JPH0365945B2 - - Google Patents
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- JPH0365945B2 JPH0365945B2 JP2105107A JP10510790A JPH0365945B2 JP H0365945 B2 JPH0365945 B2 JP H0365945B2 JP 2105107 A JP2105107 A JP 2105107A JP 10510790 A JP10510790 A JP 10510790A JP H0365945 B2 JPH0365945 B2 JP H0365945B2
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Description
本発明はモノクローナル抗体の生産に関し、特
にトレポネーマ（Treponema）細菌病原体に対
して向けられたモノクローナル抗体を連続的に生
産することのできるハイブリツド細胞株（hybrid
celllines）に関する。 近年、細菌細胞の免疫原決定基及び毒素類に対
して特異的なモノクローナル抗体を生産すること
が出来ることが診断薬及び免疫治療薬の新らしい
展望を与えている。 トレポネーマ属細菌は各種病原性病気に関わつ
ているものである。特に重要であるトレポネーマ
パリダム（Treponema pallidum）は梅毒の原
因となる性的に伝染されるヒトの細菌病原体であ
る。数十年にも亘るこの生物を理解しようとする
真摯な努力にも拘らずトレポネーマ パリダムに
ついては殆んど何も知られていない。情報の大き
な欠陥は、トレポネーマ パリダムがヒトのその
他の病原体のようにin vitroでは生育することの
できないヒトに対する極めて少ない細菌病原体の
一つであるという事実に発生するものである。そ
の結果、この生物の性質及びそれの作り出す病気
を明らかにしようと試みる研究者は実験室のウサ
ギの精巣（睾丸）においてトレポネーマ パリダ
ムを培養することに留められていた。 ヒトにおける未治療梅毒は、しばしば診断が極
めて難しい重い、慢性的且つ極めて複雑な病気で
ある。現在の診断器具の制限及びワクチンの不存
在により、有効なペニシリン治療の利用可能性を
もつてしても梅毒は米国のみにおいて毎年ほぼ35
万件の推定頻度で隆盛を示している。 更に、罹患率及び死亡率に関してより全世界的
影響をおそらく有するその他のトレポネーマによ
る病気がある。すなわち、フランベジア
（yaws）、ピンタ（pinta）、及びベジエル（bejel）
の原因であるトレポネーマはトレポネーマ パリ
ダムと形態学的及び血清学的に区別することので
きないトレポネーマである。これらの病気は極め
て深刻に全世界的であり、特にいわゆる第三世界
諸国において深刻である。これらの病気は性的に
伝染される因子であるトレポネーマ パリダムと
は対照的に通常のヒト対ヒトの接触により伝染す
るものと思われている。その結果、これらの特別
の病気は伝染性が高く、大人口に対し破壊的であ
り、そのため有効な抑制を逃れている。 過去何十年間に亘るトレポネーマ パリダム或
いはその他の非病原性トレポネーマの全細胞、抽
出物或いはアジユバント調剤を用いるワクチン開
発の多くの試みは失敗に終つている。一つの研究
は、ガンマー線照射で弱められたトレポネーマ
パリダム（Nichols）を用いたウサギのワクチン
化の成功を報告している。ヒトに対する潜在的免
疫化計画としてのこの接近手法には、幾つかの主
たる欠点がある。これらの欠点としては、新らた
に単離され、新らたに照射されたトレポネーマ類
を多量に調製することが非実用的であること、並
びにトレポネーマ懸濁液中に存在する汚染ウサギ
蛋白質に対する被投与者の過敏症反応に伴う欠点
などが挙げられる。 梅毒及びその他の関連した病気性トレポネーマ
病の研究は細菌性伝染病のその他の領域よりもは
るかに遅れ続けている。特にトレポネーマ パリ
ダム感染に対する体液応答の複雑性及びそれに引
続く抗原成分の純粋培養（fractionation）のた
めに多量のトレポネーマ パリダム細胞を得るこ
とができないことがウサギ及びヒトにおいて保護
免疫を引出す原因であるトレポネーマ パリダム
の特異的免疫原の同定を著しく妨げてきた。未だ
同定されておらず、特性化されていない特異的ト
レポネーマ パリダムの免疫原は、梅毒の抑制の
ための免疫学的接近手法への鍵を握るものと思わ
れる。 トレポネーマ種決定基に対して特異的なモノク
ローナル抗体を生産するためのトレポネーマ−感
作脾臓或いはリンパ結節細胞とプラスマ細胞の細
胞株（plasmacytoma cell lines）との形質細胞
体細胞陸合は、過去の主たる障害を迂回する新し
い革新的な方法を提供するものである。一度、首
尾よく行われるならば、トレポネーマ パリダム
抗原に対する実質的に無限の単一特異性抗体の供
給は常時容易に利用可能となる。次いで、これら
の単一特異性抗体を用いてトレポネーマ免疫原の
抗原成分を分析することができる。この新らしい
ハイブリドーマ細胞融合技術を使用して特異的ト
レポネーマ免疫原を単離し、特性化することは、
ワクチン開発を通じて発病学及び梅毒、フランベ
ジア、ピンタ及びベジエルの免疫学的抑制を理解
するために必要とされる材料及び洞察を与えるも
のと思われる。 本発明は、トレポネーマ抗原に向けられたモノ
クローナル抗体を生産する連続ハイブリツド細胞
株の開発を探索するものである。選ばれた細胞株
（cell lines）は、結合部位特異性に関してトレポ
ネーマ細菌により示される単一抗原決定基に同一
である一組の単一特異性抗体を連続的に生産する
ことができる。 本発明によればトレポネーマ抗原、特にトレポ
ネーマ パリダムに対して高度に特異的且つ均一
なモノクローナル抗体を作り出し分泌する連続ハ
イブリドーマ細胞株が確立される。 本発明は、その最も広い側面において、先ず動
物をトレポネーマ細菌に対して免疫化して開始
（priming）抗原決定基に向けられた抗体を生産
するリンパ球及びそれらの分化子孫を生育させる
ものである。このリンパ球を回収し、骨髄腫、プ
ラスマ細胞或いはハイブリドーマ細胞と融合し、
体細胞ハイブリツドを形成する。この細胞ハイブ
リツドを培養し、選択し、単離し、そして組織培
養において増殖させる。その後、このハイブリツ
ド細胞株は選ばれた免疫抗原に対するモノクロー
ナル抗体を無限に生産することができるようにな
る。よつて、本発明は、具体的には、トレポネー
マ パリダムで免疫されたマウスの脾臓細胞とネ
ズミ（murine）の骨髄腫細胞との細胞融合によ
り得られたハイブリドーマであつて、リン酸緩衝
塩水の懸濁液として４℃で７日間貯蔵して熟成さ
せた、又は超音波処理したトレポネーマ パリダ
ムの決定基に対して反応性であつて、新たに単離
された元のままの（intact）トレポネーマ パリ
ダム、トレポネーマ フアゲデニス抗原及びウサ
ギ精巣抽出物とは非反応性であるモノクローナル
抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ
を提供するものである。 本発明によれば、トレポネーマの抗原決定基に
対するモノクローナル抗体を生産する連続ハイブ
リツド細胞株が提供される。トレポネーマ パリ
ダムに特異的に向けられたモノクローナル抗体或
いはトレポネーマ群の抗原に特異的に向けられた
モノクローナル抗体（幾つかのトレポネーマ種間
に交差反応する抗体）を生産する連続細胞株が単
離された。更に、有害なトレポネーマを固定化す
ることのできる補体固定モノクローナル抗体が作
出される。 以下、本出願の時点において最良の態様を表わ
すものと思われる本発明の好ましい実施態様につ
いて説明を行う。 本発明の方法に従えば、試験動物はトレポネー
マ細菌を含有する調剤を用いた免疫化によつて抗
体生産のためにin vitroにおいて刺戟される。本
発明の好ましい実施態様においては、ウサギの精
巣から抽出したトレポネーマ パリダムの接種材
料を用いてマウスを免疫化した。 或いは又、抗体を生産することのできる正常及
び免疫分化リンパ球を試験動物から単離し、培養
し、in vitroでトレポネーマで開始し、リンパ球
ハイブリドーマを生産するに適した細胞を産生さ
せることができる。例えば、その様なミトゲン及
び／又は抗原を用いてin vitroで刺戟する方法
は、ロバートソン等のMicrobiology1980pp.181
−185（1980年）及びケツトマン等のJ.Immunol.
Methods39：203−222（1980年）に記載されてお
り、或いはプレス等のPress et al，Eur.J.
Immunol.4：155−159（1974年）に記載されてい
る脾臓断片培養法により説明されている。 宿主動物或いはそれから培養して得られた抗体
生産細胞を免疫化する経路及び手順は一般的に抗
体刺戟及び生産の確立された通常の技術に従えば
よい。本発明者等はマウスを試験モデルとして使
用したが、ヒトを含む任意の補乳動物或いはそれ
から得られる抗体生産細胞を本発明の方法に従つ
て操作してヒトのハイブリツド細胞株の生産の基
礎に役立てることができることを意図している。 免疫化後、免疫リンパ細胞を骨髄腫、プラスマ
細胞或いはハイブリドーマ細胞（以下集合的に骨
髄腫細胞と称する）と融合し、ハイブリツド細胞
株を産生し、これを無限に培養及び継代培養して
多量のモノクローナル抗体を生産することができ
る。本発明の目的のためには、融合のために選択
された免疫リンパ細胞は、免疫化動物のリンパ結
節組織或いは脾臓組織のいずれかから取り出され
たリンパ球及びそれらの正常な分化細胞（子孫）
である。本発明においては、マウス系に関し、よ
り濃度が高く、便利な抗体生産細胞源を提供する
ので、免疫脾臓細胞を用いるのが好ましい。 骨髄腫細胞は、融合ハイブリツドの連続的増殖
のための基盤を提供するものである。骨髄腫細胞
は、骨髄に対して選択性を示すプラスマ細胞から
得られた腫瘍細胞である。プラスマ細胞腫
（plasmacytoma）はプラスマ細胞から得られた
新生物細胞である。特に、本発明においては免疫
グロブリンを分泌しないリンパ球ハイブリドーマ
細胞を用いるのが好ましい。リンパ球ハイブリド
ーマ細胞は、骨髄腫或いはプラスマ細胞腫と通常
の分化リンパ細胞との融合により産生された細胞
である。骨髄腫、プラスマ細胞腫及びハイブリド
ーマを選択することにより免疫グロブリン合成を
なくすることができる。 骨髄腫及び免疫化抗体生産細胞を得るための動
物の種類は、一つの種類の細胞をもう一つの種類
のものと融合することができる意味において特に
重要ではない。しかしながら、免疫化抗体生産細
胞及び骨髄腫の源は同一の種からのものであるこ
とが好ましい。 一般的に、使用される融合技術は、コーラ等
〔Kohler et al，Eur.J.Immunol.6：11−19
（1976）〕及びケネツト等〔Kennett et al，
Lymphocyte Hybridomas−Current Topics in
Microbiology and Immunology81：77−91
（1978）Springer−Verlog，New York〕の方法
によるものである。融合は、一般的に、抗体生産
細胞の懸濁液を生育培地中の骨髄腫細胞に添加
し、その後遠沈してペレツトを形成することによ
り達成される。 融合ハイブリツドは次いでトレポネーマ抗原に
対して特異的な抗体生産を行うものについてのス
クリーニングが行われる。トレポネーマ抗原決定
基に対して特異的な抗体を分泌するハイブリドー
マが選択され、培養され、安定した遺伝暗号を有
する連続細胞株を確立する。この細胞株は凍結及
び液体窒素下での貯蔵などの多くの通常の方法の
うちの任意の方法で貯蔵及び保存することができ
る。凍結された細胞株は再生され無限に培養され
て選ばれた抗原決定基に対して特異的なモノクロ
ーナル抗体を合成及び分泌を再開することができ
る。分泌された抗体は組織培養上澄液から通常の
沈澱、イオン交換、アフイニテイ−クロマトグラ
フイーなどにより回収することができる。回収さ
れた抗体は、凍結乾燥し、余り活性を失うことな
く冷蔵下に少なくとも数週間保存することができ
る。以下、具体例により本発明の特別の実施態様
を説明するが、それらは本発明を限定するもので
はない。 Ａ 抗原の調製 トレポネーマ パリダム（Nichols）をマウス
の感作及びラジオイムノアツセイ（RIA）におけ
る抗原の源として使用した。この生物の培養は、
予め受領時にトレポネーマ パラルイス−クニク
リ（Treponema paraluis−cuniculi）感染の臨
床的及び血清学的（VDRL非反応性）証拠の不
存在を検査したニユージーランド白色ウサギの精
巣中において行つた。これらの動物は、次いで
個々に18〜20℃において抗生物質の無い食物及び
水を自由に与えて家内飼育した。精巣当り血清−
塩水抽出媒体〔0.01Mリン酸緩衝液PH7.2、0.85％
（重量／容積）NaCl、50％（容積／容積）熱不活
性化（56℃、30分間）正常ウサギ血清〕１ml中２
×107のトレポネーマ パリダムを精巣内に注射
後、12日後にトレポネーマを、細かく刻んだ精巣
から180rpm（23℃）の回転振盪により30分間精巣
当り10mlの抽出溶媒を用いて好気的に抽出した。
大きなウサギ精巣組織残渣を、遠心分離により二
回500×ｇ下、10分間23℃で、50mlの円錐形ポリ
プロピレン遠心分離管内においてトレポネーマ懸
濁液から除去した。懸濁液中のトレポネーマを次
いで運動性に対して調べ、16000×ｇにおける遠
心分離により20分間濃縮を行い、リン酸緩衝塩水
（PBS）（0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、0.85％
NaCl、PH7.2）中に懸濁し、暗視野照明顕微鏡に
より数を数えた。「新鮮な（fresh）」トレポネー
マを単離後直ちに使用しRIAプレートを構成し、
それは−70℃で調製することができた。「熟成
（aged）」トレポネーマはPBS中のトレポネーマ
パリダムの懸濁液を４℃で７日間貯蔵した後に
RIA用のマイクロリツトルプレートウエルに結合
して調製した。 T.フアゲデニス（T.phagedenis）バイオタイ
プレイター（Reiterトレポネーマ）をRIAにおい
て使用してトレポネーマ群抗原に対する抗体を固
定した。これらの生物は23℃において維持され、
10％（vol／vol）の加熱不活性化された（56℃、
30分）減菌ウシ血清を含有するBBLチオグリコ
レート媒体135C（指示薬なし）中に毎月移され
た。RIAに使用する細胞は、４mlの無菌ウシ血清
を補給された40mlのBBL Spirolate Broth（各チ
ユーブ当り全容積44ml）を含有する大きなネジキ
ヤツプをつけたチユーブ中において５日間35℃に
おいて培養した。５本のチユーブからの細胞を遠
心分離により集め、40mlの無菌PBS中において
遠心分離により二度洗浄を行い、暗視野照明顕微
鏡により測定してml当り約１×108の細胞数の細
胞密度においてPBS中に懸濁した。 ウサギ抗原と交差反応したモノクローナル抗体
或いはトレポネーマ パリダム懸濁液（マウスの
感作に用いられたもの）中に存在する汚染性ウサ
ギ宿主抗原に向けられたモノクローナル抗体を検
出するために、正常な感染されていないVDRL
非反応性ウサギの精巣からRIA用ウサギ精巣抗原
抽出物が調製された。精巣を細かく刻み、トレポ
ネーマ パリダムについて説明したと同様な血清
−塩水媒体中において抽出したが、遠心分離は一
度だけ７分間250×ｇにおいて行い、白濁した上
澄液を得た。このウサギ抗原調剤10μlをRIAにお
けるマイクロリツトルプレートウエル当り使用し
た。蛋白質測定は、この調剤10μlが約120μｇ全ウ
サギ蛋白質を含有し、この全蛋白質の50％は血清
−塩水抽出媒体中の正常なウサギ血清によるもの
であることを示した。−20℃において６ケ月まで
貯蔵した調剤は、RIAにおいて新らたに調製した
抽出物と同等に反応するようであつた。 又、トレポネーマ パリダム（T.pallidum）
或いはT.phagedenisバイオタイプReiterの超音
波処理懸濁液をもRIA抗原として用いて「遮蔽さ
れた」、表面下の、或は細胞質のトレポネーマ抗
原に向けられた抗体を検出した。PBS中ml当り
ほぼ１×108個のトレポネーマ懸濁液を段付きマ
イクロチツプ及び出力４（約40W）に設定された
Branson Sonifier Model W350を用いて全部で
３分間（50％パルスで６分間）（氷上）で超音波
処理を行つた。これらの超音波処理懸濁液10μlを
RIAにおいてマイクロリツトルプレートウエル当
り使用した。未使用懸濁液は−20℃で貯蔵した。 Ｂ プラスマ細胞腫細胞株 この研究において使用された細胞株は、シユル
マン等（Schulman et al，Nature276：269−
270（1978）〕により記載されている。BALB／ｃ
マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞株×63／Ag8間の温
成分子形成から形成されたSP2／HGLKに由来す
るハイブリツド細胞株であるマウスプラスマ細胞
腫細胞株SP2／０−Ag14（SP2／０）である。
SP2／０はIgの重鎖或いは軽鎖のいずれも合成せ
ず、20μｇの８−アザグアニン／mlに対して耐性
を示し、ヒポキサンチン／アミノプテリン−チミ
ジン（HAT）培地中においては死滅する。
SP2／０は、高グルコースを有するDulbeccoの
変成Eagle培地（DMEM）（Grand Island Bio−
logical Campany，Grand Island，New York）
において15％（vol／vol）のウシ胎児血清（Hy
−Clone FCS；Sterile Systems、ユタ州、ロー
ガン）、2mMグルタミン及び50単位のペニシリ
ン／ストレプトマイシン（GIBCO）／mlを補給
してin vitroで維持される。 Ｃ ハイブリドーマ生産のための免疫化手順 成熟したメスのBALB／ｃマウス（６〜８週
令）をJackson Laboratories社（メイン州社、
バー・ハーバー）から購入し、トレポネーマ パ
リダム抗原に対する抗体を生産する脾臓リンパ球
の源として使用した。マウスは、最初にPBS中
の新らたに調製したトレポネーマ パリダム細胞
（２×108個／0.15mlPBS）を用いてフロウンド
（Freunds）の完全アジユバンド中において
（１：１）腹腔内に注射して（IP）免疫化した。
21日日、42日目及び63日目に２×107個の新らた
に単離した生物（0.3ml PBS；IP）の３回の追
加の注射を与え、最後に84日目に0.4mlPBS中1.2
×107個の生物（0.2mlIP及び0.2ml静脈内）の注射
を行つた。最終注射の３日後に脾臓を二匹のマウ
スから無菌的に取出し、脾臓細胞を鉗子でゆつく
り細かく砕いてDMEM中に単一細胞懸濁液を調
製してハイブリドーマ細胞融合の準備を行つた。
これらの細胞は次いでDMEMを用いて遠心分離
により270×ｇで10分間８℃において３回洗浄し
た。 Ｄ ハイブリドーマの構成 ハイブリドーマはケネツト等（Kennett et al，
Lymphocyte Hybridomas−Current Topics in
Microbiology and Immunology81，pp77〜91
（1978）、Springer−Verlag New York）の基本
的方法の修正方法を用いて免疫化マウスからの脾
臓細胞をネズミのSP2／０−Ag14ハイブリドー
マ細胞（以下SP2／０と称する）と融合させて生
産した。適当な細胞株は、上記シユルマン等によ
り元来示されたのと同様に、ペンシルバニア医科
大学のロジヤーケネツト（Roger Kennett）か
ら得られた。 プラスマ細胞腫細胞を対数成長期の培養液から
収獲し、270×ｇにおいて10分間遠心分離により
ペレツト化し、DMEM中で３回洗浄した。約１
×107個のSP2／０細胞及び洗浄脾臓細胞を生育
可能な（viable）脾臓細胞７に対し、生育可能
SP2／０細胞１の比で混合し遠心分離によりペレ
ツト化した。上澄液を除去後、0.2mlの温い（37
℃）ポリエチレングリコール（DMEM中35％
wt／vol、PEG1000、J.T.Baker Chemical
Company、ニユージヤージー州フイリツプスブ
ルグ）をペレツトに添加して細胞融合を引起こし
た。 細胞を次いでペレツト化し、DMEM中におい
て洗浄し、25〜60mlのDME−Hy媒体（上記ケネ
ツト等の78頁参照）中にほぼ４×106個／mlの割
合で再懸濁し、96ウエルのマイクロリツトルプレ
ート（Costar Plastics、ニユージヤージー州、
バインランド）中における50μlアリコートでの制
限稀釈の条件下においてプレート化した。この融
合方法はSP2／０−脾臓細胞混合物、PEG及び
DMEMが全て細胞融合過程において37℃に保た
れた点において上記ケネツト等の方法と異る。こ
の細胞ペレツトをガラス棒でゆるめて細胞のゆる
やかな混合を確実に行い、細胞はPEG中におい
て37℃で３分間残存し、８℃において約５分間
（遠心分離間）残存する。 リトルフイールド等〔Littlefield等、
Science145：709〜710（1964）〕に記載されるよう
な培地中の二培濃度のHAT選択成分を２日目に
各ウエル50μlに添加した後、４日目に100μlの
HAT−MEDIUMを添加した。ハイブリツドは
６〜10日後に観察することができた。生育細胞を
含有したウエルをもう一つの96ウエルの板に分割
し、生育を行い維持するために24ウエルの組織培
養プレート（Costar Plastics）中に移した。培
養上澄液を取出して抗−トレポネーマ パリダム
反応性のスクリーニング検定及びモノクローナル
イソタイプの決定において使用した。 Ｅ モノクローナル抗体の特性化 トレポネーマ パリダムに対するモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマのRIAスクリー
ニング分析 Cookeの96ウエルのマイクロリツトルプレート
（Dynatech Laboratories、バージニア州、アレ
クサンドリア）の各ウエルにPBS中ml当り１×
108個／mlの等価量或いは前記ウサギ精巣抽出物
を含有するT.pallidum或いはT.phagedenisバイ
オタイプReiterの懸濁液或いは超音波処理物の
10μlを添加した。４℃において一晩インキユベー
トして乾固し、ウエルを各々0.2mlずつの0.2％の
ナトリウムアジドを含有するPBSで３回洗浄し
て非付着抗原を除去した。トレポネーマ及びウサ
ギ精巣組織抗原の塩化ポリビニルその他のプラス
チツクに対する強い親和性のために、これらの抗
原のマイクロリツトルプレートウエルに対する結
合を促進するために固定剤を使用する必要はなか
つた。しかしながら、必要に応じて各ウエルに10
％エタノールを20μl添加した後37℃において蒸発
させることを固定のために利用することができ
る。ウエルを次いで0.2mlのPBS＋１％wt／volウ
シ血清アルブミンで４℃において一晩予備被覆
し、0.2mlのPBS＋アジドで３度洗浄した。プレ
ートは調製した即日或いは一日後に使用した。 PIAテストのために、0.05mlの４日経たハイブ
リドーマクローン上澄液を各抗原調剤を含有する
各々のウエルに添加した。23℃において３時間
後、ウエルを0.2ml PBS＋アジドで３回洗浄後、
ウエル毎に0.1ml PBS＋アジド＋２％（vol／
vol）ウマ血清中のアフイニテイ精製した125I−標
識化ウサギの抗−マウスIgG（比活性2.0×
106CPM／μｇ）及びIgM（比活性3.7×
106CPM／μｇ）の混合物2.6×105CPMを添加し
た。この測定の結合は４℃において一昼夜行つ
た。ウエルを次いでPBS及び水道水で十分に洗
浄した。プレートの乾燥及び個々のウエルの切断
に引続いて各ウエルをNuclear Chicago1185型ガ
ンマカウンターを用いて0.4分間カウントを行つ
た。 RIAにおいて陽性のコントロールとして使用さ
れた抗血清は、１ 細胞融合において脾臓リンパ
球の源として使用されたマウスから集められたマ
ウスの抗−トレポネーマ パリダム血清及び２
BALB／ｃマウスをウサギ精巣抽出物調剤で免
疫化して製造されたマウスの抗−ウサギ精巣抽出
物を含むものであつた。マウスの抗−ウサギ精巣
抽出物血清はマウスを１日目に腹腔注射により免
疫化し（0.25ml精巣抽出物＋0.25mlフロウンドの
完全アジユバント）及び0.3mlの抽出物を30日目、
及び51日目に投与後72日目に血清を集めて得られ
た。 全部で39のハイブリドーマ細胞株がRIAにより
トレポネーマ パリダム抗原と反応したモノクロ
ーナル抗体の分泌体として同定された。RIAにお
ける反応性は0.4分当りの125Iカウント数が600を
超える場合が陽性とされた（背景カウント数は通
常200〜300のオーダーであつた）。これに基づき、
抗−トレポネーマ パリダム ハイブリドーマか
ら生ずるモノクローナル抗体は三つの主たる範疇
に分類することができた。一つのモノクローナル
抗体はトレポネーマ パリダム抗原に対して特異
的なものである。これらの中にはトレポネーマ
パリダム固定化試験において有害なトレポネーマ
パリダム生物を固定化することもできるモノク
ローナル抗体もあつた。もう一つの群のモノクロ
ーナル抗体は、トレポネーマ パリダム（T.
pallidum）及びT.phagedenisバイオタイプ
Reiter抗原の両者と反応し、従つて明らかにトレ
ポネーマ群抗原に対して向けられたものであつ
た。モノクローナル抗体の第三の群はトレポネー
マ抗原及びウサギ宿主精巣組織抗原の両者を結合
することが出来、従つてRIAにおいて試験された
全ての抗原と交差反応性の高いものであつた。 表１は抗−トレポネーマ パリダム ハイブリ
ツドをスクリーニングするために使用されたRIA
処方の一例を示す。示されたデータは行われた数
個の典型的RIA試験からの一つのものであり、ト
レポネーマ パリダムに対して特異的にモノクロ
ーナル抗体を生産する大多数のクローンに特徴的
な結果を表わすものである。表１に示されるよう
なクローンから得られたモノクローナル抗体は、
元のまゝのトレポネーマとは余りよく反応しなか
つた。しかしながら、それらはトレポネーマ パ
リダムの超音波処理された抗原には選択的に結合
するようであり、それらは細胞内或いは遮蔽抗原
のいずれかに対して向けられることができること
を暗示した。これらのトレポネーマ パリダム決
定基に対する特異性は、それらがＴ・
phagedenisバイオタイプReiter抗原調剤及びウ
サギ精巣組織抗原と交差反応としないことにより
示された。これらのモノクローナル抗体はマウス
のIgG及びIgMクラスのものであり、TPI試験に
おいてトレポネーマ パリダムに対しては反応性
を示さなかつた。RIAにおいて陽性コントロール
として使用したポリクローナル抗血清調剤（マウ
スの抗−トレポネーマ パリダム及びマウスの抗
−ウサギ精巣組織）は試験した全ての抗原に対し
て強く陽性であつた。これは、マウスの抗−トレ
ポネーマ パリダム抗体が、トレポネーマ群抗原
（T.phagedenisバイオタイプReiterの抗原と交差
反応する）並びに汚染性ウサギ宿主抗原の両者を
含有するトレポネーマ パリダム懸濁液で感作さ
れたマウスから誘導されたものであるから当然予
想されるものであつた。同様に、マウスの抗−ウ
サギ精巣抗体も又、ウサギ宿主組織及びトレポネ
ーマの両者に共通の抗原の存在によりトレポネー
マ抗原と反応した。 モノクローナル抗体イソタイプの検定 マウス抗体のイソタイプは固相RIAにより同定
された。Cookeのマイクロリツトルプレートをヤ
ギの抗−マウスイムノグロブリンで被覆した。培
養上澄液を次いで添加し、37℃で３時間インキユ
ベートした。ヨウ素標識され、アフイニテイ精製
したウサギの抗−マウス重鎖特異試薬を添加して
プレートに結合した抗体のイソタイプを同定し
た。
にトレポネーマ（Treponema）細菌病原体に対
して向けられたモノクローナル抗体を連続的に生
産することのできるハイブリツド細胞株（hybrid
celllines）に関する。 近年、細菌細胞の免疫原決定基及び毒素類に対
して特異的なモノクローナル抗体を生産すること
が出来ることが診断薬及び免疫治療薬の新らしい
展望を与えている。 トレポネーマ属細菌は各種病原性病気に関わつ
ているものである。特に重要であるトレポネーマ
パリダム（Treponema pallidum）は梅毒の原
因となる性的に伝染されるヒトの細菌病原体であ
る。数十年にも亘るこの生物を理解しようとする
真摯な努力にも拘らずトレポネーマ パリダムに
ついては殆んど何も知られていない。情報の大き
な欠陥は、トレポネーマ パリダムがヒトのその
他の病原体のようにin vitroでは生育することの
できないヒトに対する極めて少ない細菌病原体の
一つであるという事実に発生するものである。そ
の結果、この生物の性質及びそれの作り出す病気
を明らかにしようと試みる研究者は実験室のウサ
ギの精巣（睾丸）においてトレポネーマ パリダ
ムを培養することに留められていた。 ヒトにおける未治療梅毒は、しばしば診断が極
めて難しい重い、慢性的且つ極めて複雑な病気で
ある。現在の診断器具の制限及びワクチンの不存
在により、有効なペニシリン治療の利用可能性を
もつてしても梅毒は米国のみにおいて毎年ほぼ35
万件の推定頻度で隆盛を示している。 更に、罹患率及び死亡率に関してより全世界的
影響をおそらく有するその他のトレポネーマによ
る病気がある。すなわち、フランベジア
（yaws）、ピンタ（pinta）、及びベジエル（bejel）
の原因であるトレポネーマはトレポネーマ パリ
ダムと形態学的及び血清学的に区別することので
きないトレポネーマである。これらの病気は極め
て深刻に全世界的であり、特にいわゆる第三世界
諸国において深刻である。これらの病気は性的に
伝染される因子であるトレポネーマ パリダムと
は対照的に通常のヒト対ヒトの接触により伝染す
るものと思われている。その結果、これらの特別
の病気は伝染性が高く、大人口に対し破壊的であ
り、そのため有効な抑制を逃れている。 過去何十年間に亘るトレポネーマ パリダム或
いはその他の非病原性トレポネーマの全細胞、抽
出物或いはアジユバント調剤を用いるワクチン開
発の多くの試みは失敗に終つている。一つの研究
は、ガンマー線照射で弱められたトレポネーマ
パリダム（Nichols）を用いたウサギのワクチン
化の成功を報告している。ヒトに対する潜在的免
疫化計画としてのこの接近手法には、幾つかの主
たる欠点がある。これらの欠点としては、新らた
に単離され、新らたに照射されたトレポネーマ類
を多量に調製することが非実用的であること、並
びにトレポネーマ懸濁液中に存在する汚染ウサギ
蛋白質に対する被投与者の過敏症反応に伴う欠点
などが挙げられる。 梅毒及びその他の関連した病気性トレポネーマ
病の研究は細菌性伝染病のその他の領域よりもは
るかに遅れ続けている。特にトレポネーマ パリ
ダム感染に対する体液応答の複雑性及びそれに引
続く抗原成分の純粋培養（fractionation）のた
めに多量のトレポネーマ パリダム細胞を得るこ
とができないことがウサギ及びヒトにおいて保護
免疫を引出す原因であるトレポネーマ パリダム
の特異的免疫原の同定を著しく妨げてきた。未だ
同定されておらず、特性化されていない特異的ト
レポネーマ パリダムの免疫原は、梅毒の抑制の
ための免疫学的接近手法への鍵を握るものと思わ
れる。 トレポネーマ種決定基に対して特異的なモノク
ローナル抗体を生産するためのトレポネーマ−感
作脾臓或いはリンパ結節細胞とプラスマ細胞の細
胞株（plasmacytoma cell lines）との形質細胞
体細胞陸合は、過去の主たる障害を迂回する新し
い革新的な方法を提供するものである。一度、首
尾よく行われるならば、トレポネーマ パリダム
抗原に対する実質的に無限の単一特異性抗体の供
給は常時容易に利用可能となる。次いで、これら
の単一特異性抗体を用いてトレポネーマ免疫原の
抗原成分を分析することができる。この新らしい
ハイブリドーマ細胞融合技術を使用して特異的ト
レポネーマ免疫原を単離し、特性化することは、
ワクチン開発を通じて発病学及び梅毒、フランベ
ジア、ピンタ及びベジエルの免疫学的抑制を理解
するために必要とされる材料及び洞察を与えるも
のと思われる。 本発明は、トレポネーマ抗原に向けられたモノ
クローナル抗体を生産する連続ハイブリツド細胞
株の開発を探索するものである。選ばれた細胞株
（cell lines）は、結合部位特異性に関してトレポ
ネーマ細菌により示される単一抗原決定基に同一
である一組の単一特異性抗体を連続的に生産する
ことができる。 本発明によればトレポネーマ抗原、特にトレポ
ネーマ パリダムに対して高度に特異的且つ均一
なモノクローナル抗体を作り出し分泌する連続ハ
イブリドーマ細胞株が確立される。 本発明は、その最も広い側面において、先ず動
物をトレポネーマ細菌に対して免疫化して開始
（priming）抗原決定基に向けられた抗体を生産
するリンパ球及びそれらの分化子孫を生育させる
ものである。このリンパ球を回収し、骨髄腫、プ
ラスマ細胞或いはハイブリドーマ細胞と融合し、
体細胞ハイブリツドを形成する。この細胞ハイブ
リツドを培養し、選択し、単離し、そして組織培
養において増殖させる。その後、このハイブリツ
ド細胞株は選ばれた免疫抗原に対するモノクロー
ナル抗体を無限に生産することができるようにな
る。よつて、本発明は、具体的には、トレポネー
マ パリダムで免疫されたマウスの脾臓細胞とネ
ズミ（murine）の骨髄腫細胞との細胞融合によ
り得られたハイブリドーマであつて、リン酸緩衝
塩水の懸濁液として４℃で７日間貯蔵して熟成さ
せた、又は超音波処理したトレポネーマ パリダ
ムの決定基に対して反応性であつて、新たに単離
された元のままの（intact）トレポネーマ パリ
ダム、トレポネーマ フアゲデニス抗原及びウサ
ギ精巣抽出物とは非反応性であるモノクローナル
抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ
を提供するものである。 本発明によれば、トレポネーマの抗原決定基に
対するモノクローナル抗体を生産する連続ハイブ
リツド細胞株が提供される。トレポネーマ パリ
ダムに特異的に向けられたモノクローナル抗体或
いはトレポネーマ群の抗原に特異的に向けられた
モノクローナル抗体（幾つかのトレポネーマ種間
に交差反応する抗体）を生産する連続細胞株が単
離された。更に、有害なトレポネーマを固定化す
ることのできる補体固定モノクローナル抗体が作
出される。 以下、本出願の時点において最良の態様を表わ
すものと思われる本発明の好ましい実施態様につ
いて説明を行う。 本発明の方法に従えば、試験動物はトレポネー
マ細菌を含有する調剤を用いた免疫化によつて抗
体生産のためにin vitroにおいて刺戟される。本
発明の好ましい実施態様においては、ウサギの精
巣から抽出したトレポネーマ パリダムの接種材
料を用いてマウスを免疫化した。 或いは又、抗体を生産することのできる正常及
び免疫分化リンパ球を試験動物から単離し、培養
し、in vitroでトレポネーマで開始し、リンパ球
ハイブリドーマを生産するに適した細胞を産生さ
せることができる。例えば、その様なミトゲン及
び／又は抗原を用いてin vitroで刺戟する方法
は、ロバートソン等のMicrobiology1980pp.181
−185（1980年）及びケツトマン等のJ.Immunol.
Methods39：203−222（1980年）に記載されてお
り、或いはプレス等のPress et al，Eur.J.
Immunol.4：155−159（1974年）に記載されてい
る脾臓断片培養法により説明されている。 宿主動物或いはそれから培養して得られた抗体
生産細胞を免疫化する経路及び手順は一般的に抗
体刺戟及び生産の確立された通常の技術に従えば
よい。本発明者等はマウスを試験モデルとして使
用したが、ヒトを含む任意の補乳動物或いはそれ
から得られる抗体生産細胞を本発明の方法に従つ
て操作してヒトのハイブリツド細胞株の生産の基
礎に役立てることができることを意図している。 免疫化後、免疫リンパ細胞を骨髄腫、プラスマ
細胞或いはハイブリドーマ細胞（以下集合的に骨
髄腫細胞と称する）と融合し、ハイブリツド細胞
株を産生し、これを無限に培養及び継代培養して
多量のモノクローナル抗体を生産することができ
る。本発明の目的のためには、融合のために選択
された免疫リンパ細胞は、免疫化動物のリンパ結
節組織或いは脾臓組織のいずれかから取り出され
たリンパ球及びそれらの正常な分化細胞（子孫）
である。本発明においては、マウス系に関し、よ
り濃度が高く、便利な抗体生産細胞源を提供する
ので、免疫脾臓細胞を用いるのが好ましい。 骨髄腫細胞は、融合ハイブリツドの連続的増殖
のための基盤を提供するものである。骨髄腫細胞
は、骨髄に対して選択性を示すプラスマ細胞から
得られた腫瘍細胞である。プラスマ細胞腫
（plasmacytoma）はプラスマ細胞から得られた
新生物細胞である。特に、本発明においては免疫
グロブリンを分泌しないリンパ球ハイブリドーマ
細胞を用いるのが好ましい。リンパ球ハイブリド
ーマ細胞は、骨髄腫或いはプラスマ細胞腫と通常
の分化リンパ細胞との融合により産生された細胞
である。骨髄腫、プラスマ細胞腫及びハイブリド
ーマを選択することにより免疫グロブリン合成を
なくすることができる。 骨髄腫及び免疫化抗体生産細胞を得るための動
物の種類は、一つの種類の細胞をもう一つの種類
のものと融合することができる意味において特に
重要ではない。しかしながら、免疫化抗体生産細
胞及び骨髄腫の源は同一の種からのものであるこ
とが好ましい。 一般的に、使用される融合技術は、コーラ等
〔Kohler et al，Eur.J.Immunol.6：11−19
（1976）〕及びケネツト等〔Kennett et al，
Lymphocyte Hybridomas−Current Topics in
Microbiology and Immunology81：77−91
（1978）Springer−Verlog，New York〕の方法
によるものである。融合は、一般的に、抗体生産
細胞の懸濁液を生育培地中の骨髄腫細胞に添加
し、その後遠沈してペレツトを形成することによ
り達成される。 融合ハイブリツドは次いでトレポネーマ抗原に
対して特異的な抗体生産を行うものについてのス
クリーニングが行われる。トレポネーマ抗原決定
基に対して特異的な抗体を分泌するハイブリドー
マが選択され、培養され、安定した遺伝暗号を有
する連続細胞株を確立する。この細胞株は凍結及
び液体窒素下での貯蔵などの多くの通常の方法の
うちの任意の方法で貯蔵及び保存することができ
る。凍結された細胞株は再生され無限に培養され
て選ばれた抗原決定基に対して特異的なモノクロ
ーナル抗体を合成及び分泌を再開することができ
る。分泌された抗体は組織培養上澄液から通常の
沈澱、イオン交換、アフイニテイ−クロマトグラ
フイーなどにより回収することができる。回収さ
れた抗体は、凍結乾燥し、余り活性を失うことな
く冷蔵下に少なくとも数週間保存することができ
る。以下、具体例により本発明の特別の実施態様
を説明するが、それらは本発明を限定するもので
はない。 Ａ 抗原の調製 トレポネーマ パリダム（Nichols）をマウス
の感作及びラジオイムノアツセイ（RIA）におけ
る抗原の源として使用した。この生物の培養は、
予め受領時にトレポネーマ パラルイス−クニク
リ（Treponema paraluis−cuniculi）感染の臨
床的及び血清学的（VDRL非反応性）証拠の不
存在を検査したニユージーランド白色ウサギの精
巣中において行つた。これらの動物は、次いで
個々に18〜20℃において抗生物質の無い食物及び
水を自由に与えて家内飼育した。精巣当り血清−
塩水抽出媒体〔0.01Mリン酸緩衝液PH7.2、0.85％
（重量／容積）NaCl、50％（容積／容積）熱不活
性化（56℃、30分間）正常ウサギ血清〕１ml中２
×107のトレポネーマ パリダムを精巣内に注射
後、12日後にトレポネーマを、細かく刻んだ精巣
から180rpm（23℃）の回転振盪により30分間精巣
当り10mlの抽出溶媒を用いて好気的に抽出した。
大きなウサギ精巣組織残渣を、遠心分離により二
回500×ｇ下、10分間23℃で、50mlの円錐形ポリ
プロピレン遠心分離管内においてトレポネーマ懸
濁液から除去した。懸濁液中のトレポネーマを次
いで運動性に対して調べ、16000×ｇにおける遠
心分離により20分間濃縮を行い、リン酸緩衝塩水
（PBS）（0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、0.85％
NaCl、PH7.2）中に懸濁し、暗視野照明顕微鏡に
より数を数えた。「新鮮な（fresh）」トレポネー
マを単離後直ちに使用しRIAプレートを構成し、
それは−70℃で調製することができた。「熟成
（aged）」トレポネーマはPBS中のトレポネーマ
パリダムの懸濁液を４℃で７日間貯蔵した後に
RIA用のマイクロリツトルプレートウエルに結合
して調製した。 T.フアゲデニス（T.phagedenis）バイオタイ
プレイター（Reiterトレポネーマ）をRIAにおい
て使用してトレポネーマ群抗原に対する抗体を固
定した。これらの生物は23℃において維持され、
10％（vol／vol）の加熱不活性化された（56℃、
30分）減菌ウシ血清を含有するBBLチオグリコ
レート媒体135C（指示薬なし）中に毎月移され
た。RIAに使用する細胞は、４mlの無菌ウシ血清
を補給された40mlのBBL Spirolate Broth（各チ
ユーブ当り全容積44ml）を含有する大きなネジキ
ヤツプをつけたチユーブ中において５日間35℃に
おいて培養した。５本のチユーブからの細胞を遠
心分離により集め、40mlの無菌PBS中において
遠心分離により二度洗浄を行い、暗視野照明顕微
鏡により測定してml当り約１×108の細胞数の細
胞密度においてPBS中に懸濁した。 ウサギ抗原と交差反応したモノクローナル抗体
或いはトレポネーマ パリダム懸濁液（マウスの
感作に用いられたもの）中に存在する汚染性ウサ
ギ宿主抗原に向けられたモノクローナル抗体を検
出するために、正常な感染されていないVDRL
非反応性ウサギの精巣からRIA用ウサギ精巣抗原
抽出物が調製された。精巣を細かく刻み、トレポ
ネーマ パリダムについて説明したと同様な血清
−塩水媒体中において抽出したが、遠心分離は一
度だけ７分間250×ｇにおいて行い、白濁した上
澄液を得た。このウサギ抗原調剤10μlをRIAにお
けるマイクロリツトルプレートウエル当り使用し
た。蛋白質測定は、この調剤10μlが約120μｇ全ウ
サギ蛋白質を含有し、この全蛋白質の50％は血清
−塩水抽出媒体中の正常なウサギ血清によるもの
であることを示した。−20℃において６ケ月まで
貯蔵した調剤は、RIAにおいて新らたに調製した
抽出物と同等に反応するようであつた。 又、トレポネーマ パリダム（T.pallidum）
或いはT.phagedenisバイオタイプReiterの超音
波処理懸濁液をもRIA抗原として用いて「遮蔽さ
れた」、表面下の、或は細胞質のトレポネーマ抗
原に向けられた抗体を検出した。PBS中ml当り
ほぼ１×108個のトレポネーマ懸濁液を段付きマ
イクロチツプ及び出力４（約40W）に設定された
Branson Sonifier Model W350を用いて全部で
３分間（50％パルスで６分間）（氷上）で超音波
処理を行つた。これらの超音波処理懸濁液10μlを
RIAにおいてマイクロリツトルプレートウエル当
り使用した。未使用懸濁液は−20℃で貯蔵した。 Ｂ プラスマ細胞腫細胞株 この研究において使用された細胞株は、シユル
マン等（Schulman et al，Nature276：269−
270（1978）〕により記載されている。BALB／ｃ
マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞株×63／Ag8間の温
成分子形成から形成されたSP2／HGLKに由来す
るハイブリツド細胞株であるマウスプラスマ細胞
腫細胞株SP2／０−Ag14（SP2／０）である。
SP2／０はIgの重鎖或いは軽鎖のいずれも合成せ
ず、20μｇの８−アザグアニン／mlに対して耐性
を示し、ヒポキサンチン／アミノプテリン−チミ
ジン（HAT）培地中においては死滅する。
SP2／０は、高グルコースを有するDulbeccoの
変成Eagle培地（DMEM）（Grand Island Bio−
logical Campany，Grand Island，New York）
において15％（vol／vol）のウシ胎児血清（Hy
−Clone FCS；Sterile Systems、ユタ州、ロー
ガン）、2mMグルタミン及び50単位のペニシリ
ン／ストレプトマイシン（GIBCO）／mlを補給
してin vitroで維持される。 Ｃ ハイブリドーマ生産のための免疫化手順 成熟したメスのBALB／ｃマウス（６〜８週
令）をJackson Laboratories社（メイン州社、
バー・ハーバー）から購入し、トレポネーマ パ
リダム抗原に対する抗体を生産する脾臓リンパ球
の源として使用した。マウスは、最初にPBS中
の新らたに調製したトレポネーマ パリダム細胞
（２×108個／0.15mlPBS）を用いてフロウンド
（Freunds）の完全アジユバンド中において
（１：１）腹腔内に注射して（IP）免疫化した。
21日日、42日目及び63日目に２×107個の新らた
に単離した生物（0.3ml PBS；IP）の３回の追
加の注射を与え、最後に84日目に0.4mlPBS中1.2
×107個の生物（0.2mlIP及び0.2ml静脈内）の注射
を行つた。最終注射の３日後に脾臓を二匹のマウ
スから無菌的に取出し、脾臓細胞を鉗子でゆつく
り細かく砕いてDMEM中に単一細胞懸濁液を調
製してハイブリドーマ細胞融合の準備を行つた。
これらの細胞は次いでDMEMを用いて遠心分離
により270×ｇで10分間８℃において３回洗浄し
た。 Ｄ ハイブリドーマの構成 ハイブリドーマはケネツト等（Kennett et al，
Lymphocyte Hybridomas−Current Topics in
Microbiology and Immunology81，pp77〜91
（1978）、Springer−Verlag New York）の基本
的方法の修正方法を用いて免疫化マウスからの脾
臓細胞をネズミのSP2／０−Ag14ハイブリドー
マ細胞（以下SP2／０と称する）と融合させて生
産した。適当な細胞株は、上記シユルマン等によ
り元来示されたのと同様に、ペンシルバニア医科
大学のロジヤーケネツト（Roger Kennett）か
ら得られた。 プラスマ細胞腫細胞を対数成長期の培養液から
収獲し、270×ｇにおいて10分間遠心分離により
ペレツト化し、DMEM中で３回洗浄した。約１
×107個のSP2／０細胞及び洗浄脾臓細胞を生育
可能な（viable）脾臓細胞７に対し、生育可能
SP2／０細胞１の比で混合し遠心分離によりペレ
ツト化した。上澄液を除去後、0.2mlの温い（37
℃）ポリエチレングリコール（DMEM中35％
wt／vol、PEG1000、J.T.Baker Chemical
Company、ニユージヤージー州フイリツプスブ
ルグ）をペレツトに添加して細胞融合を引起こし
た。 細胞を次いでペレツト化し、DMEM中におい
て洗浄し、25〜60mlのDME−Hy媒体（上記ケネ
ツト等の78頁参照）中にほぼ４×106個／mlの割
合で再懸濁し、96ウエルのマイクロリツトルプレ
ート（Costar Plastics、ニユージヤージー州、
バインランド）中における50μlアリコートでの制
限稀釈の条件下においてプレート化した。この融
合方法はSP2／０−脾臓細胞混合物、PEG及び
DMEMが全て細胞融合過程において37℃に保た
れた点において上記ケネツト等の方法と異る。こ
の細胞ペレツトをガラス棒でゆるめて細胞のゆる
やかな混合を確実に行い、細胞はPEG中におい
て37℃で３分間残存し、８℃において約５分間
（遠心分離間）残存する。 リトルフイールド等〔Littlefield等、
Science145：709〜710（1964）〕に記載されるよう
な培地中の二培濃度のHAT選択成分を２日目に
各ウエル50μlに添加した後、４日目に100μlの
HAT−MEDIUMを添加した。ハイブリツドは
６〜10日後に観察することができた。生育細胞を
含有したウエルをもう一つの96ウエルの板に分割
し、生育を行い維持するために24ウエルの組織培
養プレート（Costar Plastics）中に移した。培
養上澄液を取出して抗−トレポネーマ パリダム
反応性のスクリーニング検定及びモノクローナル
イソタイプの決定において使用した。 Ｅ モノクローナル抗体の特性化 トレポネーマ パリダムに対するモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマのRIAスクリー
ニング分析 Cookeの96ウエルのマイクロリツトルプレート
（Dynatech Laboratories、バージニア州、アレ
クサンドリア）の各ウエルにPBS中ml当り１×
108個／mlの等価量或いは前記ウサギ精巣抽出物
を含有するT.pallidum或いはT.phagedenisバイ
オタイプReiterの懸濁液或いは超音波処理物の
10μlを添加した。４℃において一晩インキユベー
トして乾固し、ウエルを各々0.2mlずつの0.2％の
ナトリウムアジドを含有するPBSで３回洗浄し
て非付着抗原を除去した。トレポネーマ及びウサ
ギ精巣組織抗原の塩化ポリビニルその他のプラス
チツクに対する強い親和性のために、これらの抗
原のマイクロリツトルプレートウエルに対する結
合を促進するために固定剤を使用する必要はなか
つた。しかしながら、必要に応じて各ウエルに10
％エタノールを20μl添加した後37℃において蒸発
させることを固定のために利用することができ
る。ウエルを次いで0.2mlのPBS＋１％wt／volウ
シ血清アルブミンで４℃において一晩予備被覆
し、0.2mlのPBS＋アジドで３度洗浄した。プレ
ートは調製した即日或いは一日後に使用した。 PIAテストのために、0.05mlの４日経たハイブ
リドーマクローン上澄液を各抗原調剤を含有する
各々のウエルに添加した。23℃において３時間
後、ウエルを0.2ml PBS＋アジドで３回洗浄後、
ウエル毎に0.1ml PBS＋アジド＋２％（vol／
vol）ウマ血清中のアフイニテイ精製した125I−標
識化ウサギの抗−マウスIgG（比活性2.0×
106CPM／μｇ）及びIgM（比活性3.7×
106CPM／μｇ）の混合物2.6×105CPMを添加し
た。この測定の結合は４℃において一昼夜行つ
た。ウエルを次いでPBS及び水道水で十分に洗
浄した。プレートの乾燥及び個々のウエルの切断
に引続いて各ウエルをNuclear Chicago1185型ガ
ンマカウンターを用いて0.4分間カウントを行つ
た。 RIAにおいて陽性のコントロールとして使用さ
れた抗血清は、１ 細胞融合において脾臓リンパ
球の源として使用されたマウスから集められたマ
ウスの抗−トレポネーマ パリダム血清及び２
BALB／ｃマウスをウサギ精巣抽出物調剤で免
疫化して製造されたマウスの抗−ウサギ精巣抽出
物を含むものであつた。マウスの抗−ウサギ精巣
抽出物血清はマウスを１日目に腹腔注射により免
疫化し（0.25ml精巣抽出物＋0.25mlフロウンドの
完全アジユバント）及び0.3mlの抽出物を30日目、
及び51日目に投与後72日目に血清を集めて得られ
た。 全部で39のハイブリドーマ細胞株がRIAにより
トレポネーマ パリダム抗原と反応したモノクロ
ーナル抗体の分泌体として同定された。RIAにお
ける反応性は0.4分当りの125Iカウント数が600を
超える場合が陽性とされた（背景カウント数は通
常200〜300のオーダーであつた）。これに基づき、
抗−トレポネーマ パリダム ハイブリドーマか
ら生ずるモノクローナル抗体は三つの主たる範疇
に分類することができた。一つのモノクローナル
抗体はトレポネーマ パリダム抗原に対して特異
的なものである。これらの中にはトレポネーマ
パリダム固定化試験において有害なトレポネーマ
パリダム生物を固定化することもできるモノク
ローナル抗体もあつた。もう一つの群のモノクロ
ーナル抗体は、トレポネーマ パリダム（T.
pallidum）及びT.phagedenisバイオタイプ
Reiter抗原の両者と反応し、従つて明らかにトレ
ポネーマ群抗原に対して向けられたものであつ
た。モノクローナル抗体の第三の群はトレポネー
マ抗原及びウサギ宿主精巣組織抗原の両者を結合
することが出来、従つてRIAにおいて試験された
全ての抗原と交差反応性の高いものであつた。 表１は抗−トレポネーマ パリダム ハイブリ
ツドをスクリーニングするために使用されたRIA
処方の一例を示す。示されたデータは行われた数
個の典型的RIA試験からの一つのものであり、ト
レポネーマ パリダムに対して特異的にモノクロ
ーナル抗体を生産する大多数のクローンに特徴的
な結果を表わすものである。表１に示されるよう
なクローンから得られたモノクローナル抗体は、
元のまゝのトレポネーマとは余りよく反応しなか
つた。しかしながら、それらはトレポネーマ パ
リダムの超音波処理された抗原には選択的に結合
するようであり、それらは細胞内或いは遮蔽抗原
のいずれかに対して向けられることができること
を暗示した。これらのトレポネーマ パリダム決
定基に対する特異性は、それらがＴ・
phagedenisバイオタイプReiter抗原調剤及びウ
サギ精巣組織抗原と交差反応としないことにより
示された。これらのモノクローナル抗体はマウス
のIgG及びIgMクラスのものであり、TPI試験に
おいてトレポネーマ パリダムに対しては反応性
を示さなかつた。RIAにおいて陽性コントロール
として使用したポリクローナル抗血清調剤（マウ
スの抗−トレポネーマ パリダム及びマウスの抗
−ウサギ精巣組織）は試験した全ての抗原に対し
て強く陽性であつた。これは、マウスの抗−トレ
ポネーマ パリダム抗体が、トレポネーマ群抗原
（T.phagedenisバイオタイプReiterの抗原と交差
反応する）並びに汚染性ウサギ宿主抗原の両者を
含有するトレポネーマ パリダム懸濁液で感作さ
れたマウスから誘導されたものであるから当然予
想されるものであつた。同様に、マウスの抗−ウ
サギ精巣抗体も又、ウサギ宿主組織及びトレポネ
ーマの両者に共通の抗原の存在によりトレポネー
マ抗原と反応した。 モノクローナル抗体イソタイプの検定 マウス抗体のイソタイプは固相RIAにより同定
された。Cookeのマイクロリツトルプレートをヤ
ギの抗−マウスイムノグロブリンで被覆した。培
養上澄液を次いで添加し、37℃で３時間インキユ
ベートした。ヨウ素標識され、アフイニテイ精製
したウサギの抗−マウス重鎖特異試薬を添加して
プレートに結合した抗体のイソタイプを同定し
た。
【表】
【表】
トレポネーマ パリダムのおそらく表面決定基
と思われるものに対してより大きな親和性を有す
るモノクローナル抗体を生産するように思われた
トレポネーマ パリダムに対して特異的な抗体を
分泌する４種のハイブリドーマ細胞株も又単離さ
れた。これらのクローンからのモノクローナル抗
体は、元のままの「熟成した」トレポネーマ及び
トレポネーマ パリダムの音波処理物の両者と比
較的高い反応性を有したが、おそらく一つの例
外、クローン7D7、を除いては新たに単離された
トレポネーマとは反応性を有しなかつた。これら
のモノクローナル抗体についてはその他のトレポ
ネーマ或いはウサギ抗原との交差反応は殆んど或
いは全く見られなかつた。それらのトレポネーマ
パリダムの可能性のある表面成分に対する見か
け上の特異性の増大にも拘らず、これらのモノク
ローナル抗体はTPI試験においても非反応性であ
つた。 表３は、TPI試験においての、トレポネーマ
パリダムに対して反応することのできるモノクロ
ーナル抗体を生産する抗−トレポネーマ パリダ
ムハイブリドーマ細胞株を示すRIAデータを表わ
すものである。これらのクローンは補体を固定す
ることのできるマウスイソタイプの抗体を分泌し
た。これらの抗体は、しかしながら、新たに単離
した元のまゝのトレポネーマ或いは「熟成した」
元のまゝトレポネーマのいずれとも余りよく反応
しなかつた。この観察は反応性TPI試験データに
鑑みて驚くべきことであつた。
と思われるものに対してより大きな親和性を有す
るモノクローナル抗体を生産するように思われた
トレポネーマ パリダムに対して特異的な抗体を
分泌する４種のハイブリドーマ細胞株も又単離さ
れた。これらのクローンからのモノクローナル抗
体は、元のままの「熟成した」トレポネーマ及び
トレポネーマ パリダムの音波処理物の両者と比
較的高い反応性を有したが、おそらく一つの例
外、クローン7D7、を除いては新たに単離された
トレポネーマとは反応性を有しなかつた。これら
のモノクローナル抗体についてはその他のトレポ
ネーマ或いはウサギ抗原との交差反応は殆んど或
いは全く見られなかつた。それらのトレポネーマ
パリダムの可能性のある表面成分に対する見か
け上の特異性の増大にも拘らず、これらのモノク
ローナル抗体はTPI試験においても非反応性であ
つた。 表３は、TPI試験においての、トレポネーマ
パリダムに対して反応することのできるモノクロ
ーナル抗体を生産する抗−トレポネーマ パリダ
ムハイブリドーマ細胞株を示すRIAデータを表わ
すものである。これらのクローンは補体を固定す
ることのできるマウスイソタイプの抗体を分泌し
た。これらの抗体は、しかしながら、新たに単離
した元のまゝのトレポネーマ或いは「熟成した」
元のまゝトレポネーマのいずれとも余りよく反応
しなかつた。この観察は反応性TPI試験データに
鑑みて驚くべきことであつた。
【表】
【表】
トレポネーマ属の構成員間に存在することが知
られている数多くの抗原的類似性によりトレポネ
ーマ パリダム及びT.phagedenisバイオタイプ
Reiter抗原決定基の両者と交差反応するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株が産
生されることは予想されないことではなかつた。
しかしながら、単離された39の抗−トレポネーマ
パリダム ハイブリドーマのうち僅かに３個が
この特性を有するに過ぎなかつた（表４）。 RIAにおいて使用された全トレポネーマ及びウ
サギ精巣抗原と交差反応することの見出されたモ
ノクロナル抗体を生産する種類のハイブリドーマ
細胞株も又単離された。使用された制限稀釈法及
び各細胞株当り１個のみの抗体イソタイプが見ら
れた（クローン12H4を除く）という事実により、
これらのハイブリドーマ細胞株が培養液中で一緒
に成長している１より多くのハイブリドーマクロ
ーンを表わすものとは思われない。興味深いこと
に、これらの高度に交差反応性の抗体の全ては
IgMクラスの抗体であることである。
られている数多くの抗原的類似性によりトレポネ
ーマ パリダム及びT.phagedenisバイオタイプ
Reiter抗原決定基の両者と交差反応するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株が産
生されることは予想されないことではなかつた。
しかしながら、単離された39の抗−トレポネーマ
パリダム ハイブリドーマのうち僅かに３個が
この特性を有するに過ぎなかつた（表４）。 RIAにおいて使用された全トレポネーマ及びウ
サギ精巣抗原と交差反応することの見出されたモ
ノクロナル抗体を生産する種類のハイブリドーマ
細胞株も又単離された。使用された制限稀釈法及
び各細胞株当り１個のみの抗体イソタイプが見ら
れた（クローン12H4を除く）という事実により、
これらのハイブリドーマ細胞株が培養液中で一緒
に成長している１より多くのハイブリドーマクロ
ーンを表わすものとは思われない。興味深いこと
に、これらの高度に交差反応性の抗体の全ては
IgMクラスの抗体であることである。
【表】
【表】
トレポネーマ パリダム固定化（TPI）試験に
おけるモノクローナル抗体 マウスの抗−トレポネーマ パリダム血清、マ
ウスの抗−ウサギ精巣抽出血清及びモノクローナ
ル抗体分泌抗−トレポネーマ パリダム ハイブ
リドーマについて、それらのトレポネーマ パリ
ダム固定化（TPI）試験における有害トレポネー
マ パリダム（Nichols）を固定化する能力の試
験を行つた。このTPI検定は僅かな修正を施して
梅毒試験マニユアル（Center for Disease
Control，1964，Dept.of Health，Education
and Welfare，Public Health Service，N.C.D.
C.ジヨージア州、アトランタ）の記載に従つて行
つた。ハイブリドーマクローン上澄液中にペニシ
リンが存在したために試験操作においてペニシリ
ナーゼを含有させた。トレポネーマ パリダムは
接地中に使用された濃度においてはストレプトマ
イシンには感応しなかつたのでハイブリドーマク
ローン上澄液からのストレプトマイシンの除去は
必要でなかつた。 下記のハイブリドーマはトレポネーマ パリダ
ム特異性およびTPI−反応性を示した：クローン 抗体イソタイプ 3G5 IgM 4H7 IgG2b 5A7 IgM 13C6 IgG2a 13C8 IgG2b 13G10 IgG2a トレポネーマ パリダム抗体に対する 微量赤血球凝集（MHA−TP）試験 MHA−TP試験（Sera−Tekトレポネーマ抗
体試験、Ames Division、Miles Laboratories、
Inc.）を製造者によつて記載される方法によつて
行つた。すなわち、抗−トレポネーマ パリダム
モノクローナル抗体を含有する各々４日経たハ
イブリドーマクローン上澄液3μl（DMEM培地）
を57μlの吸収稀釈液（１：20稀釈率）と混合し、
室温において30分間インキユベートさせた。各モ
ノクローナル抗体調剤について吸収されたモノク
ローナル抗体混合物の25μlずつのアリコートを次
いで96ウエルマイクロリツタープレートの二重ウ
エルに添加した。各クローン試料について75μlの
感作したヒツジ赤血球を１組のウエルに添加し、
75μlの未感作ヒツジ赤血球を陰性コントロールと
してのもう一つの二重ウエルに添加した。 反応性クローンは8G2及び11E3であつた。その
他の全ての試験されたハイブリドーマクローン上
澄液は非反応性であつた。 より大きな程度の抗−トレポネーマ パリダム
特異性はIgMを分泌するクローンと対比してIgG
分泌クローンにより示されるようであつた。表６
は全てのネズミの抗−トレポネーマ パリダム
モノクローナル抗体のイソタイプ、それらの特異
性及びその研究におけるそれらの単離頻度をまと
めて示す。トレポネーマ パリダム抗原に対して
のみ反応した単離されたハイブリドーマの大多数
（31クローンのうち24）は同様の性質の７個の
IgMクローンと対比してIgGサブクラスのもので
あつた。T.phagedenisバイオタイプReiter或い
はウサギ精巣抗原のいずれとも交差反応した全部
で８個のクローンの中においてこれらの７個は
IgM生成体であつた。
おけるモノクローナル抗体 マウスの抗−トレポネーマ パリダム血清、マ
ウスの抗−ウサギ精巣抽出血清及びモノクローナ
ル抗体分泌抗−トレポネーマ パリダム ハイブ
リドーマについて、それらのトレポネーマ パリ
ダム固定化（TPI）試験における有害トレポネー
マ パリダム（Nichols）を固定化する能力の試
験を行つた。このTPI検定は僅かな修正を施して
梅毒試験マニユアル（Center for Disease
Control，1964，Dept.of Health，Education
and Welfare，Public Health Service，N.C.D.
C.ジヨージア州、アトランタ）の記載に従つて行
つた。ハイブリドーマクローン上澄液中にペニシ
リンが存在したために試験操作においてペニシリ
ナーゼを含有させた。トレポネーマ パリダムは
接地中に使用された濃度においてはストレプトマ
イシンには感応しなかつたのでハイブリドーマク
ローン上澄液からのストレプトマイシンの除去は
必要でなかつた。 下記のハイブリドーマはトレポネーマ パリダ
ム特異性およびTPI−反応性を示した：クローン 抗体イソタイプ 3G5 IgM 4H7 IgG2b 5A7 IgM 13C6 IgG2a 13C8 IgG2b 13G10 IgG2a トレポネーマ パリダム抗体に対する 微量赤血球凝集（MHA−TP）試験 MHA−TP試験（Sera−Tekトレポネーマ抗
体試験、Ames Division、Miles Laboratories、
Inc.）を製造者によつて記載される方法によつて
行つた。すなわち、抗−トレポネーマ パリダム
モノクローナル抗体を含有する各々４日経たハ
イブリドーマクローン上澄液3μl（DMEM培地）
を57μlの吸収稀釈液（１：20稀釈率）と混合し、
室温において30分間インキユベートさせた。各モ
ノクローナル抗体調剤について吸収されたモノク
ローナル抗体混合物の25μlずつのアリコートを次
いで96ウエルマイクロリツタープレートの二重ウ
エルに添加した。各クローン試料について75μlの
感作したヒツジ赤血球を１組のウエルに添加し、
75μlの未感作ヒツジ赤血球を陰性コントロールと
してのもう一つの二重ウエルに添加した。 反応性クローンは8G2及び11E3であつた。その
他の全ての試験されたハイブリドーマクローン上
澄液は非反応性であつた。 より大きな程度の抗−トレポネーマ パリダム
特異性はIgMを分泌するクローンと対比してIgG
分泌クローンにより示されるようであつた。表６
は全てのネズミの抗−トレポネーマ パリダム
モノクローナル抗体のイソタイプ、それらの特異
性及びその研究におけるそれらの単離頻度をまと
めて示す。トレポネーマ パリダム抗原に対して
のみ反応した単離されたハイブリドーマの大多数
（31クローンのうち24）は同様の性質の７個の
IgMクローンと対比してIgGサブクラスのもので
あつた。T.phagedenisバイオタイプReiter或い
はウサギ精巣抗原のいずれとも交差反応した全部
で８個のクローンの中においてこれらの７個は
IgM生成体であつた。
【表】
ここにおいて3G5（TPI−反応性）及び8G2
（MHA−TP−反応性）で同定されるハイブリツ
ド細胞株はそれぞれATCC番号HB8133及び
HB8134でATCCに寄託されている。 Ｆ 用途 本発明において説明されるハイブリドーマ細胞
株及びそれから生産されるモノクローナル抗体は
トレポネーマ細菌特にトレポネーマ パリダムに
より提供される特別の免疫抗原的成分の精製及び
特性化に有用である。更に、あるハイブリドーマ
株から生産されるモノクローナル抗体は抗原的認
識において均一であり、これにより引続くトレポ
ネーマ抗原のアフイニテイクロマトグラフイに基
づく精製に有用である。 この抗−トレポネーマ パリダム モノクロー
ナル抗体は１以上の多くの方法で新らたな診断試
験の開発に潜在的に使用することができる。直接
及び間接の免疫検定を含む各種の手法を利用する
ことができる。一般的免疫検定種剤の変容として
はラジオイムノアツセイ（直接又は間接）、螢光
抗体技術（直接又は間接）、酵素−結合免疫吸着
検定（ELISA）、溶血検定の阻害、凝集試験の阻
害、凝集反応（抗体−仲介リガンド）及び／又は
補体消費試験などが挙げられる。その様な系に１
以上の抗−トレポネーマ パリダム モノクロー
ナル抗体を使用することはモノクローナル抗体が
トレポネーマ パリダムに特異的であり極めて感
応性タイプの免疫検定において使用することがで
きるという事実により初期の一次梅毒の診塚に重
要な新規な有用な試験を潜在的に構成するものと
思われる。その様な感度のよい検定法はトレポネ
ーマ パリダム細胞或いは先天的梅毒病巣或いは
神経梅毒の脳脊髄液における抗原の検出により先
天的梅毒或いは神経梅毒の診断に有用であり得
る。 更に、こののモノクローナル抗体は現在極めて
高価で且つ非効率的方法によつて行われているウ
サギ組織からのトレポネーマ パリダム細胞を単
離精製するために使用することのできる新らたな
アフイニテイ精製試薬を潜在的に提供するもので
ある。モノクローナル抗体アフイニテイカラムク
ロマトグラフイを使用することによりアフイニテ
イ精製されたトレポネーマ パリダム細胞を調製
し、現存する梅毒の血清診断試験における診断抗
原として使用することができる。その様なアフイ
ニテイ精製されたトレポネーマ細胞は又はこの材
料が通常調製されていたトレポネーマ パリダム
細胞よりはるかに「より清浄」（即ち、汚染性ウ
サギ組織くずがない）なので既存の試験の感度も
上昇させる。又、血清診断試験における抗原とし
て全トレポネーマ パリダム細胞の代りに、モノ
クローナル抗体は、試験抗原として全トレポネー
マ細胞に代りに使用することのできるトレポネー
マ パリダム細胞の新らたに規定された抗原成分
をアフイニテイ精製する能力を有し得るものであ
る。その結果、このモノクローナル抗体は最終的
にこの生物の新らたな抗原成分を同定する能力並
びに分別されたトレポネーマ パリダム細胞から
それらを精製する能力の両者を有するものであ
る。 究極的には、アフイニテイ精製されたトレポネ
ーマ パリダム抗原成分は梅毒用ワクチンの開発
に使用し得るものである。その様なワクチンの候
補者となるので米国人口の僅かに限られた部分に
すぎないと思われるが（即ちゲイ人口、移民労働
者、内部都市住民）、その様なワクチンが有効で
あり得るその他の重要なトレポネーマ病が存在す
る。即ち、フランベジア、ピンタ、及びベジエー
ルを引き起こすトレポネーマはトレポネーマ パ
リダムとは形態学的及び血清学的には区別できな
いトレポネーマである。フランベジア、ピンタ、
及びベジエール生物のトレポネーマ パリダムと
の免疫学的類似性故に梅毒に対して開発されたワ
クチンはこれらの風土的トレポネーマ病に対して
も同様に有効であり得る。かように、免疫原であ
るトレポネーマ パリダムのアフイニテイ精製抗
原（免疫原）を調製する能力は一般的なトレポネ
ーマ病ワクチンへの極めて広い応用を有し得るも
のである。以上、本発明は説明及び例示を目的と
して特別の実施態様に向けられてきた。しかしな
がら、当業者には説明された実施態様の製造方法
及び実施方法において多くの修正及び変化を発明
の趣旨を離れることなく行うことができることが
明らかであろう。前記特許請求範囲内でのあらゆ
る等価的な修正及び変様は本発明の範囲に含まれ
るものである。
（MHA−TP−反応性）で同定されるハイブリツ
ド細胞株はそれぞれATCC番号HB8133及び
HB8134でATCCに寄託されている。 Ｆ 用途 本発明において説明されるハイブリドーマ細胞
株及びそれから生産されるモノクローナル抗体は
トレポネーマ細菌特にトレポネーマ パリダムに
より提供される特別の免疫抗原的成分の精製及び
特性化に有用である。更に、あるハイブリドーマ
株から生産されるモノクローナル抗体は抗原的認
識において均一であり、これにより引続くトレポ
ネーマ抗原のアフイニテイクロマトグラフイに基
づく精製に有用である。 この抗−トレポネーマ パリダム モノクロー
ナル抗体は１以上の多くの方法で新らたな診断試
験の開発に潜在的に使用することができる。直接
及び間接の免疫検定を含む各種の手法を利用する
ことができる。一般的免疫検定種剤の変容として
はラジオイムノアツセイ（直接又は間接）、螢光
抗体技術（直接又は間接）、酵素−結合免疫吸着
検定（ELISA）、溶血検定の阻害、凝集試験の阻
害、凝集反応（抗体−仲介リガンド）及び／又は
補体消費試験などが挙げられる。その様な系に１
以上の抗−トレポネーマ パリダム モノクロー
ナル抗体を使用することはモノクローナル抗体が
トレポネーマ パリダムに特異的であり極めて感
応性タイプの免疫検定において使用することがで
きるという事実により初期の一次梅毒の診塚に重
要な新規な有用な試験を潜在的に構成するものと
思われる。その様な感度のよい検定法はトレポネ
ーマ パリダム細胞或いは先天的梅毒病巣或いは
神経梅毒の脳脊髄液における抗原の検出により先
天的梅毒或いは神経梅毒の診断に有用であり得
る。 更に、こののモノクローナル抗体は現在極めて
高価で且つ非効率的方法によつて行われているウ
サギ組織からのトレポネーマ パリダム細胞を単
離精製するために使用することのできる新らたな
アフイニテイ精製試薬を潜在的に提供するもので
ある。モノクローナル抗体アフイニテイカラムク
ロマトグラフイを使用することによりアフイニテ
イ精製されたトレポネーマ パリダム細胞を調製
し、現存する梅毒の血清診断試験における診断抗
原として使用することができる。その様なアフイ
ニテイ精製されたトレポネーマ細胞は又はこの材
料が通常調製されていたトレポネーマ パリダム
細胞よりはるかに「より清浄」（即ち、汚染性ウ
サギ組織くずがない）なので既存の試験の感度も
上昇させる。又、血清診断試験における抗原とし
て全トレポネーマ パリダム細胞の代りに、モノ
クローナル抗体は、試験抗原として全トレポネー
マ細胞に代りに使用することのできるトレポネー
マ パリダム細胞の新らたに規定された抗原成分
をアフイニテイ精製する能力を有し得るものであ
る。その結果、このモノクローナル抗体は最終的
にこの生物の新らたな抗原成分を同定する能力並
びに分別されたトレポネーマ パリダム細胞から
それらを精製する能力の両者を有するものであ
る。 究極的には、アフイニテイ精製されたトレポネ
ーマ パリダム抗原成分は梅毒用ワクチンの開発
に使用し得るものである。その様なワクチンの候
補者となるので米国人口の僅かに限られた部分に
すぎないと思われるが（即ちゲイ人口、移民労働
者、内部都市住民）、その様なワクチンが有効で
あり得るその他の重要なトレポネーマ病が存在す
る。即ち、フランベジア、ピンタ、及びベジエー
ルを引き起こすトレポネーマはトレポネーマ パ
リダムとは形態学的及び血清学的には区別できな
いトレポネーマである。フランベジア、ピンタ、
及びベジエール生物のトレポネーマ パリダムと
の免疫学的類似性故に梅毒に対して開発されたワ
クチンはこれらの風土的トレポネーマ病に対して
も同様に有効であり得る。かように、免疫原であ
るトレポネーマ パリダムのアフイニテイ精製抗
原（免疫原）を調製する能力は一般的なトレポネ
ーマ病ワクチンへの極めて広い応用を有し得るも
のである。以上、本発明は説明及び例示を目的と
して特別の実施態様に向けられてきた。しかしな
がら、当業者には説明された実施態様の製造方法
及び実施方法において多くの修正及び変化を発明
の趣旨を離れることなく行うことができることが
明らかであろう。前記特許請求範囲内でのあらゆ
る等価的な修正及び変様は本発明の範囲に含まれ
るものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ トレポネーマ パリダムで免疫されたマウス
の脾臓細胞とネズミ（murine）の骨髄腫細胞と
の細胞融合により得られたハイブリドーマであつ
て、リン酸緩衝塩水の懸濁液として４℃で７日間
貯蔵して熟成させた、又は超音波処理したトレポ
ネーマ パリダムの決定基に対して反応性であつ
て、新たに単離された元のままの（intact）トレ
ポネーマ パリダム、トレポネーマ フアゲデニ
ス抗原及びウサギ精巣抽出物とは非反応性である
モノクローナル抗体を産生することを特徴とする
ハイブリドーマ。 ２ 骨髄腫細胞がハイブリドーマ細胞或いはプラ
スマ細胞腫細胞である、特許請求の範囲第１項記
載のハイブリドーマ。 ３ BALB／ｃマウス免疫脾臓細胞がSP2／Ｏハ
イブリドーマ細胞に融合された細胞ハイブリツド
である、特許請求の範囲第１項記載のハイブリド
ーマ。 ４ ハイブリドーマが、ATCC寄託物HB8133又
はHB8134からクローン化されたハイブリドーマ
である、特許請求の範囲第１項記載のハイブリド
ーマ。
Applications Claiming Priority (2)
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| US06/381,929 US4514498A (en) | 1982-05-26 | 1982-05-26 | Hybrid cell lines producing monoclonal antibodies directed against Treponema |
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Related Parent Applications (1)
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Publications (2)
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Family
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Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP58093327A Granted JPS5931686A (ja) | 1982-05-26 | 1983-05-26 | トレポネーマに対して向けられたモノクローナル抗体 |
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Family Applications Before (1)
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| JP58093327A Granted JPS5931686A (ja) | 1982-05-26 | 1983-05-26 | トレポネーマに対して向けられたモノクローナル抗体 |
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