JPH0368594A - ポリヌクレオチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はポリヌクレオチドの製造法に関し、更に詳細に
は遺伝子組換え材料として有用なポリヌクレオチドの新
規な化学合成法に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

近年の分子生物学、とりわけ遺伝子ｍ換え技術の進歩は
めざましいが、それに伴ない遺伝子の化学合成の重要性
も増大しつつある。従来、遺伝子、すなわちポリヌクレ
オチドの合成法としてはリン酸ジエステル法Ｃ）Ｉ、　
Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ；　ｒｓｏｍｅ　ＲｅｃｅｎｔＤ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅａｓｔｅｒｓ　ｏｆ
　８ｉｏ１ｏｇｉｃａｌ　ｒｎｔｅｒａｓｔＪ、　Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　５ｏｎｓ、　　Ｉｎｃ、、　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６１））が広く知られている
が、縮合反応に長時間を要し、分離も困難であるという
欠点があった。

リン酸ジエステル法の改良法として、リン酸トリエステ
ル法、ホスファイト法［Ｒ，Ｌ。

Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、　　Ｗ、　　Ｂ、　　Ｌｕｎ５ｆ
ｏｒｄ；　　Ｊ、　Ａ＋ｎ、　Ｃｈａｍ、　　Ｓａｃ、
。

９８、３６５５　（１９７６）　）　、ホスホロアミダ
イト法［５゜し、　　　Ｂｅａｕｃａｇｅ、　　　Ｍ、
　　　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ；　　Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎＬｅｔｔ、　、　２２．１８５９　（１９８１）
　）などが報告されている。

ところでヌクレオシド亜リン酸エステルを原料として用
いる、いわゆるＨ−ホスホネート法［８，Ｃ，Ｆｒｏｅ
ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｄ、Ｍａｔｔａｕｃｃｉ；Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２７．４６９　
（１９８６）及びＰ、　Ｊ。

Ｇａｒｅｇｇ、　Ｔ、Ｒｅｇｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｓｔａ
ｗｉｎｓｋｉ、　ａｎｄ　Ｒ。

Ｓｔｒ６ｍｂａｒｇ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌａ
ｔｔ、、　２７．４０５５（１９８６））は反応時間が
短く、ヌクレオシド亜リン酸エステルユニットが化学的
に安定で、さらにリン酸の保護基を必要としないため、
精製が容易であるなどの利点がある。

しかし、このＨ−ホスホネート法は、使用されている縮
合剤ピバロイルクロライドが溶媒中で不安定であること
、副反応が生起することなどの欠点があった。

従って、種々の利点を有するＨ−ホスホネート法をさら
に改良したポリヌクレオチドの製造法の開発が望まれて
いた。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情に鑑み本発明者らは、前記課題を解決すべく
種々検討した結果、Ｈ−ホスホネート法においてヌクレ
オシド亜リン酸エステルの縮合剤として特定のイミダゾ
リウム化合物を用いれば、副反応が生起することなく、
極めて高収率でポリヌクレオシド亜リン酸エステルが得
られること、さらにこれを酸化すればポリヌクレオチド
も効率よく製造できることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は次の一般式（１，）以下余白 （ＩＩＩ） Ｘ 〔式中、Ａはピリミジン塩基又はプリン塩基を示し、Ｒ
′はヒドロキシ基の保護基又はモノもしくはポリヌクレ
オシド亜リン酸エステル残基を示し、Ｒ２は水素原子又
はカチオン性基を示す〕で表わされるヌクレオシド亜リ
ン酸エステル誘導体（以下Ｈ−ホスホネートユニットと
略す）と次の一般式（ＩＩ） 〔式中、Ｒ４及びＲｓは低級アルキル基を示し、Ｘ及び
Ｙはハロゲン原子を示す〕 で表わされるイミダゾリニウム化合物の存在下に反応さ
せることを特徴とする一般式（ｒＶ）〔式中、Ｂはピリ
ミジン塩基又はプリン塩基を示し、Ｒ３はヒドロキシ基
の保護基又はモノもしくはポリスクレオシド亜リン酸エ
ステル残基を示す〕で表わされるヌクレオシド類とを、
次の一般式〔式中、Ａ　ＳＢ　ＳＲ’及びＲ１は前記と
同じ意味を有する〕 で表わされるポリヌクレオシド亜リン酸エステル類の製
造法、並びに当該縮合反応を利用したポリヌクレオチド
の製造法を提供するものである。

本発明は次の反応式で示される。

〔式中、Ｒ１−Ｒ５，＾、８、ｘ及びＹは前記と同じ意
味を有する〕 本発明方法の原料であるＨ−ホスホネートユニット（１
）において、Ａはピリミジン塩基又はプリン塩基であり
、具体的にはアデニン、グアニン、シトシン又はチミン
を示す。Ｒ’で示されるヒドロキシ基の保護基としては
、一般にポリヌクレオチドの合成において用いられるヒ
ドロキシ基の保護基であればいずれも用いることができ
るが、ジメトキシトリチル基、９−フルオレニルメチル
オキシカルボニル基、レブニリル基等が好ましい。また
、Ｒ２で示されるカチオン性基としては、トリエチルア
ミン、１，５−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク
−５−エン（ＯＢｔｌ）、等の三級塩基が挙げられる。

式（Ｉ）のＨ−ホスホネートユニットは、例えば５′位
を保護したヌクレオシドにトリス（１，ｌ、　１゜３、
３．３−ヘキサフルオロ−２−プロポキシ〉ホスフィン
、ビス（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフ
ィン、ビス（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ〉クロロホスフィ
ン等のホスフィン類を反応させることによって製造する
ことができる。

本発明方法の他方の原料であるヌクレオシド類（ＩＩ）
においてＢで示されるピリミジン塩基、プリン塩基の例
としては前記＾と同様のものが挙げられる。またヒドロ
キシ基の保護基としては、−般にポリヌクレオチドの台
底において用いられる保護基及び固相担体が挙げられる
。固相担体としては、ポリスチレン、ポリジメチルアク
リルアミド、ポリアクリルモルホリド、シリカゲル、多
孔質ガラスピーズ等が挙げられる。なお、かかる固相担
体との結合にあたっては通常コハク酸エステル等の架橋
剤を介して結合される。

固相担体として多孔質ガラスピーズを用い、架橋剤とし
て無水コハク酸を用いた場合のモノヌクレオシド類（Ｉ
Ｉ）は、例えば５′位保護ヌクレオシドに無水コハク酸
を反応させ、得られた５′位保１ｉｉ−３’　−〇−サ
クシニルヌクレオシドと多孔質ガラスピーズをジシクロ
カルボジイミド、トリエチルアミン及びジメチルアミノ
ピリジンの存在下に反応させることにより得られる。

また本発明に用いられる縮合剤であるイミダゾリニウム
化合物（ＩＩＩ）は、例えば入手容易な溶剤として知ら
れている次の一般式（Ｖ） （式中、Ｒ４及びＲ５は前記した意味を有する）で表わ
される１、３−ジアルキル−２−イミダゾリジノンにハ
ロゲン化剤を反応せしめることにより製造される。

ここで使用されるハロゲン化剤としては、オキザリルハ
ロゲニド、三ハロゲン化リン、五ハロゲン化リン、オキ
シハロゲン化リン、ホスゲン、トリクロロメチルクロロ
ホルメート等が挙げられる。

反応は１．３−ジアルキル−２−イミダゾリジノン又は
ハロゲン化剤の何れか一方を四塩化炭素等の適当な溶媒
に溶かしておき、これに他方を少量ずつ添加し、更に、
室温ないし７０℃で数時間〜十数時間反応させることに
よって行われる。

斯くして得られる１、３−ジアルキル−２−ハロゲノ−
イミダゾリニウム・ハロゲニドは単離することもできる
が、単離することなく、その反応液を本発明の縮合反応
に使用することもできる。

本発明を実施例するにはヌクレオシド類（Ｉｆ）に対し
て、Ｈ−ホスホネートユニット（Ｉ）を１〜５０倍モル
用いイミダゾリニウム化合物（ＩＩＩ）１〜２５０倍モ
ルの存在下に数分〜数十分縮合反応させればよい。反応
温度は室温が好ましく、反応溶媒としてはアセトニトリ
ル、ピリジン、これらの混合溶媒などを用いるのが好ま
しい。

かかる縮合反応を順次繰り返すことにより得られるポリ
ヌクレオシド亜リン酸エステルを常法に従い、酸化せし
めればポリヌクレオチドを製造することができる。

ポリヌクレオチドの製造にあたっては、前述のポリヌク
レオシド亜リン酸エステルの合成は固相で行うのが好ま
しい。固相担体上のポリヌクレオシド亜リン酸エステル
の酸化は例えばテトラヒドロフラン−ピリジン−水中で
ヨウ素を反応させることにより行うことができる。さら
に固相担体上のポリヌクレオチドを脱離するにはアルカ
リ、例えばアンモニア水等により処理すればよい。なお
、かかるポリヌクレオチド合成は市販のＤＮＡ合戒台底
利用するのが好ましい。

得られたポリヌクレオチドを精製するには、例えば、イ
オン交換もしくは、逆相シリカゲル高速液体クロマトグ
ラフィー等を利用するのが好ましい。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発明
はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

実施例１ （１）５’−〇−ジメトキシトリチルデオキシリボヌク
レオシドの製造： チミジン（１０ｍＭ、　２．４ｇ）に少量の無水ピリジ
ンを加え減圧乾固する。この操作を３回繰り返し脱水し
た後、無水ピリジン（５０−）に溶かし、ジメトキシト
リチルクロライド（１２ｍＭ、　４．１ｇ）を加え、室
温で３０〜６０分ごとにＴＬＣにより検索し原料のチミ
ジンのスポットが消失するまで反応させた。この反応溶
液に氷水を注ぎ、塩化メチレンで抽出し有機層を水で数
回洗浄した後、硫酸ナトリウムで脱水し、これを濾別除
去し有機層を減圧Ｓ縮した後、残渣を少量の塩化メチレ
ンに溶かし５〜１０％エーテル−ヘキサン溶液により再
沈澱させると５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン（
ｄ−ＤＭＴｒＴ）の白色結晶（８，８ｇ、　１　ａｄ、
　　８０％ンが得られた。

（２）　　デオキシリボヌクレオチド−３’　−Ｈ−ホ
スホネートの製造： ５′−ジメトキシトリチルチミジン（ＤＭＴｒＴ）（３
，５ｍＭ、　１．９２ｇ）に少量の無水ピリジンを加え
、３回減圧乾固し脱水する。これに無水ピリジン（１７
，５ｍＭりを加え、無水トリエチルアミン（３１，５ｍ
Ｍ、　４．４ｍｔ’　）を加えさらにトリス（１，１，
１，３゜３．３−ヘキサフルオロ−２−プロポキシ）ホ
スフィン（１０，５ｍＭ、　３．１２ｍ１！　）を加え
窒素雰囲気下、室温で３０分ごとにＴＬＣにより検索し
反応終了後０．１Ｍ１．５−ジアザビシクロ［５，４，
０］ウンデク−５−エン（０８０）水溶液で加水分解し
、塩化メチレンで３回抽出し有機層を０゜１Ｍトリエチ
ルアンモニウムビカーボネート（ＴＢＡＢ）　：　）リ
エチルアミン（Ｂｔ、Ｎ）＝　５０　：　１　（Ｖ／ｖ
）、　０．　ＩＭ　ＴＢＡＢ’？’順次５〜ｌｏ回洗浄
を行った。この時、水層に対してＴＬＣにより時々検索
しホスホネートユニットが残っていないかを確める。洗
浄が終わった後、有機層を減圧濃縮し、最後にこれを２
％ＢｔａＮを含む塩化メチレンの溶出液でシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにまり単離精製したところ、目
的とするヌクレオシド−Ｈ−ホスホネートのＤＢｔｌ塩
（３，０３ｍＭ、　　８７％、　２．３０６ｇ　）が得
られた。

（３）デオキシリボヌクレオシド−Ｈ−ホスホネートジ
エステルの製造： （２）で得られた５′−ジメトキシトリチルチミジン−
３′−Ｈ−ホスホネートの０８０塩１ｍｍｏｆ、３′−
〇−ベンゾイルチミジン１．１ｍｍｏ　！、および１゜
３−ジメチル−２−クロロ−イミダゾリニウム・クロラ
イド２．０ｍｍｏ　１をアセトニトリル−ピリジン（１
：１）溶媒中で、室温でＩＯ分攪拌した。反応を３ＩＰ
−ＮＭＲでモニターしたところ、原料であるＨ−ホスホ
ネートのシグナルが完全に消失し、新しいシグナルが８
．２１と７．２０ｐｐｍに現われ、デオキシリボヌクレ
オシド−Ｈ−ホスホネートジエステルの生成を確認した
。

実施例２ （１）　　コントロール・ボア・グラス（ＣＰＧ）への
ヌクレオシドの導入 ｌ）５′−〇−ジメトキシトリチルー３’　−０−サク
シニルチミジンの合成 ５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン（ＤＭＴｒＴ）
　（１０ｍＭ、　５．４４ｇ）を少量の無水ピリジンに
より脱水を行い、これに無水ピリジン（３０Ｔｎｌ）　
、　ジメチルアミノピリジン（１５ｍＭ、　１．８ｇ）
。

無水コハク酸（１５ｍＭ、　１．５ｇ）を加え、室温下
で５時間攪拌し、ＴＬＣによりＯＭＴｒＴのスポットが
消えるまで反応させた。反応終了後、これを減圧濃縮し
塩化メチレン（１００ｍｇ）で抽出して５％炭酸す）　
ＩＪウム水溶液で３回、水で３回洗浄し硫酸す）　ＩＪ
ウムで脱水する。これを減圧濃縮してピリジン臭を完全
に抜き再沈澱（５％エーテルへキサン溶液）を行った結
果、目的とする５′−〇−ジメトキシトリチルー３′−
〇−サクシニルチミジン（ＤＭＴｒＴＣＯ（ＣＩ（−）
　＊Ｃ００Ｈ）が５０％の収率で得られた。

１ｆ）ＣＰＧへの導入 初めに減圧乾固したアルキルアミノＣＰＧ（ｒアミノプ
ロピルＣＰＧ　ＡＭＰＯ［ｌ　５００ＢＪ　、ＢＬＢ（
’ＴＲ０−ＮｔＪＣＬＢＯＮＩＣＳ社、　　１．５ｇ）
に５′−〇−ジメトキシトリチルー３′−〇−サクシニ
ルチミジン（１，４ｍＭ。

１、２０４ｇ）とジクロロカルボジイミド（７ｍＭ。

１．４４２ｇ）　、無水トリエチルアミン（１，４ｔｎ
Ｍ、　０．１９６−）、無水ジメチルホルムアミド（７
ｍＭり、　　ジメチルアミノピリジン（数片）を加え、
室温下でアジテータ−を用いて１２時間反応させた。反
応終了後、ヌクレオシドを担持させたＣＰＧを無水ジメ
チルホルムアミド、ピリジン、メタノール、無水エーテ
ルで順に洗浄し、減圧乾固させた。これを少量測りとり
、過塩素酸を加えジメトキシトリチル基を除去し、この
トリチルカチオンの比色定量を行なった結果、目的とす
るヌクレオシドが担持量３９μＩＩＩｏ１／ｇ導入され
ていることを確認した。

これを無水酢酸：ピリジン＝　１　：　９　（Ｖ／Ｖ）
と数片のジメチルアミノピリジンにより１時間キャッピ
ングすることによりアルキルアミノ基の未反応の部分を
アシル化した。

（２）　ｄ−Ｔｐｌ　４Ｔの台底 グラスフィルターのついた内径１５開のガラス反応管に
チミジンが導入されたＣＰＧ（２８■）を入れ、初めに
ＣＰＧのキャッピングを行う。無水酢酸：ルチジン：Ｔ
ＨＦ＝１０：１０：８０と７％ジメチルアミノピリジン
のテトラヒドロフラン溶液を各ＩＷＬｌ加え３０分間反
応させた。反応後無水アセトニトリルで洗浄した。次に
２．５％ジクロロ酢酸の塩化メチレン溶液でジメトキシ
トリチル基を完全に除去し、塩化メチレン、無水アセト
ニトリルで順次洗浄し１０分間減圧乾固させた。減圧乾
固後、Ｈ−ホスホネートユニット（５５μｍｏ１゜５０
ｅｑ）　、１．　３−ジメチル−２−クロロ−イミダゾ
リニウム・クロライド（１３７，５μｍ０１゜１２５　
ｅｑ）を１ｍｌの無水アセトニトリル：無水ピリジン＝
　１　：　１　（Ｖ／Ｖ）に溶かし、１ｏ分間反応させ
た。反応後、無水ジメチルホルムアミド、無水アセトニ
トリル：無水ピリジン＝　１　：　１　（Ｖ／Ｖ）、無
水アセトニトリル、塩化メチレンの順で３〜５回洗浄を
行った。この一連の操作を１４回繰り返しｄ−ＤＭＴｒ
Ｔｐ　ｒ　＜Ｔｏ／ＸＡＪＣＰＧを合成した。各縮合収
率は過塩素酸：エタノール＝　３　：　２　（Ｖ／Ｖ）
によりトリチルカチオンの発色（Ｌｓ’ｔ）を可視スペ
クトルにより比色定置し求めた。その結果を表１に示す
。

以下余白 （３）　　ｄ−ＴＰ、ＴＯ〜〜ＣＰＧの酸化・脱離・精
製・構造確認 ｄ−Ｔｐ　＋　ａＴｏＮＸＪｃＰＧの酸化は、Ｏ，１Ｍ
ヨウ素のテトラヒドロフラン：ピリジン：水＝４４　：
　３　：　３溶液で室温下１時間行なった後、無水アセ
トニトリルで洗浄を行った。これによりホスホネートを
ホスフェートへと酸化した。さらに２８％アンモニア水
により室温下で３０分間反応させ、生成物をＣＰＧから
脱離した。これを２０％アセトニトリルを含むギ酸アン
モニウム水溶液（ｐＨ６，８）　（ＯＪ８〜０、９４Ｍ
）のグラジェント溶媒を用いてイオン交換）ＩＰＬＣ（
ＴＳＫ　ｇｅｔ　ＤＲＡＢ−２３Ｗ）にまり単離精製を
行った。

その結果２０分付近に目的物であるｄ−’ｒｐ１４Ｔが
（１００口）得られた。この目的物を２０％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により確認したところ比較のオリ
ゴチミジンと一致することから目的とするｄ−ＴＰ、Ｔ
であることを確認した。

実施例３ Ｈ−ホスホネートユニットを３０　ｅｑ、用い、１゜３
−ジメチル−２−クロロ−イミダゾリニウム・クロライ
ドを１５０　ｅｑ、用いる以外は実施例２と同様にして
ｃ＋−’ｒｐ　ｌ　４Ｔの合成を行った。この場合の収
率を表２に示す。

さらに、実施例２の（３）と同様に酸化を行い、ｄ−Ｔ
ｐ　ｔ　ａＴが（２゜５０Ｄ）得られた。

以下余白 実施例４ Ｈ−ホスホネートユニットを４０　ｅｑ、用い、１゜３
−ジメチル−２−クロロ−イミダゾリニウム・クロライ
ドを１００　ｅｑ、用いる以外は実施例２と同様にして
ｄ−ＴＩ’＋＊Ｔの合成を行った。この場合の収率を表
３に示す。

さらに実施例２の（３）と同様に酸化を行い、ｄ−Ｔｐ
＋ｍＴが（１８００）得られた。

以下余白 〔発明の効果〕 叙上の如く本発明によればＨ−ホスホネート（１）とヌ
クレオシド類（ＩＩ）の縮合反応を、多くの有機溶媒に
可溶で、かつ安定なイミダゾリニウム化合物（ＩＩＩ）
を用いることにより、短時間でかつ副反応を生起するこ
となく高収率で行うことができる。従って本発明方法は
遺伝子の合成、特に固相上でのＯＮ八へ台底極めて有用
である。また、この方法は自動合成機にも応用すること
ができる。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、Ａはピリミジン塩基又はプリン塩基を示し、Ｒ
   ＾１はヒドロキシ基の保護基又はモノもしくはポリヌク
   レオシド亜リン酸エステル残基を示し、Ｒ＾２は水素原
   子又はカチオン性基を示す〕で表わされるヌクレオシド
   亜リン酸エステル誘導体と次の一般式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中、Ｂはピリミジン塩基又はプリン塩基を示し、Ｒ
   ＾３はヒドロキシ基の保護基又はモノもしくはポリヌク
   レオシド亜リン酸エステル残基を示す〕で表わされるヌ
   クレオシド類とを、次の一般式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中、Ｒ＾４及びＲ＾５は低級アルキル基を示し、Ｘ
   及びＹはハロゲン原子を示す〕 で表わされるイミダゾリニウム化合物の存在下に反応さ
   せることを特徴とする一般式（IV） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 〔式中、Ａ、Ｂ、Ｒ＾１及びＲ＾３は前記と同じ意味を
   有する〕 で表わされるポリヌクレオシド亜リン酸エステル類の製
   造法。 ２、ヌクレオシド亜リン酸エステルを順次縮合させ、得
   られたポリヌクレオシド亜リン酸エステルを酸化せしめ
   るポリヌクレオチドの製造法において、ヌクレオシド亜
   リン酸エステルの縮合反応を次の一般式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中、Ｒ＾４及びＲ＾５は低級アルキル基を示し、Ｘ
   及びＹはハロゲン原子を示す〕 で表わされるイミダゾリニウム化合物の存在下に行うこ
   とを特徴とするポリヌクレオチドの製造法。 ３、固相担体上において、ヌクレオシド亜リン酸エステ
   ルを順次縮合させ、得られたポリヌクレオシド亜リン酸
   エステルを酸化してポリヌクレオチドとなし、次いで、
   ポリヌクレオチドを固相から脱離せしめるポリヌクレオ
   チドの製造法において、ヌクレオシド亜リン酸エステル
   の縮合反応を次の一般式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中、Ｒ＾４及びＲ＾５は低級アルキル基を示し、Ｘ
   及びＹはハロゲン原子を示す〕 で表わされるイミダゾリニウム化合物の存在下に行うこ
   とを特徴とするポリヌクレオチドの製造法。