JPS6284097A - 保護されたオリゴヌクレオチドの製造法 - Google Patents
保護されたオリゴヌクレオチドの製造法Info
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- JPS6284097A JPS6284097A JP60223139A JP22313985A JPS6284097A JP S6284097 A JPS6284097 A JP S6284097A JP 60223139 A JP60223139 A JP 60223139A JP 22313985 A JP22313985 A JP 22313985A JP S6284097 A JPS6284097 A JP S6284097A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は保護されたオリゴヌクレオチドの製造法に関し
、さらに詳しくは、リン酸部分の水酸基及びヌクレオシ
ド塩基部分のアミノ基をそれぞれβ−開裂によって脱離
する保護基及びアリルオキシカル？ニル型残基で保護し
たホスホルアミダイド試薬をモノマー成分として使用す
る保護されたオリゴヌクレオチドの製造法に関する。
、さらに詳しくは、リン酸部分の水酸基及びヌクレオシ
ド塩基部分のアミノ基をそれぞれβ−開裂によって脱離
する保護基及びアリルオキシカル？ニル型残基で保護し
たホスホルアミダイド試薬をモノマー成分として使用す
る保護されたオリゴヌクレオチドの製造法に関する。
（従来の技術）
最近の遺伝子工学の発展に伴い、その重要な素材である
ＤＮＡ （デオキシリが核酸）やＲＮＡ （リゾ核酸）
などのポリヌクレオチドを化学的に合成する方法の研究
が盛んに行われており、その具体例としてリン酸ジエス
テル法、リン酸トリエステル法、ホスファイト法などの
手法が知られている。
ＤＮＡ （デオキシリが核酸）やＲＮＡ （リゾ核酸）
などのポリヌクレオチドを化学的に合成する方法の研究
が盛んに行われており、その具体例としてリン酸ジエス
テル法、リン酸トリエステル法、ホスファイト法などの
手法が知られている。
なかでもモノマー成分としてホスホルアミダイト試薬を
用いるホスファイト法は、他の方法に比較して反応性に
優れており、最近、とくに注目を集めている〇 而して、かかるホスファイト法の場合、一般に縮合反応
における副反応を避けるためにリン酸部分の水酸基及び
ヌクレオシド塩基部分のアミノ基ｔ−保護したホスホル
アミダイト試薬がモノマー成分として用いられているが
、最近、水酸基の保護基に関して、従来から賞月されて
きたメチル基に代えてβ−シアンエチル基、β−八へダ
ノエチル基、β−ニトロエチル基などのどときβ−開裂
によって脱離する保護基を用いる方法が開発されている
（例えばＷＯ８５１００８１６、テトラヘドロン・レタ
ース第２４巻、第５２号、第５８４３〜５８４６頁など
）。
用いるホスファイト法は、他の方法に比較して反応性に
優れており、最近、とくに注目を集めている〇 而して、かかるホスファイト法の場合、一般に縮合反応
における副反応を避けるためにリン酸部分の水酸基及び
ヌクレオシド塩基部分のアミノ基ｔ−保護したホスホル
アミダイト試薬がモノマー成分として用いられているが
、最近、水酸基の保護基に関して、従来から賞月されて
きたメチル基に代えてβ−シアンエチル基、β−八へダ
ノエチル基、β−ニトロエチル基などのどときβ−開裂
によって脱離する保護基を用いる方法が開発されている
（例えばＷＯ８５１００８１６、テトラヘドロン・レタ
ース第２４巻、第５２号、第５８４３〜５８４６頁など
）。
この方法によれば、メチル基に比較して脱保護が容易な
ため従来法の難点であったチオフェノール処理を回避す
ることができ、また固相合成法に適用する場合には、担
体をアンモニア処理によって除去する際に同時に水酸基
の脱保護を実施しうるという利点を有する。
ため従来法の難点であったチオフェノール処理を回避す
ることができ、また固相合成法に適用する場合には、担
体をアンモニア処理によって除去する際に同時に水酸基
の脱保護を実施しうるという利点を有する。
しかし、この方法の場合にはアミノ基の保護基としてベ
ンゾイル基、インブチリル基などが用いられておシ、そ
れらの保護基を除去するためには熱アンモニア水で長時
間にわたって処理しなければならないという問題があっ
た。
ンゾイル基、インブチリル基などが用いられておシ、そ
れらの保護基を除去するためには熱アンモニア水で長時
間にわたって処理しなければならないという問題があっ
た。
（発明が解決しようとする問題点）
そこで本発明者らはかかる従来技術の欠点を解決すべく
鋭意検討の結果、水酸基及びアミノ基の保護基としてそ
れぞれβ−開裂によって脱離する保護基及びアリルオキ
シカル♂ニル型残基を有するホスホルアミダイト試薬を
モノマー成分として使用すると、緩和な条件で速やかに
脱保護可能な、保護されたオリゴヌクレオチドが収率よ
く得られることを見い出し、本発明を完成するに到った
。
鋭意検討の結果、水酸基及びアミノ基の保護基としてそ
れぞれβ−開裂によって脱離する保護基及びアリルオキ
シカル♂ニル型残基を有するホスホルアミダイト試薬を
モノマー成分として使用すると、緩和な条件で速やかに
脱保護可能な、保護されたオリゴヌクレオチドが収率よ
く得られることを見い出し、本発明を完成するに到った
。
（問題点を解決するための手段）
かくして本発明によれば、下記一般式〔Ｉ〕で表わされ
るオリゴヌクレオチド合成用原料と下記一般式（ＩＩ）
で表わされるホスホルアミダイド試薬を縮合させ、次い
で形成されたホスファイト部分をホスフェートに酸化す
ることを特徴とする下記一般式ＣＩ［Ｉ）で表わされる
保護されたオリゴヌクレオチドの製造法が提供される。
るオリゴヌクレオチド合成用原料と下記一般式（ＩＩ）
で表わされるホスホルアミダイド試薬を縮合させ、次い
で形成されたホスファイト部分をホスフェートに酸化す
ることを特徴とする下記一般式ＣＩ［Ｉ）で表わされる
保護されたオリゴヌクレオチドの製造法が提供される。
０−Ａ Ｒ４
Ｘ−Ｐ−０−Ａ
・・・〔ＩＩＩ〕
（式中、Ｒ４は保護基または共有結合を介して結合した
担体の残基を表わし、Ｒ２は水素原子または保護基を有
する水酸基を表わし、Ｒ３は保護基を表わし、Ａはβ−
開裂によって脱離する保護基を表わし、Ｂ ＡＯＣはア
ミノ基を有さないヌクレオシド塩基またはアミノ基もし
くはイミノ基がアリルオキシカルビニル型残基で保護さ
れたヌクレオシド塩基の残基を表わし、ＮＡＯＣはアミ
ノ基もしくはイミノ基がアリルオキシカルビニル型残基
で保護されたヌクレオシド塩基の残基を表わし、ｎは０
または正の整数を表わす。） 本発明においては、まず前記一般式（１）で示されるオ
リゴヌクレオチド合成用原料と前記一般式ＣＩＤで示さ
れるホスホルアミダイト試薬による縮合反応が行われる
。
担体の残基を表わし、Ｒ２は水素原子または保護基を有
する水酸基を表わし、Ｒ３は保護基を表わし、Ａはβ−
開裂によって脱離する保護基を表わし、Ｂ ＡＯＣはア
ミノ基を有さないヌクレオシド塩基またはアミノ基もし
くはイミノ基がアリルオキシカルビニル型残基で保護さ
れたヌクレオシド塩基の残基を表わし、ＮＡＯＣはアミ
ノ基もしくはイミノ基がアリルオキシカルビニル型残基
で保護されたヌクレオシド塩基の残基を表わし、ｎは０
または正の整数を表わす。） 本発明においては、まず前記一般式（１）で示されるオ
リゴヌクレオチド合成用原料と前記一般式ＣＩＤで示さ
れるホスホルアミダイト試薬による縮合反応が行われる
。
前記式中のＲ１はヌクレオシド化学において一般に用い
られている保護基または担体の残基であればいずれでも
よく、保護基の具体例として、例えばトリチル基、モノ
メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメチ
ルシリル基、トリエチルシリル基、トリフェニルシリル
基、Ｌ−ブチルジメチルシリル基、テトラヒドロピラニ
ル基、４−メトキシテトラヒドロビラニル基、ベンゾイ
ル基、ベンジル基、テトラヒドロフラニル基、メトキシ
メチル基、メトキシエトキシメチル基、フェノキシメチ
ル基、メチルチオメチル基、フェニルチオメチル基など
が例示される。
られている保護基または担体の残基であればいずれでも
よく、保護基の具体例として、例えばトリチル基、モノ
メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメチ
ルシリル基、トリエチルシリル基、トリフェニルシリル
基、Ｌ−ブチルジメチルシリル基、テトラヒドロピラニ
ル基、４−メトキシテトラヒドロビラニル基、ベンゾイ
ル基、ベンジル基、テトラヒドロフラニル基、メトキシ
メチル基、メトキシエトキシメチル基、フェノキシメチ
ル基、メチルチオメチル基、フェニルチオメチル基など
が例示される。
また担体はエステル結合に代表される共有結合によって
３′−水酸基に結合するものであり、その具体例として
変性シリカダル、ポリエステル、ポリアミド、ポリビニ
ルアルコール、ポリシロリサン、ポリスチレン、ガラス
などが例示される。
３′−水酸基に結合するものであり、その具体例として
変性シリカダル、ポリエステル、ポリアミド、ポリビニ
ルアルコール、ポリシロリサン、ポリスチレン、ガラス
などが例示される。
前記式中の８２は水素原子または保護基を有する水酸基
であシ、保護基の具体例としてはＲ４と同様のものが例
示される。
であシ、保護基の具体例としてはＲ４と同様のものが例
示される。
またＢＡＯＣはアミノ基を有さないヌクレオシド塩基ま
たはアミノ基もしくはイミノ基がアリルオキシカルビニ
ル型残基で保護されたヌクレオシド塩基の残基である。
たはアミノ基もしくはイミノ基がアリルオキシカルビニ
ル型残基で保護されたヌクレオシド塩基の残基である。
ヌクレオシド塩基を有するヌクレオシドの具体例として
は、例えばデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、
デオキシシチジン、チミジン、アデノシン、グアノシン
、シチジン、ウリジン、イノシンなどが例示され、これ
らのうちチミジン、ウリノン、イノシンはアミノ基を有
さないものに属する。
は、例えばデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、
デオキシシチジン、チミジン、アデノシン、グアノシン
、シチジン、ウリジン、イノシンなどが例示され、これ
らのうちチミジン、ウリノン、イノシンはアミノ基を有
さないものに属する。
塩基部分のアミン基の保護基として用いられるアリルオ
キシカルビニル型残基は脱保護反応を本質的に損わない
ものであればいずれでもよく、その具体例として、アリ
ルオキシカルブニル基、メタリルオキシカル？ニル基、
クロチルオキシカル？ニル基、フレニルオキシカルブニ
ルＭ、、Ｉ’５二ルオキシカルデニル基、シンナミルオ
キシカルブニル基、クロロアリルオキシカル？ニル基、
ｐ−クロロシンナミルオキシカルゲニル基などが例示さ
れる。
キシカルビニル型残基は脱保護反応を本質的に損わない
ものであればいずれでもよく、その具体例として、アリ
ルオキシカルブニル基、メタリルオキシカル？ニル基、
クロチルオキシカル？ニル基、フレニルオキシカルブニ
ルＭ、、Ｉ’５二ルオキシカルデニル基、シンナミルオ
キシカルブニル基、クロロアリルオキシカル？ニル基、
ｐ−クロロシンナミルオキシカルゲニル基などが例示さ
れる。
アリルオキシカルビニル型残基の炭素数は反応後に生ず
る副生物の分離や原料入手の容易性などを考慮して適宜
選択すればよいが、通常は炭素数１２以下のものが用い
られる。
る副生物の分離や原料入手の容易性などを考慮して適宜
選択すればよいが、通常は炭素数１２以下のものが用い
られる。
またＡはβ−開裂によりて脱離する保護基、すなわち下
記一般式〔■〕で示される保護基を表わす。
記一般式〔■〕で示される保護基を表わす。
Ｙ
式中、Ｙは水素原子のほかメチル基、エチル基などの低
級アルキル基を表わし、また２は電子吸引性残基を表わ
し、その具体例としてシアノ基、ニトロ基、チオシアノ
基、弗素、塩基、臭素などのへロｒン厘子、フェニルス
ルホニル基、メチルスルホニル基、フェニル基などが例
示される。この際、フェニル基部分のオルト−位及び／
又はバラ−位にはハロダン、シアン基、ニトロ基などの
置換基を有していてもよい。
級アルキル基を表わし、また２は電子吸引性残基を表わ
し、その具体例としてシアノ基、ニトロ基、チオシアノ
基、弗素、塩基、臭素などのへロｒン厘子、フェニルス
ルホニル基、メチルスルホニル基、フェニル基などが例
示される。この際、フェニル基部分のオルト−位及び／
又はバラ−位にはハロダン、シアン基、ニトロ基などの
置換基を有していてもよい。
これらの保護基のなかでも２がシアン基のものが好まし
く、とくにβ−シアノエチル基が賞月される。
く、とくにβ−シアノエチル基が賞月される。
さらにｎの値はＯまたは正の整数であれば格別制限され
るものではなく、１００もしくはそれ以上の値であって
もよい。
るものではなく、１００もしくはそれ以上の値であって
もよい。
前記一般式（ＩＩ）中のＲ２及びＡは前記と同様であシ
、Ｒ３はヌクレオシド化学において一般的に用いられて
いる保護基であって、その具体例としてはＲ１の場合と
同様のものが例示される。またＮＡｏｃはアミン基を有
さないヌクレオシド塩基を含まないこと以外はＢＡｏｃ
と同義である。
、Ｒ３はヌクレオシド化学において一般的に用いられて
いる保護基であって、その具体例としてはＲ１の場合と
同様のものが例示される。またＮＡｏｃはアミン基を有
さないヌクレオシド塩基を含まないこと以外はＢＡｏｃ
と同義である。
さらにＸは２級アミノ基を表わし、その具体例としては
ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピル
アミン基、ジ−ｔ−ブチルアミノ基、メチルグロピルア
ミノ基、メチルへキシルアミノ基、メチルシクロヘキシ
ルアミノ基、エチルベンジルアミノ基、モルホリノ基、
チオモルホリノ基、ピロリジノ基、ピペリジ７基、２．
６−シメチルピベリジノ基、ピペラジノ基、イミダ／ジ
ノ基、ピロリノ基などが例示され、炭素数１０以下のも
のが賞月される。
ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピル
アミン基、ジ−ｔ−ブチルアミノ基、メチルグロピルア
ミノ基、メチルへキシルアミノ基、メチルシクロヘキシ
ルアミノ基、エチルベンジルアミノ基、モルホリノ基、
チオモルホリノ基、ピロリジノ基、ピペリジ７基、２．
６−シメチルピベリジノ基、ピペラジノ基、イミダ／ジ
ノ基、ピロリノ基などが例示され、炭素数１０以下のも
のが賞月される。
オリゴヌクレオチド合成用１料とホスホルアミダイド試
薬の縮合反応は、通常、縮合剤を用いて溶剤の存在下に
行われる。
薬の縮合反応は、通常、縮合剤を用いて溶剤の存在下に
行われる。
用いられる縮合剤の具体例としては、例えば１−Ｈ−テ
トラゾール、５−ニトロ−１−Ｈテトラゾール、トリア
ゾールなどが例示される。
トラゾール、５−ニトロ−１−Ｈテトラゾール、トリア
ゾールなどが例示される。
また溶剤の具体例としては、ピリジン、ピコリン、ルチ
ジンなどのピリジン類、キノリン、イソキノリン、オキ
サゾール、テトラヒドロ７ラン、ジメチルホルムアミド
、ジクロロメタンなどが挙げられる。
ジンなどのピリジン類、キノリン、イソキノリン、オキ
サゾール、テトラヒドロ７ラン、ジメチルホルムアミド
、ジクロロメタンなどが挙げられる。
オリコ０ヌクレオチド合成原料とホスホルアミダイド試
薬の使用比率は適宜選択されるが、通常は前者１当量当
シ後者２〜１０当量の割合であシ、また縮合剤は前記合
成原料１モル当り２〜５モルの割合で用いられる。
薬の使用比率は適宜選択されるが、通常は前者１当量当
シ後者２〜１０当量の割合であシ、また縮合剤は前記合
成原料１モル当り２〜５モルの割合で用いられる。
かかる縮合反応は、通常、１０〜５０℃で０．２分〜２
時間にわたって行われる。
時間にわたって行われる。
縮合反応終了後、生成物中に形成されるホスファイト部
分をホスフェートに酸化するため酸化反応が行われる。
分をホスフェートに酸化するため酸化反応が行われる。
この酸化反応は常法に従って行えばよく、その具体例と
して沃素と水で酸化する方法、ｔ−ブチルパーオキシド
、ベンゾイル１４−オキシドなどのごとき過酸化物で酸
化する方法、二酸化窒素で酸化する方法などが例示され
る。
して沃素と水で酸化する方法、ｔ−ブチルパーオキシド
、ベンゾイル１４−オキシドなどのごとき過酸化物で酸
化する方法、二酸化窒素で酸化する方法などが例示され
る。
この酸化反応によって、目的とする一般式〔ＩＩＩ〕で
表わされる保護されたオリゴ９ヌクレオチドが合成され
る。かかる縮合反応及び酸化反応の一連の反応は液相で
実施してもよく、また固相で実施してもよい。もちろん
、市販されている手動型または自動型の合成機を用いて
反応を行うこともできる。
表わされる保護されたオリゴ９ヌクレオチドが合成され
る。かかる縮合反応及び酸化反応の一連の反応は液相で
実施してもよく、また固相で実施してもよい。もちろん
、市販されている手動型または自動型の合成機を用いて
反応を行うこともできる。
また酸化反応後、縮合反応の際に未反応のまま残存した
５′−水酸基を無水酢酸のごとき永久保護基で不活性化
したのち、生成物の５′−水酸基の保ｄ基（Ｒ３）を常
法に従ってプロトン酸やルイス酸などを用いて除去し、
次の縮合反応の原料に供することができる。
５′−水酸基を無水酢酸のごとき永久保護基で不活性化
したのち、生成物の５′−水酸基の保ｄ基（Ｒ３）を常
法に従ってプロトン酸やルイス酸などを用いて除去し、
次の縮合反応の原料に供することができる。
反応液中からの生成物の単離・精製は、必要に応じて保
護基を除去したのち、通常の有機合成反応の手段である
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、電気泳動、有機溶媒による分配や結晶化など公知の
手段を適宜に選択し、あるいは組み合わせて実施するこ
とが可能である。
護基を除去したのち、通常の有機合成反応の手段である
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、電気泳動、有機溶媒による分配や結晶化など公知の
手段を適宜に選択し、あるいは組み合わせて実施するこ
とが可能である。
また固相反応の場合には、必要に応じて保護基を除去し
たのち、常法に従って担体を除去し、上記と同様の手法
によって単離、精製することができる。
たのち、常法に従って担体を除去し、上記と同様の手法
によって単離、精製することができる。
（発明の効果）
かくして得られる本発明の保護されたオリゴヌクレオチ
ドは、リン酸部分の水酸基とヌクレオシド塩基のアミノ
基の双方の保護基を緩和な条件下で速やかに除去するこ
とができる。例えば、必要に応じて２′−水酸基、３′
−水酸基及び／又は５′−水酸基の保護基または担体を
除去したのち、０価のパラジウム化合物とアミンや蟻酸
塩に代表される求核試剤を用いて中性条件下に処理する
と、室温で短時間のうちにヌクレオシド塩基部分の保護
基を除去することができる。
ドは、リン酸部分の水酸基とヌクレオシド塩基のアミノ
基の双方の保護基を緩和な条件下で速やかに除去するこ
とができる。例えば、必要に応じて２′−水酸基、３′
−水酸基及び／又は５′−水酸基の保護基または担体を
除去したのち、０価のパラジウム化合物とアミンや蟻酸
塩に代表される求核試剤を用いて中性条件下に処理する
と、室温で短時間のうちにヌクレオシド塩基部分の保護
基を除去することができる。
また水酸基部分の脱保護はアンモニア水を用いて室温で
０．１〜５時間処理することによシ、容易に除去するこ
とができる。担体を使用する固相合成法の場合には、こ
の処理の間に担体からの切断を同時に行うことができる
。
０．１〜５時間処理することによシ、容易に除去するこ
とができる。担体を使用する固相合成法の場合には、こ
の処理の間に担体からの切断を同時に行うことができる
。
またβ−開裂によって脱離する保護基及びアリルオキシ
カルゲニル型残基は糖部水酸基の脱保護反応で用いられ
る一般的な条件（例えばトリクロロ酢酸による５′−水
酸基の脱保護やテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリ
ドによる３′−水酸基の脱保護など）下できわめて安定
に存在する。
カルゲニル型残基は糖部水酸基の脱保護反応で用いられ
る一般的な条件（例えばトリクロロ酢酸による５′−水
酸基の脱保護やテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリ
ドによる３′−水酸基の脱保護など）下できわめて安定
に存在する。
（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
β−シアノエトキシジクロロホスフィンにジイソプロピ
ルアミンを反応させて得たβ−シアノエトキシモノクロ
ロ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（化合
物２）３．１２ミリモルをアセトニトリル４ミリリツト
ルに溶解したのち、テトラヒドロフラン：アセトニトリ
ル−１＝２の混合溶剤１５ミリリツトルに溶解した５’
−ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−アリルオキシカル−ニ
ルデオキシシチジン（化合物１）３ミリそル及び１−Ｈ
−テトラゾール３．６ミリモルを２０℃で２０分間にわ
た）滴下し、１時間攪拌してホスホルアミダイド（化合
物３）を得た。
ルアミンを反応させて得たβ−シアノエトキシモノクロ
ロ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（化合
物２）３．１２ミリモルをアセトニトリル４ミリリツト
ルに溶解したのち、テトラヒドロフラン：アセトニトリ
ル−１＝２の混合溶剤１５ミリリツトルに溶解した５’
−ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−アリルオキシカル−ニ
ルデオキシシチジン（化合物１）３ミリそル及び１−Ｈ
−テトラゾール３．６ミリモルを２０℃で２０分間にわ
た）滴下し、１時間攪拌してホスホルアミダイド（化合
物３）を得た。
次いで、この反応液に３’−ｏ−ｔ−ブチルジメチルシ
リルチミジン（化合物４）２．８６ミリモルと１−Ｈ−
テトラゾール３．４２ミリモルを加え、２０℃で２時間
攪拌した。
リルチミジン（化合物４）２．８６ミリモルと１−Ｈ−
テトラゾール３．４２ミリモルを加え、２０℃で２時間
攪拌した。
次いで一７８℃に冷却し、二酸化窒素４．８６ミリモル
のジクロロメタン溶液を加え、３０分間酸化したのち、
０．５モル亜硫酸ナトリウム水溶液３０ミリリ、トルを
加えた。室温に戻したのち、クロロホルムと飽和食塩水
を加え、分離した水層をクロロホルムで抽出した。乾燥
後、クロマトグラフィー（シリカダル１２０？、メタノ
ール：クロロホルム−１：３０−１ ：２０）によシ分
離し、β−シアエチル−５′−〇−ジメトキシトリチル
ーＮ−アリルオキシカルがエルデオキシシチジリルー（
３′→５’）−３’−ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルチ
ミジン（化合物５）を７９ｅｌｂの収率で得た。
のジクロロメタン溶液を加え、３０分間酸化したのち、
０．５モル亜硫酸ナトリウム水溶液３０ミリリ、トルを
加えた。室温に戻したのち、クロロホルムと飽和食塩水
を加え、分離した水層をクロロホルムで抽出した。乾燥
後、クロマトグラフィー（シリカダル１２０？、メタノ
ール：クロロホルム−１：３０−１ ：２０）によシ分
離し、β−シアエチル−５′−〇−ジメトキシトリチル
ーＮ−アリルオキシカルがエルデオキシシチジリルー（
３′→５’）−３’−ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルチ
ミジン（化合物５）を７９ｅｌｂの収率で得た。
この物質の物性値は以下のとうシである。
０元素分析（Ｃ５３Ｈ６５０，５Ｎ６ＳｉＰ）Ｃａｌｃ
ｄ、 Ｃ５８，６７Ｈ６，００Ｎ ７．７５Ｆｏｕｎ
ｄ、 Ｃ５８，５７Ｈ６，０６Ｎ ７．９８Ｈ 化合物３ 。２化合物５ 実施例２ 実施例１で用いた化合物３０代わりに後記のホスホルア
ミダイド（化合物６）を用いること以外は実施例１に準
じて実験を行い、β−シアノエチル−５′−〇−ジメト
キシトリチルーＮ−アリルオキシカル？ニルデオキシア
デノシリル−（３′→５′）−３’−ｏ−ｔ−ブチルジ
メチルシリルチミジン（化合物７）を８８％の収率で得
た。
ｄ、 Ｃ５８，６７Ｈ６，００Ｎ ７．７５Ｆｏｕｎ
ｄ、 Ｃ５８，５７Ｈ６，０６Ｎ ７．９８Ｈ 化合物３ 。２化合物５ 実施例２ 実施例１で用いた化合物３０代わりに後記のホスホルア
ミダイド（化合物６）を用いること以外は実施例１に準
じて実験を行い、β−シアノエチル−５′−〇−ジメト
キシトリチルーＮ−アリルオキシカル？ニルデオキシア
デノシリル−（３′→５′）−３’−ｏ−ｔ−ブチルジ
メチルシリルチミジン（化合物７）を８８％の収率で得
た。
この物質の物性値は以下のとおシである。
・元素分析値（Ｃ５４Ｈ６，０１４Ｎ８ＰＳｉ）Ｃａｌ
ｃｄ、 Ｃ５８，４８Ｈ５，８７Ｎ １０．１１Ｆｏ
ｕｎｄ、 ０５Ｂ、２９ Ｈ５，８０Ｎ １０．
０９ＮＣＣＨ２Ｃｌ２−０−Ｐ−Ｎ（ＣＨ（ＣＨ，）２
） ２（化合物６） （化合物７） （ＡＯＣ＝アリルオキシカルボニル基）参考例１ 実施例１で得た化合物５０．３ ミＩ）モル及びトリフ
ェニルホスフィｙ０．９５ミリモルを５０ミリリ、トル
のコルベンにとシ、アルゴン雰囲気としたのち、テトラ
ヒドロフラン３ミリリツトルに溶解し、次いでｎ−ブチ
ルアミン０．６ミリモル、蟻酸０．６ミリモルを順次滴
下したのち、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パ
ラジウム（０）０．０１５ミリモルをテトラヒドロフラ
ン２ミリリ、トルに溶解して加え、室温で１０分間攪拌
した。
ｃｄ、 Ｃ５８，４８Ｈ５，８７Ｎ １０．１１Ｆｏ
ｕｎｄ、 ０５Ｂ、２９ Ｈ５，８０Ｎ １０．
０９ＮＣＣＨ２Ｃｌ２−０−Ｐ−Ｎ（ＣＨ（ＣＨ，）２
） ２（化合物６） （化合物７） （ＡＯＣ＝アリルオキシカルボニル基）参考例１ 実施例１で得た化合物５０．３ ミＩ）モル及びトリフ
ェニルホスフィｙ０．９５ミリモルを５０ミリリ、トル
のコルベンにとシ、アルゴン雰囲気としたのち、テトラ
ヒドロフラン３ミリリツトルに溶解し、次いでｎ−ブチ
ルアミン０．６ミリモル、蟻酸０．６ミリモルを順次滴
下したのち、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パ
ラジウム（０）０．０１５ミリモルをテトラヒドロフラ
ン２ミリリ、トルに溶解して加え、室温で１０分間攪拌
した。
反応後、溶剤を留去したのち、アンモニア水中室温で２
０分間処理し、アンモニア水を留去し、残渣を酢酸エチ
ルに溶かして水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥したのち
、クロマトグラフィーで分離し、アリルオキシカルブニ
ル基とβ−シアンエチル基が除去された５′−ｏ−ジメ
トキシトリチルシチジリル−（３′→５’）−３’−ｏ
−ｔ−ブチルジメチルチミジンを得た。収率は９１モル
チであった。
０分間処理し、アンモニア水を留去し、残渣を酢酸エチ
ルに溶かして水及び飽和食塩水で洗浄し、乾燥したのち
、クロマトグラフィーで分離し、アリルオキシカルブニ
ル基とβ−シアンエチル基が除去された５′−ｏ−ジメ
トキシトリチルシチジリル−（３′→５’）−３’−ｏ
−ｔ−ブチルジメチルチミジンを得た。収率は９１モル
チであった。
参考例２
化合物５の代わ９に化合物７をＯ，ｔ ５ ミ＋）モル
使用すること以外は参考例１と同様にして反応を行った
。その結果、化合物７のアリル基及びアリルオキシカル
ブニル基が除去された５′−〇−ジメトキシトリチルデ
オキシアデノシリル−（３′→５′）−３’−ｏ−ｔ−
ブチルジメチルシリルチミジンが収率９０優で得られた
。
使用すること以外は参考例１と同様にして反応を行った
。その結果、化合物７のアリル基及びアリルオキシカル
ブニル基が除去された５′−〇−ジメトキシトリチルデ
オキシアデノシリル−（３′→５′）−３’−ｏ−ｔ−
ブチルジメチルシリルチミジンが収率９０優で得られた
。
実施例３
ＣＰＧ （Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐａｒｅ Ｇｒａｓ
ｓ ）レジンにエステル結合を介して結合した５′−〇
−ジメトキシトリチルチミジン（化合物８）３０ミリグ
ラムをガラス展反応器に入れ、これにトリクロロ酢酸の
ジクロロメタン溶液を加えて５′−水酸基を脱保護した
のち、アセトニトリルで洗浄した。次いでシチジン塩基
のアミノ基がアリルオキシカルブニル基で保護されたホ
スホルアミダイド（化合物３）０、０３ミリモル及び１
−Ｈ−テトラゾール０．０４ミリモルをアセトニトリル
−テトラヒドロフラン混合溶剤に溶解して加え、室温で
２分間反応させ九。
ｓ ）レジンにエステル結合を介して結合した５′−〇
−ジメトキシトリチルチミジン（化合物８）３０ミリグ
ラムをガラス展反応器に入れ、これにトリクロロ酢酸の
ジクロロメタン溶液を加えて５′−水酸基を脱保護した
のち、アセトニトリルで洗浄した。次いでシチジン塩基
のアミノ基がアリルオキシカルブニル基で保護されたホ
スホルアミダイド（化合物３）０、０３ミリモル及び１
−Ｈ−テトラゾール０．０４ミリモルをアセトニトリル
−テトラヒドロフラン混合溶剤に溶解して加え、室温で
２分間反応させ九。
次いで、アセトニトリルで洗浄したのち、沃素溶液１．
２ミリリツトル（沃素１１．６グラム、水１ ８ ミ
リ リ 、 ト ル 、 ル チ ジ ン
１ ８ ０ ミ リ リ ッ ト ル 、
テトラヒドロフラン７２０ミリリツトル）を加え２５秒
間反応させて、担体に担持したＣ−Ｔ二量体（化合物９
）を得た。収率は８０チであった（後述の５′−ジメト
キシトリチル基の脱離に伴う発色で測定）。
２ミリリツトル（沃素１１．６グラム、水１ ８ ミ
リ リ 、 ト ル 、 ル チ ジ ン
１ ８ ０ ミ リ リ ッ ト ル 、
テトラヒドロフラン７２０ミリリツトル）を加え２５秒
間反応させて、担体に担持したＣ−Ｔ二量体（化合物９
）を得た。収率は８０チであった（後述の５′−ジメト
キシトリチル基の脱離に伴う発色で測定）。
この化合物の確認は以下の手順に従って行った。
まず前記化合物９を含む担体をアセトニトリルで〜
洗浄したのち、無水酢酸を加えて未反応の５７−水酸基
をキャッピングし、アセトニトリルを加えて洗浄シた。
をキャッピングし、アセトニトリルを加えて洗浄シた。
次いでトリフェニルホスフィン０．０９５ミリモル、ｎ
−ブチルアミン０．６ミリモル、蟻酸０．６ミリモル及
びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（
０） ０．０１５ミリモルをテトラヒドロフランに溶解
して加え、室温で１０分間反応して塩基部分のアリルオ
キシカルブニル基を脱保護した。
−ブチルアミン０．６ミリモル、蟻酸０．６ミリモル及
びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（
０） ０．０１５ミリモルをテトラヒドロフランに溶解
して加え、室温で１０分間反応して塩基部分のアリルオ
キシカルブニル基を脱保護した。
テトラヒドロフランとジクロロメタンで洗浄後、トリク
ロロ酢酸によシ５′−水酸基のジメトキシトリチル基を
脱離し、化合物１０を得た。次いで／λＪ ３０％アンモニア水溶液を加え室温で３０分放置してリ
ン酸部分のβ−シアノエチル基と担体を除去し、Ｃ−Ｔ
のダイマー（化合物１１）を得た。
ロロ酢酸によシ５′−水酸基のジメトキシトリチル基を
脱離し、化合物１０を得た。次いで／λＪ ３０％アンモニア水溶液を加え室温で３０分放置してリ
ン酸部分のβ−シアノエチル基と担体を除去し、Ｃ−Ｔ
のダイマー（化合物１１）を得た。
アンモニアを留去後、２００マイクロリツトルの水に溶
解し、このうち５マイクロリツトルの水溶液を採取し、
これに〔γ−３２Ｐ ） ＡＴＰ （ＰＢ−１７０。
解し、このうち５マイクロリツトルの水溶液を採取し、
これに〔γ−３２Ｐ ） ＡＴＰ （ＰＢ−１７０。
アマジャム）１マイクロリツトルを加えて乾固した。こ
れにカイネーションパ、ファー（Ｘ ２．５ ）を２μ
ｔ 、 Ｔ４ヌクレオチドキナーゼ（全酒蔵。
れにカイネーションパ、ファー（Ｘ ２．５ ）を２μ
ｔ 、 Ｔ４ヌクレオチドキナーゼ（全酒蔵。
２．５ｕ／μｔ）１μｔ、水２μｔを加えて３７℃でカ
イネーシｑ７を行った。ＴＬＣ（Ｐｏｌｙｇｒａｍ 、
ＣＥＬＬ３００ ＤＥＡＥ／ＨＲ−２／ １５ 、
Ｍａａｋｅｒｅｙ−Ｎａｇｓ１社製）上、ＲＮＡホモミ
ックスチェアにて展開し、−次元のオートラジオグラフ
を得、１スポツトであることを確認した。ＴＬＣから、
１スポツトの位置を抽出シ、ペノムホスホジエステラー
ゼと、ヌクレアーゼＰ１で消化させ、消化物をそれぞれ
ＤＥＡＲ−セルロースイーパーを用いる電気泳動で展開
し、これをＴＬＣに転写して、ホモミックスチェアにて
二次元に展開した。二次元の展開後、ＴＬＣのオート°
ラジオグラフをと夛、スポットの位置から保護基が脱
保護されたＣＴダイマーが生成していることを確認した
。
イネーシｑ７を行った。ＴＬＣ（Ｐｏｌｙｇｒａｍ 、
ＣＥＬＬ３００ ＤＥＡＥ／ＨＲ−２／ １５ 、
Ｍａａｋｅｒｅｙ−Ｎａｇｓ１社製）上、ＲＮＡホモミ
ックスチェアにて展開し、−次元のオートラジオグラフ
を得、１スポツトであることを確認した。ＴＬＣから、
１スポツトの位置を抽出シ、ペノムホスホジエステラー
ゼと、ヌクレアーゼＰ１で消化させ、消化物をそれぞれ
ＤＥＡＲ−セルロースイーパーを用いる電気泳動で展開
し、これをＴＬＣに転写して、ホモミックスチェアにて
二次元に展開した。二次元の展開後、ＴＬＣのオート°
ラジオグラフをと夛、スポットの位置から保護基が脱
保護されたＣＴダイマーが生成していることを確認した
。
（ＡＯｃ
化合物８
０−ＣＨ２Ｃ）１２ＣＮ
化合物９
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記一般式〔 I 〕で表わされるオリゴヌクレオチ
ド合成用原料と下記一般式〔II〕で表わされるホスホル
アミダイト試薬を縮合させ、次いで形成されたホスファ
イト部分をホスフェートに酸化することを特徴とする下
記一般式〔III〕で表わされる保護されたオリゴヌクレ
オチドの製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔III〕 （式中、Ｒ＿１は保護基または共有結合を介して結合し
た担体の残基を表わし、Ｒ＿２は水素原子または保護基
を有する水酸基を表わし、Ｒ＿３は保護基を表わし、Ａ
はβ−開裂によって脱離する保護基を表わし、Ｂ＾Ａ＾
Ｏ＾Ｃはアミノ基を有さないヌクレオシド塩基またはア
ミノ基もしくはイミノ基がアリルオキシカルボニル型残
基で保護されたヌクレオシド塩基の残基を表わし、Ｎ＾
Ａ＾Ｏ＾Ｃはアミノ基もしくはイミノ基がアリルオキシ
カルボニル型残基で保護されたヌクレオシド塩基の残基
を表わし、ｎは０または正の整数を表わす。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60223139A JPS6284097A (ja) | 1985-10-07 | 1985-10-07 | 保護されたオリゴヌクレオチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60223139A JPS6284097A (ja) | 1985-10-07 | 1985-10-07 | 保護されたオリゴヌクレオチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6284097A true JPS6284097A (ja) | 1987-04-17 |
Family
ID=16793399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60223139A Pending JPS6284097A (ja) | 1985-10-07 | 1985-10-07 | 保護されたオリゴヌクレオチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6284097A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6919437B1 (en) | 1998-06-11 | 2005-07-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthetic methods and intermediates for triester oligonucleotides |
-
1985
- 1985-10-07 JP JP60223139A patent/JPS6284097A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6919437B1 (en) | 1998-06-11 | 2005-07-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthetic methods and intermediates for triester oligonucleotides |
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