JPH0368522A

JPH0368522A - う蝕ワクチンの製造法

Info

Publication number: JPH0368522A
Application number: JP14118890A
Authority: JP
Inventors: Toshihiko Koga; 敏比古古賀; Nobuo Okabashi; 岡橋　暢夫; Ichiro Takahashi; 一郎高橋
Original assignee: KOKURITSU YOBOU EISEI KENKYUSHO; National Institutes of Health NIH
Current assignee: KOKURITSU YOBOU EISEI KENKYUSHO; National Institutes of Health NIH
Priority date: 1989-05-29
Filing date: 1990-05-29
Publication date: 1991-03-25
Anticipated expiration: 2015-09-18
Also published as: JP3089287B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産（」Ｊ１犯飛立夏− 本発明は、う蝕ワクチンの製造法および新規なストレプ
トコッカス・ミュータンスＧＳ−５変異株に関する。

丈来互技先ストレプトコッカス・ミュータンス・グループ（Ｓｔｒ
ｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　ｇｒｏｕｐ）は
、ヒトや動物におけろう蝕の最も重要な病原因子である
。

Ｓ、ｍｕｔａｎｓグループは、ＤＮＡの性状に基づき７
種の菌種に分けられ、ヒトのう蝕にもっとも関係の深い
Ｃ型Ｓ、ｍｕｔａｎｓは、その表層に血清型特異多糖抗
原、リポタイコ酸、タンパク質抗原など、さまざまな抗
原性を有する物質をもっている。

これらの菌体表層物質のなかで、特に分子量約１９万の
タンパク質抗原は、フィムブリエと呼ばれる微線毛状構
造物である（このうち、約２万は糖鎖である）。このタ
ンパク質抗原は、■／ＩＩ、Ｂ、ＰＬ、ＩＦなどとさま
ざまな名前で呼ばれており、統一されていない０本明細
書では、このタンパク質抗原をＰＡｃ（Ｈｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　５ｅｒｏｔｙｐｅ
　Ａ）と呼ぶ−このように、Ｓ、ｍｕｔａｎｓのタンパ
ク質抗原は、現在う蝕ワクチンとして最も注目されてお
り、特表昭５６−５０１３６４号公報には特定の性質を
示す抗Ｍｌ／Ｕをう蝕ワクチンとして使用することが報
告されている。また、特開昭５８−１６４５１８号公報
には、ストレプトコツカス属微生物の菌体の表層または
その抽出物を抗原とした虫歯予防用ワクチンが開示され
ている。

しかしながら、ＰＡｃをＳ、ｍｕｔａｎｓから抽出する
場合、Ｓ、＋ｎｕｔａｎｓを１（Ｍｌ培地で培養しても
数町しか回収できず実用上問題があった。また、培地中
のＰ　Ａ　ｃの濃度が低いため、不純物除去のための精
製作業に労力、時間も必要とした。

本発明者らは、Ｓ、ｍｕｔａｎｓのＰＡｃ発現遺伝子（
５狙遺伝子）を旦、セ旦（大腸菌）や互、ｍ１ｌｌｅｒ
ｉ（連鎖球菌の一種）に導入し、ｒＰＡｃを産生させた
が、異なった菌種に遺伝子を組み込んだため、産生量の
増大は認められず、また、菌体外にも遊離されなかった
。なお、ｒ　Ｐ　Ａ　ｃとは、遺伝子の組換え体によっ
て作られたＰ　Ａ　ｃ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＰＡ
ｃ）を指し、ＰＡｃと構造的に実質上同一のタンパク質
である。

さらに、本発明者らは、ＰＡｃの生物学的役割を明らか
にすべく、ｐａｃ遺伝子を大腸菌内でも連鎖球菌内でも
増殖できるプラスミド、−シャトルベクターにつなぎ、
これをＰＡｃを発現しないＳ、ｍｕｔａｎｓ　Ｇ　Ｓ　
−５株に導入したことを報告した（日本歯科評論、Ｊａ
ｎ、、１９８９．Ｎｎ５５５）、　（／かし、この０５
−５変異株では菌体へのＰｕ遺伝子の導入後５組み換え
菌からプラスミドが脱落することによってＰＡｃを産生
じなくなることがあったり、産生物の均一性にも問題が
あった。

が　　しよ　と　る本発明は、ＰＡｃの産生量の向上と精製作業の簡略化を
可能としたう蝕ワクチンの製造法、およびト旦遺伝子が
染色体遺伝子中に組み込まれたＳ、ｍｕｔａｎｓ　Ｇ　
Ｓ　−５変異株を提供するものである。

虎」し１４腹本発明のう蝕ワクチンの製造法は、口腔連鎖球菌ストレ
プトコッカス・ミュータンスの菌体表層または菌体外に
産生されるタンパク質抗原（ＰＡｃ）の発現遺伝子（Ｌ
狙遺伝子）を、ストレプトコッカス・ミュータンス０５
−５株の染色体遺伝子中に組み込んだ変異株を培養する
ことを特徴とする。

また、本発明の新規な菌株は、遺伝子工学によって作ら
れたものであって、Ｐｕ遺伝子が染色体中に組み込まれ
て形質転換され、ＰＡｃの産生能が増大したストレプト
コッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｍｕｔａｎｓ）　ＯＳ　−５（Ｋ　−３）［微工研条
寄第２４３７号］である。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

本発明では、宿主細菌としてＳ、ｍｕｔａｎｓ　Ｇ　Ｓ
−５株が用いられ、一方、ドナー細菌としてはＰ　Ａ　
ｃを産生しうるＳ、ｍｕｔａｎｓに属する菌株ならばい
ずれもが使用でき、ｃｌｎ清型、ｅ血清型、ｆ血清型な
どの菌株が好適である。このように、宿主細菌とドナー
細菌とを同一菌種に属する菌体とすることにより、産生
ずるｒＰＡｃの構造変化を極力抑えることができる。

Ｓ、ｍｕｔａｎｓ　Ｇ　Ｓ　−５は、ＰＡｃ非産生性の
公知のＳ、ｍｕｔａｎｓであり、大学等の各種研究機関
に保存されているものであるが、第三者の入手の便宜等
を考慮して微工研条寄第２４３６号（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　Ｇ　Ｓ　−５）として寄託
した。

ドナー細菌としては、ストレプトコッカス・ミュータン
ス（Ｓｔｒｅ　ｔｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）　Ｎ　
ＣＴ　Ｃ１０４４９、ストレプトコッカス・ミュータン
スＭＴ８１１、ストレプトコッカス・ミュータンスＩｎ
ｇｂｒｉｔｔ、ストレプトコッカス・ミュータンスＭＴ
６、ストレプトコッカス・ミュータンスＣ６７ストレプ
トコッカス・ミュータンスＭＴ１１８、ストレプトコッ
カス・ミュータンスＣ６７−１、ストレプトコッカス・
ミュータンスＯＭＺ７０、ストレプトコッカス・ミュー
タンスＭＴ６８０１．ストレプトコッカス・ミュータン
スＪＣＩ−５、ストレプトコッカス・ミュータンスＡ　
Ｔ　ＣＣ３３４７７、ストレプトコッカス・ミュータン
ス５ＥＩ１．ストレプトコッカス・ミュータンスＯＭ　
Ｚ　１７５、ストレプトコッカス・ミュータンスＭ　Ｔ
　５５７、ストレプトコッカス・ミュータンスＧＳ、ス
トレプトコッカス・ミュータンスＰＫ−３などが用いら
れる。

このようなドナー菌を用い、ＰＡｃをコードする遺伝子
を従来からの方法に従い、ストレプトコッカス・ミュー
タンスＧＳ−５株の染色体中に導入することにより、本
発明のストレプトコッカス・ミュータンスＧＳ−５（Ｋ
−３）が得れる。ここで、ベクター（Ｐ　Ａ　ｃを運ぶ
プラスミド）としてはシャトルベクターＰＳＡ３、ｐＶ
Ａ９８１などが、また、切断用の制限酵素としては、影
υＨ１、鋤■、シ佳■、彫工Ｒ１゜彫工Ｔ１４１．Ｈｉ
餅■、均匹Ｉ、影辺Ｉなどが用いられる。

本発明では、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）での測定による分子量が約１７万〜２
２万のタンパク質抗原（ＰＡｃ）をコードする遺伝子と
して、例えば下記に示す塩基配列の開始コドン（ＡＴＧ
）〜停止コドン（ＴＧＡ）までの１，５６５個のアミノ
酸（分子量約１７万）を実質的に含む部分をコードする
塩基配列またはその一部をあげることができる。さらに
、塩基配列の一部が他の塩基で置換されたものや一部を
欠落するものであってＰＡｃと実質的に同等の抗原性を
有するタンパクをコードする塩基配列も使用することが
できる。

（以下余白）０　−ｎ　ψ−１ψ　〜−。ト　旬閂ＯＩ＋１＋　叫〜　０１　の−ｌ”ｌト１−仇＋　　　
　　ＮＮｒ′ｌ　　　　　ｃｑ　　　　　ｗ　　　　　
ゴ←すｌ−１−＜４１−ＬｌＩｊ−イＣトＯ ○４１　　Ｕ−Ｕｌ：　　ＬＪ　−＜　−Ｕ１＋くの　
Ｌ）＜　　イト　ロイ　Ｕリ　ＬＩＩＬｏｌ−＜　　　
べ　　＋ｗ　　＜　−ｕＩ＋Ｈｅ　　ｔ−ｑ　　＜ｓ＜
　　　１−１−　　１−　　１ｊ−ト罐　ｕｚ＜ＮＬＩ
−イーＵ　　＜　　←　　）−Ｌｌ＜　　Ｕ＞　　＜１
−　　＜＜　　Ｌ）イ　ａａト　　　Ｑト　　　ト０＜ｕ　　Ｈａｓ　　ｌ−４Ｊ　　＜＞　　Ｉ＋Ｌ＋ｕ＝
＜＞Ｕ−＋ｔ＋　ａ−ロｕＨｂイー　リ＜　　Ｉ＋ＣＬ　　ｌｊロ　イの　（ＩすＩｌ
＋Ｍｌ−〜〜−＋−デ１す曝１ゝ１１−１〜−１’ｌ＆
ｒ喝ψτ１嗜ト喝　←Ｌ、＜：））−Ｌ　　Ｕｍ　　（
Ｊ：Ｉ　リ−Ｌ）−ＬＪＬＩＪ−＜＞　　＜　−＜ｋ　
　ＬＩ　−）−ＬＩ　　ＬＪ−ト４　１ＪＪ：Ｉｊ＜　
　ｓ＋−Ｌ：ｔ）　　１−１−　　ｕべ　ＬＩＪ　　”
べ　０〉　ベート４１１−喝　＋−Ｕｔ−＋−樗　Ｕｍ
　ト喝　べ−（−１−−ＬＪ　−ト＠　　ＩＪＪ：　　
Ｕ　−ＬＪ−Ｕ　−ＬＪ　−＜＞＜　−Ｌｊ＜　　Ｉｊ
＞　　＜）−Ｌｊ＜　　ｕ＜　　Ｌ）＜　　Ｌ）＜　　
＜−＜り　−ｃｓ　　＋ｗ　　Ｌ）：Ｉｔ−ｃＬＩ−ｅ
　　ｈＣａり　トロイー　＜ｋ　　Ｌ）ｌ−←Ｕ＜Ｈイ
ー　イ１１１＋ｕｕ−（ｊロ　＜Ｊ　　Ｌｌ＜　　ｌ−
Ｊ　　Ｌ）＜　　＜＜　　べく　　）−Ｊ　　ｌ、）＜
トＣ＜哨　←’　　”ｌ　　ｈ−＜４　　）−４Ｊ　　
Ｕｍ　　Ｕｃ＜＃Ｉ＜ｈ　　＜＞　　Ｕ　−＋４　０−
　　）−−（ｋ　　＜”イ（べ一　Ｉ−Ｗ　　ａ＜　　
リ＞　　Ｑ＜　　イー　ベ一　く（リー　（−イー　ト
ク　ＬＪＣＬ　　−ｃ＋ａ　　＜り　ａｍａ−＜ｕａＬ
＋　ｌ−５ｕ−＋ｖ＜−イｈ　←〜　ｕ−ｈｓ＜ｈｕ＜
　　ｔｘ＞　　ａ＜　　ＬＪＪ　　Ｌ）べ　（、Ｊ　　
）−、Ｊ　　Ｌ）ベ　リンへ」トＩ＋Ｉ＋ＣＩ＋１＋Ｉ
＋Ｃ＜−トし　ｌ−’Ｉ　　１−ｉ−＜＋ＡＵｔ：　　
　＜ｗａ　　　ＬＪＪ：　　　＜ＩＩＩＵＥ　　　イ＞
　　　Ｌｌ−＜＞　　　（ｋ＜）−＜＜　　＜１−　　
＜＜　　＜１−　　トド　Ｌ）＜　　１−１−　　＜Ｊ
本発明のＧＳ−５（Ｋ−３）株では、ト旦遺伝子がＧＳ
−５株の染色体中に組み込まれていることから、ト旦遺
伝子が脱落しに＜＜、また、ｒ　Ｐ　Ａ　ｃ産生能が高
く、ｒ　Ｐ　Ａ　ｃが菌体外に産生される。

菌株の染色体ＤＮＡ中の匡遺伝子の存在部位は、サザン
プロット法などで確認できるので、このような菌株を採
取し、培養することにより。

ｒ　Ｐ　Ａ　ｃが効率よく得られる。また、培養上滑中
のｒＰＡｃ含量が非常に高いため、精製操作は大変簡略
化される。得られたｒＰＡｃは、種々の形態でう蝕ワク
チンとして使用することができる。

本発明のＳ、＋＋＋ｕｔａｎｓ　Ｇ　Ｓ　−５（Ｋ　−
３）株の培養は、例えば次のようにして行うことができ
る。

３７ｇのプレインハートインフュージョン培地をＩＱの
蒸留水に溶解し、１２１℃にて２０分間滅菌した後、あ
らかじめ濾過滅菌しておいた５　ｍｇ／ｍ　Ｑのエリス
ロマイシンを１ｍｆｌ加え、混合する。同培養液各１０
ｍｆｌを２４ｍ　Ａの滅菌試験管に分注したものに、Ｇ
Ｓ−５（Ｋ−３）株を接種し、該培養液を３７℃で１８
時間培養し、種培養液を調製する。該種培養液１００ｍ
　Ｑを同じ組成の培地ＩＱの入った２Ｑの坂ロフラスコ
に加え、３７℃で１８時間培養して微生物液を得る。同
微生物液を１０，０ＯＯＸ工で１５分間遠心分離し上清
を得る。

また、培養上清からの精製法としては、デキストラン系
、アガロース系等のゲルｒ過法、ＡＥ、ＤＥＡＥ、ＱＡ
Ｅ、ＣＭ、ＳＰ、フォスフォ等を用いたイオン交換法、
オクチルセファロース、フェニルセファロース等を用い
た疎水性クロマト法、アフィニティクロマト法などが用
いられる。

得られたう蝕ワクチンは、経口、皮下注射等の方法で投
与される。投与量は、１０μｇ〜５０ｍｇ程度が好適で
あり、好ましくは１０μｇ〜１０ｍｇであり、ｌｌ１ｇ
が最適である。

ストレプトコッカス・ミュータンスＧＳ−５（Ｋ−３）
［微工研条寄第２４３７号］の菌学的性状は次の通りで
ある。この菌学的性質および分類方法は、　Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、２（１９８６）に
準じて行った。

Ａ、形態学的性質プレインハートインフュージョン培地で３７℃にて２日
間培養したとき、以下の形態的特徴がａ察される。

１）細胞の形および大きさ：球菌、０．５〜０．７５μｍ、連鎖を形成。

２）多形性：なし。

３）運動性：なし。

４）胞子：なし。

５）　ダラム染色性：陽性。

６）抗酸性：陰性。

Ｂ、培養的性質１）　プレインハートインフュージョン寒天平板培養：ｐＨ７，０〜７．４にて生育して、円形、偏平状、金縁
のコロニーを形成する。該コロニーの表面は滑らかで光
沢有り、黄白色あるいは淡褐色。

２）　プレインハートインフュージョン寒天斜面培養：ｐＨ７，０〜７．４にて拡布状に生育し、光沢の有る黄
白色あるいは淡褐色。

３）　プレインハートインフュージョン液体培養：ｐ）１７．０〜７．４にて生育するが、菌膜は形成せず
、均一な濁度を形成。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

５）　リドマス・ミルク：良く成育し、酸を産生じ、ミルクを凝固する。

Ｃ１生理的性質硝酸塩の還元：陰性。

脱窒反応：陰性。

ＭＰテスト：陽性。

ＶＰテスト：陽性。

インドールの生成：陰性。

硫化水素の生成：陰性。

７）デンプンの加水分解：陰性。

８）　クエン酸の利用：１（ｏｓｅｒの培地とＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地で
利用しない。

９）無機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニウム塩を利用しない。

色素の生成：＃ｉ性。

ウレアーゼ：陰性。

オキシダーゼ：陰性。

カタラーゼ：陰性。

生育の範囲３３℃から３８℃（３７℃がもっとも良好）。

ｐＨ６，０〜７．４で生育。

酸素に対する態度：通性嫌気性。

０−Ｆテスト：陽性。

糖からの酸およびガス産生：Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ −フラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、
乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット
から酸を産生ずるが、ガスは生成しない。Ｌ−アラビノ
ース、Ｄ−キシロース、イノジット、グリセリン、デン
プンからは酸もガスも生成しない。

Ｄ、　その他の性質１）　アルギニンの分解：陰性。

２）溶血性：γ溶血。

３）液化ナトリウムの耐性：４％塩化ナトリウムに耐性。

４）　その他、必要と認められる性質二二スクリンを加
水分解し、２単位／　ｍ　ｎのバシトラシンに耐性。イヌリン、Ｄ
−ラフィノース、Ｄ−メリビオースから酸を産生ずる。

ショ糖からグルカンを合成する。

以上の性質を総括すると、イヌリン、Ｄ−ラフィノース
、Ｄ−メリビオース、Ｄ−ソルビットから酸を産生じ、
アルギニンを加水分解しない、バシトラシン耐性のダラ
ム陽性の連鎖球菌であることにより、５ｔｒｅ　ｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ（ストレプトコッカス・ミュ
ータンス）である。

見里旦塾果本発明によれば、ト旦遺伝子を染色体遺伝子中に組み込
んだストレプトコッカス・ミュータンスＧＳ−５変異株
を培養することにより、高い産生量で安定してｒ　Ｐ　
Ａ　ｃを得ることができ、精製操作も簡便である。この
ような遺伝子組み換え菌の１つとして、ストレプトコッ
カス・ミュータンスＧＳ−５（Ｋ−３）が、微工研条寄
第２４３７号として、工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研：　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）に寄託されている。

失−笈一盟（１）当遺伝子の０Ｓ−５株への導入５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　Ｎ　ＣＴ
　Ｃ１０４４９のｇを有するプラスミドｐＰＣ７７およ
びシャトルベクターＰＳＡ３を制限酵素ＢａｍＨＩとｓ
ｐｈ　１でそれぞれ切断する。切断されたｐＳＡ３とｐ
ＰＣ７７をＴ４　　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、得
られたプラスミドをＥ、　ｃｏｌｉ　８８１０１株（国
立遺伝学研究所、保存機関番号：ＭＥ８５６８）に形質
転換法で導入して、クロラムフェニコール耐性、アンピ
シリン感受性、テトラサイクリン感受性のクローンを選
択した。

コロニーイムノプロット法およびウェスタンプロット法
でＰ　Ａ、　ｃを産生じていることが確認されたクロー
ンの中から組換えプラスミドを抽出し、アガロース電気
泳動でその大きさを確認したところ、いずれのクローン
も１６．４ｋｂの組換えプラスミドを有していた。これ
らのプラスミドの１つをＫと命名し、本プラスミドをエ
レクトロポレーション法でＰ　Ａ　ｃ非産生Ｓ、ｍｕｔ
ａｎｓ　Ｇ　Ｓ　　５株に導入し形質転換した。得られ
たＰＡｃ産生株をＱＳ−５（Ｋ−Ｘ）と命名した。

この操作によりＯ３−５（Ｋ−Ｘ）株は複数得られたが
、それぞれのＰ　Ａ　ｃの産生能は異なっていた。この
中でＰ　Ａ　ｃ産生能の優れた菌株ＧＳ−５（Ｋ−３）
およびＰＡｃを生産するが先の株はど優れていない菌株
ＧＳ−５（Ｋ−９）について、思の組込み部位を確認し
た。

（２）　ト旦遺伝子の組込み部位の確認０８−５株およ
び形質転換により得られたＧＳ−５（Ｋ−３）株をリゾ
チームで溶菌し。

さらにプラスミドと染色体ＤＮＡの分離操作を行なった
。分離したプラスミド画分をアガロース電気泳動したと
ころ、第１図に示す通りＧＳ−５株およびＧＳ−５（Ｋ
−３）株の本画分中にプラスミドは存在しなかった。一
方、ＧＳ−５（Ｋ−９）株の画分中にはプラスミドが認
められた。

また、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断後、常法により
サザンプロット分析を行なった。

エリスロマイシン耐性遺伝子のＢａｍＨＩフラグメント
をプローブとして用いたところ、第２図に示すように、
ＧＳ−５株およびＧＳ−５（Ｋ−９）株の染色体ＤＮＡ
は反応性を示さなかったのに対して、Ｏ３−５（Ｋ−３
）株の染色体ＤＮＡの約１６ｋｂフラグメントが反応性
を示した。

これらの知見より、ａｓ−５（Ｋ−３）株において、プ
ラスミドル８Ｍ１は相同組換えの結果ＧＳ−５株の染色
体ＤＮＡ中に組み込まれたことが確認された。一方、Ｐ
Ａｃは産生ずるものの、先の０Ｓ−５（Ｋ−３）株はど
の産生能がないＧＳ−５（Ｋ−９）株は、Ｌ狙遺伝子が
プラスミド中に存在し、染色体中にト！遺伝子を見い出
すことができなかった。

サザンプロット分析については、Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈａｒｎ　（１９７５）　：　Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｕａｎｃ
ｅｓ　ａｍｏｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓｓｅｐ
ａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ　Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　９８，５０３−５１７に詳記されている
。

（３）培養およびｒ　Ｐ　Ａ　ａ　（ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ　ＰＡｃ）の精製Ｓ、ｍｕｔａｎｓ　Ｇ　Ｓ　−５（Ｋ　−３）株をＴＴ
ＹブロースまたはＢＨＩブロースの透析外液で培養後、
培養上清を硫酸アンモニウム６０％飽和源度にて塩析し
、沈査を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５に溶解
、透析して、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
スカラムに本標品を流す。同緩衝液をカラムに２ベツド
体積流した後、０モルから０．５モルまでのＮａＣ１濃
度勾配溶出を行なう、その結果、Ｎ　ａ　Ｃｌが０．２
モル付近でｒ　Ｐ　Ａ　ｃが溶出する。この溶出画分は
そのままｒＰＡｃの精製標品として使用可能である。Ｇ
Ｓ−５（Ｋ−３）株では、培養上清中のｒＰＡｃ含量が
非常に高いため、精製操作はこのように大変簡略化され
る。

これらのｒＰＡｃは、種々の形態でう蝕ワクチンとして
使用される。

また、同様にし、てＮ　ＣＴ　Ｃ１０４４９株、ＧＳ−
５株、ＧＳ−５（Ｋ−９）株を培養し、培養上清中に産
生されたＰＡｃを精製し、その量を蛋白量を基準として
ローリ−法により測定し、相対値として下記表−ｌに示
した。本発明のＧＳ−５（Ｋ−３）株により、著しく産
生量が増大することが判る。

（以下余白）（４）ｒＰＡｃによる免疫実験表−２の組成物をＰＢＳに溶解し、この０．１ｍＱをマ
ウス１群５匹に対して、ＩＯ日間隔で腹腔内に注射し、
２回免疫した。２回目の投与の７日後にマウスより採血
し、ｒＰＡｃに対する血中抗体価を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。その結果を表−２
に示す。なお、抗体価は得られた血清を１７１０希釈し
た後さらに倍々希釈したときにＥＬＩＳＡ法で反応性を
示す血清の希釈の逆数で表わした。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミド分画のアガロース電気泳動を示す図
である。第２図は”Ｐｓｍエリスロマイシンシン遺伝子ＢａｍＨ
Ｉフラグメントプローブを用いた染色体ＤＮＡのサザン
プロット分析結果を示す図である。第１図　３４プラスミド画分のアガロ−入電気泳動レーン１ニブラスミドρＳＭＩ（環状プラスミド）レー
ン’ｌ：　ＧＳ−５３のプラスミド画分レーン３　：　
ＧＳ−５　　（Ｋ〜３）棟のプラスミド画分レーン４　
：　ＧＳ　−５（’に−９）株カブラスミド画分第２３２ｐｇＱ二リスロマイシン耐性遺伝子５ａｓ＋ＨＩフラグメンドブＯ−べ全周いた染色体ＤＩＪＡのサザノプ口−７）−骨材レーン１　：　ＧＳ−５ａ寮色体ＤＮＡのベミＦｉＩ断片ｖ　−７２：　ＧＳ−５（ＧＳ−５（Ｋ−３）ａ＾のも
ヱＲ１断片レーン３　：　ＧＳ−５（に−９）衣染色体ＯＮＡのも
逓Ｒｒ断片

Claims

【特許請求の範囲】１、口腔連鎖球菌ストレプトコッカス・ミュータンスの
菌体表層または菌体外に産生されるタンパク質抗原の発
現遺伝子を、ストレプトコッカス・ミュータンスＧＳ−
５株の染色体遺伝子中に組み込んだ変異株の培養により上記抗原を
製造することを特徴とするう蝕ワクチンの製造法。２、前記タンパク質抗原が、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法での測定による分子量が約１７万〜２２
万のものである請求項１記載の製造法。３、前記変異株が微工研条寄第２４３７号として寄託さ
れたストレプトコッカス・ミュータンスＧＳ−５（Ｋ−
３）株である請求項１または２に記載の製造法。４、口腔連鎖球菌ストレプトコッカス・ミュータンスの
菌体表層または菌体外に産生されるタンパク質抗原の発
現遺伝子が染色体中に組み込まれ、該タンパク質抗原の
産生能を有するストレプトコッカス・ミュータンスＧＳ −５（Ｋ−３）。