JPH0370474B2 - - Google Patents
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- JPH0370474B2 JPH0370474B2 JP60268218A JP26821885A JPH0370474B2 JP H0370474 B2 JPH0370474 B2 JP H0370474B2 JP 60268218 A JP60268218 A JP 60268218A JP 26821885 A JP26821885 A JP 26821885A JP H0370474 B2 JPH0370474 B2 JP H0370474B2
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- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規なDNA及びその用途に関する。
更に詳しくは、本発明は、ニワトリリゾチームの
シグナルペプチドをコードするDNAとヒトリゾ
チーム構造遺伝子から成る雑種プレリゾチーム遺
伝子を含有する組み換えDNA及びそれを保持す
る酵母の形質転換体に関する。 〔従来技術及び問題点〕 ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、
乳、リンパ線、白血球、血漿、軟骨、肺、腎臓、
脾臓、肝臓、腸管、耳下腺、皮膚、精液、白血病
患者の尿中等に見い出される酵素蛋白質であり、
Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミ
ン酸間のβ−１，４結合を加水分解するムラミダ
ーゼ（muramidase）としての酵素活性を有して
いることが知られている。 またヒト乳由来のリゾチームは下記の配列で示
される130個のアミノ酸からなる事が知られてい
る（例えば、船津ら「溶菌酵素」55〜58頁、講談
社サイエンテイフイク（1977）参照）。 【表】 【表】 リゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有す
るので、食品等の防腐剤あるいは医薬品として、
リゾチーム単独又は抗生物質との併用による抗菌
剤として利用することができる。また、血液凝固
及び止血作用、抗炎症作用、呼吸器疾患者に対す
る喀痰喀出作用等をも有するものでそれらを対象
とした医薬品としても利用することができる。 ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する
ことができるが、医療等を目的とする工業的生産
の要求を満たすには効率が悪く実用的ではない。
本発明は、組み換えDNA技術により安価にしか
も多量に純粋なヒドリゾチームを分泌生産するこ
とを可能にしたものである。 合成雑種プレリゾチーム遺伝子を用いて組み換
えDNA技術によりヒトリゾチームを製造する方
法は後により詳しく記述するが基本的には下記の
工程により成る。 (1) 遺伝子の設計 (2) 遺伝子の化学合成 (3) 適当な発現用ベクターへの遺伝子の組み込み (4) 得られた組み換えプラスミドに依る適当な宿
主の形質転換 (5) 形質転換体の培養によるヒトリゾチームの生
産及び回収 上記の工程において、宿主として大腸菌を用い
た場合の製造法に関しては、すでに本発明者らの
一部によつてその詳細が日本特許出願59−201366
号及び59−201367号明細書に開示されている 宿主として酵母（Saccharomyces cerevisiae）
を用いた場合、大腸菌を用いた場合と比較して (イ) 培養が安全かつ容易であり、より高密度で培
養する事が可能である。 (ロ) 発熱物質等の毒性物質の混入をさける事がで
きるため生産物の安全性がより高くなる。 (ハ) 高等動物由来の遺伝子産物が正しい構造をと
りやすい。 (ニ) 酵母細胞はリゾチームに対して非感受性であ
るためより安定に生産し得る。 等の利点を有している。 しかしながら、本発明者らによつて既に提案さ
れた方法（日本特許出願60−139710）では、酵母
細胞内で発現したヒトリゾチームを培地中に分泌
させることができない。従つて、酵母菌体を回収
し、菌体を破砕し、ここから目的タンパンク質を
抽出、分離、精製する必要がある。しかし、酵母
菌体内には多量の夾雑タンパク質が存在するた
め、分離、精製はかなり困難な作業となる。ま
た、酵母菌体内で直接接発現されたタンパク質で
はＮ末端アミノ酸として、翻訳開始コドンAUG
に由来するメチオニンが目的タンパク質のＮ末端
に付加した所望でない付加物として産生される可
能性がある。従つて、適当なシグナルペプチドを
含有する融合タンパク質前駆体として産生させた
後、発現産物を酵母菌体内でプロセシングさせ、
成熱タンパク質として菌体外に分泌させることが
できれば、前記の様な問題点を一挙に解決するこ
とが可能となる。 ところで、ヒトリゾチームのアミノ酸配列は既
知であるが、その前駆体タンパク質及び遺伝子は
いずれも未だ単離されていない。しかし、ヒトリ
ゾチームと生物活性が極めて類似したニワトリリ
ゾチームについては、遺伝子が単離されており、
この配列から前駆体タンパク質（ニワトリプレリ
ゾチーム）と、これをコードするDNA配列を知
ることができる。（例えば、A.Jungら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA77，5759（1980）参照）。リ
ゾチームはヒトでもニワトリでも細胞内から細胞
外に分泌されるタンパク質であることから、酵母
においても、適切なシグナルペプチドをヒトリゾ
チーム成熱タンパク質のＮ末端に付加できれば、
酵母の分泌系を利用して培地中に分泌させること
が可能であると考えられる。 〔発明の構成〕 本発明者らは、この様な状況の中で、酵母細胞
を用いたヒトリゾチームの菌体外分泌生産を目的
として種々検討を重ねた結果、ニワトリゾチーム
のシグナルペプチドをコードするDNAを利用す
ることにより正しくプロセシングされたヒトリゾ
チームを高レベルで培地中に分泌生産させること
が可能であることを見出し、本発明を完成するに
至つた。本発明を次に詳細に説明する。 (1) 遺伝子の設計 １−１ 構造遺伝子対応DNA ヒトリゾチームを構成するアミノ酸を指定
するいくつかのコドンのうちから下記の条件
を満すものを選んでDNAを合成する。 (A) 可能な限り酵母で高頻度に使用されてい
るコドンを選ぶ。 (B) 後記する各々の合成フラグメントが分子
内あるいは分子間で望まない相補性配列を
持たない様にする。 本発明で用いる構造遺伝子は第６図に示さ
れる遺伝子であるが、同遺伝子の設計及び取
得法については、すでに本発明者らにより日
本特許出願59−201367号明細書にその詳細が
開示されているので、それを参照されたい。 １−２ シグナルペプチド対応DNA 酵母での分泌を可能にするためには、上記
の構造遺伝子の5′未端側に分泌に必要なシグ
ナルペプチド配列に対応するDNAを翻訳読
取枠を一致させて付加する必要がある。通
常、酵母で異種タンパク質を分泌生産させる
ために利用されるシグナルペプチドとしては
酵母が本来培地中に分泌する酵母タンパク質
のシグナルペプチドが利用されている。これ
を以下「同種シグナル」という。例えば、イ
ンベルターゼに通常結合しているアミノ酸プ
レ配列であるインベルターゼシグナルペプチ
ドや酵母α因子の前駆体タンパク質に含まれ
るシグナルペプチドを利用する場合である。
一方、ニワトリリゾチームのシグナルペプチ
ドとしては、前記の如く、単離されたニワト
リリゾチーム遺伝子の解析から、以下の構造
であることが見出された。（例えば、A.Jung
ら、Pro.Natl.Acad.Sci.USA.775759（1980）
参照） met-18−arg−ser−lue-15−leu−ile−lev−val
−lue-10−cys−phe−leu−pro−lue-5−ala−
ala−leu−gly-1↓ − lys+1−val−phe−gly−arg+5… 但し、＋１は成熟型ニワトリリゾチームの
Ｎ未端アミノ酸を示し、−１〜−18は前駆体
ニワトリリゾチームに含まれるシグナルペプ
チドを示している。矢印は前駆体がニワトリ
細胞内で成熟型に変換される際の切断位置を
示している。 この様なニワトリ由来のシグナルペプチド
を酵母本来のシグナル以外という意味で、以
後「異種シグナル」という。この様な異種シ
グナルが前記の同種シグナルと全く同様に機
能するか否か、即ち、酵母細胞内で発現、プ
ロセシング及び分泌を達成するか否かは明ら
かではない。何故ならば、酵母の分泌過程は
まだ十分に解明されていないことから、ニワ
トリやヒトなどの高等哺乳類細胞の分泌過程
と同一か否かが明らかでないからである。酵
母で異種タンパク質の分泌生産に「異種シグ
ナル」を用いた例としては、ヒトインターフ
エロンのシグナルペプチド（アミノ酸残基23
個に対応するDNA）を利用した例がある。
（R.A.Hitzemanら、Science、219、620
（1983））しかし、この場合には、培地中に分
泌されたインターフエロンは、酵母によつて
発現した全インターフエロンの約10％にすぎ
なかつた。しかも分泌されたインターフエロ
ンは、所望の切断部位でプロセシングされた
ものは約65％であり、これより長さの長い所
望でないインターフエロンが約35％、同時に
副生していた。このことは、酵母細胞がヒト
由来のシグナルペプチドを不完全に認識して
いることを示唆するものである。一般に、分
泌タンパク質は通常粗面小胞体（RER）中
での翻訳によつて形成されるが、この際、シ
グナルペプチドはシグナル認識粒子（SRP）
という推定粒子と相互作用し、次いでSRP
受容体又は結合タンパク質（docking
protein）といわれる推定RER膜タンパク質
を認識し、その後にタンパク質がRER膜を
通つて輸送される（例えば、G.Blobel and
B.Dobberstein、J.Cell.Biol.，67，835
（1975）或いはP.Walter and G.Blobel、J.
Cell.Biol.，91，545（1981）参照）。 このタンパク質は一担RER内腔に分離さ
れた後、ゴルジ装置へ移送され、次に小胞内
へ包入される。小胞が原形質膜と融合すると
小胞内容物（タンパク質）が原形質膜と細胞
壁の間に限定されたペリプラズマ空間
（periplasmic space）に放出される。 以上の分泌過程は酵母においても妥当であ
ると考えられているが、酵母の推定SRPは
哺乳類細胞のSRPと同等ではないかも知れ
ない。また、分泌過程でタンパク質のin
vivoでの修飾（例えばリン酸化、グリコシル
化等）がおこるか否か、分泌タンパク質の局
在化にどの程度関与するのかも明らかではな
い。にも拘らず、ニワトリリゾームのシグナ
ルペプチドが酵母内で正しく機能するかも知
れないと推定された根拠は以下の理由によ
る。 (A) ニワトリリゾチームのシグナルペプチド
は18個のアミノ酸残基からなり、酵母本来
のインベルターゼシグナル（アミノ酸18
個）、α−ガラクトシダーゼシグナル（ア
ミノ酸18個）、酸性フオスフアターゼシグ
ナル（アミノ酸17個）等と極めて類似した
長さを有している。 (B) シグナルペプチドのＮ未端付近には、同
種シグナルによく見られる塩基性アミノ酸
残基としてargが存在している。 (C) シグナルペプチドの中央部には、leu、
ile、val、phe等の疎水性アミノ酸からな
る領域が存在し、これも同種シグナルと極
めて類似している。 ニワトリリゾチーム前駆体が成熟型に変
換（プロセシング）される際の切断部位は
gly（−１）とlys（＋１）の間であるが、酵
母の場合には、これと同一の部位で切断さ
れるか否かを予測する根拠は明確ではな
い。しかし、前記の理由から同一部位で切
断される可能性は高いと推定される。 以上の考えから、異種シグナルを酵母での
リゾチーム分泌用シグナルとして利用するこ
とした。その設計に際しての基本的な考えは
以下の通りである。 (A) シグナルペプチドに対応するヌクレオチ
ド配列としては、mRNAレベルでの２次
構造上の障害を防止するために、ニワトリ
由来のコドンをそのまま利用する。 (B) シグナルペプチドに対応するDNAは、
構造遺伝子との連結を容易にするため構造
遺伝子の5′側に存在する制限酵素TaqI部
位までをカバーする領域として、これを化
学合成する。 (C) プラスミドへの組み込み、プラスミドか
らの切り出しを容易にするため、5′側に制
限酵素認識配列をもたせる。 この様にして設計されたシグナル配列
DNAの一具体例は第７図のヌクレオチド配
列式で表わされるDNAであり、これを適当
な制限酵素で処理したヒトリゾチーム構造遺
伝子と連結することにより雑種プレリゾチー
ム遺伝子とした後、適当なベクターに組み込
むことにより酵母で発現、分泌させることが
可能である。 (2) 遺伝子の合成 上記のように設計した遺伝子を合成するに
は、＋、−両鎖のそれぞれについて、これをいく
つかのフラグメントに分けて、それらを化学的
に合成し各々のフラグメントを連結する方法に
よれば良い。 本発明で用いた構造遺伝子は、第６図に示さ
れる遺伝子であるが、同遺伝子の取得法につい
てはすでに本発明者らに依り日本特許出願59−
201367号明細書にその詳細が開示されているの
で、それを参照されたい。一方、シグナルペプ
チドDNAについては、第７図に示されるDNA
フラグメントに分割して、フラグメントの合
成、精製、5′−水酸基のリン酸化及びフラグメ
ントの連結を行なうが、それ自体は公知の方法
に従つて行うことができる。 (3) 組み換えプラスミドの調製 ３−１ プレリゾチーム遺伝子のプラスミドベク
ターへの導入 前記の様にして作成した雑種プレリゾチー
ム遺伝子を宿主内で増殖可能なプラズミドベ
クター又は宿主内で増殖、発現が可能な様に
構成されたプラズミドベクターの適当な挿入
部位に組み込む。 組み込み操作そのものは分子生物学の分野
で公知の常法に従つて行うことができる。具
体的な方法については後記の実施例を参照さ
れたい。 本発明により雑種プレリゾチーム遺伝子の
増殖はpBR322、pAT153（例えば、Twigg
ら、Nature、283、216〜218（1980）参照）
等の公知の種々のプラズミドベクターを用い
て行うことができる。また、プラズミド
DNAの単離精製も分子生物学の分野で公知
の常法に従つて行うことができる。第６図に
示される構造遺伝子をpBR322のBamHI切
断部位に挿入して得られたPHLY−１の取得
法に関しては日本特許出願59−201367号明細
書を参照されたい。 本発明雑種プレリゾチーム遺伝子によりヒ
トリゾチームの酵母での発現は、ADH1プロ
モーター（例えばHitzermanら、Nature293
717〜722（1981）参照）、PGKプロモーター
（例えば、Hitzemanら、Science219620
（1983）参照）、GAPDHプロモーター（例え
ば、Urdeaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80
7461〜7465（1983）参照）、PHO5プロモータ
ー（例えばKramerら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA81367〜370（1984）参照）、ENOプロモ
ーター（例えばHollandら、J.Biol.Chem.
2561385〜1395（1981）参照）及びGAL10プ
ロモーター（例えば、Broachら、
Experimental Manipulation of Gene
Expression83〜117（1983）参照）等を有す
る公知の種々の発現ベクターを用いて行うこ
とができる。 これらの発現ベクターのうちの一具体例は
YEp51（例えば、Broachら、Experimetnal
Manipulation of Gene Expression 83〜
117（1983）参照）である。 ３−２ 方向性の判定 プラズミドに組み込まれた雑種プレリゾチ
ーム遺伝子の方向性の判定は遺伝子内に含ま
れる特定の塩基配列を認識する制限酵素（例
えば、Tag、Bst Ｅ、Xba等であり、
第６図及び第７図を参照されたい）でその部
位を切断し、遺伝子外の特定部位を別の制限
酵素を用いて切断して、得られた断片のサイ
ズをアガロースゲル電気泳動等の通常用いら
れている方法で分析する事により行うことが
できる。 (4) 形質転換 ４−１ 宿主 雑種プレリゾチーム遺伝子を組み込んだ組
み換えプラズミドの調製、増殖は大腸菌を用
いて行われるが、宿主細胞の大腸菌での一具
体例はE.coli C600（例えば、Nelsonら、
Virology108338〜350（1981）参照）である。 雑種プレリゾチーム遺伝子を組み込んだ組
み換えプラズミドによるヒトリゾチームの発
現は酵母を用いて行われるが、宿主細胞の酵
母での一具体例は、S.cerevisiae KK4（例え
ば、Nogiら、Mol.Gen.Genet.195 29〜34
（1984）参照）である。ヒトリゾチーム遺伝
子を組み込んだ組換えプラズミドによる形質
転換は上記の宿主に限定されるものではな
く、公知の種のS.cerevisiae誘導体（例えば
イーストジエネテイツクストツクセンター
（Yeast Genetic Stock Center）カタログ参
照）を使用することができる。これらのS.
cerevisiae誘導体の多くのものはイーストジ
エネテイツクストツクセンター（Yeast
Genetic Stock Center）及び公認の微生物
機関、例えばアメリカンタイプカルチヤーコ
レクシヨン〔American Type Culture
Collection〕に寄託されておりそこから分譲
が可能である。 ４−２ 形質転換 形質転換操作ものものは、分子生物学の分
野で公知の常法に従つて行うことができる。
（大腸菌の形質転換については、例えば、
Cohenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA692110
〜2114（1972）及びManiatisら、Molecular
Cloning249〜253（1982）参照。酵母の形質
転換については、例えばHinnenら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA751929（1978）及びIto
ら、J.Bacteriol.153163〜168（1983）参照）。 ４−３ 形質転換体 酵母に於ける形質転換体の具体例は、S.
cerevisiae KK4をYEp−HLYSIGで形質転
換させて得た形質転換体であつて、本発明で
はこれをS.cerevisiae KK4（YEp−
HLYSIG）と命名した。 ５ ヒトリゾチームの分泌生産 この様にして得た形質転換体を分子生物学及
び発酵学の分野で公知の常法に従つて培養すれ
ばヒトリゾチームが分泌生産される。 ヒトリゾチームは公知の免疫沈降反応、ラジ
オイムノアツセイ（例えばYuzurihaらChem.
Pharm.Bull.272802〜2806（1979）及び
YuzurihaらChem.Pharm.Bull.26908〜914
（1978）参照）、酵素活性測定法（例えば
Sidhanら、Agric.Biol.Chem.451817〜1823
（1981）及びMorsky Anal.Biochem.12877〜85
（1983）参照）等を用いて検出、定量すること
ができる。 また生産したヒトリゾチームは生化学及び発
酵学分野で公知の常法を適宜組み合せて回収、
精製することができる。 実施例 シグナルペプチド対応DNAフラグメントの化
学合成 前記のようにして設計したニワトリリゾチーム
シグナルペプチド対応DNAは第７図に示す９個
のフラグメントに分けて合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチドフラグメントは公知の方法（例え
ば、P.L.deHasethら、Nucleic Acids Res.，11，
773（1983）参照）に準じて、固相合成法により、
Applied Biosystems社製のDNA合成機
（Model380A）を用いて合成した。ホスフオアミ
ダイト試薬等の合成用試薬はすべてApplied
Biosystems社製のものを用い、付属のオペレー
ターズマニユアル（(株)日科機より入手可能）に従
つて使用した。合成DNAは、核酸塩基と5′水酸
基が保護されリン酸保護基が脱保護された状態で
シリカゲル担体から切り離し、回収した。これら
の保護DNAオリゴマーは28％アンモニア水３ml
で60℃、４時間処理することにより、5′端のジメ
トキシトリチル基以外はすべて脱保護されたオリ
ゴマーを得た。同オリゴマーを高速液体クロマト
グラフイーで逆相系担体（Cosmosil5C18：半井
化学社製）を用い、0.1M酢酸−トリエチルアミ
ン緩衝液（PH6.5）中アセトニトリルの直線濃度
勾配による溶出にて精製した。上記精製液を減圧
留去にて約500μに濃縮した後、最終濃度80％
となるように永酢酸を加え、室温15分間処理する
ことによりジメトキシトリチル基を除去した。こ
れを上記の方法により高速液体クロマトグラフイ
ーで精製し、10〜20OD260単位の完全に脱保護さ
たオリゴマーを得た。 リン酸化及びフラグメントの連結反応 上記の化学合成した９個のフラグメントを
HLYSIG1〜５及びHLYSIG6〜９の２つのブロ
ツクＡ及びＢに分けて各ブロツクを連結し更に２
つのブロツクを連結して全体のシグナルペプチド
対応DNAを合成した。９個のフラグメントのう
ち、両端に当るHLYSIG−１及びHLYSIG−８
を除く７個のフラグメントを前記の２つのブロツ
クＡ及びＢにまとめて、その5′端の水酸基をリン
酸化し、ひきつづいて連結反応を行つた。 リン酸化及び連結反応の詳細をHLMSIG−１
〜５を含むブロツクＡの場合について述べれば下
記の通りである。 リン酸化を行う４個のフラグメント
（HLYSIG2〜５）各2μの混合物を15単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ、24pmoleの〔γ−32P〕
ATP（2900Ci／mmol）、及びリン酸化緩衝液
（1mMスペルミジン、50mMジチオスレイトール
（DTTと略）、100mM MgCl2、500mM Tris−
HCl（PH7.5）及び（1mM EDTA）を含む45μ
の反応液中で37℃、30分間インキユベートした
後、80nmoleのATP、24単位のT4−ポリヌクレ
オチドキナーゼを添加し、37℃で60分間、更にイ
ンキユベートした。これを65℃で10分間インキユ
ベートした後永冷した。これをフエノール抽出、
エタノール沈殿によつてDNAを回収した後、
60μlの減菌水に溶解した。これにフラグメント
HLYSIG−14μgを加え、20mM Tris−HCl（PH
7.5）及び10mM MgCl2となるように1M Tris−
HCl（PH7.5）及び1M MgCl2を添加し、65℃10分
間インキユベートした後、37℃、20分間、さらに
室温（約25℃）、20分間静置した。次いで、ATP
及びDTTを各々0.4mM及び10mMとなるように
加え16単位のT4−DMAリガーゼを加えて反応液
量100μとして、冷蔵庫（約10℃）中で12時間
反応させて連結させた。反応終了後フエノール抽
出、エタノール沈殿を行いDNAを回収して20μ
のTE緩衝液（10mM Tris−HClPH7.5、lmM
EDTA）に溶解して−20℃で保存した。 同様にしてHLYSIG6〜９よりブロツクＢを合
成した。但し、ブロツクＢについては、ブロツク
Ｂを合成後この連結反応物の全量を
20nmoleATP、15単位のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ及び前述のリン酸化緩衝液を含む30μの
反応液中で37℃60分間インキユベートして、後で
添加したHLYSIG−８の5′水酸基をリン酸化し
た。これを65℃、10分間インキユベートした後、
37℃、20分間、さらに室温（約25℃）20分間静置
した。次に、ブロツクＡ及びブロツクＢ
（HLYSIG−８をリン酸化したもの）の連結反応
物のそれぞれ半量（10μ）を混合し、ブロツク
Ａの連結反応に使用したものと同じ組成の反応液
中で冷蔵庫（約10℃）内で、12時間反応させた。
8.3M尿素を含む10％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で生成物を分離して、目的の（Ａ＋Ｂ）ブ
ロツク即ち、シグナルペプチドに対応するDNA
フラグメント（68mer及び70mer）を調製した。 クローニング シグナルペプチド対応DNAは、翻訳読取り枠
が一致する様に制限酵素処理したヒトリゾチーム
構造遺伝子DNAと連結し、これをpBR322ベク
ターにクローニングした。以下にその詳細を記
す。 ヒドリゾチーム構造遺伝子を含むプラスミドPH
LY−150μgを10mM Tris−HCl（PH7.5）、50mM
NaCl、10mM MgCl2及び190単位の制限酵素
Sau3AIを含む200μの反応液中で37℃、４時間
インキユベートした後、フエノール抽出、エタノ
ール沈殿を行つた。この反応生成物を５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によつてシトリゾチー
ム遺伝子を含む418bpのフラグメントを単離し
た。次にこのDNA断片を10mM Tris−HCl（PH
7.5）7mM MgCl2、10mM NaCl、7mM β−メ
ルカプトエタノール、100μg／mlのBSA、及び48
単位の制限酵素Tagを含む82μの反応液中で
65℃、12時間、インキユベートした。この反応液
をフエノール抽出、エタノール沈澱でDMAを回
収し、、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、
385bp（第６図でHLY−７及び５上のTag−部
位からHLY−55及び−56上のSau3A部位までに
相当する）のDNA断片を単離した。一方、プラ
スミドpBR322 7.5μgを10mM Tris−HCl（PH
7.5）、100mM MaCl、10mM MgCl2、80単位の
制限酵素Sal及び24単位の制限酵素Bam HIを
含む100μの反応液中で37℃、12時間インキユ
ベートした後、フエノール抽出、エタノール沈殿
を行つた。こね反応物を５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行つて4.1Kbのフラグメントを単
離した。 次に、先に調製したシグナルペプチド対応
DNAフラグメントの全量、ヒトリゾチーム構造
遺伝子を含む385bpの制限酵素Tag／Sau3Aフ
ラグメントの１／４量、及び4.1Kbのプラスミド
pBR322の制限酵素BamHI／Sal切断フラグメ
ントの半量の３者を混合し緩衝液（50mM
Tris−HCl（PH7.5）、10mM MgCl2、10mM
DTT、1mMスペルミジン、1mM ATP、
100μg／mlのBSA）及び10単位のT4DNAリガー
ゼを含む95μの反応液中で冷蔵庫（約10℃）内
で12時間反応させた。この反応物をフエノール抽
出、エタノール沈殿により、DNAを回収した。
次にこのDNAを用いてE.Coli C600株を形質転換
し、アンピシリン抵抗性（60μg／ml）の形質転
換体を得た。 組換えプラスミドの同定 上記の形質転換体をアンピシリン60μg／mlを
含有するLB寒天培地（バクトトリプトン10ｇ／
、バクトイーストエキステラクト５ｇ／、
NaCl10g／ Difco寒天15ｇ／、水酸化ナト
リウムでPH7.5に調製したもの）の上に載置した
ニトロセルロースフイルター上で増殖させた。37
℃、４時間放置、クロラムフエニコール170μg／
ml及びアンピシリン50μg／mlを含有するLB寒天
培地上にフイルターを移した。15時間の増幅後、
in situのコロニースクリーニング法（例えば、
Grunsteinら、proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，
3961（1975））を用いて目的プラスミドを含むコロ
ニーを検索した。ハイブリダイゼーシヨンプロー
ブとしては、 32P−標識したヒトリゾチーム構造
遺伝子の5′側約半分を含む210bpのDNAフラグメ
ントを用いた。これは、PHLY1を制限酵素
BamHI／Xba切断し、５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によつて210bpの断片を単離した
ものを、ニツクトランスレーシヨン法（例えば、
P.W.J.Rigbyら、J.Mol.Biol.，113，237（1977））
によつて 32P−標識した。ハイブリダイゼーシヨ
ンは50mM Tris−HCl（PH7.5）、４×SSC（１×
SSC＝0.15M NaCl，0.015M（クエン酸ナトリウ
ム））、１×Denhardt′s溶液（0.02％BSA、0.02％
フイコール400、0.02％ポリビニルピロリドン）、
50％ホルムアミド及び50μg／mlのSalmontestes
DNA中に、１×105cpmの 32P−プローブを加
え、42℃で一晩行なつた。フイルターを42℃、
（２×SSC＋0.1％SDS）中で、30分、３回洗浄し
た。乾燥したフイルターを−80℃で、Dupont
Lightning−Plus増感スクリーンを用いてKodak
XAR−5X線フイルムに露出した、組換えプラス
ミドを含有するコロニー約1200個を、 32P−標識
DNAフラグメントを用いるin situハイブリダイ
セーシヨンで調べた結果、約３分の１のコロニー
がハイブリダイズした。これらのうち12個のコロ
ニーから少量のプラスミドDNAをBirnboim
and Dolyの方法（Nucleic Acids Res.，２、
1513（1979））で調製した。これらプラスミド
DNAを制限酵素Xba／Sal切断、及びEcoR
／Sal切断によつて解析した。その結果12個
のコロニーは、いずれも５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によつて各々244bp、829bpのフラ
グメントを与える目的プラスミドを保有している
ことが判明した。このプラスミドをPHLYSIGと
命名した（第１図参照）。 発現用プラスミドの作成 プラスミドYEp51 20μgを緩衝液（10mM
Tris−HCl（PH7.5）、100mM NaCl、10mM
MgCl2、1mM DTT）、50単位の制限酵素Sal
及び40単位の制限酵素Hindを含む70μの反応
液中で37℃、５時間反応させた後、0.7％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、GAL10プロモーター
を含む約6.9Kbの断片を回収した。一方、プラス
ミドPHLYSIG30μgを上記緩衝液、70単位の
Sal及び84単位のHindを含む200μの反応液
中で37℃、５時間反応させた後、５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、融合プレリゾチー
ム遺伝子を含む800bpの断片を回収した。上記の
約6.9Kb DNA断片の半量と800bPDNA断片の半
量を緩衝液及び６単位のT4DNAリガーゼを含
む100μの反応液中で、冷蔵庫（約10℃）内で、
12時間反応して連結させた。次にこの反応液を用
いてE.coli C600株を形質転換しアンピシリン
（60μg／ml）抵抗性の形質転換体を得た。これら
の形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、制
限酵素Sal／Hind、EcoR／Xba等の切
断パターンの解析を行つて第１図に示されるよう
な組み換えプラスミドYEp−HLYSIGを含む形
質転換体を選び出した。 発現用組み換え体の調製 プラスミドYEP−HLYSIG5μgを用いて、S.
cerevisiae KK4株（α.ura3，hisl or his3、trpl、
leu2、ga180）を既知の酢酸リチウム法（例えば、
Itoら、J.Bacteriol.，153，163（1983）参照）で
形質転換しロイシン非要求性の形質転換体を得
た。この形質転換体をKK4（YEP−HLYSIG）と
命名した。 ヒトリゾチームの分泌発現 前記組み換え体S.cerevisiae KK4（YEp−
HLYLSIG）及び本発明者らにより既に日本特許
出願60−139710号明細書に開示した組み換え体S.
cerevisiae KK4（YEp HLY−１）を用いて炭素
源としてガラクトース或いはグルコースを含む培
地で増殖させ、培地中へのヒトリゾチームの分泌
の有無について調べた。培養はロイシンを除いた
各種アミノ酸（終濃度20〜375mg／）、アデニン
サルフエイト（終濃度20mg／）、ウラシル（終
濃度20mg／）を含む最小培地（（Difco社製、
アミノ酸不含バクト酵母窒素塩基）（Sherman
ら、Methods in Yeast Genetics，62頁、Cold
Spring Harbour（1982）参照）200mlに炭素源と
して、２％ガラクトース或いは２％グルコースを
加えて30℃で行なつた。 組み換え体S.cerevisiae KK4（YEp−
HLYSIG）の場合、炭素源としてガラクトース
（SGal）或いはグルコース（SD）を含む培地を
用い、培養液のKlett値が360〜380に達した時、
培地中のヒトリゾチーム活性は各々、18unit／
ml、22unit／mlを示した（第２図参照）。但し、
リゾチーム活性の測定はMorskyの方法（Anal.
Biochem.，128，77（1983）参照）に準じて、以
下の方法で行つた。Micrococcus lysodeikticus
菌体懸濁液（凍結乾燥菌体15mg／100ml50mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（PH6.4）800μに、試料
200μを添加し、すばやく混合後、光路長１cm
の石英セル中で菌体懸濁液の濁度減少を450nmの
吸光度を測定することにより追跡した。酵素活性
はこの測定系で反応１分後から11分後までの10分
間における吸光度減少を室温（25℃）で測定し、
１ユニツトは、１分間当たり0.001の吸光度
（450nm）減少を示す値として定義した。炭素源
としてグルコースを用いた場合にはガラクトース
を用いた場合に比べてヒトリゾチーム活性の培地
中での分泌の遅延が見られたが、これは、発現に
使用したGal10プロモーターの誘導が最少培地中
のグルコースにより抑制され、菌体の増殖ととも
にグルコースが消費されたために抑制が解除され
たためであると思われる。一方、組み換え体S.
cereviae KK4（YEp HLY−１）を炭素源として
ガラクトースを含む培地（SGal）を用いて増殖
させた場合、ヒトリゾチーム活性は全く培地中に
分泌されなかつた（第２図）。このことは、ヒト
リゾチーム活性の培地中への分泌には、前記シグ
ナルペプチド部分が必須のものであることを示し
ている。 発現ヒトリゾチームの局在性 ロイシンを除いた各種アミノ酸（終濃度20〜
375mg／）アデニンサルフエイト（終濃度20
mg／）、ウラシル（終濃度20mg／）及び炭素
源として２％のガラクトースを含む上記の最少培
地（SGal）200ml中で前記組み換え体S.
cerevisiae KK4（YEp−HLYSIG）を30℃で増殖
した。培養開始後、18.5時間、23.3時間、38.8時
間、61.8時間、85.8時間および134.3時間の培養液
10mlを15000rpm、２分間の遠心分離により菌体
と上清に分離した。上記上清を「細胞外画分
（Medium）」とした。上記菌体を1.2Mソルビト
ールおよび10mM KH2PO4（PH6.8）よりなる緩
衝液１mlで２回洗浄後、２mlの1.2Mソルビトー
ル、10mM KH2PO4（PH6.8）および0.6％
Zymolyase100T（キリンビール社製）を含む緩衝
液中で30℃、30分間インキユベートした後
3000rpm2分間の遠心で菌体と上清に分離した。
上記上清を「ペリプラズム画分（periplasmic
space）」とした。上記菌体を１mlの1.2Mソルビ
トールおよび10mM KH2PO4（PH6.8）よりなる
緩衝液で２回洗浄後、２mlの同一組成よりなる緩
衝液に懸濁した。上記懸濁液中の菌体を３分間の
超音波処理により破砕後、15Krpm、２分間の遠
心分離により、沈殿物と上清に分離した。上記上
清を「細胞内画分（Intracellular）」とした。「細
胞外画分」、「ペリプラズム画分」および「細胞内
画分」のそれぞれに含まれるヒトリゾチーム活性
をM.Iysodeikticusを用いる前記溶菌法により測
定した。各画分におけるヒトリゾチーム活性の局
在性は菌体の増殖とともに変化したが、菌体増殖
定常期以降ではほぼ「細胞外画分（Medium）」
60％、「ペリプラズム画分（Periplasmic
space）」10％、「細胞内画分（Intracellular）」30
％の分布を示した（第３図）。また、市販のヒト
リゾチーム精製標品（Sigma社製）を用いて、定
量した結果、上記測定法で1unitは培地中に換算
して0.02μg／mlの生成量であることが判明した。 分されたヒトリゾチーム蛋白質の精製 S.cerevisiae KK4（YEp−HLYSIG）を２％ガ
ラクトースを含む上記の最小培地（SGal培地）
400ml中で30℃、１昼夜通気培養した。Klett400
〜500まで増殖した培養物を10000rpm、10分間遠
心して酵母細胞を除き、培養上清画分を得た。上
清画分は凍結乾燥の後、少量（10〜20ml）の
50mMリン酸緩衝液（PH8.0）に溶かし、同緩衝
液に対して充分に透析した。透析後、濃縮された
上清画分はFPLC（Pharmacia社）を用い陽イオ
ン交換カラムMono Ｓ HR5／５（Pharmacia
社）で分離した。活性画分はカラムを１ml／分の
流速で、50mMリン酸緩衝液（PH8.0）存在下20
分間の０−1M KCl直線濃度勾配にかけることに
よつて溶出された。この段階で溶菌活性で見たリ
ゾチームの溶出パターンは0.25MKCl付近で溶出
されてくる唯一の主要ピークと完全に一致した
（第４図）。また同じように市販の精製ヒトリゾチ
ーム（Sigma社）をMono Ｓカラムにかけると
カラムでの保持時間はこの主要ピークと完全に一
致し、0.25MKCl付近で単一の溶出ピークを示し
た。この段階で、ほとんど単一のリゾチーム標品
を得ることも可能であるが、さらに純度の確認及
び溶出画分の脱塩の目的から逆相系のカラムを用
いた高速液体クロマトグラフイー（HPLC）によ
つてさらに精製した。Mono Ｓカラムでリゾチ
ーム活性を持つた画分を全てプールし、直接
ODS逆相カラム（Cosmosil5C18半井化学）で精
製した。活性画分は１ml／分の流速で、0.1％、
トリフルオロ酢酸（TFA）存在下45分間の５−
70％アセトニトリル直線濃度勾配でカラムから溶
出された。約50％アセトニトリ（カラム保持時間
約30分）の位置に単一の主要ピークとして溶出さ
れたピークは、別に対照としてODSカラムにか
けた市販の精製ヒトリゾチームの溶出位置と完全
に一致した。またリゾチームのMicrococcus溶菌
活性の溶出パターンとも完全に一致した。以上の
操作により、単一なヒトリゾチーム標品を培養上
清から約70％の収率で得ることができた（表−
１）。単離されたヒトリゾチーム標品は
Micrococcusの溶菌活性において市販の精製ヒト
リゾチームとほぼ同じ代謝回転速度を示した。こ
のことは、雑種プレリゾチーム人工遺伝子によつ
て酵母で発現したリゾチーム蛋白は触媒活性上も
天然のヒトリゾチームと差がないことを示してい
る。 【表】 ヒトリゾチーム蛋白質のアミノ末端配列決定 酵母培養上清より精製されたヒトリゾチーム蛋
白質のアミノ酸配列はAppllied Biosystems社の
気相アミノ酸シーケンサー470Aで分析した。ア
ミノ末端は順次エドマン分解によつてPTH−ア
ミノ酸として回収された。次にPTH−アミノ酸
は逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
イーによつて分離され、標準PTH−アミノ酸の
保持時間との比較により同定した。その結果、こ
の精製標品のＮ末端アミノ酸は、リジンのみが検
出された。またＮ末端より20番目のアミノ酸まで
その配列を決定した結果、H2N−Lys−Val−
Phe−Glu−Arg−Cys−Glu−Leu−Ala−Arg−
Thr−Leu−Lys−Arg−Leu−Gly−Met−Asp
−Gly−Tyr…であり、既に天然のヒトリゾチー
ムについて報告されているアミノ酸配列と完全に
一致した。このことはニワトリ卵白リゾチームの
分泌シグナルペプチドをＮ末端に付加したヒトリ
ゾチーム蛋白をコードしている化学合成遺伝子
（雑種プレリゾチーム遺伝子）が酵母内で正確に
翻訳され、プロセシングされ、分泌されたことを
示している。
更に詳しくは、本発明は、ニワトリリゾチームの
シグナルペプチドをコードするDNAとヒトリゾ
チーム構造遺伝子から成る雑種プレリゾチーム遺
伝子を含有する組み換えDNA及びそれを保持す
る酵母の形質転換体に関する。 〔従来技術及び問題点〕 ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、
乳、リンパ線、白血球、血漿、軟骨、肺、腎臓、
脾臓、肝臓、腸管、耳下腺、皮膚、精液、白血病
患者の尿中等に見い出される酵素蛋白質であり、
Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミ
ン酸間のβ−１，４結合を加水分解するムラミダ
ーゼ（muramidase）としての酵素活性を有して
いることが知られている。 またヒト乳由来のリゾチームは下記の配列で示
される130個のアミノ酸からなる事が知られてい
る（例えば、船津ら「溶菌酵素」55〜58頁、講談
社サイエンテイフイク（1977）参照）。 【表】 【表】 リゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有す
るので、食品等の防腐剤あるいは医薬品として、
リゾチーム単独又は抗生物質との併用による抗菌
剤として利用することができる。また、血液凝固
及び止血作用、抗炎症作用、呼吸器疾患者に対す
る喀痰喀出作用等をも有するものでそれらを対象
とした医薬品としても利用することができる。 ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する
ことができるが、医療等を目的とする工業的生産
の要求を満たすには効率が悪く実用的ではない。
本発明は、組み換えDNA技術により安価にしか
も多量に純粋なヒドリゾチームを分泌生産するこ
とを可能にしたものである。 合成雑種プレリゾチーム遺伝子を用いて組み換
えDNA技術によりヒトリゾチームを製造する方
法は後により詳しく記述するが基本的には下記の
工程により成る。 (1) 遺伝子の設計 (2) 遺伝子の化学合成 (3) 適当な発現用ベクターへの遺伝子の組み込み (4) 得られた組み換えプラスミドに依る適当な宿
主の形質転換 (5) 形質転換体の培養によるヒトリゾチームの生
産及び回収 上記の工程において、宿主として大腸菌を用い
た場合の製造法に関しては、すでに本発明者らの
一部によつてその詳細が日本特許出願59−201366
号及び59−201367号明細書に開示されている 宿主として酵母（Saccharomyces cerevisiae）
を用いた場合、大腸菌を用いた場合と比較して (イ) 培養が安全かつ容易であり、より高密度で培
養する事が可能である。 (ロ) 発熱物質等の毒性物質の混入をさける事がで
きるため生産物の安全性がより高くなる。 (ハ) 高等動物由来の遺伝子産物が正しい構造をと
りやすい。 (ニ) 酵母細胞はリゾチームに対して非感受性であ
るためより安定に生産し得る。 等の利点を有している。 しかしながら、本発明者らによつて既に提案さ
れた方法（日本特許出願60−139710）では、酵母
細胞内で発現したヒトリゾチームを培地中に分泌
させることができない。従つて、酵母菌体を回収
し、菌体を破砕し、ここから目的タンパンク質を
抽出、分離、精製する必要がある。しかし、酵母
菌体内には多量の夾雑タンパク質が存在するた
め、分離、精製はかなり困難な作業となる。ま
た、酵母菌体内で直接接発現されたタンパク質で
はＮ末端アミノ酸として、翻訳開始コドンAUG
に由来するメチオニンが目的タンパク質のＮ末端
に付加した所望でない付加物として産生される可
能性がある。従つて、適当なシグナルペプチドを
含有する融合タンパク質前駆体として産生させた
後、発現産物を酵母菌体内でプロセシングさせ、
成熱タンパク質として菌体外に分泌させることが
できれば、前記の様な問題点を一挙に解決するこ
とが可能となる。 ところで、ヒトリゾチームのアミノ酸配列は既
知であるが、その前駆体タンパク質及び遺伝子は
いずれも未だ単離されていない。しかし、ヒトリ
ゾチームと生物活性が極めて類似したニワトリリ
ゾチームについては、遺伝子が単離されており、
この配列から前駆体タンパク質（ニワトリプレリ
ゾチーム）と、これをコードするDNA配列を知
ることができる。（例えば、A.Jungら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA77，5759（1980）参照）。リ
ゾチームはヒトでもニワトリでも細胞内から細胞
外に分泌されるタンパク質であることから、酵母
においても、適切なシグナルペプチドをヒトリゾ
チーム成熱タンパク質のＮ末端に付加できれば、
酵母の分泌系を利用して培地中に分泌させること
が可能であると考えられる。 〔発明の構成〕 本発明者らは、この様な状況の中で、酵母細胞
を用いたヒトリゾチームの菌体外分泌生産を目的
として種々検討を重ねた結果、ニワトリゾチーム
のシグナルペプチドをコードするDNAを利用す
ることにより正しくプロセシングされたヒトリゾ
チームを高レベルで培地中に分泌生産させること
が可能であることを見出し、本発明を完成するに
至つた。本発明を次に詳細に説明する。 (1) 遺伝子の設計 １−１ 構造遺伝子対応DNA ヒトリゾチームを構成するアミノ酸を指定
するいくつかのコドンのうちから下記の条件
を満すものを選んでDNAを合成する。 (A) 可能な限り酵母で高頻度に使用されてい
るコドンを選ぶ。 (B) 後記する各々の合成フラグメントが分子
内あるいは分子間で望まない相補性配列を
持たない様にする。 本発明で用いる構造遺伝子は第６図に示さ
れる遺伝子であるが、同遺伝子の設計及び取
得法については、すでに本発明者らにより日
本特許出願59−201367号明細書にその詳細が
開示されているので、それを参照されたい。 １−２ シグナルペプチド対応DNA 酵母での分泌を可能にするためには、上記
の構造遺伝子の5′未端側に分泌に必要なシグ
ナルペプチド配列に対応するDNAを翻訳読
取枠を一致させて付加する必要がある。通
常、酵母で異種タンパク質を分泌生産させる
ために利用されるシグナルペプチドとしては
酵母が本来培地中に分泌する酵母タンパク質
のシグナルペプチドが利用されている。これ
を以下「同種シグナル」という。例えば、イ
ンベルターゼに通常結合しているアミノ酸プ
レ配列であるインベルターゼシグナルペプチ
ドや酵母α因子の前駆体タンパク質に含まれ
るシグナルペプチドを利用する場合である。
一方、ニワトリリゾチームのシグナルペプチ
ドとしては、前記の如く、単離されたニワト
リリゾチーム遺伝子の解析から、以下の構造
であることが見出された。（例えば、A.Jung
ら、Pro.Natl.Acad.Sci.USA.775759（1980）
参照） met-18−arg−ser−lue-15−leu−ile−lev−val
−lue-10−cys−phe−leu−pro−lue-5−ala−
ala−leu−gly-1↓ − lys+1−val−phe−gly−arg+5… 但し、＋１は成熟型ニワトリリゾチームの
Ｎ未端アミノ酸を示し、−１〜−18は前駆体
ニワトリリゾチームに含まれるシグナルペプ
チドを示している。矢印は前駆体がニワトリ
細胞内で成熟型に変換される際の切断位置を
示している。 この様なニワトリ由来のシグナルペプチド
を酵母本来のシグナル以外という意味で、以
後「異種シグナル」という。この様な異種シ
グナルが前記の同種シグナルと全く同様に機
能するか否か、即ち、酵母細胞内で発現、プ
ロセシング及び分泌を達成するか否かは明ら
かではない。何故ならば、酵母の分泌過程は
まだ十分に解明されていないことから、ニワ
トリやヒトなどの高等哺乳類細胞の分泌過程
と同一か否かが明らかでないからである。酵
母で異種タンパク質の分泌生産に「異種シグ
ナル」を用いた例としては、ヒトインターフ
エロンのシグナルペプチド（アミノ酸残基23
個に対応するDNA）を利用した例がある。
（R.A.Hitzemanら、Science、219、620
（1983））しかし、この場合には、培地中に分
泌されたインターフエロンは、酵母によつて
発現した全インターフエロンの約10％にすぎ
なかつた。しかも分泌されたインターフエロ
ンは、所望の切断部位でプロセシングされた
ものは約65％であり、これより長さの長い所
望でないインターフエロンが約35％、同時に
副生していた。このことは、酵母細胞がヒト
由来のシグナルペプチドを不完全に認識して
いることを示唆するものである。一般に、分
泌タンパク質は通常粗面小胞体（RER）中
での翻訳によつて形成されるが、この際、シ
グナルペプチドはシグナル認識粒子（SRP）
という推定粒子と相互作用し、次いでSRP
受容体又は結合タンパク質（docking
protein）といわれる推定RER膜タンパク質
を認識し、その後にタンパク質がRER膜を
通つて輸送される（例えば、G.Blobel and
B.Dobberstein、J.Cell.Biol.，67，835
（1975）或いはP.Walter and G.Blobel、J.
Cell.Biol.，91，545（1981）参照）。 このタンパク質は一担RER内腔に分離さ
れた後、ゴルジ装置へ移送され、次に小胞内
へ包入される。小胞が原形質膜と融合すると
小胞内容物（タンパク質）が原形質膜と細胞
壁の間に限定されたペリプラズマ空間
（periplasmic space）に放出される。 以上の分泌過程は酵母においても妥当であ
ると考えられているが、酵母の推定SRPは
哺乳類細胞のSRPと同等ではないかも知れ
ない。また、分泌過程でタンパク質のin
vivoでの修飾（例えばリン酸化、グリコシル
化等）がおこるか否か、分泌タンパク質の局
在化にどの程度関与するのかも明らかではな
い。にも拘らず、ニワトリリゾームのシグナ
ルペプチドが酵母内で正しく機能するかも知
れないと推定された根拠は以下の理由によ
る。 (A) ニワトリリゾチームのシグナルペプチド
は18個のアミノ酸残基からなり、酵母本来
のインベルターゼシグナル（アミノ酸18
個）、α−ガラクトシダーゼシグナル（ア
ミノ酸18個）、酸性フオスフアターゼシグ
ナル（アミノ酸17個）等と極めて類似した
長さを有している。 (B) シグナルペプチドのＮ未端付近には、同
種シグナルによく見られる塩基性アミノ酸
残基としてargが存在している。 (C) シグナルペプチドの中央部には、leu、
ile、val、phe等の疎水性アミノ酸からな
る領域が存在し、これも同種シグナルと極
めて類似している。 ニワトリリゾチーム前駆体が成熟型に変
換（プロセシング）される際の切断部位は
gly（−１）とlys（＋１）の間であるが、酵
母の場合には、これと同一の部位で切断さ
れるか否かを予測する根拠は明確ではな
い。しかし、前記の理由から同一部位で切
断される可能性は高いと推定される。 以上の考えから、異種シグナルを酵母での
リゾチーム分泌用シグナルとして利用するこ
とした。その設計に際しての基本的な考えは
以下の通りである。 (A) シグナルペプチドに対応するヌクレオチ
ド配列としては、mRNAレベルでの２次
構造上の障害を防止するために、ニワトリ
由来のコドンをそのまま利用する。 (B) シグナルペプチドに対応するDNAは、
構造遺伝子との連結を容易にするため構造
遺伝子の5′側に存在する制限酵素TaqI部
位までをカバーする領域として、これを化
学合成する。 (C) プラスミドへの組み込み、プラスミドか
らの切り出しを容易にするため、5′側に制
限酵素認識配列をもたせる。 この様にして設計されたシグナル配列
DNAの一具体例は第７図のヌクレオチド配
列式で表わされるDNAであり、これを適当
な制限酵素で処理したヒトリゾチーム構造遺
伝子と連結することにより雑種プレリゾチー
ム遺伝子とした後、適当なベクターに組み込
むことにより酵母で発現、分泌させることが
可能である。 (2) 遺伝子の合成 上記のように設計した遺伝子を合成するに
は、＋、−両鎖のそれぞれについて、これをいく
つかのフラグメントに分けて、それらを化学的
に合成し各々のフラグメントを連結する方法に
よれば良い。 本発明で用いた構造遺伝子は、第６図に示さ
れる遺伝子であるが、同遺伝子の取得法につい
てはすでに本発明者らに依り日本特許出願59−
201367号明細書にその詳細が開示されているの
で、それを参照されたい。一方、シグナルペプ
チドDNAについては、第７図に示されるDNA
フラグメントに分割して、フラグメントの合
成、精製、5′−水酸基のリン酸化及びフラグメ
ントの連結を行なうが、それ自体は公知の方法
に従つて行うことができる。 (3) 組み換えプラスミドの調製 ３−１ プレリゾチーム遺伝子のプラスミドベク
ターへの導入 前記の様にして作成した雑種プレリゾチー
ム遺伝子を宿主内で増殖可能なプラズミドベ
クター又は宿主内で増殖、発現が可能な様に
構成されたプラズミドベクターの適当な挿入
部位に組み込む。 組み込み操作そのものは分子生物学の分野
で公知の常法に従つて行うことができる。具
体的な方法については後記の実施例を参照さ
れたい。 本発明により雑種プレリゾチーム遺伝子の
増殖はpBR322、pAT153（例えば、Twigg
ら、Nature、283、216〜218（1980）参照）
等の公知の種々のプラズミドベクターを用い
て行うことができる。また、プラズミド
DNAの単離精製も分子生物学の分野で公知
の常法に従つて行うことができる。第６図に
示される構造遺伝子をpBR322のBamHI切
断部位に挿入して得られたPHLY−１の取得
法に関しては日本特許出願59−201367号明細
書を参照されたい。 本発明雑種プレリゾチーム遺伝子によりヒ
トリゾチームの酵母での発現は、ADH1プロ
モーター（例えばHitzermanら、Nature293
717〜722（1981）参照）、PGKプロモーター
（例えば、Hitzemanら、Science219620
（1983）参照）、GAPDHプロモーター（例え
ば、Urdeaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80
7461〜7465（1983）参照）、PHO5プロモータ
ー（例えばKramerら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA81367〜370（1984）参照）、ENOプロモ
ーター（例えばHollandら、J.Biol.Chem.
2561385〜1395（1981）参照）及びGAL10プ
ロモーター（例えば、Broachら、
Experimental Manipulation of Gene
Expression83〜117（1983）参照）等を有す
る公知の種々の発現ベクターを用いて行うこ
とができる。 これらの発現ベクターのうちの一具体例は
YEp51（例えば、Broachら、Experimetnal
Manipulation of Gene Expression 83〜
117（1983）参照）である。 ３−２ 方向性の判定 プラズミドに組み込まれた雑種プレリゾチ
ーム遺伝子の方向性の判定は遺伝子内に含ま
れる特定の塩基配列を認識する制限酵素（例
えば、Tag、Bst Ｅ、Xba等であり、
第６図及び第７図を参照されたい）でその部
位を切断し、遺伝子外の特定部位を別の制限
酵素を用いて切断して、得られた断片のサイ
ズをアガロースゲル電気泳動等の通常用いら
れている方法で分析する事により行うことが
できる。 (4) 形質転換 ４−１ 宿主 雑種プレリゾチーム遺伝子を組み込んだ組
み換えプラズミドの調製、増殖は大腸菌を用
いて行われるが、宿主細胞の大腸菌での一具
体例はE.coli C600（例えば、Nelsonら、
Virology108338〜350（1981）参照）である。 雑種プレリゾチーム遺伝子を組み込んだ組
み換えプラズミドによるヒトリゾチームの発
現は酵母を用いて行われるが、宿主細胞の酵
母での一具体例は、S.cerevisiae KK4（例え
ば、Nogiら、Mol.Gen.Genet.195 29〜34
（1984）参照）である。ヒトリゾチーム遺伝
子を組み込んだ組換えプラズミドによる形質
転換は上記の宿主に限定されるものではな
く、公知の種のS.cerevisiae誘導体（例えば
イーストジエネテイツクストツクセンター
（Yeast Genetic Stock Center）カタログ参
照）を使用することができる。これらのS.
cerevisiae誘導体の多くのものはイーストジ
エネテイツクストツクセンター（Yeast
Genetic Stock Center）及び公認の微生物
機関、例えばアメリカンタイプカルチヤーコ
レクシヨン〔American Type Culture
Collection〕に寄託されておりそこから分譲
が可能である。 ４−２ 形質転換 形質転換操作ものものは、分子生物学の分
野で公知の常法に従つて行うことができる。
（大腸菌の形質転換については、例えば、
Cohenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA692110
〜2114（1972）及びManiatisら、Molecular
Cloning249〜253（1982）参照。酵母の形質
転換については、例えばHinnenら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA751929（1978）及びIto
ら、J.Bacteriol.153163〜168（1983）参照）。 ４−３ 形質転換体 酵母に於ける形質転換体の具体例は、S.
cerevisiae KK4をYEp−HLYSIGで形質転
換させて得た形質転換体であつて、本発明で
はこれをS.cerevisiae KK4（YEp−
HLYSIG）と命名した。 ５ ヒトリゾチームの分泌生産 この様にして得た形質転換体を分子生物学及
び発酵学の分野で公知の常法に従つて培養すれ
ばヒトリゾチームが分泌生産される。 ヒトリゾチームは公知の免疫沈降反応、ラジ
オイムノアツセイ（例えばYuzurihaらChem.
Pharm.Bull.272802〜2806（1979）及び
YuzurihaらChem.Pharm.Bull.26908〜914
（1978）参照）、酵素活性測定法（例えば
Sidhanら、Agric.Biol.Chem.451817〜1823
（1981）及びMorsky Anal.Biochem.12877〜85
（1983）参照）等を用いて検出、定量すること
ができる。 また生産したヒトリゾチームは生化学及び発
酵学分野で公知の常法を適宜組み合せて回収、
精製することができる。 実施例 シグナルペプチド対応DNAフラグメントの化
学合成 前記のようにして設計したニワトリリゾチーム
シグナルペプチド対応DNAは第７図に示す９個
のフラグメントに分けて合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチドフラグメントは公知の方法（例え
ば、P.L.deHasethら、Nucleic Acids Res.，11，
773（1983）参照）に準じて、固相合成法により、
Applied Biosystems社製のDNA合成機
（Model380A）を用いて合成した。ホスフオアミ
ダイト試薬等の合成用試薬はすべてApplied
Biosystems社製のものを用い、付属のオペレー
ターズマニユアル（(株)日科機より入手可能）に従
つて使用した。合成DNAは、核酸塩基と5′水酸
基が保護されリン酸保護基が脱保護された状態で
シリカゲル担体から切り離し、回収した。これら
の保護DNAオリゴマーは28％アンモニア水３ml
で60℃、４時間処理することにより、5′端のジメ
トキシトリチル基以外はすべて脱保護されたオリ
ゴマーを得た。同オリゴマーを高速液体クロマト
グラフイーで逆相系担体（Cosmosil5C18：半井
化学社製）を用い、0.1M酢酸−トリエチルアミ
ン緩衝液（PH6.5）中アセトニトリルの直線濃度
勾配による溶出にて精製した。上記精製液を減圧
留去にて約500μに濃縮した後、最終濃度80％
となるように永酢酸を加え、室温15分間処理する
ことによりジメトキシトリチル基を除去した。こ
れを上記の方法により高速液体クロマトグラフイ
ーで精製し、10〜20OD260単位の完全に脱保護さ
たオリゴマーを得た。 リン酸化及びフラグメントの連結反応 上記の化学合成した９個のフラグメントを
HLYSIG1〜５及びHLYSIG6〜９の２つのブロ
ツクＡ及びＢに分けて各ブロツクを連結し更に２
つのブロツクを連結して全体のシグナルペプチド
対応DNAを合成した。９個のフラグメントのう
ち、両端に当るHLYSIG−１及びHLYSIG−８
を除く７個のフラグメントを前記の２つのブロツ
クＡ及びＢにまとめて、その5′端の水酸基をリン
酸化し、ひきつづいて連結反応を行つた。 リン酸化及び連結反応の詳細をHLMSIG−１
〜５を含むブロツクＡの場合について述べれば下
記の通りである。 リン酸化を行う４個のフラグメント
（HLYSIG2〜５）各2μの混合物を15単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ、24pmoleの〔γ−32P〕
ATP（2900Ci／mmol）、及びリン酸化緩衝液
（1mMスペルミジン、50mMジチオスレイトール
（DTTと略）、100mM MgCl2、500mM Tris−
HCl（PH7.5）及び（1mM EDTA）を含む45μ
の反応液中で37℃、30分間インキユベートした
後、80nmoleのATP、24単位のT4−ポリヌクレ
オチドキナーゼを添加し、37℃で60分間、更にイ
ンキユベートした。これを65℃で10分間インキユ
ベートした後永冷した。これをフエノール抽出、
エタノール沈殿によつてDNAを回収した後、
60μlの減菌水に溶解した。これにフラグメント
HLYSIG−14μgを加え、20mM Tris−HCl（PH
7.5）及び10mM MgCl2となるように1M Tris−
HCl（PH7.5）及び1M MgCl2を添加し、65℃10分
間インキユベートした後、37℃、20分間、さらに
室温（約25℃）、20分間静置した。次いで、ATP
及びDTTを各々0.4mM及び10mMとなるように
加え16単位のT4−DMAリガーゼを加えて反応液
量100μとして、冷蔵庫（約10℃）中で12時間
反応させて連結させた。反応終了後フエノール抽
出、エタノール沈殿を行いDNAを回収して20μ
のTE緩衝液（10mM Tris−HClPH7.5、lmM
EDTA）に溶解して−20℃で保存した。 同様にしてHLYSIG6〜９よりブロツクＢを合
成した。但し、ブロツクＢについては、ブロツク
Ｂを合成後この連結反応物の全量を
20nmoleATP、15単位のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ及び前述のリン酸化緩衝液を含む30μの
反応液中で37℃60分間インキユベートして、後で
添加したHLYSIG−８の5′水酸基をリン酸化し
た。これを65℃、10分間インキユベートした後、
37℃、20分間、さらに室温（約25℃）20分間静置
した。次に、ブロツクＡ及びブロツクＢ
（HLYSIG−８をリン酸化したもの）の連結反応
物のそれぞれ半量（10μ）を混合し、ブロツク
Ａの連結反応に使用したものと同じ組成の反応液
中で冷蔵庫（約10℃）内で、12時間反応させた。
8.3M尿素を含む10％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で生成物を分離して、目的の（Ａ＋Ｂ）ブ
ロツク即ち、シグナルペプチドに対応するDNA
フラグメント（68mer及び70mer）を調製した。 クローニング シグナルペプチド対応DNAは、翻訳読取り枠
が一致する様に制限酵素処理したヒトリゾチーム
構造遺伝子DNAと連結し、これをpBR322ベク
ターにクローニングした。以下にその詳細を記
す。 ヒドリゾチーム構造遺伝子を含むプラスミドPH
LY−150μgを10mM Tris−HCl（PH7.5）、50mM
NaCl、10mM MgCl2及び190単位の制限酵素
Sau3AIを含む200μの反応液中で37℃、４時間
インキユベートした後、フエノール抽出、エタノ
ール沈殿を行つた。この反応生成物を５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によつてシトリゾチー
ム遺伝子を含む418bpのフラグメントを単離し
た。次にこのDNA断片を10mM Tris−HCl（PH
7.5）7mM MgCl2、10mM NaCl、7mM β−メ
ルカプトエタノール、100μg／mlのBSA、及び48
単位の制限酵素Tagを含む82μの反応液中で
65℃、12時間、インキユベートした。この反応液
をフエノール抽出、エタノール沈澱でDMAを回
収し、、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、
385bp（第６図でHLY−７及び５上のTag−部
位からHLY−55及び−56上のSau3A部位までに
相当する）のDNA断片を単離した。一方、プラ
スミドpBR322 7.5μgを10mM Tris−HCl（PH
7.5）、100mM MaCl、10mM MgCl2、80単位の
制限酵素Sal及び24単位の制限酵素Bam HIを
含む100μの反応液中で37℃、12時間インキユ
ベートした後、フエノール抽出、エタノール沈殿
を行つた。こね反応物を５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行つて4.1Kbのフラグメントを単
離した。 次に、先に調製したシグナルペプチド対応
DNAフラグメントの全量、ヒトリゾチーム構造
遺伝子を含む385bpの制限酵素Tag／Sau3Aフ
ラグメントの１／４量、及び4.1Kbのプラスミド
pBR322の制限酵素BamHI／Sal切断フラグメ
ントの半量の３者を混合し緩衝液（50mM
Tris−HCl（PH7.5）、10mM MgCl2、10mM
DTT、1mMスペルミジン、1mM ATP、
100μg／mlのBSA）及び10単位のT4DNAリガー
ゼを含む95μの反応液中で冷蔵庫（約10℃）内
で12時間反応させた。この反応物をフエノール抽
出、エタノール沈殿により、DNAを回収した。
次にこのDNAを用いてE.Coli C600株を形質転換
し、アンピシリン抵抗性（60μg／ml）の形質転
換体を得た。 組換えプラスミドの同定 上記の形質転換体をアンピシリン60μg／mlを
含有するLB寒天培地（バクトトリプトン10ｇ／
、バクトイーストエキステラクト５ｇ／、
NaCl10g／ Difco寒天15ｇ／、水酸化ナト
リウムでPH7.5に調製したもの）の上に載置した
ニトロセルロースフイルター上で増殖させた。37
℃、４時間放置、クロラムフエニコール170μg／
ml及びアンピシリン50μg／mlを含有するLB寒天
培地上にフイルターを移した。15時間の増幅後、
in situのコロニースクリーニング法（例えば、
Grunsteinら、proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，
3961（1975））を用いて目的プラスミドを含むコロ
ニーを検索した。ハイブリダイゼーシヨンプロー
ブとしては、 32P−標識したヒトリゾチーム構造
遺伝子の5′側約半分を含む210bpのDNAフラグメ
ントを用いた。これは、PHLY1を制限酵素
BamHI／Xba切断し、５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によつて210bpの断片を単離した
ものを、ニツクトランスレーシヨン法（例えば、
P.W.J.Rigbyら、J.Mol.Biol.，113，237（1977））
によつて 32P−標識した。ハイブリダイゼーシヨ
ンは50mM Tris−HCl（PH7.5）、４×SSC（１×
SSC＝0.15M NaCl，0.015M（クエン酸ナトリウ
ム））、１×Denhardt′s溶液（0.02％BSA、0.02％
フイコール400、0.02％ポリビニルピロリドン）、
50％ホルムアミド及び50μg／mlのSalmontestes
DNA中に、１×105cpmの 32P−プローブを加
え、42℃で一晩行なつた。フイルターを42℃、
（２×SSC＋0.1％SDS）中で、30分、３回洗浄し
た。乾燥したフイルターを−80℃で、Dupont
Lightning−Plus増感スクリーンを用いてKodak
XAR−5X線フイルムに露出した、組換えプラス
ミドを含有するコロニー約1200個を、 32P−標識
DNAフラグメントを用いるin situハイブリダイ
セーシヨンで調べた結果、約３分の１のコロニー
がハイブリダイズした。これらのうち12個のコロ
ニーから少量のプラスミドDNAをBirnboim
and Dolyの方法（Nucleic Acids Res.，２、
1513（1979））で調製した。これらプラスミド
DNAを制限酵素Xba／Sal切断、及びEcoR
／Sal切断によつて解析した。その結果12個
のコロニーは、いずれも５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によつて各々244bp、829bpのフラ
グメントを与える目的プラスミドを保有している
ことが判明した。このプラスミドをPHLYSIGと
命名した（第１図参照）。 発現用プラスミドの作成 プラスミドYEp51 20μgを緩衝液（10mM
Tris−HCl（PH7.5）、100mM NaCl、10mM
MgCl2、1mM DTT）、50単位の制限酵素Sal
及び40単位の制限酵素Hindを含む70μの反応
液中で37℃、５時間反応させた後、0.7％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、GAL10プロモーター
を含む約6.9Kbの断片を回収した。一方、プラス
ミドPHLYSIG30μgを上記緩衝液、70単位の
Sal及び84単位のHindを含む200μの反応液
中で37℃、５時間反応させた後、５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、融合プレリゾチー
ム遺伝子を含む800bpの断片を回収した。上記の
約6.9Kb DNA断片の半量と800bPDNA断片の半
量を緩衝液及び６単位のT4DNAリガーゼを含
む100μの反応液中で、冷蔵庫（約10℃）内で、
12時間反応して連結させた。次にこの反応液を用
いてE.coli C600株を形質転換しアンピシリン
（60μg／ml）抵抗性の形質転換体を得た。これら
の形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、制
限酵素Sal／Hind、EcoR／Xba等の切
断パターンの解析を行つて第１図に示されるよう
な組み換えプラスミドYEp−HLYSIGを含む形
質転換体を選び出した。 発現用組み換え体の調製 プラスミドYEP−HLYSIG5μgを用いて、S.
cerevisiae KK4株（α.ura3，hisl or his3、trpl、
leu2、ga180）を既知の酢酸リチウム法（例えば、
Itoら、J.Bacteriol.，153，163（1983）参照）で
形質転換しロイシン非要求性の形質転換体を得
た。この形質転換体をKK4（YEP−HLYSIG）と
命名した。 ヒトリゾチームの分泌発現 前記組み換え体S.cerevisiae KK4（YEp−
HLYLSIG）及び本発明者らにより既に日本特許
出願60−139710号明細書に開示した組み換え体S.
cerevisiae KK4（YEp HLY−１）を用いて炭素
源としてガラクトース或いはグルコースを含む培
地で増殖させ、培地中へのヒトリゾチームの分泌
の有無について調べた。培養はロイシンを除いた
各種アミノ酸（終濃度20〜375mg／）、アデニン
サルフエイト（終濃度20mg／）、ウラシル（終
濃度20mg／）を含む最小培地（（Difco社製、
アミノ酸不含バクト酵母窒素塩基）（Sherman
ら、Methods in Yeast Genetics，62頁、Cold
Spring Harbour（1982）参照）200mlに炭素源と
して、２％ガラクトース或いは２％グルコースを
加えて30℃で行なつた。 組み換え体S.cerevisiae KK4（YEp−
HLYSIG）の場合、炭素源としてガラクトース
（SGal）或いはグルコース（SD）を含む培地を
用い、培養液のKlett値が360〜380に達した時、
培地中のヒトリゾチーム活性は各々、18unit／
ml、22unit／mlを示した（第２図参照）。但し、
リゾチーム活性の測定はMorskyの方法（Anal.
Biochem.，128，77（1983）参照）に準じて、以
下の方法で行つた。Micrococcus lysodeikticus
菌体懸濁液（凍結乾燥菌体15mg／100ml50mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（PH6.4）800μに、試料
200μを添加し、すばやく混合後、光路長１cm
の石英セル中で菌体懸濁液の濁度減少を450nmの
吸光度を測定することにより追跡した。酵素活性
はこの測定系で反応１分後から11分後までの10分
間における吸光度減少を室温（25℃）で測定し、
１ユニツトは、１分間当たり0.001の吸光度
（450nm）減少を示す値として定義した。炭素源
としてグルコースを用いた場合にはガラクトース
を用いた場合に比べてヒトリゾチーム活性の培地
中での分泌の遅延が見られたが、これは、発現に
使用したGal10プロモーターの誘導が最少培地中
のグルコースにより抑制され、菌体の増殖ととも
にグルコースが消費されたために抑制が解除され
たためであると思われる。一方、組み換え体S.
cereviae KK4（YEp HLY−１）を炭素源として
ガラクトースを含む培地（SGal）を用いて増殖
させた場合、ヒトリゾチーム活性は全く培地中に
分泌されなかつた（第２図）。このことは、ヒト
リゾチーム活性の培地中への分泌には、前記シグ
ナルペプチド部分が必須のものであることを示し
ている。 発現ヒトリゾチームの局在性 ロイシンを除いた各種アミノ酸（終濃度20〜
375mg／）アデニンサルフエイト（終濃度20
mg／）、ウラシル（終濃度20mg／）及び炭素
源として２％のガラクトースを含む上記の最少培
地（SGal）200ml中で前記組み換え体S.
cerevisiae KK4（YEp−HLYSIG）を30℃で増殖
した。培養開始後、18.5時間、23.3時間、38.8時
間、61.8時間、85.8時間および134.3時間の培養液
10mlを15000rpm、２分間の遠心分離により菌体
と上清に分離した。上記上清を「細胞外画分
（Medium）」とした。上記菌体を1.2Mソルビト
ールおよび10mM KH2PO4（PH6.8）よりなる緩
衝液１mlで２回洗浄後、２mlの1.2Mソルビトー
ル、10mM KH2PO4（PH6.8）および0.6％
Zymolyase100T（キリンビール社製）を含む緩衝
液中で30℃、30分間インキユベートした後
3000rpm2分間の遠心で菌体と上清に分離した。
上記上清を「ペリプラズム画分（periplasmic
space）」とした。上記菌体を１mlの1.2Mソルビ
トールおよび10mM KH2PO4（PH6.8）よりなる
緩衝液で２回洗浄後、２mlの同一組成よりなる緩
衝液に懸濁した。上記懸濁液中の菌体を３分間の
超音波処理により破砕後、15Krpm、２分間の遠
心分離により、沈殿物と上清に分離した。上記上
清を「細胞内画分（Intracellular）」とした。「細
胞外画分」、「ペリプラズム画分」および「細胞内
画分」のそれぞれに含まれるヒトリゾチーム活性
をM.Iysodeikticusを用いる前記溶菌法により測
定した。各画分におけるヒトリゾチーム活性の局
在性は菌体の増殖とともに変化したが、菌体増殖
定常期以降ではほぼ「細胞外画分（Medium）」
60％、「ペリプラズム画分（Periplasmic
space）」10％、「細胞内画分（Intracellular）」30
％の分布を示した（第３図）。また、市販のヒト
リゾチーム精製標品（Sigma社製）を用いて、定
量した結果、上記測定法で1unitは培地中に換算
して0.02μg／mlの生成量であることが判明した。 分されたヒトリゾチーム蛋白質の精製 S.cerevisiae KK4（YEp−HLYSIG）を２％ガ
ラクトースを含む上記の最小培地（SGal培地）
400ml中で30℃、１昼夜通気培養した。Klett400
〜500まで増殖した培養物を10000rpm、10分間遠
心して酵母細胞を除き、培養上清画分を得た。上
清画分は凍結乾燥の後、少量（10〜20ml）の
50mMリン酸緩衝液（PH8.0）に溶かし、同緩衝
液に対して充分に透析した。透析後、濃縮された
上清画分はFPLC（Pharmacia社）を用い陽イオ
ン交換カラムMono Ｓ HR5／５（Pharmacia
社）で分離した。活性画分はカラムを１ml／分の
流速で、50mMリン酸緩衝液（PH8.0）存在下20
分間の０−1M KCl直線濃度勾配にかけることに
よつて溶出された。この段階で溶菌活性で見たリ
ゾチームの溶出パターンは0.25MKCl付近で溶出
されてくる唯一の主要ピークと完全に一致した
（第４図）。また同じように市販の精製ヒトリゾチ
ーム（Sigma社）をMono Ｓカラムにかけると
カラムでの保持時間はこの主要ピークと完全に一
致し、0.25MKCl付近で単一の溶出ピークを示し
た。この段階で、ほとんど単一のリゾチーム標品
を得ることも可能であるが、さらに純度の確認及
び溶出画分の脱塩の目的から逆相系のカラムを用
いた高速液体クロマトグラフイー（HPLC）によ
つてさらに精製した。Mono Ｓカラムでリゾチ
ーム活性を持つた画分を全てプールし、直接
ODS逆相カラム（Cosmosil5C18半井化学）で精
製した。活性画分は１ml／分の流速で、0.1％、
トリフルオロ酢酸（TFA）存在下45分間の５−
70％アセトニトリル直線濃度勾配でカラムから溶
出された。約50％アセトニトリ（カラム保持時間
約30分）の位置に単一の主要ピークとして溶出さ
れたピークは、別に対照としてODSカラムにか
けた市販の精製ヒトリゾチームの溶出位置と完全
に一致した。またリゾチームのMicrococcus溶菌
活性の溶出パターンとも完全に一致した。以上の
操作により、単一なヒトリゾチーム標品を培養上
清から約70％の収率で得ることができた（表−
１）。単離されたヒトリゾチーム標品は
Micrococcusの溶菌活性において市販の精製ヒト
リゾチームとほぼ同じ代謝回転速度を示した。こ
のことは、雑種プレリゾチーム人工遺伝子によつ
て酵母で発現したリゾチーム蛋白は触媒活性上も
天然のヒトリゾチームと差がないことを示してい
る。 【表】 ヒトリゾチーム蛋白質のアミノ末端配列決定 酵母培養上清より精製されたヒトリゾチーム蛋
白質のアミノ酸配列はAppllied Biosystems社の
気相アミノ酸シーケンサー470Aで分析した。ア
ミノ末端は順次エドマン分解によつてPTH−ア
ミノ酸として回収された。次にPTH−アミノ酸
は逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
イーによつて分離され、標準PTH−アミノ酸の
保持時間との比較により同定した。その結果、こ
の精製標品のＮ末端アミノ酸は、リジンのみが検
出された。またＮ末端より20番目のアミノ酸まで
その配列を決定した結果、H2N−Lys−Val−
Phe−Glu−Arg−Cys−Glu−Leu−Ala−Arg−
Thr−Leu−Lys−Arg−Leu−Gly−Met−Asp
−Gly−Tyr…であり、既に天然のヒトリゾチー
ムについて報告されているアミノ酸配列と完全に
一致した。このことはニワトリ卵白リゾチームの
分泌シグナルペプチドをＮ末端に付加したヒトリ
ゾチーム蛋白をコードしている化学合成遺伝子
（雑種プレリゾチーム遺伝子）が酵母内で正確に
翻訳され、プロセシングされ、分泌されたことを
示している。
第１図は発現用プラスミドYEp−HLYSIGの
作成法を示した図、第２図は、雑種プレリゾチー
ム遺伝子の酵母での分泌発現を示した図、第３図
は酵母で発現したヒトリゾチームの局在性を示し
た図、第４図は、酵母で分泌発現したヒトリゾチ
ームのMono Ｓカラムによる精製を示した図、
第５図は、酵母で分泌発現したヒトリゾチームの
逆相カラムによる精製を示した図、第６図は、ヒ
トリゾチーム構造遺伝子のヌクレオチド配列を示
す図、及び第７図は、ニワトリリゾチームシグナ
ルペプチドをコードするDNAのヌクレオチド配
列を示す図である。第２図において、１はSGal
で培養したKK4（YEp−HLYSIG）の菌体増殖
性、２はSDで培養したKK4（YEp−HLYSIG）
の菌体増殖性、３はSGalで培養したKK4
（YEpHLY−１）の菌体増殖性、４はSGalで培
養したKK4（YEp−HLYSIG）の酵素活性、５は
SDで培養したKK4（YEp−HLYSIG）の酵素活
性及び６はSGalで培養したKK4（YEpHLY−１）
の酵素活性を示すプロツトである。 又、第３図において、７はSGalで培養した
KK4（YEp−HLYSIG）の菌体増殖性、８は細胞
内画分におけるリゾチーム活性の局在性、９は細
胞外画分におけるリゾチーム活性の局存性、及び
１０はペリプラズム画分におけるリゾチーム活性
の局在性を示すプロツトであり、棒グラフは全リ
ゾチーム活性を示す。
作成法を示した図、第２図は、雑種プレリゾチー
ム遺伝子の酵母での分泌発現を示した図、第３図
は酵母で発現したヒトリゾチームの局在性を示し
た図、第４図は、酵母で分泌発現したヒトリゾチ
ームのMono Ｓカラムによる精製を示した図、
第５図は、酵母で分泌発現したヒトリゾチームの
逆相カラムによる精製を示した図、第６図は、ヒ
トリゾチーム構造遺伝子のヌクレオチド配列を示
す図、及び第７図は、ニワトリリゾチームシグナ
ルペプチドをコードするDNAのヌクレオチド配
列を示す図である。第２図において、１はSGal
で培養したKK4（YEp−HLYSIG）の菌体増殖
性、２はSDで培養したKK4（YEp−HLYSIG）
の菌体増殖性、３はSGalで培養したKK4
（YEpHLY−１）の菌体増殖性、４はSGalで培
養したKK4（YEp−HLYSIG）の酵素活性、５は
SDで培養したKK4（YEp−HLYSIG）の酵素活
性及び６はSGalで培養したKK4（YEpHLY−１）
の酵素活性を示すプロツトである。 又、第３図において、７はSGalで培養した
KK4（YEp−HLYSIG）の菌体増殖性、８は細胞
内画分におけるリゾチーム活性の局在性、９は細
胞外画分におけるリゾチーム活性の局存性、及び
１０はペリプラズム画分におけるリゾチーム活性
の局在性を示すプロツトであり、棒グラフは全リ
ゾチーム活性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ニワトリリゾチームシグナルペプチドをコー
ドする領域とヒトリゾチーム構造遺伝子領域から
なる雑種プレリゾチーム遺伝子と、酵母プロモー
ターを含有する組み換えDNA。 ２ 前記シグナルペプチドをコードする領域は下
記のヌクレオチド配列を有するものである特許請
求の範囲第１項の組み換えDNA。 ATG AGG TCT TTG CHA ATC TTG
GTG CTT TGC TAC TCC AGA AAC
GAT TAG AAC CAC GAA ACG TTC CTG CCC CTG GCT GCT CTG
GGG AAG GAC GGG GAC CGA CGA GAC
CCC ３ 前記シグナルペプチドをコードする領域が該
酵母プロモーターの下流側で、かつ前記構造遺伝
子の上流にあり、いずれもこれらと解読枠が一致
していることを特徴とする特許請求の範囲第１項
または２項の組み換えDNA。 ４ 前記雑種プレリゾチーム遺伝子は下記のヌク
レオチド配列を有するものである特許請求の範囲
第１項乃至第３項のいずれかの組み換えDNA。 【表】 ５ 前記雑種プレリゾチーム遺伝子は5′端に制限
酵素切断部位（SalI部位）を、また3′端に２個の
翻訳終止信号（TAA TGA）と制限酵素切断部
位（Sau3AI部位）を有するものである特許請求
の範囲第１項乃至第４項のいずれかの組み換え
DNA。 ６ 組み換えDNAがプラスミドPHLYSIGである
特許請求の範囲第１項の組み換えDNA。 ７ 該プロモーターが酵母のGAL10プロモータ
ーである特許請求の範囲第１項乃至第５項のいず
れかの組み換えDNA。 ８ 該プロモーターがプラスミドYEp51のもの
である特許請求の範囲第７項の組み換えDNA。 ９ 組み換えDNAがプラスミドYEp−HLYSIG
である特許請求の範囲第８項の組み換えDNA。 １０ ニワトリリゾチームシグナルプチドをコー
ドする領域とヒトリゾチーム構造遺伝子領域から
なる雑種プレリゾチーム遺伝子と、プロモーター
を含有する組み換えDNAを保持する酵母の形質
転換体。 １１ 酵母の形質転換体がS.cerevisiae KK4
（YEp−HLYSIG）である特許請求の範囲第１０
項の酵母の形質転換体。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60268218A JPS62248488A (ja) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | 組み換えｄｎａ及びそれを含む酵母形質転換体 |
| JP33282790A JPH03183479A (ja) | 1985-11-28 | 1990-11-29 | ヒトリゾチーム分泌生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60268218A JPS62248488A (ja) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | 組み換えｄｎａ及びそれを含む酵母形質転換体 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33282790A Division JPH03183479A (ja) | 1985-11-28 | 1990-11-29 | ヒトリゾチーム分泌生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62248488A JPS62248488A (ja) | 1987-10-29 |
| JPH0370474B2 true JPH0370474B2 (ja) | 1991-11-07 |
Family
ID=17455552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60268218A Granted JPS62248488A (ja) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | 組み換えｄｎａ及びそれを含む酵母形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62248488A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0771509B2 (ja) * | 1988-07-12 | 1995-08-02 | 工業技術院長 | ヒトβ−ＮＧＦの発現法 |
-
1985
- 1985-11-28 JP JP60268218A patent/JPS62248488A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62248488A (ja) | 1987-10-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |