンを含有する配列の 両者を得ることができる。ＤＮＡ配列の化学合成およびハイブリザイゼーシロン 法は当該技術分野で周知である。ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリ ーの調製法も当業者に周知である。モレキュラークローニング（マニアテイスら ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２）参照。

発現ベクターはＰＡＭをコードする配列を適当なベクターに挿入することによっ て構築することができる。適当なベクターはＰＡＭ配列の挿入部位の直ぐ上流に 転写開始のためのプロモーターを有する。適当なプロモーターは当該技術分野で 既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる。例えば、 マウスメタロチオナインプロモーターおよび５Ｖ−４０スモールＴプロモーター を、それぞれ、マウスおよびサル細胞に用いることができる。細菌プロモーター は、細菌内でＰＡＭを発現させるのに用い得る。ＰＡＭ配列の挿入部位下流にｐ ｏｌｙ−Ａシグナルがあることが望ましｔｌ。

これはＰＡＭ配列から得られたものでも、他の遺伝子起源のものであってもよい 。ベクター中には薬物耐性マーカーのような選択可能なマーカーが存在すること が望ましい。特に望ましいマーカーは抗細菌性物質（例、ネオマイシン）および 抗臭核性物質（例、０４１８）の両者を解毒し得る細菌性アミノグリコシドホス ホトランスフェラーゼ遺伝子である。

本明細書で用いるＰＡＭ酵素をフードするＤＮＡ単離体は生きた細胞から抽出さ れた分子であって、ＰＡＭをコードしていない配列を実質上、含有しない。また は、ＤＮＡ単離体は本明細書に記載の配列であって、他のタンパク質をコードす る配列を含まない配列に従って化学合成された分子であってもよい。本明細書記 載のＤＮＡベクターは幾つかの棟内で複製可能な分子である。従って、本発明は 、ＰＡＭ　ＤＮＡ配列を生物学的に製造する方法を提供するものである。ＤＮＡ ベクターは、インビトロまたはインビボでの組換えＤＮＡ法のいずれかによる遺 伝操作によって製造される。従って、例えば天然に存在する染色体はこの語句に は包含されない。そのようなりＮＡベクターの１つは、ラムダｇｔｌｌベクター 内のウシＰＡＭ（ラムダＰＡＭ−６）の−次翻訳産物の全暗号配列を担持する、 ラムダファージである。その他のそのようなベクターはマウスメタロチオナイン プロモーターから下流をコードする全ＰＡＭ暗号配列を含有するＭｔ、ＰＡＭ− １である。それはまた、アンピシリンおよびＧ４１８耐性遺伝子、並びに細菌の 複製起点をも含有している。加えて、スモールＴ抗原遺伝子から単離されたＳ　 ｖ４０ｐｏｌｙ　−Ａ部位およびスプライス部位も含有している。

本発明のＰＡＭタンパク質の発現を実施するのに用い得る培養細胞は複製可能で あり、かつＰＡＭ酵素のイントロン不含暗号配列を発現し得るものであればよい 。一般に細胞は活性なＰＡＭタンパク質の産生における産生率および費用に応じ て選択されるであろう。

考慮されるべき、可能で望ましい細胞特性には、ＰＡＭタンパク質にとって安定 な環境の準備、ＰＡＭの分泌、ＰＡＭに富む膜の形成、ＰＡＭのグリフシル化お よび／またはりん酸化、ＰＡＭの忠実なエンドプロテアーゼ分解が含まれる。こ れらの特性全部が特定の目的に必要な訳でなく、むしろ相互に排他的である。あ る目的では、大腸菌のような原核性微生物が使用され、他の目的ではＳ、セレビ シェのような真核性微生物が使用され、さらに他の応用例では組織培養が用いら れる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばマウス、ラットおよび サル細胞が含まれる。発現は一過性または連続的なＰＡＭ遺伝子の組み込みのい ずれによってもよい。これらの細胞システムの選択および使用も通常の技術者に とって既知である。

ＰＡＭによって活性化されるペプチドホルモンは神経性および内分泌系の生物学 的に活性なペプチドである。即ち、それらは通常、細胞の生産よりもむしろ細胞 の機能に影響を及ぼす。既知の神経系および内分泌系ペプチドのほぼ半数が活性 に不可欠なカルボキシ末端のアルファアミド化アミノ酸を有する。これらにはガ ストリン、神経ペプチドＹ、バンプレッシン、コルチコトロピン放出因子が含ま れる。前駆体分子のアミノ酸配列が決定された場合、成熟ペプチドのアミド化残 基の次には常にグリシンが見い出されている。ＰＡＭの基質にとって、アミ７基 受容残基に隣接するアミノ基質供給体としてグリシンが必須のようである。多く の組織に新規なアミド化ペプチドが見い出されており、それらの生産にＰＡＭが 必要と考えられている。

本発明の実施に用いる膜製品は合成品または天然物のいずれであってもよい。膜 スバニングドメインを有する純化ＰＡＭタンパク質をリポソームまたは天然の膜 、例えば細菌や動物起源の膜に導入する。

膜調製法は当該技術分野で既知である。レンガサミーら［Ｒｅｎｇａｓａｍｙ　 Ａ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｎ＋ｎ、、　 Ｖｏｌ、　１２６＋　ｐｐ、　１−７（１９８５）］。リポソームの調製法も既 知である。スゾカら［５ｚｏｋａ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　Ｖｏｌ、７５．　ｐｐ 、４１９４　４１９８（１９７８）］。または、マウス皮質刺激性腫瘍細胞やラ ット脳下垂体前葉細胞等のＰＡＭを産生ずる細胞の膜にＰＡＭを導入したものを ＰＡＭ活性を有するメンプラン製品の供給源として用いてもよい。他の膜製品供 給源としては複製可能でイントロン不含のＰＡＭ暗号配列を発現する培養細胞が ある。膜結合ＰＡＭの使用には生産物の単離、生成の容易さと、ＰＡＭの安定化 という利点がある。

大腸菌をラムダファージＰＡＭ−１、ＰＡＭ−２、ＰＡＭ　３またはＰＡＭ−５ に感染させ、Ｉ　ＰＴＧ（イソプロピル−ベーターＤ−チオガラクトピラノシド ）で処理するとＰＡＭタンパク質配列配列現された。（構築に関する詳しい記載 は実施例２、マツプは第１図参照。）発現タンパク質は大腸菌のベーターガラク トシダーゼとウシＰＡＭ配列との融合タンパク質である。従って、これら感染細 胞は、複製可能であってＰＡＭタンパク質のイントロン不含暗号配列を発現し得 る培養細胞の１例である。その他、ＰＡＭタンパク質および活性なＰＡＭ酵素を 産生じ得る培養細胞は多数存在する。複製および発現が有効に行われるためには 適当なベクターが必要である。そのようなベクターも当業者には多数知られてい る。

多数の動物種起源のＰＡＭのｍＲＮＡおよび遺伝子は任意のラムダＰＡＭファー ジから得られたＤＮＡプローブまたは第２図記載のウシＰＡＭ配列に従って合成 されたプローブを用いて同定することができる。これらのＤＮＡプローブは様々 な動物種および様々な組織のＲＮＡから導かれたｃＤＮＡライブラリーからＰＡ Ｍをコードするクローンを同定するのに有用である。これらのプローブはまた、 ゲノムライブラリー中のＰＡＭクローンの同定にも有用である。一般にこれらの プローブは長さ約６０〜５ｏｏｏヌクレオチドであって、合成するか、生物から 単離される。プローブはまた、同じ動物の様々な器官でのＰＡＭ産生の研究にも 用いろれる。例えば、ラムダＰＡＭ−１の０．７ｋｂおよび２．２ｋｂ断片を用 いてラットの様々な組織でのＰＡＭ発現レベルを測定した。プローブによって、 ラットの脳下垂体中葉、大脳皮質および間脳では最も高レベルにＰＡＭｍＲＮＡ 発現が検出され、脳下垂体前葉では低レベル、肝臓ではＰＡＭｍＲＮＡを全く検 出しなかった。これらのプローブによって、マウスの皮質刺激性腫瘍細胞中のＰ ＡＭｍＲＮＡを検出することもできた。これらのプローブを用いて、ウシ、ヒト 、ラットおよびマウスゲノムＤＮＡの消化物中のホモローガス制限断片の同定も 行われた。

上記のように、他の動物種のＰＡＭｃＤＮＡが得られれば、ＰＡＭタンパク質の 発現ベクターを構築することができる。これらを適当な培養細胞に適用し、ＰＡ Ｍタンパク質を発現させることができる。そのようなベクターの構築方法は当業 者に既知である。

膜スパニングドメインを有し、実質上池のタンパク質を含有しないＰＡＭタンパ ク質を得る方法は多数ある。タンパク質は動物の脳下垂体のような天然起源から 得ることができるが、ごく僅かしか期待できない。または、完全長さのＰＡＭ暗 号配列を発現する複製可能な培養細胞から膜結合ＰＡＭを精製することができる 。タンパク質の大部分がＰＡＭ−ＡまたはＰＡＭ−Ｂに存在するものでないない ので、この膜結合ＰＡＭタンパク質は殆どのカラムクロマトグラフィーにおいて ＰＡＭ−ＡまたはＰＡＭ−Ｂと異なる挙動を示すだろう。しかしながら、ＰＡＭ −Ａ、ＰＡＭ−ＢまたはＰＡＭ−ベーターガラクトシダーゼ融合タンパク質に対 して惹起された抗体を用いて大きいＰＡＭタンパク質を同定することができる。

サイズや電荷のような他の物性を用いて、大きいＰＡＭタンパク質をＰＡＭ−Ａ またはＰＡＭ−Ｂから分けることができる。加えて、ＰＡＭ−ＡおよびＰＡＭ− Ｂに用いたアフィニティー精製法も有効であろう。

その他のタンパク質精製法も当業者にとって既知であり、それを本発明に用いる ことができる。

ＰＡＭ酵素を用いてタンパク質を効率良（アミド化するためには、反応条件が最 適でなければならない。種々の型のＰＡＭが異なる物性を有し、異なるコファク ターを要求するであろう。ＰＡＭ−ＡおよびＰＡＭ−Ｂの両者とも、アルカリ性 に至適ｐＨを有する。また、それらの活性は酸素分子、銅およびアスコルビン酸 塩の添加で促進される。

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発 明を制限するものではない。

実施例１ 本実施例ではウシ脳下垂体中葉から精製された、目的の酵素活性（即ち、ペプチ ジル−グリシンアルファーアミド化モノオキシゲナーゼ活性）に相当するタンパ ク質に関して述べる。

ＰＡＭ−ＡおよびＰＡＭ−Ｂをマーシーら（Ｍｕｒｔｈｙ、Ｊ　ｏｕｒｎａｌｏ ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、２６　Ｌ　Ｐｐ 、　１８１５　１８２２（１９８６）：ｌの記載した方法に従って精製した。０ ．９％Ｎａ（Ｊｌ。

０　、７５　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　ｌ；：　Ｐ　Ａ　Ｍ　Ｂ　９　μ９を煮沸溶解し 、７ｏインドの完全アジ一バントと一緒に乳化したものをウサギに皮下注射して ポリクローナルＰＡＭ抗血清（Ａｂ３６）を生成させた；ウサギを同様のＰＡＭ −Ｂ試料で一回、追加免疫し、さらに、ＰＡＭ−ＡとＰＡＭ−Ｂとの混合物で２ 回、追加免疫した。４００のウシ脳下垂体中葉から採取し、純化したＰＡＭ−Ａ およびＰＡＭ−Ｂを活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア＞３５０ｘｙ と結合させた。ワンドら［Ｗａｎｄ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、 　１２　（Ｌ　ｐｐ、　９５３　９６１（１９８７）］の記載に従い、抗血清を アフィニティー精製した。純化抗体をプロティンＡ樹脂に結合させた。

ウサギ血清中のＰＡＭ活性との混同を避けるために酵素消耗アツセイを用いた。

純化ｐ　Ａｍ−Ｂを放射性ヨウ素で標識したＰＡＭ−Ｂタンパク質によってスパ イク処理した。スパイク処理した混合物を抗ＰＡＭ樹脂と一緒にインキ一ベート した。次いで樹脂を上溝と分離した。樹脂と結合した放射活性を測定し、上清に 残存する酵素活性の量をめた。様々な量の抗体樹脂を用い、同様にインキニベー シ１ンして測定を行った。

その結果、上清からのＰＡＭ活性の消失と、樹脂に結合した放射性標識タンパク 質の量とに直線関係を認めた。この結果から酵素活性を主要タンパク質と同定す ることに矛盾しなかった。

実韮肩ヱ 本実施例ではＰＡＭｃＤＮＡクローンを得る方法、およびＰＡＭＤＮＡｒｒ片の マンピンングについて記載する。上記のごとくにして抗血清（Ａｂ３６）を調製 した。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーを調製するために、シナイブ−ら［Ｓ　ｎｙｄｅｒ ＋Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ、　１５５＋　ｐａ ｒｔ　Ｆ　（１９８７）］およびデイヴイスら［Ｄａｖｉｓ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　 ５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （１９８６）〕の方法を用いた。詳しくは、チャーブウィンらＥＣｈｉｒｇｓｉ ｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　Ｖｏｌ、１８＋　ｐｐ、５２９４　５２９９（１ ９７９）コの方法で脳下垂体中葉から全ＲＮＡを調製した。アマ−ジャム（Ａ＋ ｏｅｒｓｈａｍ）ｃＤ　Ｎ　Ａ合成システムによるｃＤＮＡの合成にｐｏｌｙ（ Ａ　）’　ＲＮ　Ａ５μ９を用いた。ガプラーら［Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｇｅｎｅ、 　Ｖｏｌ、　２５＋　ｐｐ、　２６３−２６９（１９８３）］。ゲルろ過によっ て５００塩基対以上の長さのｃＤＮＡセグメントを選択した。これらをラムダｇ ｔｌｌアーム（プロメガ・バイオチク）１μ２と結合させＧｉｇａｐａｋ　Ｇｏ ｌｄ’″インヒドロラムダＤＮＡパッケージングキット（ストラタジーン）を用 いてパッケージングした。２．３Ｘ１０＠個の組換えファージが得られ、全ファ ージの１１％が非組換え体であった。

組換えファージをまず上記のアフィニティー精製したＰＡＭ抗血清でスクリーニ ングした。１ｓｏｘｘの皿６枚に皿あたり６．３Ｘ１０４の密度で組換えファー ジをブレーティングした。ＰＡＭ抗血清と反応性を有するタンパク質を産生ずる ファージを同定するために、ファージプレートにＩ　ＰＴＧ（イソプロピル−ベ ーターＤ−チオガラクトピラノシド）でコートしたニトロセルロースフィルター を８時間適用することにより、ファージをＩ　ＰＴＧで誘導した。このフィルタ ーを次いで、ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、１５０ｍＭ　ＮａＣｇ、ｐ Ｈ７，５）中、室温で０．５時間洗浄した。次いで、タンパク質を含有しないフ ィルタ一部分を０．１　ｎ／ｌＱウシ血清アルブミンと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ を含有するＴＢＳ中、室温で１時間プロ・２り（保護）した。抗血清（Ａｂ３６ ）をＴＢＳ／ＢＳＡ＋Ｔｗｅｅｎ２０で希釈し、フィルターに適用し、フィルタ ーと抗体を４℃で一夜、または室温で４時間インキュベートした。次いでフィル ターをＴＢＳ／ＢＳＡ＋Ｔｖｅｅｎ２０により室温で０．５時間洗浄した。ＴＢ Ｓ／ＢＳＡ中、放射性ヨウ素化プロティンＡ（１０ＳｃｐＩ！ｌ／ｘＩ２）を室 温で２〜４時間フィルターに加えた。フィルターを室温において、ＴＢＳ／ＢＳ Ａ中で１ｏ分間、次Ｌ’ｌｔ”、０．１％　ＮＰ−４０含有ＴＢＳ／ＢＳＡ中で １０分間×２、次いでＴＢＳ／ＢＳＡ中で１０分間洗浄した。

強化スクリーンを用い、オートラジオグラフィーによって一７０℃で放射性活性 の局在部位を検出した。最初、抗血清と反応陽性の１８プラークを同定した。再 スクリーニングでは、６個のみが陽性でありその内、最大シグナルを産生ずる４ フアージ（ラムダＰＡＭ−１、ＰＡＭ−２、ＰＡＭ−３、およびＰＡＭ−５）を 更に特性化した。

特性化した組換えファージは遺伝子の５°末端を欠失していたので、５°末端を 含有するプラークを同定するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした 。これを、他のライブラリ一部分とニックトランスレーションしたラムダＰ　Ａ Ｍ　１　（０，４ｋｂおよび０．７ｋｂ断片）とのハイブリザイゼーシ１ンによ って行った。このようにして完全長のＰＡＭｃＤＮＡを含有すると思われるファ ージ、ラムダＰＡＭ−６を同定した。

第１図にアフィニティー精製Ａｂ３６とｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを用いて同定し たファージのために得たｅＤＮＡクローンの構造を要約して示す。プラーク精製 したファージＤＮＡｆｅＥｅｏＲ１消化し、放出された断片のサイズをアガロー スゲル電気泳動で測定した。ラムダＰＡＭ−１のＥｃｏＲ１断片をＢ　１ｕｅｓ ｃｒｉｐｔ’−（ストラタジーン）にサブクローニンクシ、ニックトランスレー シゴンし、他のファージのＥｃｏＲＩ消化物のサザーンブロッテイングのプロー ブとして用いた。

この断片をＥｃｏＲＩ株ＣＡＣ，４５６で産生される融合タン／１り質の分子量 と制限断片に対する合成オリゴヌクレオチド（表１の下方に記載）の雑種形成（ ハイブリザイス）能力に基づいて５’−３’方同に並べた。ファージラムダＰＡ Ｍ−３ａおよびラムダＰＡＭ−５ａがラムダＰＡＭ−３およびＰＡＭ−５の精製 中に明らかになった。

（以下余白） 表１に記載の各分析のために４００の凍結ウシ脳下垂体中葉からＰＡＭを精製し た（１）。４つの異なる標品に関してＰＡＭ−ＢのＮＨ１末端配列を決定した。

ＮＨ，末端配列に関して、各サイクルごとに一致する複数の残基が見い出された 。データは、示唆された２個の主要ＮＨ，末端配列の存在と合致していた。さら に、はぼ等量のＧｌｕおよびＴｙｒが４１位に一致して認められた。

大と理１ 本実施例ではウシＰＡＭｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を得た。

サブクローニングしたＰＡＭｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片の配列を、ジデオキシ鎖 ターミネーション法で決定した［サンガーら（Ｓ　ａｎｇｅｒ：ＬＰｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｓ　ｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ 　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ。

７４、ｐｐ、５４６３−５４６７（１９７７）；ビギンら（Ｂ　１ｇｇ１ｎ）、 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓ 　ｃｉｅｎｃｅ　Ｕ　Ｓ　Ａ、　Ｖｏｌ、　８０、ｐｐ、３９６３−３９６５（ １９８３）；シアンら（Ｃｈｅｎ）、　Ｄ　Ｎ　ＡＶｏｌ、４．ｐｐ、１６５− １７０（１９８５）］。ストラタシーンノ示シた方法で１本鎖配列決定を行った 。２本鎖配列決定はニューイングランドバイオラボの方法で行った。ラムダＰＡ Ｍ−１の２．２ｋｂＥｃｏＲＩ断片の配列を決定するためにストラタジーン供給 のＥｘｏＩＩ［／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼキットを用いて、ｃＤＮＡの ５°および３゛末端から内側に向かって順番に進む一連の欠失断片を生じさせた 。

ラムダＰＡＭ−１、ＰＡＭ−５およびＰＡＭ−６の配列決定法は第１図Ｂにおけ る矢印で示されている。配列決定された臭化シアンペプチドと、合成オリゴヌク レオチドの関係はファージマツプ下方の斜線を引いた棒および線断片で示されて いる。ラムダＰＡＭ−６の０、６ｋｂ　ＥｃｏＲ１断片の配列を決定するために 、ＮｄｅＩおよびＮａｒ■による欠失断片を調製した。０．８ｋｂ断片と０．７ ｋｂ断片とを分割するＥｃｏＲＩ部位はペプチドＨＲ６内にあり、これらＥｃｏ ＲＩ断片はいずれもオリゴヌクレオチドＮ０１６とハイブリザイズした。（臭化 シアン断片およびオリゴヌクレオチドについては表１参照）。適当な５ｓｐｌ− ＸｂａＩ断片のサブクローニングと合成オリゴヌクレオチドブライマーとを用い て０．７ｋｂ断片と２．２ｋｂ断片を分離するＥ。。Ｒ１部位を横切る配列を決 定した。合成オリゴヌクレオチドブライマーまたは唯一（ユニーク）の制限部位 を用いる欠失を利用して分子の特定領域の配列決定を行った。

得られたラムダＰＡＭ−１、ＰＡＭ−５およびＰＡＭ−６のヌクレオチド配列を 用いてｃＤＮＡ配列を組み立て、アミノ酸配列を推定した。第１ｂ図に記載した ように、ＤＮＡ両鎖の全分子の配列を決定した。アミノ酸配列は、ライン下方に 開始メチオニン（太い下向矢印で示されている）から番号が付されている（第２ 図参照）。臭化シアン断片に基づいて得たペプチド配列の情報と合致するアミノ 酸残基を下線で示す。塩基性アミノ酸対は１対のムで表示されている。Ｎ−結合 グリコシル化の可能性部位には点々が付されている。

ｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルはボックスで囲まれている。ラムダＰＡＭ−５にお いて、ヌクレオチド２８２３から２８７６までの５４塩基対セグメントが不在で ある。

第３図はＰＡＭｃＤＮＡ配列の重要な特徴を示す図である。推定のシグナル配列 および膜スパニングドメインの位置が示されている。

可能な塩基対開裂部位の全てが示されており、ＰＡＭ−ＡおよびＰＡＭ−Ｂのア ミノ−末端、並びにカルボキシ−末端と思われる部位が示されている。銅結合に 関連している可能性があるヒスチジンに富む２領域の配列も示されている。この 図では、標準的なアミノ酸の１字表記法を用いた。

実施例４ この実施例では、微生物による、ＰＡＭ抗体と反応性のタンパク質の発現を証明 する。

大腸菌株ＣＡＧ４５６の培養物ＬｏｗＯをラムダｇｔｌｌ、ラムダＰＡＭ−１、 ラムダＰＡＭ−２またはラムダＰＡＭ−３で感染させ、１０ｍＭベータガラクト シダーゼオペロン（Ｉ　ＰＴＧ）でＩＰＴＧ誘導を行った。３７°Ｃで２時間経 過後、細胞をペレット化し、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ） 含有ＳＤＳゲルサンプルバッファー［レムリらの記載に従う（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖ ｏｗ、　２２７＋　Ｐ９．６８０−６８５（１９７０）］に煮沸溶解した。約５ ％の各試料を８％ポリアクリルアミドスラブゲルにかけて分画し、ニトロセルロ ースに移し、ＰＡＭ　Ａｂ３６またはベーターガラクトシダーゼと反応性のマウ スモノクローナル抗体と　ＩｔＪ−標識プロチインＡを用いて観察した。観察は オートラジオグラフィーによって行った。

産生された融合タンパク質は明らかに不均一（不均質）であった。

産生された最大の融合タンパク質の分子量はミオシンの分子量よりもやや大きく 、約１００．０００ダルトンのＰＡＭ関連タンパク質領域の生産が示唆された。

これはウシ脳下垂体から精製されたＰＡＭタンパク質のサイズの２倍以上である 。融合タンパク質はＴ　ｒｉｔ。

ｎＸ−１００のような可溶化剤の存在下においても不溶性である。

寒履豊五 この実施例ではうムダＰＡＭ−１によって産生された融合タンパク質が実際に、 真性のＰＡＭ酵素と免疫学的に関連していることを証明する。

上（実施例１）に記載した酵素欠失アッセイを用いた。この実験のために、プロ ティンＡ−セファロースからなる樹脂に融合タンパク質抗体（下記）を共有結合 的に交差結合させた。さらに、樹脂に結合した酵素活性と、上清に残存する酵素 活性との分析法を考案した。

ラムダＰＡＭ−１の融合タンパク質に対する抗体を、ラムダＰＡＭ−１で感染さ せた大腸菌ＣＡＧ４５６の培養物５０！！（の細胞ペレットを凍結および解凍す ることによって産生させた。ライゼートを１００＠ＭソディウムＴＢＳ、ｐＨ７ ，４，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ１．５Ｘｆｆ中で音波処理し、ｌｏ 、ｏｏＯＸｇで１０分間遠心した。融合タンパク質の大部分がペレット中に存在 した。細胞ペレットをＳＤＳサンプルバッファー２πａに煮沸溶解し、セファク リルＳ−３００ＳＦカラムに適用した。カラムから溶出したフラクションをポリ アクリルアミドスラブゲル電気泳動にかけ、クーマシーブリリアントブルー処理 して観察した。カラム溶出液から得た、ミオシンからベーターガラクトシダーゼ までのサイズのタンパク質を含有するフラクションを分取し、ウサギの免疫化に 用いた。

３匹の雌性二二−ジランドホワイトラビット（２ｋｇ）をフロイントの完全アジ 二バントに乳化した培養物５０峠から得た融合タンパク質の１／６（それぞれ０ ．５Ａｔ−０単位）で免疫した。ウサギを、フロインドの不完全アジニバント中 の等量の融合タンパク質を用い、２〜４週間の間隔で５回、追加免疫した。ウサ ギＡｂ４５から得た免疫グロブリンを硫酸アンモニウムで沈澱させ、３Ｍチオシ アン酸カリウム、Ｏ，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！（ｐＨ７，２）に対して透析し 、Ｓ−３００カラムで同一バッファー中で分画した。８０．　ＯＯＯダルトン以 上のタンパク質を含有する両分を５ＱｍＭ　ＮａＴＥＳ、ｐＨ７゜４に対して透 析し、プロティンＡ−セファロースと結合させた。

免疫前（ブレイミニン）の血清と抗血清Ａｂ３６は、プロティンＡ−セファロー スと結合させる前にチオシアン酸カリウム処理しなかった。チオシアン酸カリウ ム処理を行わないと、Ａｂ４６から調製した樹脂のＰＡＭ活性は０　、１５　ｐ ｍｏｌ／　ｈであった。Ａｂ３６抗血清および未処理Ａｂ４６樹脂中のＰＡＭ活 性は循環しているＰＡＭ抗体と結合した循環中のウサギＰＡＭによるものと思わ れる。

ＰＡＭ−Ａ（０，９５ｐｍｏｌ／ｈ）ＰＡＭ−Ｂ（０，６５ｐｍｏｌ／ｂ）また は１００．０ＯＯＸ９ウシ脳下垂体脳下上清（２、７８ｐｍｏｌ／　ｈ）の一部 を表２に示した抗血清から得た免疫グロブリンを共有結合的に交差結合させたプ ロティンＡ−セファロース樹脂と一緒にインキコベートした・樹脂と結合した酵 素活性を２回測定した結果、＋または一１５％以内の範囲の偏差であった。この 実験を様々な形で９回繰り返し、同様の結果を得た。

免疫前　０．００１　０．０３０．００２　０．０６　３　０．３　２（ベータ ーｇａｌ−０，００１０，５５０，１６０，５２５８２５１９ＰＡＭ融合） 表２の最下段に見られるように、Ａｂ４６（ベーターガラクトシダーゼ−ＰＡＭ 融合タンパク質に対して惹起された）はウシ脳下垂体中葉から単離された上滑の ＰＡＭ活性と結合し、除去された。このことはうムダＰＡＭクローンが実際にＰ ＡＭ酵素をコードする配列を有することを示すものである。

国際調査報告 一＋１１″ｌ　Ａ−肯１””＝　ＰＣＴ／ＬＩＳ　ＢＢ１０３１７２国際調査− 暢告　ＰＣＴＡＩ５８ｇ１０３１７２５Ａ　２４ｇ３９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＰＡＭ酵素をコードするＤＮＡ単離体。 ２．ＰＡＭ酵素をコードするＤＮＡベクター。 ３．ＰＡＭ酵素をコードする配列がイントロンを含有しないものである請求項２ 記載のＤＮＡベクター。 ４．ＰＡＭ酵素をコードする配列がラット、ウシ、マウス、およびヒトからなる 群から選択される動物のゲノムとホモローガスである請求項２記載のＤＮＡベク ター。 ５．ＰＡＭ酵素がＰＡＭ−Ａである請求項２記載のＤＮＡベクター。 ６．ＰＡＭ酵素がＰＡＭ−Ｂである請求項２記載のＤＮＡベクター。 ７．ＰＡＭのプロペプチドの暗号配列を含有する請求項２記載のＤＮＡベクター 。 ８．膜スパニングドメインの暗号配列を含有する請求項２記載のＤＮＡベクター 。 ９．完全長のウシＰＡＭｍＲＮＡの一次翻訳産物をコードする配列を含有する請 求項２記載のＤＮＡベクター。 １０．ＰＡＭ酵素を製造する方法であって、複製可能であって、イントロンを含 有しないＰＡＭ酵素の暗号配列を発現する培養細胞を得、 該培養細胞を増殖させ、次いで 該培養細胞から、産生されたＰＡＭを回収することからなる方法。 １１．産生されたＰＡＭがＰＡＭ−Ａ、ＰＡＭ−Ｂ、ベーターガラクトシダーゼ −ＰＡＭ融合タンパク質、および完全長のＰＡＭｍＲＮＡの一次翻訳産物からな る群から選択されるものである請求項１０記載の方法。 １２．培養細胞が原核性細胞である請求項１０記載の方法。 １３．培養細胞が真核性細胞である請求項１０記載の方法。 １４．該イントロン不含暗号配列が膜スパニングドメインの暗号配列を含有する ものである請求項１０記載の方法。 １５．該イントロン不含暗号配列が完全長のＰＡＭｍＲＮＡの一次翻訳産物の暗 号配列を含有するものである請求項１０記載の方法。 １６．インビトロでペプチドホルモン前駆体を活性化してＣ−末端アミノ酸残基 にアルファーアミド基を有する成熟ホルモンを得る方法であって、 成熟ホルモンのＣ−末端アミノ酸残基のＣ−末端側にグリシン残基を有するペプ チドホルモン前駆体を得、該ペプチドホルモン前駆体とＰＡＭ活性を有する膜製 品とを接触させてペプチドのアルファーアミド化誘導体を形成させることからな る方法。 １７．膜製品が、完全長のＰＡＭｍＲＮＡの一次翻訳産物の暗号配列を発現する 複製可能な培養細胞から調製されたものである請求項１６記載の方法。 １８．膜製品が、膜スパニングドメインを有するＰＡＭ酵素を合成膜に導入する ことにより調製されるものである請求項１６記載の方法。 １９．膜製品がイントロン不含のＰＡＭ酵素の暗号配列を発現する複製可能な培 養細胞から調製されたものである請求項１６記載の方法。 ２０．膜スパニングドメインを含有し、実質上、ＰＡＭ活性を示さないタンパク 質を含有しないＰＡＭタンパク質。 ２１．ＰＡＭ酵素をコードするベクターで形質転換された培養細胞。 ２２．イントロンを含有しない、ＰＡＭ酵素の暗号配列で形質転換された請求項 ２１記載の培養細胞。 ２３．原核性細胞である請求項２１記載の細胞。 ２４．酵母細胞である請求項２１記載の細胞、２５．哺乳類細胞である請求項２ １記載の細胞。 ２６．鳥類細胞である請求項２１記載の細胞。 ２７．ＰＡＭ酵素が膜スパニングドメインを含有する請求項２１記載の細胞。