JPH036790B2

JPH036790B2 -

Info

Publication number: JPH036790B2
Application number: JP57132790A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Myake; Ryohei Yamazaki; Kazumasa Yokoyama; Tadakazu Suyama
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 1982-07-28
Filing date: 1982-07-28
Publication date: 1991-01-30
Also published as: JPS5922901A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なウロキナーゼ誘導体、その製造
法及び血栓溶解剤に関する。更に詳しくは、本発
明は水可溶性ウロキナーゼ・デンプン結合物、そ
の製造法当該結合物を有効成分とする血栓溶解剤
に関する。フイブリンおよび血栓の溶解酵素であるウロキ
ナーゼは各種血栓症や塞栓性疾患の治療および制
癌剤との併用療法等に広く用いられており、優れ
た臨床効果をもたらしている。しかし生体に投与
されたウロキナーゼは、蛋白体としても又酵素活
性としてもいずれも速やかに血中より消失し、こ
のものの血中半減期はわずか１〜２分である。さ
らに投与されたウロキナーゼの酵素活性は血中の
ウロキナーゼ阻害因子による作用を受け、ある閾
値以上の量を投与しないと、血栓溶解能が発現し
ないことが判つている。ウロキナーゼのこのような血中動態は、十分な
効果を得るためには必然的に大量投与へと進展せ
ざるを得ず、今日の大量投与療法になつていると
理解される。発明者らはかねてより血中における
ウロキナーゼを効力を持続させ、かつ血中の阻害
因子による影響を受けにくくすることを研究し、
実験及び検討を重ねた結果、水可溶性のウロキナ
ーゼ・デンプン結合物を創製すると共に当該結合
物がウロキナーゼの単独投与時にみられる種々の
欠点を改善し得ること、及びウロキナーゼの酵素
活性を十分にかつ持続的に発揮しうることを見出
し、その医薬としての有用性に着目して本発明を
完成した。即ち、本発明は、分子量が９万〜50万、ウロキナーゼとデンプ
ンのモル比が１：１〜１：10であつて、ウロキ
ナーゼとデンプンとが、−CH₂NH−または

【式】（式中、ｎは１〜６の整数を示す）を介して結合してなる
水可溶性ウロキナーゼ・デンプン結合物、ウロキナーゼとデンプンの反応性誘導体とを
反応させる上記の水可溶性ウロキナーゼ・デン
プン結合物の製造法、および、上記の水可溶性ウロキナーゼ・デンプン結合
物を有効成分とする血栓溶解剤に関する。本発明に用いるウロキナーゼは医薬として精製
されたものであれば、人尿、腎組織培養のいずれ
の由来のものでもよく、更に遺伝子工学の手法に
よりヒト由来のウロキナーゼ遺伝子を大腸菌に投
入し、培養後その大腸菌が生産するウロキナーゼ
でもよい。また分子量25000〜60000の範囲のもの
を使用することが好ましい。本発明にて使用されるデンプンは、たとえばハ
イドロキシエチルデンプン（HES）などの如き
デンプン誘導体をも含む概念であり、通常分子量
４万〜40万のものが用いられる。以下の説明にお
いて、実験例及び実施例以外で使用されるウロキ
ナーゼ・デンプン結合物はかかるデンプン誘導体
の結合部をも包含するものである。本発明のウロキナーゼ・デンプン結合物は、活
性化デンプン（たとえば、デンプンの水酸基をア
ルデヒドに活性化したものなど）とウロキナーゼ
とを直接結合させたものでもよく、また活性化デ
ンプンとウロキナーゼとを他の基を介して間接的
に結合したものでもよい。ここに活性化デンプン
とは、デンプン分子中の水酸基をウロキナーゼ分
子中のアミノ基と反応しうるよう活性化したもの
であり、たとえば式

【式】

【式】で表わされる化合物などがあげられる。化合物
（）は、たとえばデンプンを過ヨウ素酸などで
酸化することによつて、製造される。化合物
（）は、デンプンとシアンブロマイドとを反応
させることによつて得られる。これらの活性化法
は、J.Biol.Chem.251、1081（1976年）、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA73、2128（1976年）等に記載
されている。本発明のウロキナーゼ・デンプン結合物の製造
法は、たとえば次の如くである。本反応においては、まずデンプンを酸化剤（た
とえば過ヨウ素酸ナトリウム）にて酸化する。こ
の際デンプン100重量部に対して酸化剤を10〜40
重量部使用する、また反応時間は10〜60分であ
り、室温、暗所で撹拌処理することによつて行わ
れる。かくして得られた活性化デンプンは通常反
応終了後、３〜5Mの水酸化ナトリウムで中和し、
水で透析した後凍結乾燥する。かくして得られた
活性化デンプンの酸化度は10〜50％である。ウロ
キナーゼと活性化デンプンとの反応は通常、ウロ
キナーゼ100重量部に対して活性化デンプン20〜
2000重量部を反応させることによつて行われる。
この際ウロキナーゼは水溶液として、また活性化
デンプンはリン酸緩衝液（PH６〜８）溶液として
反応に供される。かくして得られた化合物を還元
することによつて目的物が得られるが、この際、
還元剤としては、水素化ホウ素金属塩が使用さ
れ、特に好ましくは水素化ホウ素による還元の前
に水素化シアンホウ素金属塩にて還元する水素化
ホウ素金属塩及び水素化シアンホウ素金属塩とし
ては各主アルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム
塩）が好ましいものとして例示される。当該還元
は、通常０〜30℃、好ましくは４℃にて６〜12時
間撹拌することによつて行われる。〔式中、Ｘ、X′はそれぞれハロゲン原子（たと
えば、クロルなど）を、ｎは１〜６の整数を示
す。〕デンプンと臭化シアンとの反応には、前者100
重量部に対して後者を10〜100重量部を使用する。活性化デンプンに二官能性化合物（例えばジア
ミノエタン、ジアミノヘキサン）次いでハロゲン
アセチルハロゲンド（たとえば、ブロムアセチル
ブロミド）を作用させて結合させる。次にこの活
性化デンプンとウロキナーゼとを接触させウロキ
ナーゼ・デンプン結合物を得る。この結合反応
は、PH7.2〜11に調整し、温度３〜25℃で12〜48
時間接触させることにより行なう。かくして得られたウロキナーゼ・デンプン結合
物は公知のゲル過法、分子篩別法、イオン交換
法等にて回収できるが、ゲル過法で分画した場
合はウロキナーゼ・デンプン結合物と未結合のデ
ンプン及びウロキナーゼがきわめて明瞭な差違を
持つて挙動するから、目的とする結合物の回収を
容易に行いうる。回収したウロキナーゼ・デンプ
ン結合物は、除菌過及び加熱処理等を行なつた
のち分注し、凍結乾燥してウロキナーゼ・デンプ
ン結合物を含有する血栓溶解剤が得られる。このようにして得たウロキナーゼ・デンプン結
合物の性状は水及び生理的塩類溶液に容易に溶解
し、ウロキナーゼとデンプンとのモル比は１：１
〜１：10である。また、ウロキナーゼ・デンプン
結合物のPH安定性、加熱安定性及び血漿中プロテ
アーゼ阻害因子に対する安定性を調べると、PHに
ついてはウロキナーゼ自体はPH３〜10の範囲にわ
たつて比較的安定であるが、ウロキナーゼ・デン
プン結合物はさらに安定であり、PH２〜11の広い
範囲にわたつて力価の低下は全く認められなかつ
た。加熱安定性についてはウロキナーゼが最も安
定なPH8.0において60℃の加温を行つたところ、
ウロキナーゼ単独のものは２時間の加熱で安全に
失活したのに対し、ウロキナーゼ・デンプン結合
物は加熱10時間後においてもなお100％の活性残
存率を示し、熱に対して非常に安定であることが
認められた。本発明に係るウロキナーゼ・デンプン結合物
は、血栓溶解作用を有するので血栓溶解剤として
有用であり、たとえば注射剤として非経口的に投
与される。具体的には、たとえば、50〜30000IU
の本品を日本薬局方注射用蒸留水0.5〜５mlに溶
解し、年令、症状および経過に応じて適宜加減し
て静脈内注射、点滴静注、点滴注射、結膜下又は
球後注射して用いる。本発明に係るウロキナーゼ・デンプン結合物は
血中で極めて安定であつて容易に解離や分解をせ
ず、熱に対しても著るしく安定であり、血中のウ
ロキナーゼ阻害因子の作用を受けにくく、ウロキ
ナーゼ単独では血栓溶解作用を示さない低活性の
投与でも血栓溶解作用をもたらし、生体内に投与
したとき血中滞留時間が著るしく延長し、毒性も
ほとんど検出されない等の優れた特性を有し、従
来にない極めて有用性の高い医薬を提供できる効
果がある。以下、実施例及び実験例を挙げて本発明をより
具体的に説明する。実施例１ヒト血漿を用いてウロキナーゼ又はウロキナー
ゼ・デンプン結合物及びウロキナーゼ・HES結
合物の血漿中プロテアーゼ阻害因子に対する抵抗
性を調べた。試験方法は、活性が100IU（国際単
位）／ml（国際単位については、医薬品研究(3)、
295−308、1974年参照）になる様に稀釈したウロ
キナーゼ単独、ウロキナーゼ・デンプン結合物又
はウロキナーゼ・HES結合の各225μに18％ヒ
ト血漿アルブミン15μを混合し、次いでこの混
合液20μにヒト血漿80μを混ぜ、37℃にて１
時間インキユベートしたのちヒトフイブリン標準
平板法（B.B.A.、24、278−282、1975年）にて
ウロキナーゼ活性を測定し、ヒト血漿とのインキ
ユベート前のウロキナーゼ活性を100％とし、そ
のウロキナーゼ残存活性を算出した。試験結果は
第１図に示す通りであり、ウロキナーゼ単独の残
存活性が1.5％であるのに対し、ウロキナーゼ・
デンプン結合物及びウロキナーゼ・HES結合物
ではそれぞれ28及び25％であつた。このことから
本結合物は血漿中プロテアーゼ阻害因子の影響に
対して抵抗性を有することが認められた。実験例２ウロキナーゼ・デンプン結合物とウロキナー
ゼ・HES結合物について高速液体クロマトグラ
フイー（LC−3A：島津製作所製）を用いて
Somenoら〔J.Chromat.、188、185−92（1980）〕
の方法に従い分析した。担体としてTSK−
Gel3000SW（東洋ソーダ製）を用い、PH３の0.2M
リン酸緩衝液を1.2ml／minの流速で展開したと
ころ、第２図の高速液体クロマトグラムを得た。
その結果、ウロキナーゼ・デンプン結合物とウロ
キナーゼ・HES結合物は予想された如く高分子
側に溶出された。実験例３ウロキナーゼ・デンプン結合物とウロキナー
ゼ・HES結合物とウロキナーゼ単独のものの血
栓溶解能をチヤンドラループ法を用いて比較し
た。この試験方法は新鮮で正常なヒト・クエン酸
血液１mlを内径３mm、長さ270mmのプラスチツ
ク・チユーブに入れ、この血液にさらに3.8％塩
化カルシウム・２水塩液0.1ml添加したのち、チ
ユーブの両端に内径５mm、長さ15mmのシリコンチ
ユーブを接合してループにする。このチユーブを
直ちに水平面より80℃の角度で毎分12回転するよ
うに設計された回転盤に載せ、37℃の恒温室にて
20分間回転させる。これにより血液カラムの先端
に長さ約13mmの人工血栓が生成する。この人工血
栓は病理組織学的にみて人体にできる混合血栓と
極めて近似した組織像を有するといわれている。ループをこの装置から取りはずしたのち、ルー
プ状にしたポリビニルチユーブの一端をシリコン
チユーブからはずし、試料液又は生理食塩液0.1
mlをチユーブ内に入れ、再度チユーブをループ状
にし、回転装置に架け、回転を続けた。第１番目のループに就いて血栓溶解を開始して
から４時間後に、この第１番目のループを回転装
置から抜き取り、チユーブ内の血栓を10mlの蒸留
水にhomogenizeし、遠心し（3600rpm、５分
間）、上清の540nｍに於ける吸光度を測定した。
第２番目以降のループも第１番目のループに引き
続いて抜き取り、先と同様に処理した。なお、試料液添加群の血栓溶解率（Ｙ）を次式
に従つて求めた。Ｙ＝（１−Ａ／Ac）×100（％）但し、Ａ；試料液を添加したループについての540nｍ
における吸光度 Ac；生理食塩液を添加したループについての
540nｍにおける吸光度の平均値ウロキナーゼ単独とウロキナーゼ・デンプン結
合物とウロキナーゼ・HES結合物のチヤンドラ
ループ法による血栓溶解試験の結果は第３図に示
す如くである。第３図におけるグラフの横軸は試
料液0.1mlをループ内に注入した時の最終力価を
表示しており、且つ力価はフイブリン平板法で測
定した値である。この図より、ウロキナーゼ・デンプン結合物と
ウロキナーゼ・HES結合物の血栓溶解曲線が、
両者ともにウロキナーゼ単独の同曲線よりも左側
に移動しており、ウロキナーゼ単独よりも血栓溶
解能が強くなつていることが分る。実験例４次にビーグル犬（雄、体重12〜15Kg）を用いて
ウロキナーゼ・デンプン結合物とウロキナーゼ・
HES結合物の血中維持効果を実験し、ウロキナ
ーゼの単独投与と比較した。ウロキナーゼは、ク
ロラミンＴ法（Biochem J.89、114、1963年）に
より ¹²⁵Iで標織した。すなわち、ウロキナーゼ
10万単位をリン酸緩衝液0.5mlに溶解したのちこ
のウロキナーゼ水溶液0.1mlに1mCi／mlNa ¹²⁵I
を0.1ml加え、さらに0.05％クロラミン−T0.1ml
を加えて室温にて５分間反応させたのち0.1％重
亜硫酸ナトリウム0.1mlを加えて反応を止め、こ
の反応混液をセフアデツクスＧ−25カラムに通し
て ¹²⁵I−ウロキナーゼと遊離のNaI¹²⁵を分別過
した。このようにして得た ¹²⁵I−ウロキナーゼを２
分し、１つはそのまま動物実験用試料とし、他は
各々分子量40万の活性化デンプンあるいはHES
と反応させ、 ¹²⁵I−ウロキナーゼ・デンプン結
合物と ¹²⁵I−ウロキナーゼ・HES結合物を得て
動物実験試料とした。 ¹²⁵I−ウロキナーゼ・デ
ンプン結合物と、 ¹²⁵I−ウロキナーゼ・HES結
合物及び ¹²⁵I−ウロキナーゼのそれぞれ２×
10⁶cpmをビーグル犬に静脈内投与し、それぞれ
の血中濃度を10分おきに求めた。実験結果は第１
表に示す通りであり、ウロキナーゼ・デンプン結
合物、ウロキナーゼ・HES結合物はウロキナー
ゼ単独に比較して血中半減期は第１次減衰曲線か
らはそれぞれ5.6倍と5.5倍に、第２次減衰曲線か
らはそれぞれ4.7倍と4.6倍にそれぞれ延長し、ウ
ロキナーゼにデンプンあるいはその誘導体を結合
させると著るしい血中維持効果が得られることを
認めた。

【表】実験例５急性毒性試験をウイスター系ラツトの尾静脈内
投与により調べるため、体重１Kgにつきウロキナ
ーゼ・デンプン結合物のウロキナーゼ50万IUを
静注し投与後７日間にわたつて一般症状の観察と
体重測定を行つたところ、体重は順調に増加して
全く異常所見は認められなかつたし、剖検ならび
に組織学的検査の結果も全く異常を認めなかつ
た。実施例１デンプン１ｇを秤取し、これに蒸留水20mlを加
え溶解させ、356mgの過ヨウ素酸ナトリウムを蒸
留水５mlに溶解させたものを添加し、室温で暗所
にて30分間撹拌した。撹拌後、4Mの水酸化ナト
リウム溶液で中和し、水で充分透析した。透析
後、凍結乾燥する。次にウロキナーゼ10mg（100
万IU）を含有する水溶液４mlに上記の活性化デ
ンプン28mg（3.5モル当量）を0.1Mリン酸緩衝液
（PH７）に溶解させたものを加え、更に水素化シ
アノホウ素ナトリウムを1.22mg添加し、４℃にて
18時間撹拌する。撹拌後、水素化ホウ素ナトリウ
ムの4.3mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH７）に溶解さ
せたものを加え、４℃にて18時間撹拌する。撹拌
後、水素化ホウ素ナトリウム３〜６mgを上記の緩
衝液に溶解させたものを加え、４℃にて６〜12時
間撹拌する。撹拌後上記緩衝液にて透析する。得
られた反応混合物をセフアデツクスＧ−200のカ
ラムにかけてゲルロ過し、ウロキナーゼと上記の
デンプンの結合物と未反応のウロキナーゼとを分
別する。分別して得られた結合物を集め、ミリポ
アフイルターによる除菌過を行い、ウロキナー
ゼ力価を測定して分注量を決めたのち、所定量だ
け小分けして分注し、凍結乾燥してウロキナー
ゼ・デンプン結合物含有血栓溶解剤を得た。この
結合物は前述したウロキナーゼ・デンプンの特性
を有していた。実施例２実施例１におけるデンプンの代わりにHES（分
子量４万）を用いて、以下実施例１と同様に処理
することにより、ウロキナーゼ・HES結合物を
得た。又、この得られたウロキナーゼ・HES結
合物は前述の諸特性を有していた。実施例３デンプン（分子量４万）１ｇを秤取し、これに
蒸留水49mlを加えて溶かし、これに臭化シアン
150mgをシアン化メタン1.5mlに溶かした液を滴加
して十分に撹拌する。この間1M水酸化ナトリウ
ムにてPH10.2〜10.5に維持する。反応開始より５
分経過後に濃塩酸にてPH2.2に下げ、ジアミノエ
タン２mlに加えてPH9.5に上げ、PH9.5に保つて４
℃で１夜静置する。この後蒸留水に対して透析し
たのち凍結乾燥してアミノエチルアミノデンプン
を得る。次にこれを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
25mlに溶解し、ブロムアセチルブロミド１mlを滴
下し、約２時間1M水酸化ナトリウムでPH7.0に保
つたのち蒸留水で透析し、凍結乾燥して活性化化
合物末を得る。その50mgを0.1M炭酸緩衝液（PH
9.5）0.4mlに溶かし、ウロキナーゼ５mg（50万
IU）を加え、約５℃にて50時間静置して結合反
応を行う。次いで反応混合物をセフアデツクスＧ
−200のカラムにかけてゲル過し、ウロキナー
ゼ・デンプン結合物を得る。この結合物は前述の
諸特性を有していた。実施例４実施例３におけるデンプンの代わりにHES（分
子量４万）を用いて、以下実施例３と同様に処理
することにより、ウロキナーゼ・HES結合物を
得た。又、このウロキナーゼ・HES結合物は前
述の諸特性を有していた。実施例５デンプン（分子量４万）１ｇを実施例３と同様
に臭化シアン150mgと反応させ、ジアミノヘキサ
ン２mlを加えて、同様の条件下で処理してアミノ
ヘキシルアミノデンプンを得た。これを実施例３
と同じくブロモアセチルブロミドで処理してＮ−
ブロモアセチルアミノヘキシルアミノデンプンが
得られた。この50mgを上記緩衝液１mlに溶かし、
ウロキナーゼ５mg（５万IU）を加え、約５℃に
て50時間反応させた。実施例２と同様に反応混合
物をゲル過分別した。得られた結合物は前述の
特性を有していた。実施例６実施例５におけるデンプンの代わりにHES（分
子量４万）を用いて以下同様に処理し、ウロキナ
ーゼ・HES結合物を得た。このウロキナーゼ・
HES結合物は前述の諸特性を有していた。なお、実施例１〜６における生成物の特性は次
の通りである。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は血漿中プロテアーゼ阻害因子に対する
抵抗性を示す図、第２図１はウロキナーゼ、第２
図２はウロキナーゼ・デンプン結合物、第２図３
はウロキナーゼ・HES結合物におけるそれぞれ
の高速液体クロマトグラムであり、実線は280n
ｍにおける吸光度であり、破線は屈折率を示すも
のである。第３図はウロキナーゼとウロキナー
ゼ・デンプン結合物そしてウロキナーゼ・HES
結合物の血栓溶解曲線を示している。

Claims

【特許請求の範囲】１分子量が９万〜50万、ウロキナーゼとデンプ
ンのモル比が１：１〜１：10であつて、ウロキナ
ーゼとデンプンとが、−CH₂NH−または
【式】（式中、ｎは１〜６の整数を示す）を介して結合してなる水可
溶性ウロキナーゼ・デンプン結合物。２ウロキナーゼとデンプンの反応性誘導体とを
反応させて、分子量が９万〜50万、ウロキナーゼ
とデンプンのモル比が１：１〜１：10であつて、
ウロキナーゼとデンプンとが、−CH₂NH−また
は【式】（式中、ｎは１〜６の整数を示す）を介して結合してなる水
可溶性ウロキナーゼ・デンプン結合物を得ること
を特徴とする水可溶性ウロキナーゼ・デンプン結
合物の製造法。３デンプンの分子量が４万から40万である特許
請求の範囲第２項記載の水可溶性ウロキナーゼ・
デンプン結合物の製造法。４分子量が９万〜50万、ウロキナーゼとデンプ
ンのモル比が１：１〜１：10であつて、ウロキナ
ーゼとデンプンとが、−CH₂NH−または
【式】（式中、ｎは１〜６の整数を示す）を介して結合してなる水可
溶性ウロキナーゼ・デンプン結合物を有効成分と
する血栓溶解剤。