JPS6043116B2 - ウロキナ−ゼ誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なウロキナーゼ誘導体に関するものてあ
り、詳しくはウロキナーゼ誘導体としてのウロキナーゼ
を活性化デキストランと化学的に結々させた水可容性の
ウロキナーゼ・デキストラン結合物を開発し、このもの
がウロキナーゼそのものに比べ新しい種々の優れた酸素
学的特性及び生物学的特性を有することにより、このウ
ロキナーゼ誘導体を医薬として提供しようとするのであ
る。

フィブリンおよび血栓の溶解要素であるウロキナーゼ
は各種血栓症や塞栓性疾患の治療および制癌剤との併用
療法等に広く用いられており、優れた臨床効果をもたら
している。

しカル生体に投与されたウロキナーゼは、蛋白体として
も又酵素活性としてもいずれも速やかに血中より消失し
、このものの血中半減期はわずか１〜２分である。さら
に投与されたウロキナーゼの酸素活性は血中のウロキナ
ーゼ阻害因子による作用を受け、ある閥値以上の量を投
与しないと、血栓溶解能が発現しないことが判つている
。 ウロキナーゼのこのような血中動態は、投与効果を
得るためには必然的に大量投与へと進展せざるを得ず、
今日の大量投与療法になつていると理解される。

発明者らはかねてより血中におけるウロキナーゼの効力
を持続させ、かつ血中の阻害因子による影響を受けにく
くすることを研究し、実験及び検討を重ねた結果水可溶
性のウロキナーゼ・デキストラン結合物がウロキナーゼ
の単独投与時にみられる種々の欠点を改善し得ること、
及びウロキナーゼの酸素活性を十分にかつ持続的に発揮
し得ることを見出し、これらの新知見に基づいて本発明
を完成するに至つた。 ウロキナーゼをある種の担体に
結合、包埋または吸着させて固定化する試みはすべにい
ろいろとなされているが、いずれも担体して水不溶性の
合成樹脂、コラーゲン繊維、高分子天然化合物等を用い
て水不溶化ウロキナーゼの形にしており、これらは人工
血管や透析回路等の医療用器具を使用目的として開発さ
れたもので、ウロキナーゼの単独投与のように医薬とし
て用いられていない。

本発明に類似した物質としてはウロキナーゼーヘパリン
複合体がある（特開昭４８−５６８８８号公報）。これ
はポリアニオン体であるへバリンが蛋白を非特異的に吸
着する性質を利用し、へバリンをウロキナーゼの分離、
精製工程に導入して、ウロキナーゼをへバリン複合体の
形で共沈、回収するのである。このようにして得た複合
体は水に溶解すると再びウロキナーゼとへバリンに解離
し、生体に投与すると両者は血中で別々に挙動し、ウロ
キナーゼの単独投与もしくはウロキナーゼとへバリンの
混合投与と全く変らないことになり、本発明物質がもた
らすような効果を示さない。本発明に係るウロキナーゼ
誘導体は水可溶性のウロキナーゼ●デキストラン結合物
であり、このものは、加熱又は阻害因子に対する安定性
及び酵素活性の持続性に関して優れた性質を有す。本発
明に用いるウロキナーゼは医薬として精製されたもので
あれば人尿又は組織腎培養のいずれの由来のものでもよ
く、分子量２５０００〜６００００の範−囲から任意に
選んで使用できる。デキストランも由来を特に限定され
るものではなく、医薬として用いうる分子量１０００〜
２００万の範囲から任意に選ぶことができる。ウロキナ
ーゼとデキストランの組成比はデキストラン１ｍ９に対
してウロキナーゼ．１００〜１００００１Ｕ（国際単位
）である（国際単位については医薬品研究（３），２９
５〜３０８，１９７４年参照）。結合物の製法はまずデ
キストランの活性化を行い、次いでウロキナーゼと活性
化デキストランを直接又は炭素数１〜３の鎖状分子を仲
介とし．て結合させる。デキストランの活性化は公知の
方法を利用することができ、例えば共有結合法（Ｊ●Ｂ
ｌＯｌ．Ｃｈｅｍ．２５ｌ，ｌＯ８ｌ，ｌ９７６年）、
デキストランのアルドヘキソピラノース環の開裂法（Ｐ
ｒＯｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７３，
２ｌ２８，ｌ９７６年）、−ニ官能性化合物結合法（Ｐ
ｒＯｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７３，
２ｌ２８，ｌ９７６年）等がある。

共有結合法はデキストラン１ｍｇに対してシアンブロマ
イドを０．０５〜１ｍ９の割合で添加し、そのＰＨを約
９〜１１．５に調整して室温で約２〜１紛間反応させる
。反応終了後過剰のハロゲン化物を除去し、得られた活
性化デキストランにウロキナーゼを接触させる。これら
の活性化及び結合の反応式は次の通りである。アルドヘ
キソピラノース環の開裂法は酸化剤として過ヨウ酸ナト
リウムを用い、デキストラン１即に対して約０．０１〜
０．２ｍｇの酸化剤を添加し、５〜２時間の処理を行う
。

反応の終了後過剰の添加物を除去し、得られた活性化デ
キストランにウロキナーゼを接触させる。これらの反応
式は次の通りである。二官能性化合物結合法は例えばシ
アンブロマイドでデキストランを活性化し、この活性化
デキストランを二官能性化合物例えばジアミノエタンを
結合させて炭素数１〜３の鎖状分子を生成し、さらにブ
ロムアセチルプロミドを結合させたのちウロキナーゼと
接触させる。

これらの活性化及び結合反応式は次の通りである。ウロ
キナーゼと活性化デキストランの結合反応は、ＰＨを７
．２〜１１に調整し、温度３〜２５℃で０．５〜１０ｃ
ｔｆ間接触させる。

反応終了後未結合物を分離して目的とするウロキナーゼ
◆デキストラン結合物を回収する。回収法には公知のゲ
ル淵過法、分子篩別法、イオン交換法等を使用できるが
、ゲルｐ過法で分画した場合はウロキナーゼ・デキスト
ラン結合物と未結合のデキストラン及びウロキナーゼが
きわめて明瞭な差違を持つて挙動するから、目的とする
結合物の回収を容易に行いうる。回収したウロキナーゼ
・デキストラン結合物は、除菌ろ過及び加熱処理等を行
なつたのち分注し、凍結乾燥してウロキナーゼ・デキス
トラン結合物製剤を得る。このようにして得たウロキナ
ーゼ・デキストラン結合物の性状は水及び生理的塩類溶
液に容易に溶解する。

デキストラン１ＴＬｇ当りのウロキナーゼ活性は反応条
件によつて異なるが、人フィブリン標準平板法（Ｂ．Ｂ
．Ａ．？，２７８〜２８２，１９７５年）による測定力
価で、１００〜１００００ＰＵ（プロウグ単門位）の範
囲にある。（プロウグ単位については、医薬研究（３）
，２９５〜３０８，１９７拝参照）。ウロキナーゼとデ
キストランの結合比率は両者の反応量及び反応条件等を
変えることによつて任意に選ぶことができる。本物質の
基質特異性を人フィブリン・標準平板法による測定力価
（プロウグ単位）をベースにしてＴＯｓｙｌ−１ｙｓｉ
ｎｅｍｅｔ１１ｙ１ｅｓｔｅｒ（ＴＬＭＥ）に対するＫ
ｉｎｅｔｉｃｓをみると第１表に示す通りである。すな
わち１ＰＵ当りのエステル分解能Ｖｍａｘ（×１０１μ
ＭＯＩＴＬＭＥ／Ｍｉｎ／ＰＵ）は、ウロキナーゼデキ
ストラン結合物の方がもとのウロキナーゼ単独のものよ
り３〜４倍も高くなつている。又基質親和性を示すミカ
エリス定数Ｋｍ（ＭＭ）を比較すると、ウロキナーゼ単
独のものが０．７９であるのに対しウロキナーゼ・デキ
ストラン結合物では０．９７に上昇しており、両者は全
く別のミカエリス定数をもつことが判る。ウロキナーゼ
・デキストラン結合物のＰＨ安定性、加熱安定性及び血
中のウロキナーゼ阻害因子に対する安定性を調べると、
ＰＨについてはウロキナーゼ泊体はＰＨ３〜１０の範囲
にわたつて比較的安定であるが、ウロキナーゼ・デキス
トラン結合物はさらに安定であり、ＰＨ２〜１１の広い
範囲にわたつて力価の低下は全く認められなかつた。

加熱安定性についてはウロキナーゼが最も安定なＰＨ８
．Ｏにおいて６０℃の加温を行つたところ、第１図に示
す如くウロキナーゼ単独のものは２時間の加熱で安全に
失活したのに対し、ウロキナーゼ・デキストラン結合物
は加熱１叫間後においてもなお１００％の活性残存率を
示し、熱に対して非常に安定であることが認められた。
次にヒト胎盤から精製（特公昭４６−２１４６４号公報
）した人血のウロキナーゼ阻害因子を用いてウロキナー
ゼ活性の阻害され方を調べた。試験方法はウロキナーゼ
・デキストラン結合物を７５１Ｕ／Ｍｔ，ウロキナーゼ
単独のものを１５０１Ｕ／Ｍｔにそれぞれ調整し、これ
に種々のウロキナーゼ阻害因子液を等量ずつ加えて混和
し、３ｒＣにて３吟間加熱し、その０．０２ｍｔをとつ
て人フィブリン標準平板法にてウロキナーゼカ価を測定
した。試験結果は第２図に示す通りである。１００％阻
害量をみるとウロキナーゼ単独のものでは阻害因子５０
１Ｕ／ｍｌ（単位は特公昭４６−２１４６４号公報の川
野らの方法による）でほぼ完全に阻害さねたのに対し、
ウロキナーゼ・デキストラン結合物では２００１Ｕ／ｍ
ｌを要し、本結合物は血中のウロキナーゼ・阻害因子の
作用を非常に受けにくいことが判明した。このことから
本結合物は血中のウロキナーゼ阻害因子の影響に対して
抵抗性を有することが示唆される。またウロキナーゼ・
デキストラン結合物をデンプンゲル電気泳動法にて０．
１７Ｍ，Ｔｒｉｓ−Ｈ２ＢＯ４緩衝液、ＰＨ８．８，ｌ
ｍＡ／Ｃ７ｎ，ｌｍ間、４℃の条件下で分析すると、ウ
ロキナーゼ単独のものとほとんど同じ泳動パターンを示
し、両者の電気的な性状にほとんど差異のないことが認
められた。ウロキナーゼ・デキストラン結合物とウロキ
ナーゼ単独のものの血栓溶解能をチヤンドラループ法を
用いて比較した。

この試験方法は新鮮で正常なヒト・クエン酸血液１ｍ１
を内径３ＴＷ１，長さ２７０薗のプラスチック・チュー
ブに入れ、この血液にさらに３．８％の塩化カルシウム
●２水塩液０．１ｍ１添加したのち、チューブの両端に
内径５Ｔｎ！Ｔｔ，長さ１５？のシリコンチューブを接
合してループにする。このチューブを直ちに水平面より
８０℃の角度で毎分１淵するように設計された回転盤に
載せ、３ｒＣの恒温室にて３紛間回転させる。これによ
り血液カラムの先端に長さ１３ｗ１の人工血栓が生成す
る。この人工血栓は病理組織学的にみて人体にできる混
合血栓に極めて近似した組織像を有するといわれている
。このような人工血栓をループ内の血液に作成したのち
、種々の濃度のウロキナーゼ液を０．１ｍＬずつ添加し
て血液中のウロキナーゼ終濃度が１〜２０ＰＵ／ｍｌに
なるように調整し、さらに３７℃にて丘回転／分の回転
を正確に４時間続けて人工血栓の溶解を行う。回転終了
後にテユーブ内の人工血栓を取出し、ファン試液（１）
局）に浸して１液固定したのち血栓重量を秤量し、次式
により血栓溶解率を求めた。対照としてウロキナーゼ液
の代りに生理食塩水を同量添加し、同様に４時間回転さ
せたのち同じ方法で処理して血栓重量を秤量した。試験
結果は第３図に示す通りであり、ウロキナーゼ単独のも
のは１０ＰＵ／ｍｌ以下の濃度で全く血栓溶解能を示さ
なかつたが、ウロキナーゼ・デキストラン結合物は１０
ＰＵ／ｍｌ以下の低い濃度域においても著明な血栓溶解
能をもたらした。

このことから本結合物が血栓溶解剤として非常にすぐれ
た効果を期待できるものである。次にビー グル犬（雄
、体重１２〜１５ｋ９）を用いてウロキナーゼ・デキス
トラン結合物の血中維持効果を実験し、ウロキナーゼの
単独投与と比較した。試験方法にはクロラミンＴ法（Ｂ
ｉＯｅｈｅｍＪ．？，１１４，１９６３年）を用い、ウ
ロキナーゼ１０万単位をリン酸緩衝液０．５ｍ１に溶解
したのちＮａｌ２５ｌ／ＭＣｉ加え、さらに１％クロラ
ミンーＴＯ．５ｍｌを加えて室温にて２分間反応さたの
ち、こお反応混液をセフアデツクスＧ−２５カラムに通
して１２５１−ウロキナーゼと遊離のＮａＩｌ２５は分
別ｐ過した。このようにして得た１２５１−ウロキナー
ゼを２分し、１つはそのまま動物実験用試料とし、他は
分子量５０万の活性化デキストランと反応させ、１２５
１−ウロキナーゼ・デキストラン結合物を得て動物実験
用試料とした。１２５１−ウロキナーゼ・デキストラン
結合物及び１２５１−ウロキナーゼのそれぞれ２×１Ｃ
ｆ′Ｃｐｍをビークル犬に静脈内投与し、それぞれの血
中濃度を１吟おきに求めた。

実験結果は第２表及び第４図に示す通りであり、本結合
物はウロキナーゼ単独に比較して血中半減期は第１次減
衰曲線からは５．１倍に、第２次減衰曲線からは４．４
倍にそれぞれ延長し、ウロキナーゼのデキストランとの
結合が著るしい血中維持効果を有することを認めた。急
性毒性試験をウイスター系ラットの尾静脈内投与により
調べるため、体重１ｋ９につき本結合物のウロキナーゼ
５０万ＩＵを静注し投与後７日間にわたつて一般症状の
観察と体重測定を行つたところ、体重は順調に増加して
全く異常所見は認められなかつたし、部検ならびに組織
学的検査の結果も全く異常を認めなかつた。

本発明に係るウロキナーゼ・デキストラン結合物の臨床
使用における投与量および投与方法は、５０〜３０００
０旧の本品を日本薬局方注射用蒸留水０．５〜５ｍ１に
溶解し、年令、症状および経過に応じて適宜加減して静
脈内注射、点滴静注、点滴注射、結膜下又は球後注射し
て用いる。

本発明に係るウロキナーゼ・デキストラン結合物は血中
で極めて安定であつて容易に解離や分解をせず、熱に対
しても著るしく安定であり、血中のウロキナーゼ阻害因
子の作用を受けにくく、ウロキナーゼ単独では血栓溶解
作用を示さない低力価の投与でも血栓溶解作用をもたら
し、生体内に投与したとき血中滞留時間が著るしく延長
し、毒性もほとんど検出されない等の優れた特性を有し
、従来にない極めて有用性の高い医薬を提供できる効果
がある。

実施例１ デキストランＴ−１０，Ｔ−４０，Ｔ−７０，Ｔ一５０
０又はＴ−２０００（フアーマシア社製、スエーデン）
のいずれか２０ｍ９を秤取し、これに０．１Ｍ炭酸ナト
リウム１０ｍ１を加えて溶かす。

このデキストラン液にブロムシアン６０ｍｇを固形又は
溶液の形で加え、室温にて５分間攪拌する。この間痔水
酸化ナトリウム溶液を用いて反応液のＰＨを１１．０に
保ち、デキストランの活性化反応を行う。５分間の攪拌
を終了すると、痔塩酸液にてＰＨを８．５に下げて反応
を停止させる。

このうち反応生成物を透析またはセフアデツクスＧ−２
５のカラムにてゲルろ過し、未反応のブロムシアン等を
除去して活性化デキストラン液を得る。次にウロキナー
ゼ５０ｙｊ［Ｕを活性化デキストラン液に加えて溶かし
、室温にて１夜ゆるく攪拌しながら結合反応を行なう。

反応が終了すると反応混液をセフアデツクスＧ−２００
のカラムにかけてゲルろ過し、ウロキナーゼ・デキスト
ラン結合物と未反応のウロキナーゼとを分別する。なお
ゲル淵過に代えてボアーサイズ１０〜２０万のメンブラ
ン・フィルターを用いて分子篩別してもよい。このよう
にして得たウロキナーゼ・デキストラン結合を集め、ミ
リボアフィルターによる除菌ｐ過を行い、ウロキナーゼ
カ価を測定して分注量を決めたのち、所定量を小分けし
て分注し、凍結乾燥してウロキナーゼ・デキストラン結
合物製剤を得る。この製剤は前述したウロキナーゼ・デ
キストラン結合物の種々の特性を保有していた。実施例
２デキストラン１ｙを蒸留水９ｍ１を加えて溶かし、こ
れに１０％過ヨウ素酸ナトリウム１ｍｔを加え４℃の暗
所に１夜静置して活性化反応を行う。

このうち３％重亜硫酸ナトリウム３ｍ１を加えて活性化
反応を停止させ、蒸留水で１夜透析したのち凍結乾燥し
て活性化デキストラン末を得る。ウロキナーゼ液１０万
ＩＵに活性化デキストラン末１００ｍｇを加え、ＰＨ９
．５にて４℃で約４時間静置して結合反応を行う。その
後実施例１と同様に遊離の未反応ウロキナーゼを分子篩
別して除去し、ウロキナーゼ・デキストラン結合物を除
菌■過し、分注したものを凍結乾燥して製剤とする。こ
の製剤は前述したウロキナーゼ・デキストラン結合物の
特性を保有していた。実施例３ デキストラン１ｙに蒸留水４０ｍ１を加えて溶かし、こ
れにプロミアム１５０ｍ９をシアン化メタン１．５ｍ１
に溶かした液を滴加して十分に攪拌する。

この間１Ｎ水酸化ナトリウムにてＰＨｌＯ．２〜１０．
５に維持する。反応開始より５分経過後に濃塩酸にてＰ
Ｈ２．２に下げ、ジアミノエンタン２７ｒＬ１を加えて
ＰＨ９．５に上げ、ＰＨ９．５に保つて４℃で１夜静置
する。この後蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥して
アミノエチルアミノデキストランを得る。次にこれを０
．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）２５ｍ１に溶解し、
ブロムアセチルプロミド１ｍ１を滴下し、約２時間１Ｎ
水酸化ナトリウムでＰＨ７．Ｏに保つたのち蒸留水で透
析し、凍結乾燥して活性化デキストラン末を得る。その
５０ｍ９を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９．５）０．４ｍ
１に溶かし、ウロキナーゼ２万ＩＵを加え、約５℃にて
５叫間静置して結合反応を行う。次いで反応混合物をセ
フアデツクスＧ−２００のカラムにかけてゲルろ過し、
ウロキナーゼ・デキストラン結合物を得る。第５図はセ
フアデツクスＧ−２００のカラムによるゲル洒過のパタ
ーンであり、対照としてウロキナーゼ及びデキストラン
のパターンを付記した。このようにして得た製剤は前述
したウロキナーゼ・デキストラン結合物の種々の特性を
保有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は加熱安定性を示す線図、第２図は阻害因子に対
する安定性を示す線図、第３図は血栓溶解率を示す線図
、第４図は血中維持効果を示す線図、第５図はゲル淵過
のパターンを示す線図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ウロキナーゼをデキストランと化学的に結合させた
   水可溶性のウロキナーゼ・デキストラン結合物からなる
   ウロキナーゼ誘導体。 ２ デキストランの分子量が１０００〜２００万である
   特許請求の範囲第１項に記載のウロキナーゼ誘導体。 ３ ウロキナーゼが尿性又は培養腎組織由来である特許
   請求の範囲第１項に記載のウロキナーゼ誘導体。 ４ 組成比がデキストラン１ｍｇに対してウロキナーゼ
   １００〜１００００ＩＵである特許請求の範囲第１項記
   載のウロキナーゼ誘導体。