JPH0365326B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、貯蔵寿命の長い高酸素輸送能力を有
する交叉結合されたヘモグロビン剤の製法に関
し、それに於て、基質の含まれないヘモグロビン
溶液は燐酸ピリドキサール又はヘキサ燐酸イノシ
トールで処理され、３乃至８個の炭素原子の炭素
鎖を有するジアルデヒドと交叉結合される。 “血液交替”としてヘモグロビン溶液を使用す
ることの努力は、今世紀の前半から成されてい
る。注射によつて赤血球の溶血物を与える企てに
よつて発展が初まつた。しかしながら、これらの
製剤中に含まれる基質成分は腎臓に毒性の影響を
有し、且つまた凝固の化学反応に影響を及ぼすこ
とがすぐにわかつた。努力は次に基質の含まれな
いヘモグロビン溶液の製造に向けられた。これに
対する異なつた２つの研究がある。ラビナーとそ
の協力者は1967年に遠心力と限外濾過によて基質
の含まれない溶液を最初に製剤した〔ラビナー
エス エフ（Rabiner S.F.）その他、ジヤーナ
ル エクスペリメンタル メデイシン（J.Exp.
Med.）、126 1127、1967年〕。この方法はカー
ボンハルト（K.Bonhard）によつて改良された
（西独特許発明明細書第2248475号）。最近結晶化
された基質の含まれないヘモグロビンが報告され
た〔ドウ ベニユトエヌ（De Venuto F.）、ジ
ヤーナル ラボラトリー クリニツク メデイシ
ン（J.Lab.Clin.Med.）、89，509，1977年〕。しか
しながら、これらの基質の含まれないヘモグロビ
ン溶液は、それらが明らかな不利益を多数有して
いるために、血液交換に使用するためには適して
いない。 赤血球内のPH値は、血漿のPH値よりも低く、
7.4に対して約7.2である。この酸性の相異は酸素
固定曲線の左側への移行を引き起こす。それは、
即ち酸素親和力の増加は、赤血球中の酸素の解離
を調節する作用物質、２，３−ジ−ホスホグリセ
リン酸塩（DPG）の回収によつてさらに増大さ
れる。上記の方法で製剤されたヘモグロビン溶液
は、約16ミリバールだけの半飽和圧P₅₀を有して
いる。該半飽和圧P₅₀を２，３−ジ−ホスホグリ
セリン酸塩の添加によつて生体外で31ミリバール
に上昇させることは可能であるが、しかし、生体
内では該ジ−ホスホグリセリン酸塩のヘモグロビ
ンに対する弱い結合に起因して該ジ−ホスホグリ
セリン酸塩は腎臓によつて非常に急速に排出され
る。この不利益はもつと強く結合された作用物質
の使用によつて除去される。西独特許出願公開明
細書第2617822号中に多量の酸素を生じさせるヘ
モグロビン剤を導き出す燐酸ピリドキサールを使
用する方法が記述されている。 酸素製出量の低さの問題は解決されたが、記述
されている溶液に疑いのない不利益が残されてい
る。即ち、これらの溶液の血管内の半減期はわず
かに約100分である。血漿中に溶解しているヘモ
グロビンは、その構造及び大きさ（分子量64500）
によつて、腎臓によつて急速に除去される。又、
もしそれが血液交替に必要な大量を注射されたな
らば、それは一時的に腎臓の機能を損傷する。 血管内の半減期を延ばすために、種々の方々が
使用されている。それらの方法の全てはヘモグロ
ビンの分子量の増大に目的が向けられている。１
つの企ては、ヘモグロビンを例えばデキストラン
〔チヤング ジエー イー（Chang，J.E.）その
他、カナダ、ジヤーナル 生化学（Can.J.
Biochem.）55，398，1977年）〕、ヒドロキシエチ
ル澱物（西独特許出願公開明細書第2616086号）、
ゼラチン（西独特許出願公告明細書第2449885
号）、アルブミン（西独特許出願公告明細書第
24498885号）及びポリエチレングリコール（西独
特許出願公開明細書第3026398号）の様な高分子
量重合体と結合させることである。又、ヘモグロ
ビン分子同士を結合する目的で非常に多くの種類
の交叉結合剤が使用されている（西独特許出願公
告明細書第2449885号、米国特許第4001200号、米
国特許第4001401号）。 これら交叉結合された製剤の全ては血管内の半
減期は延長されたが、それらは多数の他の不利益
を受ける。 ２価の試薬によつて、該ヘモグロビンを互いに
又は他の高分子と結合することは、均一な分子量
の製造物を生じさせない。それはむしろ４本の鎖
の基本構造から始まりそれのオリゴマーを経て、
高度に重合した分子に到る限界を定める広い分子
量の分布を生じさせる。そのように広い分子量の
分布がそれらの溶液の耐性に及ぼす影響が何かと
いうことはまだ十分に知られていない。しかしな
がら実験動物の腎臓及び肝臓の組織学上の変質は
単量体成分及び重合体成分の夫々に起因すること
は明らかである。 ヘモグロビン分子の化学修飾は、しばしば酸素
固定曲線に影響を与える。ほとんどの場合、酸素
に対する親和力は増加する。それゆえに、より少
量の酸素が各種の生理学的条件下で組織に生じ
る。他の場合、化学的に変化されたヘモグロビン
は肺の中の酸素の分圧では少量の酸素を受容す
る。それ由に十分な酸素の輸送は保証されない。
交叉結合に先行する燐酸ピリドキサールの様な作
用物質の結合は、酸素の親和力の増大に対して作
用する。しかし、血漿のPH値7.4に於て繰り返し
27ミリバール以上の半飽和圧P₅₀を得ることは不
可能であつた。 該交叉結合は、同時に、ヘモグロビン溶液の貯
蔵寿命を非常に減少させる。貯蔵寿命の限界の要
因は、メトヘモグロビンの形成であり、それは酸
素を輸送せず且つ除々に該溶液の効果をなくさせ
る。 本発明の目的は、血管内の半減期が延ばされた
交叉結合した下記ヘモグロビン剤の製剤にあり、
それはａ） 狭い分子量分布を有する。即ち、高
度に重合されたヘモグロビンを含まず且つ交叉結
合していないヘモグロビンが少ない。ｂ） 又、
この安定した分子量分布を保持するのにもかかわ
らず、交叉結合を行なう。ｃ） 又、高い酸素輸
送能力を有し、且つｄ） 良好な安定性（貯蔵寿
命）を有する。 この目的は本発明によつて達成される。即ち、
基質を含まない濃縮ヘモグロビン溶液を、酸素分
圧を０ミリバールに低くする量の酸素消費還元剤
で処理し、このように公知の方法で得られた酸素
を除去された製造物を燐酸ピリドキサール又はヘ
キサ燐酸イノシトールのような生理学的に耐性の
作用物質で処理し、ただちにPH値６乃至８でジア
ルデヒドで処理し、交叉結合された製造物を５乃
至20倍の量のカルボニル基特定還元剤で還元し、
該溶液を水で希釈し、それを交叉結合していない
ヘモグロビンの量が15％以下になるまで限外濾過
器を通してポンプで循環し、交叉結合は限外濾過
の前又はその間に遂され且つ還元剤の添加によつ
て製造物を安定化する。また必要に応じて、前記
カルボニル基特定還元剤で還元し、該溶液を水で
希釈した後、活性炭で処理するようにしてもよ
い。 本発明によつて製造されるヘモグロビン剤は、
上述の不利益は１つも有しない。 上述の望まれる性質ａ）乃至ｄ）は実質的に下
記の全体的な製造工程によつて達成される。 ａ） 限外濾過 ｂ） カルボニル基特定還元剤での還元 ｃ） 酸素消費還元剤での化学的酸素除去の遂行 ｄ） 交叉結合され、限外濾過されたヘモグロビ
ン剤に対する還元剤の添加。 交叉結合は、炭素原子数３乃至８の炭素鎖を含
むジアルデヒドで遂行される。それらは、例えば
西独特許出願公告明細書2449885号に記述されて
いる。 更に低い酸素親和力のために、交叉結合は例え
ば西独特許出願公開明細書第2617822号に記述さ
れている燐酸ピリドキサール又は西独特許出願公
開明細書第2740053号に記述されているヘキサ燐
酸イノシトールの様な生理学的に耐性の作用物質
での処理が遂行される。 これら上述の方法で製剤された溶液は上昇され
た酸素親和力（約20ミリバールの半飽和圧P₅₀）
を有する。 西独特許出願公告明細書第2449885号に記述の
交叉結合過程の１実施例に於て、該ヘモグロビン
溶液は交叉結合の前にデソキシ型に転換されてい
る。しかし、酸素除去は窒素の排出及び溢流によ
つて遂される。しかしながら、比較的に大量が使
用されるならば、酸素除去は完全ではない。この
方法によつて、５リツトル容器中の２リツトルの
18％ヘモグロビン溶液の酸素除去に於て、40回繰
り返した後でさえ、酸素の分圧はわずかに33ミリ
バールに低下しただけであつた。酸素固定曲線か
ら該ヘモグロビンは依然、この酸素分圧で75％飽
和していることがわかる。 驚くべきことには、もし該ヘモグロビン溶液
が、化学的に交叉結合の前にデソキシ型に完全に
転換されるならば、燐酸ピリドキサールの様な作
用物質で処理された交叉結合し、還元され、且つ
限外濾過されたヘモグロビン剤がPH値7.4で33〜
38ミリバールの半飽和圧P₅₀で製剤され得ること
が見い出された。 本発明によれば、全ての酸素はアスコルビン
酸、還元グルタチオン、還元メチレンブルー又は
適当に中和されたアスコルビン酸の様な酸素消費
還元剤によつて該溶液から除去される。この方法
の効果は表１からわかる。

【表】 上述の交叉結合されたヘモグロビン溶液は、依
然として分子量分布の安定性が限られているとい
う不利益を有している。それらが貯蔵中、大きな
分子量の方に移行する（第３ａ図，第３ｂ図）。
尚、第３ａ図は製造直後、第３ｂ図は製造５週間
後の上記ヘモグロビン剤の分子量分布曲線を夫々
示す。アルデヒドとアミノ基とでアゾメチンを製
する反応は非常に急速に起こる。それは動力学的
に制御される。しかしながらアゾメチン結合は容
易に加水分解的に切断する。そのために、アゾメ
チン結合の再配列によつて貯蔵中に熱力学的にさ
らに安定な結合が形成される。これを避けるた
め、該アゾメチン結合はNaBH₄、KBH₄又は
NaCNBH₃の様なカルボニル基特定還元剤での
還元と解媒的な水素化によつて安定化される。 第４ａ図，第４ｂ図には、NaBH₄での還元の
例が示されている。尚第４ａ図は製造直後、第４
ｂ図は製造５週間後のNaBH₄で還元したヘモグ
ロビン剤の分子量分布曲線を夫々示す。反応中に
形成するBO₃は限外濾過中に除去される。 もし、燐酸ピリドキサールが作用物質分子とし
て使用されるならば他の有利性が与えられる。該
燐酸ピリドキサールはまたアゾメチン結合によつ
て該ヘモグロビン分子を結合する。還元によつ
て、それゆえ交叉結合が安定化されるだけではな
く、該作用物質はその結合点で固定される。 重合されたヘモグロビンを含まず且つ交叉結合
していないヘモグロビンの非常に少ない交叉結合
したヘモグロビン誘導体のために使用される限外
濾過装置は好ましくは中空繊維カートリツジから
成る。しかしながら、平坦な膜フイルターをまた
使用し得る。 該限外濾過は下記に示される２つの方法によつ
て遂行され得る。 方法１（第１図） 例えば燐酸ピリドキサールのような作用物質
が加えられた、酸素除去された交叉結合されな
いヘモグロビン溶液は冷却された供給容器Ａ内
に置かれ、ポンプによつて分子量100000の浸透
性を有する中空繊維装置Ｂを介して循環され
る。限外濾過液は最初に分子量100000の浸透性
を有する第２中空繊維装置Ｃによつて濃縮され
る。それはＤで交叉結合剤と混合され、反応容
器Ｅ内で37℃に加熱され、次で該供給容器Ａに
戻される。交叉結合された分子はもはや限外濾
過装置Ｂの膜を通過することができない。この
配列はいかなる交叉結合したヘモグロビンも２
度と交叉結合剤と接触することができないこ
と、換言すぜば重合体の形成が除去されること
を保証する。依然として交叉結合していない残
余のヘモグロビンは反応の終了後限外濾過によ
つて除去される。 方法２（第２図） 更に均一な交叉結合製造物の達成の第２の可
能性は、下記の熟慮に基いている。交叉結合反
応に於ては、分子間及び分子内交叉結合が競合
する。ヘモグロビン濃度の上昇によつて、該反
応は分子間交叉結合に有利に移行され得る。
今、もし交叉結合剤の量が重合体の製造物が形
成しないような量に選択され、その時一定量の
交叉結合していないヘモグロビンに加えられる
ならば、単にオリゴマーが得られる。交叉結合
していないヘモグロビン分子は、部分的に分離
され、続いて分子量100000で遮断する膜上で限
外濾過される。該交叉結合は反応容器Ａ内で起
こる。該反応の終了後、該溶液はポンプによつ
て該限外濾過装置Ｂを介して循環される。該装
置Ｂ内では、交叉結合していないヘモグロビン
は該膜を通過する。限外濾過の溢流による循環
中の容量の損失は、供給容器Ｃからの水によつ
て埋め合わされる。 これらの方法で製剤された交叉結合されたオリ
ゴマーのヘモグロビン溶液（分子量約200000）
は、重合体のヘモグロビンを全く含まず且つ15％
以下の交叉結合していないヘモグロビンを含む。 方法１に於ては工程は、交叉結合されていない
ヘモグロビンから企てられ、交叉結合は限外濾過
を介する循環中に起こり、重合体の製造物が形成
されないように制御されるが、方法２に於ては、
既に制御された交叉結合を有する交叉結合製造物
が使用される。 カルボニル基特定試薬で反応後、非常にあわ立
つた溶液上のあわをつぶすために、該混合物は水
で希釈される。 親油性物質の還元及び濾過の向上のために、該
希釈溶液はもし望まれるならば活性炭で処理され
得る。 本発明の全ての工程は、もし方法２が使用され
るならば下記の如く行なわれる。 最初の15乃至30％ヘモグロビン溶液は、酸素の
分圧に依存して、酸素の分圧が０ミリバールに減
少されるようなカセイソーダで中和されたアスコ
ルビン酸のような酸素消費還元剤で処理される。
ヘモグロビンが酸素ガスで飽和されている場合、
これは、ヘモグロビン１モル当り４モルのアスコ
ルビン酸でなければならない。０乃至10℃に冷却
された該溶液は、２乃至５倍、好ましくは3.35倍
のモル数の燐酸ピリドキサールまたはヘキサ燐酸
イノシトールのような作用物質で処理される。次
で交叉結合は、好ましくは10％水溶液中でPH値６
乃至８、好ましくは7.0で、ジアルデヒドによつ
て遂行される。量は重合体のヘモグロビンが形成
されないような割合である。 続く還元は、最初のヘモグロビンを基に計算し
て、５乃至20倍、好ましくは13.8倍のモル量の
NaBH₄の様なカルボニル基特定還元剤で遂行さ
れる。 次で、限外濾過は、分子量100000に合わせた浸
透性のフイルターを介して、交叉結合されていな
いヘモグロビンの量が濾液中の全ヘモグロビンの
５乃至15％になるまで遂行された。 交叉結合されたヘモグロビン溶液の貯蔵寿命は
メトヘモグロビンの形成によつて限定される。本
発明に従つて、これらのヘモグロビン剤は、アス
コルビン酸、還元グルタチオン又は還元メチレン
ブルーの様な還元物質の添加によつて自動酸化に
対して安定化される。１年間の貯蔵期間の後、メ
トヘモグロビンの内容量は、依然として全ヘモグ
ロビンの量の10％以下であつた。また、どの作用
物質が使用されるのかということは取るに足りな
い。好ましくは、アスコルビン酸は、安定化のた
めに、ヘモグロビンに関して４倍を越えて使用さ
れる。 燐酸ピリドキサールを使用して本発明に従つて
製剤された交叉結合されたヘモグロビン溶液の酸
素固定曲線は第５図中に示される。半飽和圧P₅₀
は36ミリバールである。驚くべきことに、該曲線
は、自然のヘモグロビンと同様にＳ字状である。
そのような曲線は、交叉結合されたヘモグロビン
にはかつて決して見られなかつた。 ヘキサ燐酸イノシトールを使用して得られた酸
素固定曲線は、第６図中に示される。 本発明の方法によつて製剤されたヘモグロビン
溶液の効果及び耐性は、うさぎ及びラツトの動物
実験によつて証明された。本発明の方法によつて
形成された製剤には細菌性発熱物質は含まれてい
なかつた。 下記の実施例は本発明のさらなる説明を助ける
であろう。 実施例 １ 西独特許発明明細書第2248475号の実施例１に
よつて製剤されたヘモグロビン溶液は、分子量
100000に合せられた浸透性を有する中空繊維カー
トリツジでの限外濾過によつて19.6％に濃縮され
た。この溶液に４倍のモル量以上の中和されたア
スコルビン酸が加えられ、該混合物は無菌濾過さ
れ、次で少くとも24時間置かれた。この酸素除去
された19％ヘモグロビン溶液は反応容器内に置か
れ、冷却され、次で水１リツトル中に溶解した
4.3ｇのNaH₂PO₄と３ｇのNa₂HPO₄で処理され
た。 次で、かきまぜながら2.2ｇの燐酸ピリドキサ
ールが加えられた。PH値は6.6に低下した。反応
時間は１時間であつた。この後、激しくかきまぜ
ながら13.9mlの10％水性グルタリツクジアルデヒ
ド溶液が加えられ、該混合物は再び１時間かきま
ぜられた。還元のために、1.34ｇのNaBH₄が加
えられた。それは１リツトルの水中に手短かにあ
らかじめ溶解されている。30分の反応時間の後、
非常にあわ立つた溶液が６リツトルの水で希釈さ
れ、その結果あわは大部分つぶされ、次でこの溶
液は、１リツトル当り10ｇの活性炭での処理の１
時間後に無菌フイルターを通して濾過された。分
子量100000に合わされた浸透性の中空繊維カート
リツジを介する限外濾過のために、最初に限外濾
過装置は充填され、次で1.1リツトルの希釈溶液
は閉鎖容器内に置かれる。この量は、ポンプによ
つて絶えず再循環される。限外濾過によつて起こ
る容量の損失は絶えず希釈ヘモグロビン溶液で置
き換えられる。この方法で、該溶液は再たび濃縮
される。該ヘモグロビン溶液が容量損失の補充に
消費されるとすぐに、該限外濾過は９リツトルの
蒸留水で続けられ、次で約10乃至11％に濃縮され
る。コロイドの浸透圧及びヘモグロビン濃度の調
節のために、115mlの20％ヒトアルブミンが加え
られた。最終的な無菌濾過の前に、次の成分即ち
3.32ｇのNaCl、14.5ｇのグルコース、1.66ｇの
NaHCO₃、0.26ｇのKCl、及び0.16ｇのMgSO₄、
更に安定化のために0.61ｇの中和されたアスコル
ビン酸がまた加えられた。 収量：660ml ヘモグロビン濃度：8.5％ メトヘモグロビン：5.1相対％ コロイドの浸透圧：36.8ミリバール 半飽和圧P₅₀：38.6ミリバール 相対粘度：2.6 分子量分布：第７ａ図参照 （セフアローゼ6B上ゲルクロマトグラム） 実施例 ２ 処理は実施例１と同様である。リン酸ピリドキ
サールの換りに、水に溶解されてPH値が7.6に調
節された2.59ｇのヘキサ燐酸イノシトールが作用
物質として加えられた。 収量：925ml ヘモグロビン濃度：8.9％ メトヘモグロビン：2.6相対％ 半飽和圧P₅₀：27ミリバール 分子量分布：第７ｂ図参照 （セフアローゼ6B上のゲルクロマトグラム）

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明製法の１実施例の工程図、第２
図は他の実施例の工程図、第３ａ図，第３ｂ図は
従来法によつて得られたヘモグロビン剤の分子量
分布曲線、第４ａ図，第４ｂ図は本発明製法によ
つて得られたヘモグロビン剤の分子量分布曲線、
第５図は燐酸ピリドキサールを使用した場合の本
発明製法によつて得られたヘモグロビン剤の酸素
固定曲線、第６図はヘキサ燐酸イノシトールを使
用した場合の前記酸素固定曲線、第７ａ図，第７
ｂ図は実施例１及び２のゲルクロマトグラムを示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 基質を含まないヘモグロビン溶液を燐酸ピリ
   ドキサール又はヘキサ燐酸イノシトールで処理
   し、炭素原子数３乃至８個の炭素鎖を有するジア
   ルデヒドと交叉結合された貯蔵寿命の長い高酸素
   輸送能力を有する交叉結合されたヘモグロビン剤
   の製法に於て、基質を含まない濃縮ヘモグロビン
   溶液は酸素の分圧を０ミリバールに低くする量の
   酸素消費還元剤で処理され、かくして得られた酸
   素除去製造物を燐酸ピリドキサール又はヘキサ燐
   酸イノシトールで処理し、次でPH値６乃至８でジ
   アルデヒドで処理され、該交叉結合された製造物
   は５乃至20倍の量のカルボニル基特定還元剤で還
   元され、該溶液は水で希釈され、交叉結合してい
   ないヘモグロビンの量が15％以下になるまで循環
   しつつ限外濾過され、該交叉結合は限外濾過の前
   又は最中に遂行され、且つ製造物は還元剤の添加
   によつて安定化されることを特徴とする貯蔵寿命
   の長い高酸素輸送能力を有する交叉結合されたヘ
   モグロビン剤の製法。 ２ 前記カルボニル基特定還元剤で還元された溶
   液は水で希釈された後、活性炭で処理することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヘモグ
   ロビン剤の製法。 ３ 該酸素消費量還元剤として中和されたアスコ
   ルビン酸が使用れることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項又は第２項に記載のヘモグロビン剤の
   製法。 ４ 該カルボニル基特定還元剤としてNaBH₄が
   使用されることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項ないし第３項のいずれか１項に記載のヘモグロ
   ビン剤の製法。